Universidad Popular del Cesar

Facultad de ciencias de la salud

Departamento de microbiologa
2009

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE

SUELOS.
ANTES DE INICIAR EL PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

El uso de bata de manga larga, gorro, tapabocas y guantes es obligatorio durante la

permanencia en el laboratorio, igualmente no olvide usar zapatos cerrados de material
resistente para evitar cualquier riesgo de accidente y/o infeccin.

Organcese; coloque las maletas y dems tiles no relacionados con la practica de

laboratorio en el lugar indicado por el docente, luego desinfecte su mesn de trabajo
con hipoclorito de sodio; posteriormente ubique los reactivos, equipos y muestras
necesarios para realizar su trabajo, de manera que facilite la consecucin de los
procedimientos, llevndolos a cabo, de la manera ms sencilla.

Verifique que el material necesario para el desarrollo de la prctica este completo y

estril.

Cada estudiante debe contar con asas curva y redonda, lminas y laminillas,
marcadores de tinta indeleble, cinta amarilla para pared, vinipel, toallas de papel
desechables e hipoclorito.

Tenga muy en cuenta las seales de seguridad, nunca las cambie de lugar o dae
alguna.

DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRCTICA

Tenga cuidado con el uso del mechero, antes de prenderlo reconozca la posicin de
cerrado o abierto (palanca en cruz o en paralelo al tubo de gas). Verifique igualmente
que la manguera que conduce el gas hacia mechero este en buenas condiciones, de lo
contrario evite usar ese mechero.

Para evitar contaminaciones con otros microorganismos al hacer repiques, debe

asegurarse de esterilizar el asa calentando el alambre de ferro nquel con el mechero

en toda su extensin hasta que sta se ponga roja, este proceso debe realizarse antes
y despus del uso.

Abra la caja de Petri, tubos u otros que contengan medios o cultivos el menor tiempo
posible y cerca al mechero para evitar contaminaciones.

Es conveniente mantener un poco de hipoclorito concentrado en un vaso en donde se

descarten las asas utilizadas; cuando se manipulan hongos se prefiere la desinfeccin
del asa sumergindola en hipoclorito por 5 minutos, ya que, el proceso de incineracin
puede generar aerosoles que contienen esporas dispersantes.

Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapn en la

mano derecha sostenido entre el dedo meique y la palma de la mano, cerca de a la
llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo ndice y el
pulgar. Del correcto manejo de los tubos depende el xito de los cultivos y por
consiguiente tambin los resultados microbiolgicos.

Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlos a tapar
para evitar la formacin de aerosoles o la contaminacin del contenido del tubo con
bacterias del medio ambiente.

Destapar las cajas de Petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en la mano

izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. Para tener
esta posibilidad la caja debe estar sobre la mesa con el medio hacia arriba, esta se
debe coger con la mano izquierda y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la
misma mano.

Las lminas deben estar limpias y desengrasadas.

El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora.

Las cajas de petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las
superficies de los cultivos.

No olvide descartar los medios de cultivo en un tiempo no superior a 8 das, segn lo

indicado por el docente, ya que los hongos y actinomicetes tienen un perodo de
crecimiento mayor.

Es recomendable no incubar tubos con medios de cultivo slidos o lquidos en gradillas

de madera, ya que, adems de ocupar gran espacio en la incubadora, la madera es un
material no recomendado para el trabajo con microorganismos.

Recuerde mantener su sitio de trabajo aseado y organizado, an durante el desarrollo

de las prcticas, evite caminar o recorrer el laboratorio continuamente con muestras
biolgicas, microorganismos, o reactivos peligrosos como cidos o bases fuertes.

Si va a preparar y servir medios de cultivo, tenga en cuenta que este procedimiento

debe hacerse en un sitio destinado para este fin, cuyo mesn debe haber sido
desinfectado previamente con hipoclorito de sodio. La temperatura adecuada para
servir el medio de cultivo es aquella un poco superior a la corporal, si el medio esta
demasiado caliente puede generar vapores de agua que posteriormente, al disminuir
la temperatura generaran agua lquida que a su vez facilita la contaminacin del medio;
si por el contrario, el medio se deja enfriar demasiado antes de servir, se tienden a
generar grumos de agar solidificado y la probabilidad de contaminacin por
microorganismos presentes en el ambiente aumenta.

El microscopio debe manejarse de manera tcnica. Encenderlo una sla vez. Una vez
logrado el enfoque de la muestra para retirar la lmina, pase al objetivo de menor
aumento (10X), no gire el tornillo macromtrico, pues desenfocara la distancia frontal.

Est prohibido hacer manipulacin boca-mano. Comer, fumar, cortar cinta pegante con
la boca, morder lpices dentro del laboratorio.

En caso de derrame o ruptura de un recipiente con cultivo, cubrir con papel toalla y
aplicar un germicida. Informar al profesor, en caso eventual de accidente, cortadura,
quemadura para tomar accin pronta y apropiada

DESECHOS
Comunes
Infecciosos
(Aguas
o
suelo
contaminadas)

ESTADO FISICO
Slidos
Slidos
Lquidos

ENVASE
Bolsas plsticas
Bolsas plsticas
Recipientes
hermticos
en
bolsas plsticas

COLOR
Negro/Gris

Punzocortantes

Solido
Solido
Liquido

Recipientes rigidos
Doble
bolsa
plsticas cuando las
caractersticas
lo
permitan
Envases originales

Rojo

Solido

Bolsas gruesas

Verde

Solido

Bolsas plasticas en
recipientes
hermeticos

Quimicos

Biologico (plantas,
suelo, troncos)
Especiales

Rojo

Rojo

Amarillo

AL FINALIZAR LA PRCTICA.

Elimine los residuos de muestras en las bolsas destinadas para su desecho, recuerde
que los medios de cultivo con microorganismos deben someterse a esterilizacin en
autoclave, antes de ser desechados.

Lave el material de vidrio que no requiera ser esterilizado y dispngalo de manera

organizada sobre el mesn indicado.

Limpie los lentes del microscopio con papel de arroz y guarde estos equipos en el lugar
correspondiente.

Verifique que su puesto de trabajo haya quedado limpio y desinfectado con hipoclorito
de sodio.

Recuerde guardar su bata de laboratorio dentro de una bolsa y lavarla por separado,
previa desinfeccin con un lquido blanqueador.

Todo el equipo reusable (por ej. puntas de micro pipetas, jeringas, cnulas, agujas,
tubos para recoleccin de especmenes, etc.) deber ser ubicado en un recipiente
metlico o de plstico resistente a punciones o cortaduras. Se recomienda el uso de
bidones y botellas de plstico o cualquier recipiente similar acondicionado para tal fin.
El recipiente contendr lquido decontaminante y deber estar ubicado en el mismo
lugar de trabajo.

ACTIVIDAD GRUPAL.
1. Observa el comportamiento del personal de laboratorio (estudiantes, auxiliares, docentes)
toma fotos o realiza un video si es posible y analiza:

Se practican las normas de bioseguridad?

Qu riesgos potenciales corre el personal de laboratorio?
Qu prcticas inadecuadas (no
acordes con las normas de bioseguridad)
observaste?
Como microbilogo, qu recomendaciones generales haras para mejorar la
bioseguridad en tu universidad?

Todos los grupos de trabajo presentan los videos realizados o exponen las fotos y con base en
lo observado deben elaborar un plegable o folleto, que contenga las normas necesarias para
prevenir contaminaciones y accidentes, durante el desarrollo de las prcticas de microbiologa
de suelos. El mejor folleto o plegable ser expuesto en el laboratorio.

PRACTICA 1
TCNICAS PARA EL ENRIQUECIMIENTO Y OBSERVACIN IN
SITU DE MICROORGANISMOS DEL SUELO
OBJETIVOS

Aplicar tcnicas sencillas para el enriquecimiento y la observacin de microorganismos

del suelo in situ.
Observar la diversidad y los patrones de colonizacin de microorganismos del suelo sobre
superficies slidas.
Practicar la observacin de microorganismos del suelo in vivo

MATERIALES
Laminas portaobjetos limpias
Capilares
Cinta adhesiva
Pala
Asas Agujas rectas y curvas.
Coloraciones (Gram, Azul de lactofenol, safranina)
Microscopio
Parafina (una vela)
Una Papa
Sacabocados
Frascos de vidrio
Muestras de suelo
Alcohol
Mecheros
PROCEDIMIENTO
I. Observacin De Microorganismos Del Suelo Por La Tcnica De Portaobjeto Enterrado

Tome un par de portaobjetos limpios y desengrasados, nalos por sus superficies.

Posteriormente envulvalos con cinta adhesiva transparente en sus extremos.

Seleccione un suelo protegido de la actividad humana, animales etc. Con la ayuda de una
pala entierre varios pares de laminas unidas a profundidades de 5, 15 y 30 cm. Puede
tambin enterrar laminas en diferentes tipos de suelo segn si inters (ejm: diferente grado
de humedad, diferente grado de fertilidad, diferente vegetacin).
Marque el sitio y deje enteradas las laminas por 2 , 4 y 6 semanas.

Retire del suelo las lminas enterradas en cada sitio, a las 2, 4 y 6 semanas.

Separe el par de laminas, lave cuidadosamente la superficie expuesta y retire las

partculas gruesas de suelo, debe quedar una pelcula fina sobre la lamina, la cual no debe
ser daada. Lave bien la parte opuesta de la lamina y y squela con cuidado para
colocarla sobre la platina del microscopio

Observe primero en montaje hmedo, (con agua y laminilla), y luego con colorantes a 10,
40 y 100X.

Trate de identificar estructuras microbianas, patrones de crecimiento, diversidad de formas

etc.

Dibuje y describa las observaciones, tabule los resultados de acuerdo a las diferentes
profundidades y suelos que quiere comparar.

II. Observacin De Microorganismos Del Suelo Por La Tcnica De Capilares

Tome una lamina portaobjetos y y coloque sobre ella entre 5 y 10 tubos capilares,
Pguelos con cinta adhesiva en sus extremos sin obstruir los orificios.

Entierre las laminas en el suelo a diferentes profundidades (igual que en el

procedimiento anterior, sin embargo es recomendable esta tcnica para observar
microorganismos en suelos bastante hmedos), si se quiere se puede introducir
algunos sustratos en el interior de los capilares.

Despus de transcurridas 2,4 y 8 semanas, desentierre las lminas, realice

observaciones macro y microscpicas tomando las muestras del interior los capilares
con ayuda de una aguja ( en caso de ser necesario parta los capilares y prepare
montajes hmedos y coloreados).

Compare lo observado entre diferentes muestras y con la tcnica anterior.

III. Enriquecimiento Y Observacin De Clostridium Sp Amiloliticos

Este ensayo es un mtodo clsico de enriquecimiento para la obtencin de bacterias
anaerbicas, aisladas a partir de agregados de suelo en un medio natural rico en almidn
como es la papa.

Se toma una papa y con un sacabocados de aproximadamente 1 centmetro de dimetro

(previamente impregnado con alcohol y flameado) se orada hasta la mitad. Se retira el
cilindro de papa y se corta unos 3mm en la base, e deja sobre papel absorbente, caja de
Petri o una lamina limpia junto al mechero para que no se contamine.

Se introduce en el orificio una pequea cantidad de agregados de suelo (cerca de 0,5 g) y

se coloca nuevamente el cilindro de papa.

Se sella con parafina liquida (vela derretida), y se coloca dentro de un frasco de boca
ancha, al que se le agrega agua hasta cubrir la papa inoculada y se tapa con papel de
aluminio o una tapa metlica.

Se deja incubar al medio ambiente por 2 -3 das.

Se retira la papa del frasco, se retira el cilindro de papa y del interior del orificio se toman
muestras con ayuda del asa para hacer extendidos, se dejan secar al aire. Se fijan al calor
y se colorea con Gram.

Realice otro montaje para ser coloreado con la coloracin para endosporas de Shaeffer
Fulton (Consultar procedimiento).

CUESTIONARIO
1. Consulte que es una tcnica
microbiologa del suelo.

de cultivo por enriquecimiento y para que se usa en

2. Consulte las diferentes morfologas de bacterias endosporadas y los tipos de sustratos

utilizados, tanto anaerobias como aerobias.
3. Que son los microorganismos oligotrficos y un mtodo de enriquecimiento para la
seleccin de este tipo de microorganismos presentes en el suelo o el agua, consulte dos

gneros de este tipo de microorganismos y describa sus caractersticas morfolgicas y de

crecimiento.

PRACTICA 2
DETERMINACION DEL EFECTO RIZOSFERICO
OBJETIVOS

Evidenciar el efecto de la rizosfera sobre el nmero de microorganismos del suelo

adyacente a la raz.
Determinar el efecto rizosfrico en plntulas de inters, mediante la obtencin del ndice
rizosfrico.

MATERIALES
Cajas de Petri con Agar Nutritivo (AN) o Agar Plate count (PCA)
Tubos de ensayo para preparar series de diluciones
Pipetas de 1 -5 mL
Micropipetas 1-100 microlotros y 100-1000 microlitros
Asas de vidrio en L (Asas de Drigalsky)
Muestras de suelo rizosfrico de diferentes especies vegetales
Muestras de suelo no rizosfrico
Vortex
Solucin salina o agua peptonada.
Cada grupo debe traer un 2 asas de hokey (asa de vidrio en forma de L) estriles.
PROCEDIMIENTO
I Toma De Muestras

En un suelo con cobertura boscosa, un suelo cultivado o un jardn, seleccione una plntula
saludable ( segn su inters) y desentirrela con cuidado, extrayendo todo el sistema
radical sin romper las races.
Sacuda suavemente las races de tal manera que se desprenda el volumen de suelo que
no esta adherido directamente a la superficie radical, tome 100 gramos de races finas con
las partculas de suelo que estn adheridas directamente a la superficie rodeando las
races (Suelo rizosfrico)
En el mismo terreno seleccione el rea mas cercan al lugar donde se encontraba la
planta, pero que no tenga influencia del sistema radical y tome unos 100 gramos de suelo
(suelo no rizosfrico).
Coloque por separado en bolsas plsticas el suelo rizosfrico y el suelo no rizosfrico,
rotlelo y transprtelo al laboratorio en el menor tiempo posible.

II Procesamiento de las muestras

Tome las races de la plntula y agtelas vigorosamente sobre una superficie limpia y
desinfectada, hasta que se desprenda la mayor cantidad posible de suelo rizosfrico, tome
10 gramos de dicho suelo y disulvalo en 90 mL de agua agitando vigorosamente en el
vortex hasta que no se distingan grnulos de suelo en el fondo del recipiente. A partir de
all, prepare una serie de diluciones hasta
10 -6 en los tubos de ensayo con solucin salina o agua peptonada.
Tome diez gramos del suelo no rizosfrico y proceda de la misma manera a realizar una
serie de diluciones.

De cada dilucin (10 -1 a 10-6) de suelo rizosfrico, tome 0,1 mL y proceda a realizar una
siembra en superficie en una caja de Petri con Agar Nutritivo o Agar Plate Count, con
ayuda del asa de vidrio

Repita el procedimiento anterior a partir de la serie de diluciones del suelo no rizosfrico.

Rotule las cajas e Incbelas a una temperatura entre 25 a 30 oC por 3 a 5 das o hasta
evidenciar el crecimiento de colonias microbianas en toda la superficie de la caja.

Retire las cajas de la incubadora y proceda a realizar el recuento del nmero de colonias
en cada cajas y determine el numero de UFC por gramo de suelo rizosfrico (R) y el
numero de UFC por gramo de suelo no rizosfrico ( S).

Determine la relacin R/S

Interprete el resultado de acuerdo al valor:

R/S > 1,

De acuerdo al resultado, explique el efecto rizosfrico de la planta sobre la microbiota del

suelo.

R/S = 1

R/S <1

NOTA: Se puede determinar el efecto rizosfrico para diferentes grupos de microorganismos

inoculando la muestra de las diluciones en medios de cultivo selectivos para hongos, bacterias,
actinomicetes, etc, o incluso gneros y especies de especial inters.
CUESTIONARIO
4. Que es la competencia rizosfrica de un microorganismo?
5. Que importancia practica tiene la determinacin del efecto rizosfrico?.
6. Qu factores relacionados con la interaccin planta microorganismo pueden influir en el
resultado del ndice R/S)?

PRACTICA 3
OBTENCIN DE MICROORGANISMOS FIJADORES DE
NITROGENO DE VIDA LIBRE
OBJETIVOS

Obtener microorganismos fijadores asimbiticos de nitrgeno de los generos Azospirillun y

Azotobacter
Comprobar La tcnica de aislamiento en cultivos selectivos para la obtencin de bacterias
fijadoreas de nitrgeno activas
Observar las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de bacterias fijadoras de nitrgeno
de vida libre, en respuesta a condiciones ambientales propicias para su actividad.

PROCEDIMIENTO
PREPARE LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS PARA AISLAMIENTO

Medio Ashby para aislamiento de Azotobacter sp

Componente
Cantidad (gr / L)
K2HPO4
0,2
MgSO4 7H2O
0,2
NaCl
0,2
CaCO3
5
K2SO4
0,1
Manitol
15
Agar
15
PH Ajustar a 7
*Se puede agregar 5ml de extracto de suelo o 0.1 gramo de extracto de levadura.
Esterilizacin: 20 minutos a 121 oC
Medio NFB cido mlico Semislido para aislamiento de Azospirillum sp
Componente
Cantidad (gr / L)
K2HPO4
0,5
Na2MoO4
2 mg
MnSO4
0.3mg
MgSO4 7H2O
0,2
NaCl
0,02
CaCl2
5
FeSO4
0,0017
Acido Malico
5
KOH
4
Agar
2
*zul de bromotimol (Solucin)
3 ml
PH Ajustar a 6,5 - 7
*Azul de bromotimol Solucin al 0.5% con KOH 0.2 N.
Esterilizar a 121C, 20 minutos en autoclave
El medio semislido se sirve en tubos de ensayo o frascos ocupando un tercio del volumen.
Con la misma preparacin se agregan 15 gramos de agar para preparar medio slido y se
suplementa con 0,5 gramos de extracto de levadura
Para evidenciar el crecimiento de algunas especies de Azospirillum se puede preparar el medio
slido sin azul de bromotimol y a cambio se agrega 15ml de solucin de rojo congo(1 g
disuelto en 400 mL)
OBTENCIN DE MICROORGANISMOS NFB EN LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS
10

PURIFICACIN DE CEPAS
Azotobacter:
Tome muestras de suelo de buena calidad, pase la muestra por tamices de diferente tamao
de poro hasta obtener partculas de suelo uniformes, del menor tamao posible conservando
su estructura y agregacin. Transfiera los grnulos seleccionados a una caja de petri seca y
estril, con unas pinzas estriles, tome los grnulos de suelo y dispongamos de a 5, 7 o 9
sobre las cajas con medio de cultivo Ashby (Figura1). Incube a 30 oC y observe
peridicamente hasta evidenciar colonias en crecimiento alrededor de los grnulos. Consulte la
literatura para reconocer las caractersticas del genero en este medio de cultivo. Tome las
colonias tpicas de Azotobacter, realice coloracin de Gram para reconocer sus caractersticas
microscpicas y purifquelas sobre nuevas cajas de medio de cultivo selectivo.

Figura 1: Disposicin de grnulos de suelo sobre medio de cultivo Ashby

Fijadores microaerofilicos tipo Azospirillum
Tome muestras de raicillas finas (con el suelo adherido sobre su superficie) de plantas
gramneas (maz, caa, arroz, pastos). Coloque 1 gramo junto en un tubo con 9 ml de solucin
salina al 0,8% . Agite vigorosamente en vortex durante 5 minutos, posteriormente prepare
diluciones seriadas y de cada una de las diluciones inocule 0,1ml en cada frasco del medio
selectivo semislido, incube a 30 oC hasta observar la formacin de una pelcula fina de color
blanco o amarillo a 2-5 ml de la superficie del medio. Con un asa tome una parte de la pelcula
formada y transfirala al medio selectivo slido realizando estriado por agotamiento, con el fin
de obtener colonias aisladas. Realice coloraciones de Gram para reconocer sus caractersticas
microscpicas.
PROCEDIMIENTO COMPLEMENTARIO OPCIONAL
OBTENCIN DE UN
SELECCIONADOS.

BIOPREPARADO

BASE

DE

LOS

MICROORGANISMOS

A partir de cada aislamiento microbiano de los diferentes grupos funcionales se lleva a cabo
una propagacin masiva para la obtencin de un inculo en caldo nutritivo enriquecido con
extracto de levadura y glucosa, o en diferentes medios que permitan el crecimiento rpido y
abundante de los diferentes microorganismos.
INOCULACIN DE PLANTAS DE CRECIMIENTO CORTO CON BIOPREPARADOS A BASE
DE MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL
4.1 Se colocan 500 gramos de suelo en recipientes plsticos.
4.2. Se sembraron 10 semillas de la planta seleccionada (planta indicadora de crecimiento
rpido) en cada uno de los recipientes.
4.3. Seguidamente se aplican10ml del biopreparado con el microorganismo a probar sobre toda
la superficie del suelo y se riega inmediatamente sin inundacin. Se coloca un tratamiento sin
inoculo como control y se adiciona el medio de cultivo sin microorganismo.

11

4.4. Realice conteos diarios del porcentaje de semillas germinadas en cada tratamiento

DETERMINACIN DEL EFECTO DE LA INOCULACIN POR MEDIO DE PARAMENTROS

DE CRECIMIENTO VEGETAL
Despus de varios das de crecimiento das se desentierran cuidadosamente todas las plantas
y se realizan las siguientes determinaciones:
Longitud Promedio de la raz.
Longitud Promedio de las hojas.
Biomasa del follaje y de races.

CUESTIONARIO

Consulte las caractersticas morfolgicas propias del genero Azotobacter y Azospirillum

que permiten su reconocimiento en el laboratorio.
Qu diferencia hay en el proceso de fijacin de nitrgeno entre bacterias de vida libre
como las estudiadas en esta prctica y bacterias simbiticas como Frankia sp y
Rhizobium sp?
Que importancia ha tenido el uso de inoculantes microbianos a base de Azotobacter y
Azospirillum para la agricultura.

12

PRACTICA 4
BACTERIAS FIJADORAS DE NITRGENO
SIMBITICAS.
OBJETIVOS
Obtener cultivos de bacterias fijadoras de nitrgeno del gnero Rhizobium a partir de
ndulos de plantas leguminosas.
Comparar la morfologa de bacterias del gnero Rhizobium en simbiosis vs en cultivo.
MATERIALES
Cajas de Petri con agar selectivo YMA o agar ELMARC
Tubos de ensayo para preparar series de diluciones
Pipetas de 1 -5 mL
Micropipetas 1-100 microlotros y 100-1000 microlitros
Asas de vidrio en L (Asas de Drigalsky)
Plantulas de palntas leguminosas noduladas
Muestras de suelo adyacente a plantas leguminosas
Vortex
Solucin salina o agua peptonada.
Bistur
Asas rectas y redondas.

PROCEDIMIENTO
En un suelo de buena calidad identifique la presencia de plantas saludables y vigorosas de
especies leguminosas ( Trbol, Arveja, Frilol, Leucaena, etc), desentierre algunas plantas con
cuidado para extraer el sistema radical completo sin daar la raz principal y races
secundarias.
Lave cuidadosamente la raz e identifique los ndulos radicales formados por la infeccin de
bacterias simbiticas del genero Rhizobium, estas estructuras son tumores de color rojo,
marrn o caf, de forma lobulada o acorazonada como se observa en la siguiente figura.

Seleccione ndulos grandes, brillantes y de color intenso, lvelos con abundante agua y
transfiralos a una caja de petri limpia y seca.
Desinfecte la superficie de los ndulos, sumergindolos en una solucin de hipoclorito de sodio
al 5% durante 1 minuto, lave nuevamente los ndulos varias veces con agua estril para retirar
el exceso de hipoclorito de la superficie (entre 5 y 8 lavados de a un minuto), tenga la
precaucin de realizar los lavados cerca al mechero o en cmara de esterilidad para evitar
contaminacin de los ndulos con bacterias y hongos ambientales.
Coloque los nodulos lavados y desinfectados sobre una caja de petri limpia y estril, con ayuda
de un bistur o una cuchilla desinfectada corte un ndulo por el centro y verifique la presencia
de leghemoglobina, una sustancia de color rojizo presente en ndulos activos (fijadores de
nitrgeno) y con buen contenido de bacteroides de Rhizobium.
Tome diferentes porciones de ndulos y colquelos con una pinza estril sobre la superficie de
agar YMA o agar ELMARC
e inocule las cajas de petri a temperaturaentre 25 a 30 oC .
Tambin puede tomar los ndulos cortados y preparar diluciones en solucin salina o agua
peptonada para inocular a partir de las diluciones y realizar siembra masiva con ayuda de un
asa de Hokey.

13

Tome secciones de ndulos sobrantes, con un asa tome una muestra del interior, realice un
frotis y realice una tincin de Gram. Identifique las clulas de Rhizobium y observe
cuidadosamente la morfologa y tamao de los bacteroides.
Al cabo de 5 a 7 das retire los cultivos de la incubadora y observe el crecimiento de colonias
alrededor de los ndulos, o masivamente en toda la superficie a en las cajas inoculadas a
partir de las diluciones.
Tome muestras de las colonias mas representativas y realice coloraciones de Gram, compare
la forma y el tamao de las clulas, con lo observado a partir de las muestras directas de los
ndulos, establezca las diferencias. Y discuta los resultados.
PROCEDIMIENTO COMPLEMETARIO OPCIONAL
Tome colonias puras y prepare una suspensin bacteriana, determine el numero de UFC por
medio de conteos en cmara de Neubauer o por espectrofotometra.
Tome plantas o semillas de la misma especie leguminosa de donde fueron obtenidas las
colonias de Rhizobium, desinfecte las superficies y lvelas con abundante agua.
Coloque en contacto las plntulas o las semillas con la suspensin bacteriana, por un tiempo
entre 15 y 30 minutos, luego retrelas y proceda a sembrarlas en recipientes con suelo
esterilizado o pasterizado.
Al cabo de 2 o 3 semanas de crecimiento desentierre las plantas y compruebe la formacin de
ndulos radicales formados por la infeccin con las clulas de Rhizobium inoculadas.

CUESTIONARIO
Qu la leghemoglobina y que papel desempea en el interior de los nodulos formados por
Rhizobium en races de plantas leguminosas?
Qu son los bacteroides y que diferencias morfolgicas y funcionales presentan con celulas
de Rhizobium de vida libre ?.
Qu importancia tiene la colonizacin y fijacin de nitrgeno por parte de de Rhizobium para
la produccin de cultivos de plantas leguminosas ?

14

PRACTICA 5
OBTENCIN DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS Y
SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS
OBJETIVOS

Obtener diferentes microorganismos solubilizadores de fosfatos a partir de muestras de

suelo y races de plantas.
Obtener microorganismos celulolticos a partir de muestras de material vegetal en
descomposicin natural.
Observar la expresin de la actividad de organismos solubilizadores de fosfatos y
degradadores de celulosa en los medios de cultivo selectivos.
Determinar cualitativamente la actividad solubilizadora de fosfatos mediante la medicin
del ndice de solubilizacin relativa.

PROCEDIMIENTO
PREPARE LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE LOS
ORGANISMOS DE INTERES
Medio SRS para el aislamiento de Solubilizadores de fosfatos
Componente
Cantidad (gr / L)
(NH4)2 SO4
0,5
KCL
0,2
MgSO4
0,3
MnsO4
0,004
FeSO4
0,002
NaCl
0,2
Glucosa
10
Extracto de levadura
0,5
Purpura de bromocresol
0,1
*Ca3 (PO4)2
5
Agar
15
Esteriliza a 121oC 30 minutos.
PH:7
El fosfato se esteriliza en forma independiente y se adiciona a los otros componentes antes de
servir.
Medio para Degradadores de celulosa. Agar Celulosa Rojo Congo
Componente
K2HPO4
MgSO4
Celulosa en polvo
Rojo congo
Agar
Gelatina
Extracto de suelo
PH 7 con NaOH0,1N
Esteriliza a 121oC 30 minutos.

Cantidad (gr / L)
0,5
0,25
1,88
0,2
5
2
100ml

15

OBTENCIN DE MICROORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE FOSFATOS

Tome muestras de suelo de buena calidad o compost maduro, pase la muestra por tamices de
diferente tamao de poro hasta obtener partculas de suelo uniformes, del menor tamao
posible conservando su estructura y agregacin. Transfiera los grnulos seleccionados a una
caja de Petri seca y estril, con unas pinzas estriles, tome los grnulos de suelo y
dispngalos de a 5, 7 o 9 sobre las cajas con medio de cultivo SRS. Tambin puede tomar
segmentos de raicillas de plantas exigentes en fsforo tales como maz, trigo o caa de azcar,
Incube a 30 oC y observe peridicamente hasta evidenciar colonias de hongos o bacterias en
crecimiento alrededor de los grnulos o de las raicillas. La actividad solubilizadora se evidencia
por la aparicin de un halo transparente alrededor de la colonia en el medio SRS, acompaado
de cambio de pH del medio que se evidencia por una coloracin amarilla en el medio que
originalmente es de color prpura. Seleccione las colonias con mayor expresin de la actividad
solubilizadora y purifquelas sobre nuevas cajas de medio de cultivo selectivo SRS.
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD SOLUBILIZADORA DE FOSFATOS
La valoracin de la eficiencia relativa de solubilizacin de los aislamientos, se puede realizar
empleando el mtodo propuesto por Sundara Rao y Sinha (1963) sobre el medio original de
aislamiento (SRS), el cual est basado en la medicin del dimetro de halos de transparencia
alrededor de colonias bacterianas que crecen en un medio de cultivo sin formas solubles de
PO4 3- pero con fosfato de calcio o hierro, el cual puede ser solubilizado por las colonias
microbianas que presenten esta capacidad. La eficiencia relativa de solubilizacin de fosfatos
se expresa haciendo una relacin del dimetro del halo de solubilizacin con respecto al
dimetro de la colonia. Sin embargo esta tcnica se puede considerar nicamente cualitativa.
Para la determinacin relativa de solubilizacin se toman cajas de Petri con medio SRS con
fosfato de calcio, de cada aislamiento bacteriano, se siembra en el centro de la caja una
colonia de bacteria tomada con la punta de una aguja a partir de colonias de 48 horas de
crecimiento. Se hacen de 3 a 5 replicas para cada aislamiento y se incuban a 31C por 5 das,
luego de los cuales se registr el dimetro de las colonias y el dimetro de los halos de
solubilizacin (transparencia en el medio de cultivo)
Para valorar la actividad solubilizadora se emplea la relacin:

Actividad =

Dimetro de solubilizacin
__________________________________
Dimetro de la colonia bacteriana

Donde el valor mnimo del ndice de solubilizacin es de 1. Esto corresponde a una colonia que
no presenta halo de solubilizacin evidente y se asume que este es igual al dimetro de la
colonia.

OBTENCION
DE

MICRORGANISMOS
CELULOLITICOS
Aspecto inicial del
medio de cultivo SRS, con
Crecimiento de colonias bacterianas
partculas de fosfato de calcio tribsico, poco
solubilizadoras de fosfato en medio SRS: A,
Tome solubles.
muestras de suelo rico en residuos de vegetales,
compost
elaborado a partir de
dimetro de
la colonia.
materiales
celulsicos,
dedemadera
en descomposicin,
hojarasca,
pasedela
El indicador
de pHtrozos
(prpura
bromocresol)
B, dimetro humus
del halou de
solubilizacin
torna el medio de color morado a pH neutro.
fosfatos. C, acidificacin del medio de
cultivo (el indicador de pH vira a amarillo).
16

muestra por tamices de diferente tamao de poro hasta obtener partculas de suelo uniformes,
del menor tamao posible. Transfiera los grnulos seleccionados a una caja de Petri seca y
estril, con unas pinzas estriles, tome los segmentos de material en descomposicin y
dispngalos sobre las cajas con medio de cultivo Agar Celulosa Rojo Congo.
Incube a 30 oC y observe peridicamente hasta evidenciar colonias de microorganismos en
crecimiento alrededor de las partculas. Consulte la literatura para reconocer las caractersticas
de colonias que degradan celulosa. Purifique las colonias con mayor expresin de la actividad
celulolitica sobre nuevas cajas de medio de cultivo selectivo.
CUESTIONARIO

Consulte y elabore una sntesis de los mecanismos bioqumicos que presentan hongos y
bacterias para llevar a cabo la solubilizacin de fosfatos.
Consulte las fuentes de fosfato inorgnico y orgnico sobre las cuales actan los
microorganismos solubilizadores para liberar el in ortofosfato.
Explique el mecanismo de accin de organismos celulolticos, para la descomposicin de
la celulosa.
Consulte algunos gneros de hongos y bacterias conocidos por su actividad degradadota
de celulosa.
Consulte un mtodo para evaluar la actividad de microorganismos celuloliticos.

17

PRACTICA 6
EVALUACIN DEL EFECTO DE MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL
CRECIMIENTO VEGETAL L SOBRE ESPECIES VEGETALES DE
CRECIMIENTO RPIDO
INTRODUCCIN
Los microorganismos del suelo, especialmente los que habitan la rizsfera, desarrollan
procesos de gran inters para el crecimiento y nutricin de las plantas; entre tales acciones
se encuentra la degradacin de la materia orgnica, la fijacin de nitrgeno, produccin y
liberacin de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, solubilizacin de elementos
minerales nutrientes de las plantas, proteccin frente a fitopatgenos, etc. Es as como en
la actualidad existe un creciente inters en aplicaciones agroecolgicas mediante la
utilizacin de microorganismos rizosfricos como fertilizantes biolgicos, para lo cual los
estudios bsicos hacen importantes aportes para llegar a tecnologas que permitan la
utilizacin masiva de biopreparados microbianos (biofertilizantes y / o fitoestimuladores) en
modelos alternativos de agricultura enmarcados dentro el concepto de sostenibildad.
Los microorganismos que incrementan el suministro y la disponibilidad de nutrientes,
mejorando el nivel de fertilidad del suelo y contribuyendo al crecimiento de la planta se
denominan
biofertilizadores. Similarmente, a los microorganismos que producen
sustancias con actividad biolgica anloga a la de fitohormonas y aumentan
la
productividad en los cultivos, se denominan fitoestimuladores ( Barea & Olivares, 1998).
OBJETIVO GENERAL
Observar la accin promotora del crecimiento vegetal
de microorganismos rizosfricos
obtenidos en el laboratorio de microbiologa del suelo, sobre plantas de crecimiento rpido.
OBJETIVOS ESPECIFOCOS

Obtener microorganismos biofertilizadores y fitoestimuladores

y preparar un inoculo
microbiano a base de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal.
Llevar a cabo la inoculacin del biopreparado sobre plantas indicadoras.
Determinar la respuesta de las plantas indicadoras, mediante la medicin de variables
agronmicas, tras la inoculacin con biopreparados microbianos.

MATERIALES

Semillas de arroz, tomate, algodn, cebada, maz, lechuga etc.

Recipientes o bolsas plsticas con capacidad para un Kg de suelo
Pipetas o jeringas de 5 -10 cc
3 Kg Suelo
Cepas de diferentes microorganismos obtenidos en las prcticas anteriores del laboratorio
de microbiologa del suelo (Azotobacter sp, Azospirillum sp, Pseudomonas, etc)
Matraces con medio de cultivo lquido (Caldo nutritivo)

PROCEDIMIENTO
Obtencin de biopreparados
Se toman las diferentes cepas microbianas seleccionadas y se lleva a cabo una propagacin
masiva de cada microorganismo, para la obtencin de un inculo en caldo nutritivo
enriquecido con extracto de levadura y glucosa, o en diferentes medios que permitan el

18

crecimiento rpido y abundante de los diferentes microorganismos. Para ello se toma suficiente
inoculo a partir de una colonia fresca y pura, y se inocula en condiciones de esterilidad en un
erlenmeyer con 200 ml de medio de cultivo lquido y se incuban por dos o tres das (si es
posible con agitacin permanente). Cuando observe crecimiento abundante, detenga el
crecimiento, determine la cantidad de UFC/ ml mediante recuentos en cmara de Neubauer o
por nefelometra.

Montaje del bioensayo de promocin del crecimiento

Cada grupo de laboratorio selecciona una planta segn su inters y consigue semillas que
no hayan sido tratadas con antifungicos o bactericidas.
Proceder a lavar cuidadosamente 50 semillas
Se toman 5 recipientes plsticos y se colocan 500 gramos de suelo en cada uno.
Se distribuyen 10 semillas de la planta seleccionada uniformemente en la superficie del
suelo en cada recipiente.
Seleccionar 3 de los biopreparados elaborados y con la ayuda de una pipeta o con una
jeringa limpia, se toman 10 ml del biopreparado y se aplican uniformemente sobre las
semillas. Utilice un biopreparado diferente para cada recipiente, en el cuarto recipiente
inocule una mezcla de los tres microorganismos seleccionados y en el quinto recipiente
aplique 10ml del medio de cultivo estril para utilizarlo como control sin inoculo microbiano.

En resumen:
Recipiente 1: Suelo + Bacteria 1 + 10semillas
Recipiente 2: Suelo + Bacteria 2 + 10semillas
Recipiente 3: Suelo + Bacteria 3 + 10semillas
Recipiente 4: Suelo + Bacterias 1 2 y 3 + 10semillas
Recipiente 5: Suelo + medio de cultivo sin bacterias + 10semillas

Despus de la inoculacin cubra las semillas con una capa delgada de suelo
inmediatamente con suficiente agua pero sin inundacin.

y riegue

Seguimiento del bioensayo

Figura 1: Ejemplo de un bioensayo con organismos biofertilizantes.

Realizar conteos diarios del porcentaje de semillas germinadas en cada recipiente. Despus de
pasados 3 das sin variacin en el numero de semillas germinadas, realice tablas y graficas
para comparar la velocidad de germinacin en cada uno de los recipientes con semillas
inoculadas.
Despus de determinar el porcentaje de germinacin, observar el crecimiento de las plantas
durante 7 a 10 das ms, manteniendo la humedad en el suelo.

19

Despus de varios das de crecimiento se desentierran cuidadosamente todas las plantas y se

realizan las siguientes determinaciones:

Longitud Promedio de la raz.

Longitud Promedio de las hojas.
Biomasa del follaje y de races.

Figura2: Ejemplo del registro de las variables respuesta.

Elabore tablas de datos y / o graficas para presentar y explicar los resultados y elabore un
informe analizando y concluyendo en concordancia a lo planteado en los objetivos.

20

PRACTICA 7
COMPOSTAJE
El compost es un producto derivado de un proceso natural constantemente cambiante en el
que participan varios grupos de microorganismos, cada uno apropiado a diferentes condiciones
y durante un tiempo determinado. Los sustratos proporcionados provienen de desechos
vegetales conservando segn su composicin una relacin de carbono y nitrgeno apropiada
para no limitar el proceso y obtener un producto de color y olor similar al suelo. Otros producto
adicionado es el estircol, el cual, se constituye en la principal fuente de microorganismos. En
general los materiales usados son considerados elementos sobrantes de distintas actividades
productivas, por lo que el compostaje es considerada una excelente estrategia para el manejo
de residuos orgnicos, al generarse un producto que enriquece el suelo pero sobre todo, que
mejora las condiciones fsicas y qumicas del mismo.
En una pila de material en compostaje, si bien se dan procesos de fermentacin en
determinadas etapas y bajo ciertas condiciones, lo deseable es que prevalezcan los
metabolismos respiratorios de tipo aerobio, tratando de minimizar los procesos fermentativos y
las respiraciones anaerobias, ya que los productos finales de este tipo de metabolismo no son
adecuados para su aplicacin agronmica y conducen a la prdida de nutrientes.
MATERIALES.

Residuos vegetales escogidos y picados:

papa, cscaras de alverja, zanahoria, cscaras de frutas, cebolla, perejil y especies, papel
(diferente de peridico), desechos de rosa.

1 bulto de cada uno de los siguientes materiales:

Estircol de vaca y/o gallina y/o equino.
Pasto seco y/o heno y /o cascarilla de arroz.
1 kilo de cal.
1 kilo de urea granulada.
1 kilo de Melaza.

Pala y rastrillo de jardinera.

vasija plstica.
Agua
6 tubos de PVC de 25 cm de alto y de pulgada de dimetro.
1 tubo de PVC de 60 cm de largo y de pulgada de dimetro.
Guantes
pH metro.
Termmetro.

PROCEDIMIENTO.

Antes de realizar la pila ubique un sitio amplio y protegido del sol excesivo y la lluvia; y
genere la estructura para organizar la pila de compostaje.
Distribuya los materiales en la pila de abajo hacia arriba en el siguiente orden: pasto seco,
residuos vegetales y pasto picado, boiga de bovino o equino (esta ultima es la ms
recomendada), cal.
Coloque los materiales en capas siguiendo el orden que se presenta a continuacin:
2 cm de cascarilla de arroz seca.
6 cm de residuos vegetales en mezcla con el pasto seco.
3 cm de boiga.
Disperse una delgada capa de cal por toda la pila.
Adicione melaza diluida en agua.

21

Puede enriquecer el compostaje adicionando urea y o roca fosfrica como fuentes de N y P

adicionales.
Repita el proceso aumentando la altura de la pila hasta agotar los residuos vegetales.
Para controlar la desecacin o humedad excesiva, procure cubrir la pila o realizarla bajo
techo.
Realice volteos semanales con el propsito de airear la pila.
De igual manera controle la humedad peridicamente, la cual debe ser un poco superior a
la capacidad de campo (al tomar un puado deben escurrir algunas gotas al hacer presin
de la muestra).
Evalu cada 5 das el pH y la temperatura antes de realizar el volteo.
Para determinar el pH tome muestras a partir de varios puntos genere una muestra
compuesta y realice a partir de solucin con 2.5 partes de agua (de la misma manera que
se efecta para suelos).
La temperatura debe determinarla, considerando el promedio tomado en 3 puntos de la pila
a una profundidad media.

El compost estar listo cuando la mezcla presente color caf-negruzco y la temperatura se

haya estabilizado.

Complete la siguiente tabla segn las observaciones semanales del proceso.

SEMANA
S

COLO
R

OLOR

TAMAO
DE
PARTCU
LA

TEMPERATURA

PH

PRESENCIA
/AUSENCIA
DE HONGOS Y
ACTINOS.

1
2
3
4
5

Grafique la relacin de la temperatura y el pH en el tiempo.

Investigue las etapas del proceso de compostaje y determine la duracin de cada etapa en
este caso.

22

PRACTICA 8
AISLAMIENTO DE NEMATODOS
Los nematodos son animales invertebrados, pertenecientes al Phylum Artropoda, clase
Nematoda, la estructura que los limita se llama cutcula, esta posee 6 o 7 capas y su funcin es
la permeabilidad, igualmente poseen cabeza, en ella labios, papilas y una estructura
puntiaguda llamada estilete o diente rgano encargado de la alimentacin primordialmente,
esfago, cavidad de segmentacin y cola (Volcy C, 1977). Generalmente poseen seis estados
en sus ciclo de vida: huevo, cuatro estados larvarios y adulto, donde el primer estado larvar
ocurre dentro del huevo y cuando eclosiona, se jalla en segundo estado, y cada uno de los
cambios larvarios implica el cambio de cutcula, estilete y otros organos este proceso es
conocido como muda. Los nematodos pueden vivir en diferentes ambientes, muy fros como
tundras, desiertos, etc. En el suelo es posible encontrar diferentes grupos de nematodos como
fitopatogenos, saprofitos, predadores, micofagos y entomopatogenos entre ellas los gneros
Meloidogyne, Panagrolaimus, Seinura, Aphelechoides y Rhabditis, respectivamente. La
importancia de estos radica en la asociacin que presentan con los cultivos ya que en el caso
de Meloisogyne, causa agallas en mas de 2000 especies de plantas, asi mismo, pueden
encontrarse en el suelo siendo fauna benfica como los que atacan a hongos e insectos. Esta
practica busca familiarizar al estudiante con la obtencin de nematodos apartir de suelo y luego
brindar herramientas para el aprendizaje de la produccin de estos in situ.
Para la toma de muestra puede usar diferentes es importante tomar muestras de suelo
homogeneo, con textura, humedad y temperatura similar, en el caso de un cultivo trate de
escoger lotes pequeos y uniformes en cuanto a edad, pendiente del terreno, historia, etc. Asi,
tomando muestras del mismo tamao puede seguir cualquiera de los esquemas para el
muestreo aleatorio o estratificado (Ver Figura 8.1), en el caso de los cultivos trate de eliminar el
efecto de los bordes.

Figura 8.1. Procedimientos para toma de muestras de suelos para nematodos

Existen diferentes procedimientos para separar los nematodos del suelo como el tamizado, el
metodo de gravedad de Cobb, el metodo de la bandeja, decantacin y tamizado de Christie y
Perry, y Centrifugacion-flotacion
PROCEDIMIENTO
Obtencin de nematodos
Embudo de Bareman

Realice el montaje como se muestra en la figura 8.2, tenga en cuenta que la distancia de la
lampara sea suficiente para calentar pero no para inhabilitar a los enmatodos, agregue
agua tibia al embudo hasta la mitad, acondicione una malla dentro del embudo y sobre
esta, un papel filtro, deposite 100 gramos del suelo a analizar

23

Figura 8.2 Tcnica Embudo de Baermann.

Ubique un beaker debajo de la manguera, trate de sostener la manguera con una pinza
evitando la salida del agua y encienda la lmpara, as, estimulara la migracin de los
nematodos hacia el beaker.
Luego de 24 horas, los nematodos se encontraran en el beaker.
Realice montajes al estereoscopio agua del beaker y observe los diferentes nematodos.

Embudo de Baermann modificado

Antes de hacer el montaje anterior mezcle 200g suelos con 3 litros de agua en un
recipiente amplio, agite la suspensin y filtrele por tamices N 60, 230, 325, (apertura 250,
63, 44 respectivamente)
Los residuos obtenidos en los ltimos dos tamices se depositan en una toalla y se colocan
sobre el embudo.

Gravedad de Cobb

Coloque 1kg de suelo en un balde con 8 litros de agua, remueva la suspensin y tamice
por el tamiz N 20, recogieno el agua en otro balde y realizando el ciclo por los tamices 60,
100, 230 y 325.
Los residuos retenidos en estos tamices mezclelos y llevelos a un embudo o a una bandeja
de plstico para obtener nematodos limpios y sin partculas de suelo
Identificacion de nematodos entomopatogenos

Adicione 1ml del agua de los nematodos aislados a papel filtro, recortado en forma de
circulo dentro de cajas de petri pequea
Ubique una larva de Galeria mellonella o Spodoptera frujiperda, rotule y selle muy bien,
evitando el contacto con otros insectos durante la manipulacin, luego de 48 horas realice
diseccin de cada una de las larvas y observe los diferentes nematodos.
Realice la identificacin de los nematodos y clasifique fitopatogenos y entomopatogenos,
realizando la observacin de labios y estilete, segn la figura.

24

Grafique todos los nematodos observados en el aislamiento y analice segn las caractersticas
de suelos.
El grupo comentara la experiencia del montaje y el aislamiento.
Mediante diferentes mtodos divulgue a los dems grupos, los nematodos encontrados
parasitando al insecto.

25

PRACTICA 9
MICORRIZAS.
El trmino micorriza describe la simbiosis de ciertos hongos con races de casi la totalidad de
plantas verdes; estas asociaciones representan mltiples beneficios para la planta,
principalmente derivados del aumento del rea que las races pueden explorar para tomar los
nutrientes, otro beneficio resulta de la liberacin de compuestos orgnicos por las micorrizas
vesculo-arbusculares que solubilizan los fosfatos y los hacen en consecuencia, ms
disponibles.
Las micorrizas fueron descubiertas por el botnico alemn Frank apellido en 1885, en las
races de algunos rboles forestales; posteriomente en 1900 el francs Bernard apellido puso
de manifiesto su importancia en relacin con las orqudeas, hasta ese momento las micorrizas
eran consideradas excepciones, pero ahora se sabe que esta simbiosis no se establece con
ciertas plantas en contadas excepciones.
Aproximadamente unas 5.000 especies de hongos con carpforos (principalmente
Basidiomycetes) estn asociados a rboles forestales en regiones boreales y templadas,
estableciendo un tipo de micorriza. Los dos tipos ms comunes, extendidas y conocidas son
las ectomicorrizas y las endomicorrizas. Cada tipo se distingue sobre la base de la relacin de
las hifas del hongo con las clulas radicales del hospedador. En las ectomicorrizas el micelio
invade la raz sin entrar en el interior de las clulas, de aqu el nombre de ectomicorrizas. En
las endomicorrizas el micelio invade la raz, inicialmente de manera intercelular, pero luego
penetra en el interior de las clulas radicales, desde la rizodermis hasta las clulas corticales
(enumerarVer figura).
En esta gua se presentan las metodologas bsicas para el aislamiento de esporas y
determinacin del porcentaje de infeccin de las micorriza en la raz, las metodologas pueden
variar de acuerdo al tipo de raz, debido a que las races de especies forestales requieren ser
sometidas durante un tiempo ms prolongado a clarificacin con KOH.

MATERIALES:
completar materiales.
Alcohol de
Alcohol de
Bistur / Asa de siembra
Cmara de incubacin

PROCEDIMIENTO:
Por grupos cada uno puede trabajar diferentes especies de plantas, detrminar el numeri de
esporas y porcentaje de infeccion, posteriormente se hacen comparaciones de los valores
obtenidos.
Para el ensayo de cuantificacin de esporas debe tomar suelo rizosferico de un cultivo de
inters en la zona a una profundidad entre 10 a 20 cm.
Para la cuantificin del porcentaje de infeccin, debe 50 gramos de races aproximadamente.
Determine el pH de la muestra de suelo.
CUANTIFICACIN DEL PORCENTAJE DE INFECCION (Phillips Hayman, 1970; Konke
Gemma, 1983).

26

1) Separar races de 2do y 3er orden

2) Cortar raices en fracciones de 2 cm
3) Sumergir races en tubo de ensayo con KOH al 10%
4) Llevar a Bao Maria por 15 minutos a 1 hora (dependiendo del grosor) a 90 C
5) Revisar peridicamente hasta observar la raz transparente sin daar la corteza
6) Llevar al colador con chorro suave de agua
7) Sumergir las races pigmentadas en peroxido al 20% (H2O2) de 5 a 15 minutos
8) Lavar al chorro suave
9) Acidificar la raz sumergindola en HCl 10% por 5-15 minutos (NO LAVAR)
10) Colorear con azul de tripan 0.05%
11) Incubar a bao maria por 5 - 15 minutos
12) Extender aproximadamente 10 raices en una lamina
13) Observar al microscopio (usar glicerol y cubrir con laminillas)
14) Determinar porcentaje de colonizacin.
Para el caso de endomicorrizas se determina la infeccin teniendo en cuenta la presencia de
hifas (H), vesculas (V), arbsculos (A) y esporas (E) del hongo M.V.A. en la raz. Y con los
datos obtenidos se calcula el porcentaje de infeccin total (IT%), segn la siguiente formula:

N. de campos observados con estructuras MVA

% Infeccin Total = __________________________________________ x100
N. de campos observados
Para determinar el porcentaje de infeccin de cada una de las estructuras del hongo (MVA), se
aplica la siguiente formula:
N. de campos observados con c/u de las
estructuras de MVA
% Infeccin Total de (M.V.A) = ___________________________________________ x 100
N. total de campos observados

AISLAMIENTO DE ESPORAS: METODO DEL TAMIZADO HUMEDO Y CENTIFUGACION EN

GRADIENTE DE SACAROSA (Gerolema Nicholson, 1963)
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
13)
14)
15)
16)

Pesar 20 gramos de suelo (Suelo hmedo)

Vaciar en beaker
Agregar 200 ml de agua desionizada para disgregar
Agregar mas agua hasta completar el volumen de 800 ml, agitar vigorosamente, sin
chispee
Dejar reposar por 20 segundos
Verter sobrenadante en tamices de 400 y 38 micrmetros
Repetir los pasos anteriores tres veces
Recolectar tamizado de 38 micrmetros en tubo de ensayo
Llevar a centrifugar por 3 minutos a 2700 RPM
Recolectar precipitado
Agregar sacarosa al 50%
Centrifugar por 5 minutos a 2700 RPM
Verter sobrenadante en tamiz de 38 micrmetros
Lavar tamizado y verterlo en una caja de petri .
Observar las esporas en el esteroscopio
Recolectar esporas y conservarlas en Meizner

27

Algunas esporas encontradas en suelos del Cesar (GARCES E, et al 2006

Gigaspora ssp. (Aumento10x)

Entrophospora ssp.

Sclerocystis ssp.
Glomus ssp

Hifas Intramatricales

Hifas Extramatricales

28

Complete la siguiente tabla de resultados.

% INFECCION EN RAIZ POR ESTRUCTURA DEL
HONGO

PLANTA

h.Intra,

h. Extra

Vesiculas

Arbusc

Esporas

NUMERO Y DIVERSIDAD
DE ESPORAS EN EL
SUELO RIZOSFERICO

# Esporas/
100gr

Diversidad
Esporas/
20gr

Dibuje e identifique las estructuras observadas en el microscpio.

Discuta sobre los resultados resumidos en el cuadro.
Establezca posibles asociaciones entre las especies vegetales, las condiciones del
suelo (pH) y los datos consignados en la tabla de resultados.

29