APLICACIN DE LA GENETICA

I.- APLICACIN EN BIOTECNOLOGA

Biotecnologa. Es la utilizacin de clulas y componentes de
clulas, microbianas, vegetales y animales en cultivo para la
fabricacin de sustancias especficas.
Ingeniera Gentica, rama que se concentra en el estudio del
ADN, para su manipulacin
La constitucin gentica de los individuos se denomina
genotipo
Los rasgos observables o medibles de un individuo se
denominan fenotipo.
El fenotipo es consecuencia del genotipo.
La Ingeniera gentica busca cambiar el fenotipo
manipulando del genotipo.

II.- HERRAMIENTAS DE MANIPULACION

Mutaciones
Ingeniera gentica.
Fusin de protoplastos
ADN- recombinante: Permiten la propagacin de
secuencias de DNA de cualquier organismo mediante
su insercin en molculas de DNA de otro origen.
PCR : Tcnicas de amplificacin, que permiten la
obtencin in vitro de cantidades ilimitadas de
copias exactas de una secuencia de DNA

Mutaciones: algunas definiciones

Cualquier cambio heredable en la secuencia del material gentico se
denomina mutacin
Se denomina mutacin gentica, mutacin molecular o mutacin
puntual a los cambios que alteran la secuencia de nucletidos del
ADN.
Estas mutaciones en la secuencia de ADN pueden llevar a la
sustitucin de aminocidos en las protenas resultantes.
Las mutaciones son el origen de todos los polimorfismos heredables
Un polimorfismo es una variacin en la secuencia de un lugar
determinado del ADN entre los individuos de una poblacin.
Las mutaciones en un gen determinado crean variantes de este gen,
denominadas alelos
Los rasgos observables o medibles de un individuo se denominan
fenotipo
El fenotipo es consecuencia del genotipo

SI HAY UNA LESIN EN EL DNA

Reparacin del DNA

Proliferacin Normal

Errores en la reparacin Dao severo en

el DNA

Arresto del ciclo celular

Proliferacin anormal
-Mutaciones
- Aberraciones Cromosmicas

-Apoptsis
-Necrosis

El origen de las mutaciones

Espontneas
Debidas a procesos celulares normales
Dependen de la tasa de error de la DNA polimerasa y
de la eficiencia de los sistemas de reparacin
Suceden con baja frecuencia

Inducidas
Debidas a agentes fsicos o qumicos (mutgenos) que
daan las molculas de DNA
El tipo de dao es especfico del mutgeno
La frecuencia de mutacin es funcin de la dosis de
mutgeno

TIPOS DE MUTACIONES
Mutacin por sustitucin de bases: Se producen al cambiar un par de
bases por otro:
Transicin. cuando un par de bases es sustituido por su alternativa del
mismo tipo. Las dos bases pricas son adenina (A) y guanina (G), y las
dos pirimdicas son citosina (C) y timina (T). Ejemplo: La sustitucin de
un par AT, por un par GC.
Transversin. Cuando un par de bases es sustituida por otra del otro
tipo. Por ejemplo, la sustitucin del par AT por TA o por CG.

Mutaciones de corrimiento estructural. Cuando se aaden o se quitan

pares de nucletidos alterndose la longitud de la cadena.
Si se aaden o quitan pares en un nmero que no sea mltiplo de tres,
las consecuencias son mas graves, porque a partir de ese punto, y no
slo en l, toda la informacin queda alterada. Hay dos casos:
Delecin: en la secuencia de nucletidos se pierde uno y la cadena se
acorta en una unidad.
Insercin: Dentro de la secuencia del ADN se introducen nucletidos
adicionales, alargndose la cadena.

TIPOS DE MUTACIONES
GATCATAGATACCATGA

GATCATAGATACCATGA

GATCATAGATACCATGA
GATCATAAATACCATGA

GATCATAGATACCATGA
GATCATA
ATACCATGA
GATCATAATACCATGA

Sustitucin

GATCATAGATACCATGA
GATCATAG ATACCATGA
GATCATAGATACCATGA
GATCATAGCATACCATGA
Insercin

Delecin

EFECTOS DE LAS SUSTITUCIONES

TAC (tirosina)

TAT (tirosina)

Mutacin silenciosa
Protena silvestre
Efecto fenotpico:
Ninguno

AAC (asparragina)

TAG (terminacin)

Cambio de sentido
Sin sentido
Protena alterada en una Efecto fenotpico:
posicin
Prdida de funcin
Efectos fenotpicos:
Ninguno
Prdida de funcin
Ganancia de
funcin
Cambio de funcin

EFECTOS DE LAS DELECIONES E INSERCIONES

CON ANA SON DOS MAS

Delecin 1 pb

CON ANS OND OSM AS

Insercin 1 pb

CON ANH ASO NDO SMA S

Se provoca un cambio en la fase de lectura o

desfase
Protena alterada a partir del sitio de la mutacin
Efecto fenotpico:
Prdida de funcin

MECANISMOS ENDGENOS
1.

Prdida de bases tipo purinas por ruptura espontnea del

enlace con el azcar 5000/da/clula humana

2.

Deaminacin espontnea de citosinas y adeninas produce

uracilo e hipoxantina

3.

Daos oxidativos. Molculas con oxgenos reactivos atacan los

anillos de las bases nitrogenadas. (superxidos, perxidos y
radicales hidroxilo) que se producen durante el metabolismo
normal, el ozono y ciertas drogas pueden daar el ADN,
ejemplo,
la 8-oxi-7,8 dihidrodesoxiguanina.

Error de replicacin. La ADN polimerasa puede incorporar bases

equivocadas en la replicacin. como por ejemplo el 5-bromouracilo
o la 2-aminopurina, que se incorporan en el ADN que se replica en
lugar de las bases correspondientes timina y adenina

BASES NITROGENDAS

A.- PERDIDA DE BASE

Ocurre una delecin

B.- DESAMINACIN
La Citosina (C) por desaminacin se convierte en Uracilo (U) y el
Uracilo empareja con Adenina (A) producindose transiciones:
GCAT.
El Uracilo (U) no forma parte del ADN, existindo un enzima
llamada glucosidasa de uracilo encargada de detectar la
presencia de U en el ADN y retirarlo.

EFECTO DE DEAMINACIN

C.- DAOS OXIDATIVOS AL ADN

El metabolismo aerbico produce radicales superoxido O2, perxido
de hidrgeno H2O2 e hidroxilo.
Transformacin de Guanina (G) en 8-oxo-7,8dihidro-desoxiguanina que simula una
Adenina (A).
Esta alteracin produce transversiones:
GCTA.

La Timidina se convierte en
Glicol de timidina.

AGENTES MUTAGNICOS EXGENOS

1.

Radiaciones ionizantes: rayos gamma y rayos X

causan rupturas en la doble hlice y delecin

2.

Luz UV causa formacin de dmeros de timina

3.

Qumicos ambientales como agentes alquilantes,

deaminantes y otras sustancias qumicas forman
derivados con las bases del ADN.

A.- RADIACIN IONIZANTE

Reacciones oxidativas.
Produce iones (hidrgeno o de radicales hidroxilo
(OH) ionizados).
Estos radicales reaccionan con otras molculas de su
misma clase para formar perxido de hidrgeno
(H2O2) que puede destruir protenas y ADN.

Daos cromosmicos.
roturas fsicas lesiones cromosmicas que luego
estimulan intercambios entre partes del mismo
cromosoma o de diferentes cromosomas.

B.- RADIACIN ULTRAVIOLETA

La absorcin de rayos UV es principalmente en citosina y
timina.
La radiacin UV provoca la insercin de una molcula
de agua en el doble enlace C-C.
Cuando hay dos pirimidinas sucesivas en la misma
hlice la luz UV hace que se produzcan puente de
hidrgeno entre ambas, formando dmeros de Timina.
Tales dmeros distorsionan la hlice de DNA e impiden
su replicacin, como resultado la clula no se divide y
puede morir.

DIMEROS DE TIMINA

C.- QUMICOS AMBIENTALES

Agentes alquilantes
Etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil
sulfato(DES) , etiletanosulfonato, mostaza nitrogenada, etc.
El EMS introduce un metilo o etilo en la Guanina y produce
transiciones GCAT.

Etiletanosulfonato y mostaza nitrogenada, tambin adicionan

grupos metilo o etilo a la Guanina, haciendo que se comporte
como un anlogo de base de la Adenina.

ALQUILANTES
Introduccin de etilo en guanina y timina

DESAMINANTES
Iones bisulfito y cido nitroso.
El cido nitroso transforma la Citosina (C) en Uracilo (U), el
Uracilo (U) empareja con la Adenina (A) produciendo
transiciones.
La desaminacin de las Adenina (A) la convierte en hipoxantina
que empareja con la Citosina (C) produciendo transiciones.

Hidroxilamina aade un grupo hidroxilo(OH) al grupo amino de

la citosina, haciendo que la base sufra un cambio tautomrico.

DESANIMACIN

REEMPLAZO DE UNA BASE EN EL ADN

Los anlogos de bases son compuestos qumicos que
pueden remplazar a una base determinada.
El 5-Bromouracilo (5BU) es anlogo de la Timina (T) y
puede remplazarla.
El 5BU :
en su forma cetnica empareja con la Adenina (A)
en su forma enlica (5BU*) empareja con la Guanina (G).

5-Bromouracilo

(5BU)

REMPLAZO DE UNA BASE EN EL ADN

La 2-Aminopurina (2AP)
es anlogo de la Adenina
(A) y puede remplazarla.
La 2AP aparea con la
Timina (T).
En su forma imno (2AP*)
empareja con la Citosina
(C).
Esta alteracin produce
transiciones.

AGENTES INTERCALANTES
La Proflavina, Naranja de acridina y otros Compuestos (ICR): son
compuestos con estructuras planas que se meten o intercalan
entre las bases nitrogenadas del ADN produciendo adiciones o
deleciones de un solo par de nucletidos.

MUTGENOS QUE PRODUCEN PRDIDA DEL

EMPAREJAMIENTO ESPECFICO
Daan muchas bases nitrogenadas y producen como consecuencia
un bloqueo de la replicacin del ADN.
La mayora de los compuestos cancergenos producen este tipo de
alteraciones. Debido a la gran cantidad de alteraciones que
producen en el ADN como primera medida se produce un bloqueo
de la replicacin y se ponen en marcha un sistema de emergencia
denominado abreviadamente SOS para reparar los daos y permitir
que la clula se replique y pueda seguir viviendo.
Este sistema produce un relajamiento de la especificidad de
apareamiento de la ADN polimerasa III de E. coli.
ejemplos :
Benzopireno: es un producto resultante de los motores de
combustin y es un potente carcingeno.
Hidroxilamina (HA): produce especficamente transiciones GCAT.

REPARACIN DE DAO AL ADN

Reparacin de apareamientos incorrectos:
la reparacin de apareamientos incorrectos posteriores a la replicacin
requiere la existencia de un sistema que sea capaz de realizar las siguientes
operaciones:
Reconocer las bases mal apareadas.
Determinar cual de las dos bases es la incorrecta.
Eliminar la base incorrecta y sintetizar.
Esta reparacin la realizan los productos de los genes mutH, mutL, mutS y
mutU.

INGENIERA GENTICA
Surge en los aos 70 (siglo XX) cuando se
consigue introducir material gentico de una
especie en clulas de otra especie muy distinta.

Tecnicas:
Fusin de protoplastos
ADN recombinante (clonacin)

A.- FUSIN DE
PROTOPLASTOS

FUSIN DE PROTOPLASTOS VEGETALES

Obtencin de clulas de las dos especies que se van ha hibridar.
Aplicacin de una enzima (celulasa pectinasa) la cual destruye la
pared celular, quedando la clula desprotegida de esa membrana,
tomando el nombre de protoplastos.
Se aplican pulsos elctricos a clulas en suspensin (electroporacin)
o inducir la desorganizacin de las membranas empleando
polietilenglicol.

FUSIN DE PROTOPLASTOS
VEGETALES

Luego ocurren las uniones

de protoplastos y la mitosis
de esas uniones celulares
producen muchas clulas
lo que origina un callo.
Con ayuda de auxina y
citoquinina, se estimula el
desarrollo radicular y foliar
y forma una plantita
hbrida.
Ejemplo. La hibridacin
entre el tomate y la papa.
Papaya con naranja, etc.

La tecnologa del ADN recombinante consiste en aislar y

manipular un fragmento de ADN de un organismo para
"recombinarlo" con el de otro organismo.
En el campo de la Ingeniera gentica consiste en
aislar y multiplicar un gen, o en general, un trozo
de ADN

En Animales superiores consiste en obtener un

individuo a partir de una clula o de un ncleo de
otro individuo

Digestin con enzimas de restriccin

Ligacin en un vector adecuado (plsmido)

Inserto

Vector

Introduccin en el hospedador (E. coli)

Propagacin por divisin celular

El proceso de
clonacin
molecular
persigue la
propagacin de
una molcula de
DNA de forma
estable en un
hospedero
distinto a aquel
del que procede,
mediante su
insercin en un
replicn del
hospedero
elegido.

LAS HERRAMIENTAS DE LA CLONACIN

Enzimas para la manipulacin del DNA (Enzimas de restriccin)
Enzimas de restriccin
Ligasas
Polimerasas
Kinasas y fosfatasas
Vectores de clonacin.
a) un plsmido (fragmento extra de ADN bicatenario circular de unos
4,3 kb, que existe en algunas especies de bacterias).
b) un csmido (similar al plsmido pero de mayor longitud, unos 40
kb).

c) un virus vector ( en este caso el ADN extrao que se quiere

transferir se incorpora al ADN vrico y funciona como ADN
recombinante).

TECNOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE

Plsmido

Plsmidos
gen de resistencia
a la ampicilina

3
Extremos cohesivos

Molcula de ADN recombinante

Plsmido

Virus

Ciclo lisognico

PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa, PCR (Polymerase
Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular
desarrollada en 1986 por Kary Mullis.
Su objetivo es obtener un gran nmero de copias de un
fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo.
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN
polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea
ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las
hebras de ADN recin formadas entre s, tras cada fase de
replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse a
polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Para ello se utilizan unos oligonucletidos que se han de disear como

cebadores que inician la replicacin "in vitro.

Utilidades: realizar pruebas de paternidad o averiguar la autora de un delito;

realizar secuenciaciones de genomas (mucho ms rpido que a partir de la
clonacin en clulas), etc.

PCR
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se
desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era
necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. (95 C en las
fases de desnaturalizacin del ADN)
Hoy se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de
microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas.
Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa
Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y
Thermus termophilus (Tth).
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un
aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar
los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria
para cada etapa de la reaccin.

COMPONENTES
PCR
Para que el proceso
se lleve a cabo en el
tubo de reaccin
debemos encontrar:
a- ADN objetivo ( el
que se quiere
amplificar)
b- ADN Polimerasa
c- Deoxinucletidos
d- Primers

POLIMERASAS PCR
Para replicar el ADN, la tcnica PCR hizo uso, en un principio, de
la ADN polimerasa de la bacteria Escherichia coli. Pero esta
enzima resulta desactivada debido a la alta temperatura
requerida para desnaturalizarla doble cadena del ADN, por lo cual
deba agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada
ciclo.
Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando
se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila"
Thermus aquaticus. En efecto, la ADN polimerasa de este
microrganismo, denominada Taq polimerasa, acta
eficientemente entre los 75 C y los 80 C y resiste ms de dos
horas a 93 C.
De esta manera es posible mezclar todos los componentes de la
PCR al comenzar el primer ciclo y la reaccin en cadena puede
llevarse a cabo mediante equipos automatizados que realizarn
los ciclos trmicos programados.

PCR
En la primera etapa (desnaturalizacin) la doble hlice de ADN se
separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubacin de la
muestra a altas temperaturas (93-97C).
La renaturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya.

PCR
En el segundo paso (hibridacin) los cebadores se unen a las zonas 3
complementarias que flanquean el fragmento que queremos
amplificar.
Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65 C)

PCR
En la tercera etapa (elongacin) se produce la sntesis de una cadena
sencilla (producindose un fragmento de doble cadena por la
complementariedad) en la direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA
polimerasa, la cual incorpora los deoxinucletidos fosfato presentes
en el medio siguiendo la cadena molde.

CICLOS REPETIDOS
Al cabo del primer ciclo de tres reacciones
(desnaturalizacin, apareamiento, extensin) el tramo de
ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad
original se encuentra disponible para ser nuevamente
replicado en un segundo ciclo.
El resultado de la aplicacin de numerosos ciclos "en
cadena" da lugar a la amplificacin geomtrica del
segmento de ADN delimitado por los primers.

APLICACIONES PCR

-Biotecnologa y Ciencias agropecuarias

-Secuenciacin de ADN
-Estudios de evolucin molecular
-Diagnstico de enfermedades hereditarias
-Diagnstico de enfermedades oncolgicas
-Diagnstico prenatal

Obtencin de protenas de inters mdico, comercial, etc.

(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulacin)

Se ha conseguido obtener la vacuna de la hepatitis B mediante la tecnologa

del ADN recombinante.
El gen de la subunidad proteica del virus de la hepatitis fue introducido en la
bacteria Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces cerevisiae, las cuales
produjeron en cultivo la protena del virus.
Los anticuerpos sirven como defensa frente a enfermedades infecciosas y
sustancias extraas, pero adems son un medio de curacin para aquellos
enfermos que no son capaces de producirlos.
La tcnica de los anticuerpos monoclonales permite obtener gran cantidad
de ellos y sin impurezas; consiste en inmortalizar las clulas responsables de
su fabricacin, las clulas plasmticas que se forman por activacin de los
linfocitos B.
La forma de conseguirlo es hibridando clulas plasmticas y clulas tumorales
con capacidad para multiplicarse indefinidamente (clulas de mielomas), el
resultado son clulas hbridas llamadas hibridomas que se pueden clonar.
Cada clon (procedente de un solo hibridoma) producir un anticuerpo
monoclonal.

Las enfermedades genticas debidas a un solo gen defectuoso ascienden

a ms de 4000, de las cuales 345 afectan al cromosoma X, por lo que
sern transmitidas a los nios varones, si su madre posee uno de esos
defectos genticos.
La terapia gnica est siendo considerada la cuarta revolucin de la
medicina (despus de las medidas de salud pblica, la anestesia, y las
vacunas y antibiticos).
Para su aplicacin se siguen dos estrategias:
a) Insertar una copia sana de un gen en las clulas del paciente con
una enfermedad gentica, para compensar el efecto del gen
defectuoso
b) Introducir un gen especialmente diseado para que proporcione
una nueva caracterstica a las clulas (por ejemplo, introducir en
linfocitos un gen que produzca un inhibidor del virus del sida en pacientes
afectados por el VIH).

La clonacin en plantas se consigue sobre todo mediante la manipulacin de

cultivos celulares. La principal tcnica empleada es la propagacin vegetativa in
vitro.
Se consigue mediante la obtencin de
unos fragmentos o explantes de la planta
madre. Los explantes se colocan en un
medio de cultivo adecuado y produce un
callo (masa de clulas sin diferenciar); los
callos pueden dividirse en multitud de
fragmentos o incluso hacerse una
suspensin de clulas. En el momento que
se desee, se cambian las concentraciones
de hormonas auxina y citoquinina, esto
hace que se diferencien las clulas de los
callos con lo que originarn plantas
enteras.
Se usa para hacer ms rentables la
produccin de flores o de metabolitos
secundarios (perfumes, pigmentos, etc.)

Se trata de disparar bolitas de oro

que llevan fragmentos de ADN
adheridos, sobre una poblacin de
clulas.
Las bolitas que queden en el
citoplasma pueden transferir el
ADN que transportan a algn
cromosoma de la clula
bombardeada.
Las aplicaciones agrcolas van
desde el mejoramiento de
procesos bsicos como la
fotosntesis y la fijacin de
nitrgeno atmosfrico por parte de
las plantas, hasta la resistencia a
herbicidas, agentes patgenos y
factores de estrs (salinidad del
suelo, sequa, etc.), as como la
obtencin de productos agrcolas
de mejor calidad y caractersticas
nuevas.

Figura 6: Obtencin de una planta transgnica por transformacin biolstica

Plantas transgnicas

Agrobacterium tumefaciens es patgena de plantas.Produce tumores

Agrobacterium

ncleo
Plsmido Ti

Transgnesis= introduccin de ADN

extrao en un genoma, de modo
que se mantenga estable de forma
hereditaria.

cromosoma

inductor de
tumores
contiene
oncogenes
(genes onc)

cromosoma

Ingeniero
gentico
natural tras
sutitucin de
genes onc por
genes de
inters

clula
vegetal
tumores

Proliferacin de
hormonas
crecimiento. Se
forman tumores en
las zonas de la
lesin

Resistencia a herbicidas, insectos y enfermedades microbianas

El maz transgnico de Novartis Resistente al herbicida y al gusano
barrenador europeo (contiene el Gen de resistencia a la toxina Bt de Bacillus
thuringiensis)
Problemas:Larvas de especies de insectos predadores benficos (larvas
verdes de crisopa) murieron cuando fueron alimentadas con el gusano
barrenador europeo
Gold rice de Monsanto con color amarillo por los altos niveles de
vitamina A
Sintesis de productos de inters comercial

La obtencin de un gran numero de animales con cierta

caracterstica (producir mas leche, engordar rpidamente, producir
lana azul, etc.) . Se usan para ello dos tcnicas:
a) la disgregacin de clulas embrionarias a partir de un embrin,
de modo que cada clula separada funciona como un zigoto y
originar un animal.
b) la transferencia nuclear; sta consiste en obtener vulos
enucleados (se les ha extrado el ncleo por microsuccin) y
conseguir introducir un ncleo de una clula embrionaria o de
una diferenciada (especializada), con esta ltima modalidad se
obtuvo la famosa oveja Dolly.
Cuanto ms diferenciada est una clula ms difcil es conseguir su
reprogramacin para que funcione como un zigoto y origine un
nuevo animal.

Clonacin de animales (transferencia nuclear de

clulas embrionarias)

Aparato de microinyeccin

Clonan cerdos destinados a trasplantar sus rganos a

humanos

La empresa escocesa PPL Therapeutics

logra
retirar de los cerditos el gen que provoca el
rechazo en transplantes a humanos "alfa 1,3
galactosil transferasa"

Enero 2002. AP Photo/Roanoke Times, Gene Dalton (IDEAL-EFE)

Paso importante en favor del xenotrasplante (transferencia de clulas u rganos

de una especie a otra)

Ayudar a superar la escasez de rganos humanos para hacer trasplantes de

todo tipo

La posibilidad de clonar animales

mamferos, tanto a partir de clulas
embrionarias como de clulas
diferenciadas , abre la puerta para
la clonacin de humanos.

Clonar personas enteras est

prohibido en muchos pases y
condenado por muchas
instituciones, pero clonar tejidos
humanos con fines teraputicos es
pedido por multitud de cientficos,
sobre todo desde que se puede
dirigir la diferenciacin de clulas
madre hacia la obtencin de tejidos
concretos.
Tcnica de clonacin