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Orientadores:
Maria Helena Miguez Rocha Leo, D.Sc.
Priscilla Filomena Fonseca Amaral, D.Sc.
ESCOLA DE QUMICA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
2011
ii
iii
FICHA CATALOGRFICA
EQ/UFRJ.
Ttulo (srie)
iv
DEDICATRIA
AGRADECIMENTOS
Gostaria de deixar registrada minha gratido:
A meus pais, Rogrio e Elizeth, por todo apoio e sacrifcios que fizeram por mim,
durante toda minha vida, e pela educao que o melhor presente que recebi deles at hoje.
Ao meu irmo Rafael pelo apoio de informtica e pela pacincia e Bia por sua
amizade.
minha co-orientadora, Dra. Priscilla Amaral, por me ensinar nestes anos uma nova
carreira, por me incentivar e por manter a confiana em mim at quando eu mesmo duvidava.
minha orientadora, a Dra. Maria Helena Miguez Rocha-Leo, pela confiana e por me
dar a oportunidade de aprender mais do que eu esperava.
A Juan Pablo pelo amor e pela pacincia, durante todo o perodo de escrita da tese, pela
ajuda com o tratamento de imagens, pelos finais de semana passados comigo no laboratrio para
a realizao dos experimentos e, principalmente, pelo carinho nos momentos mais difceis.
Ao pessoal do Laboratrio 103 por me receberem de braos abertos e por me fazerem
sentir parte da equipe, pela companhia, pela pacincia e pelo incansvel interesse na procura de
hifas.
Em especial Mariana, por me ajudar com o projeto no perodo da escrita. Luana e
Kelly por me auxiliarem com as ferramentas utilizadas neste trabalho e ao Diego, por se dispor
a ajudar com as imagens.
Aos meus familiares, por entenderem a minha ausncia em certos perodos e
principalmente, a minha tia Elisa e ao meu tio Robson, que me receberam em sua casa, como
uma filha e me permitiram compartilhar de suas vidas de forma to prxima, hoje vocs so
como pais para mim.
minha prima Bianca por me ceder seu quarto durante a semana, para que eu pudesse
estar aqui no Rio em tempo integral.
famlia Botero, por me receber to bem e me incentivar a alcanar meus objetivos.
Profa Silvia Carrio da Universidade de Aveiro, Portugal, pela idia do estudo da
relao entre farnesol e dimorfismo em Yarrowia lipolytica.
Ao pessoal do laboratrio de coleptera do Museu Nacional, pela ajuda com as fotos e
a
Prof Marcela Monn, por permitir a utilizao da lupa do seu laboratrio para a obteno das
fotos de morfologia colonial.
CAPES e CNPq pelo apoio financeiro para a manuteno dos equipamentos e a
compra dos reagentes.
Enfim, agradeo a Deus, por ter me dado fora de vontade para superar todos os
obstculos e chegar at o fim dessa etapa da minha vida, para que uma nova possa comear.
vi
Resumo da Dissertao de Mestrado apresentada ao Curso de Ps-Graduao em
Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica/UFRJ como
parte dos requisitos necessrios para obteno do grau de Mestre em Cincias.
vii
de 400x. Atravs de um planejamento experimental verificou-se que a agitao utilizada
para o cultivo das clulas de Y. lipolytica influenciou de forma significativa a formao
de hifas. Agitaes inferiores induziram a formao de um maior nmero de hifas,
provavelmente devido a uma menor oferta de oxignio no meio de cultivo. Farnesol foi
adicionado aos meios de cultivo nas concentraes de 300, 600, 900 e 1200 M para a
determinao da concentrao mais eficaz para a inibio da formao de hifas. Foi
observado que o farnesol inibe o crescimento celular em Y. lipolytica. A formao de
hifas tambm foi inibida em 31,6% e esta inibio foi dependente da concentrao. Na
presena de N-acetilglicosamina como indutor, a inibio da formao de hifas por
farnesol chegou a 44,4%.
viii
Abstract of a Dissertation presented to Curso de Ps-Graduao em Tecnologia de
Processos Qumicos e Bioqumicos - EQ/UFRJ as partial fulfillment of the requirements
for the degree of Master of Science.
ix
Through an experimental design showed that agitation used for growing cells of Y.
lipolytica significantly influenced the formation of hyphae. The lower agitation speed
induced the formation of a larger number of hyphae, probably due to a reduced oxygen
supply in the medium. Farnesol was added to medium at concentrations of 300, 600,
900 and 1200 M to determine the most effective concentration to inhibit the formation
of hyphae It was observed that farnesol inhibited cell growth and hyphae formation of
Y.lipolytica. The farnesol also inhibited the formation of hyphae in 31,6% and this
inhibition was dependent of concentration. In the presence of N-acetylglucosamine as a
promoter, inhibition of hyphal formation by farnesol reached 44,4%.
x
NDICE GERAL
1 - INTRODUO................................................................................................................1
2 - OBJETIVOS...................................................................................................................4
3 - REVISO BIBLIOGRFICA...........................................................................................5
3.1. Farnesol.....................................................................................................................5
3.2.Quorum sensing....................................................................................................9
3.3. Yarrowia lipolytica...................................................................................................11
3.3.1. Dimorfismo............................................................................................................13
4 - METODOLOGIAS EXPERIMENTAIS.............................................................................18
4.1. Materiais..................................................................................................................18
4.2. Equipamentos..........................................................................................................18
4.3. Microrganismo........................................................................................................19
4.4. Preservao.............................................................................................................19
4.5. Inculo.....................................................................................................................19
4.6. Experimentos para induo da formao de hifas em meio lquido..................20
4.6.1. Descrio dos experimentos..................................................................................20
4.6.2. Meios de cultivo....................................................................................................20
4.6.3. Planejamento experimental....................................................................................21
4.7. Experimentos para induo de formao de hifas em meio slido....................22
4.8. Experimentos para inibio da formao de hifas..............................................23
4.9. Esterilizao............................................................................................................24
4.10.Mtodos Analticos................................................................................................25
4.10.1. Quantificao do crescimento celular..................................................................25
4.10.2. Determinao da concentrao de glicose...........................................................26
4.10.3. Processamento digital de imagens.......................................................................26
5 - RESULTADOS E DISCUSSES......................................................................................29
5.1. Avaliao do cultivo de Yarrowia lipolytica na presena de diferentes fontes de
carbono...........................................................................................................................29
5.2. Avaliao do efeito do soro fetal bovino no cultivo de Yarrowia lipolytica........31
5.3. Planejamento experimental:delineamento composto central rotacional
(DCCR) 22...................................................................................................................... 34
xi
5.4. Induo da formao de hifas em sistemas sob baixa rotao...........................38
5.4.1. O efeito de diferentes fontes de carbono sobre a morfologia celular de Yarrowia
lipolytica..........................................................................................................................38
5.4.2. O efeito do soro fetal bovino sobre a morfologia celular de Yarrowia
lipolytica..........................................................................................................................40
5.5. Avaliao do efeito de trans-trans farnesol no cultivo de Yarrowia lipolytica....42
5.5.1. Efeito de farnesol sobre a morfologia e o crescimento celular de Yarrowia
lipolytica na presena de soro fetal bovino.....................................................................43
5.5.2. Efeito de farnesol sobre a morfologia e o crescimento celular de Yarrowia
lipolytica.na presena de N-acetilglicosamina................................................................48
5.6. Avaliao da morfologia colonial de Yarrowia lipolytica.....................................50
5.6.1. Efeito da fonte de carbono e de soro fetal bovino sobre a morfologia das colnias
de Yarrowia lipolytica ....................................................................................................50
5.6.2. Efeito de farnesol sobre a morfologia das colnias de Yarrowia
lipolytica..........................................................................................................................53
6 CONCLUSES.............................................................................................................56
7 - SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS..................................................................58
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................................59
xii
NDICE DE TABELAS
xiii
NDICE DE FIGURAS
xiv
Figura 5.7. Foto de microscopia ptica em aumento de 400x de amostra retirada da
camada superficial do meio de cultivo sob baixa rotao...............................................37
Figura 5.8. Perfil de alongamento para as clulas de Yarroria lipolytica na presena de
glicose como fonte de carbono, nos pontos 0, 15 e 24 h do experimento realizado sob
agitao de 60 rpm ..........................................................................................................39
Figura 5.9. Perfil de alongamento para as clulas de Yarroria lipolytica na presena de
N-acetilglicosamina como fonte de carbono, nos pontos 0, 15 e 24 h do experimento
realizado sob agitao de 60 rpm....................................................................................40
Figura 5.10. Perfil de alongamento para as clulas de Yarroria lipolytica na ausncia de
glicose e na presena de 10% de soro fetal bovino, nos pontos 0, 15 e 24 h do
experimento realizado sob agitao de 60 rpm...............................................................41
Figura 5.11. Perfil de alongamento para as clulas de Yarroria lipolytica na presena de
glicose e de 10% de soro fetal bovino, nos pontos 0, 15 e 24 h do experimento realizado
sob agitao de 60 rpm....................................................................................................42
Figura 5.12. Cintica de crescimento celular de Y. lipolytica em meio YPD* com 10%
de soro fetal bovino (experimento controle) e em meio YPD*com 10% de soro fetal
bovino e diferentes concentraes de farnesol, com agitao de 60 rpm........................44
Figura 5.13. Percentagem de hifas formadas (considerando hifas as clulas com
alongamento maior que 2) nos cultivos de Y. lipolytica, sob agitao de 60 rpm, em
meio YPD* com 10% de soro fetal bovino e com diferentes concentraes de
farnesol............................................................................................................................46
Figura 5.14. Porcentagem de inibio da formao de hifas por farnesol (I) para Y.
lipolytica nos cultivos sob agitao de 60 rpm em YPD* com 10% de soro fetal bovino
e com diferentes concentraes de farnesol....................................................................47
Figura 5.15. Cintica de crescimento celular de Y. lipolytica em meio YPN com 1% de
N-acetilglicosamina (experimento controle) e em meio YPN com 1% de Nacetilglicosamina e diferentes concentraes de farnesol, com agitao de 60
rpm...................................................................................................................................48
Figura 5.16. Porcentagem de hifas formadas nos cultivos de Y. lipolytica sob agitao
de 60 rpm em meio YPN com 1% de N-acetilglucosamina e com diferentes
concentraes de farnesol................................................................................................49
Figura 5.17. Porcentagem de inibio da formao de hifas por farnesol para Y.
lipolytica nos cultivos sob agitao de 60 rpm em meio YPNcom 1% de Nacetilglicosamina e diferentes concentraes de farnesol...............................................50
Figura 5.18. Fotos digitais das colnias (A e B) de Y. lipolytica em meio slido
contendo glicose como fonte de carbono........................................................................51
xv
Figura 5.19. Foto de microscopia ptica (aumento de 400x) de Y. lipolytica em meio
slido contendo glicose como fonte de carbono..............................................................51
Figura 5.20. Fotos digitais das colnias (A e B) de Y. lipolytica em meio slido
contendo N-acetilglicosamina como fonte de carbono....................................................52
Figura 5.21. Foto de microscopia ptica (aumento de 400x) de Y. lipolytica em meio
slido contendo N-acetilglicosamina como fonte de carbono.........................................52
Figura 5.22. Fotos digitais das colnias (A e B) de Y. lipolytica em meio slido
contendo glicose como fonte de carbono e soro fetal bovino..........................................53
Figura 5.23. Foto de microscopia ptica (aumento de 400x) de Y. lipolytica em meio
slido contendo glicose como fonte de carbono e soro fetal bovino...............................53
Figura 5.24. Fotos digitais das colnias de Y. lipolytica em meio slido contendo
glicose como fonte de carbono, na presena de 600 M de farnesol..............................54
Figura 5.25. Fotos digitais das colnias de Y. lipolytica em meio slido contendo Nacetilglicosamina como fonte de carbono, na presena de 600 M de farnesol.............54
Figura 5.26. Fotos digitais das colnias de Y. lipolytica em meio slido contendo
glicose como fonte de carbono e soro fetal bovino, na presena de 600 M de
farnesol............................................................................................................................54
Figura 5.27. Fotos de microscopia ptica (aumento de 400x) de Y. lipolytica em meio
slido na presena de glicose(A), N-acetilglicosamia (B) e glicose e soro fetal bovino
(C), na presena de 600 M de farnesol..........................................................................55
Captulo 1 INTRODUO
1. INTRODUO
Yarrowia lipolytica uma levedura estritamente aerbia, no patognica,
originalmente era chamada Candida lipolytica e seu estudo tem atrado grande interesse, pois
apresenta uma grande aplicao biotecnolgica por sua capacidade de metabolizar lipdeos e
hidrocarbonetos e de excretar diversos metablitos em grande quantidade cidos orgnicos e
protenas extracelulares sendo muito usada para expresso e secreo de protenas
especficas (BARTH & GAILLARDIN, 1997).
Yarrowia lipolytica apresenta tambm a capacidade de dimorfismo, ou seja, alterar sua
morfologia celular de acordo aom as condies do ambiente. A homologia existente entre este
fungo saprfita e a espcie patognica C. albicans sugere a utilizao de Y. lipolytica para o
estudo do dimorfismo (RUIZ-HERRERA & SENTRANDEU, 2002).
O fungo dimrfico Candida albicans um dos mais importantes fungos patognicos
oportunistas do homem. Este fungo faz parte da microbiota normal do homem e de animais e
est presente de forma comensal na pele, nas cavidades oral, nasal, aural e vaginal e no trato
intestinal (PORTELA, 2006). Acredita-se que o principal fator de virulncia deste fungo est
relacionado com a sua capacidade de mudar a morfologia celular de leveduras para a forma
filamentosa. Muitos estudos tm sido realizados para estabelecer a relao entre a transio
dimrfica, a densidade celular e o sistema quorum sensing e para identificar a molcula
indutora desta transio. Segundo Hornby et al. (2001), existe uma correlao entre a
quantidade de quorum sensing molecule (QSM) produzida e o nmero de clulas presentes.
Vrios fatores predispem ao desenvolvimento da candidase, como por exemplo,
distrbios endcrinos, gravidez, deficincia de ferro, etc. No entanto, o aumento do nmero
de infeces sistmicas por fungos oportunistas se deve, principalmente, ao maior nmero de
pacientes HIV (human immunodeficiency virus), pacientes em quimioterapia e transplantados
(HUBE, 2000). Todos estes pacientes apresentam seu sistema imune debilitado, seja pela
doena que apresentam ou pelo tratamento a que so submetidos. Outros fatores que esto
relacionados so o aumento do nmero de procedimentos invasivos e o uso abusivo de
antibiticos. De qualquer modo, em todos estes pacientes a candidemia (infeco invasiva)
est relacionada com o aumento das taxas de mortalidade e um maior tempo de hospitalizao
(BLANCO, 2009).
O tratamento das infeces fngicas, principalmente as sistmicas, difcil e lento
devido grande familiaridade gentica existente entre hospedeiro e patgeno, ambos
eucariotas. Os frmacos antifngicos mais utilizados atuam na membrana celular do fungo
Captulo 1 INTRODUO
que muito similar membrana celular do homem (SILVA, 2004). Um nmero limitado de
drogas antimicticas vivel para utilizao em micoses sistmicas e, geralmente, o
tratamento realizado longo, pois as drogas so utilizadas em doses mnimas para diminuir a
sua toxicidade ao paciente.
Devido a todos esses aspectos, os fatores de virulncia dos fungos tm sido
extensivamente estudados e caracterizados com o objetivo de desenvolvimento de novos
medicamentos ou novas formas de preveno destas doenas. Geralmente, as infeces so
desencadeadas por um distrbio entre a imunidade do hospedeiro e o microrganismo
comensal. Muitos fatores esto associados virulncia de C. albicans, entre eles a produo
de enzimas hidrolticas, de adesinas na parede celular, a formao de biofilmes e a sua
mudana morfolgica. (PORTELA, 2006).
Em relao ao papel do dimorfismo como fator de virulncia, as clulas
leveduriformes esto relacionadas com a disseminao do microrganismo no ambiente, com
seu contato com o hospedeiro e com a sua disseminao pela corrente sanguinea, enquanto
que as hifas e pseudohifas so necessrias para a invaso tecidual (geralmente quando infecta
rgos), pois so mais resistentes a ao de fagcitos, portanto, ambas as formas esto
presentes na formao de biofilmes e parecem estar relacionadas virulncia. As cepas de C.
albicans que no apresentam a capacidade de formar hifas so geralmente avirulentas
(BLANCO, 2009).
A transio dimrfica em C. albicans est relacionada a diferentes condies
ambientais in vivo (Figura 1.1.). A induo do dimorfismo in vitro pode ser realizada
pela adio de indutores ao meio de cultivo como o soro fetal bovino, N-acetil glucosamina,
prolina, pela exposio da levedura a pH neutro/alcalino temperatura de 37C e presena
de CO (BLANCO, 2009).
A levedura Yarrowia lipolytica tambm apresenta a habilidade de formar hifas. Em
cepas selvagens esta habilidade pode proporcionar uma vantagem seletiva quando submetidas
a condies de estresse, facilitando a obteno de nutrientes (GANCEDO, 2001; KAWASSE
et al., 2003).
Y. lipolytica um fungo capaz de crescer em meios de cultura simples e complexos,
apresentando dimorfismo naturalmente, formando clulas leveduriformes, pseudo-hifas e
hifas septadas (BARTH e GAILLARDIN, 1997).
Captulo 1 INTRODUO
Transio morfolgica
Temperatura, prolina, glicose
pH, soro, N-acetilglicosamina
concentrao celular, Zn....
Figura 1.1. Dimorfismo em Candida albicans. (A) blastosporos; (B) tubos germinativos; (C) formao de hifas
a partir do crescimento apical de tubos germinativos; (D) miclios; (E) blastosporos secundrios separados dos
filamentos. Adaptado de MOLERO et al., 1998.
Captulo 2 OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
O objetivo principal da presente dissertao reside no emprego de farnesol, uma
molcula quorum sensing na inibio da formao de hifas pela levedura dimrfica
Yarrowia lipolytica em meios lquido e slido visando estudar o seu efeito sobre o
dimorfismo.
3. REVISO BIBLIOGRFICA
3.1.
Farnesol
Farnesol (C15H26O) um lcool sesquiterpeno constitudo por trs unidades de
al., 2004) e o cido farnesico (OH et al., 2001). O farnesol no excretado por C.
albicans em condies de anaerobiose estrita (MOSEL et al., 2005).
Ensaios de bioatividade com 40 anlogos do farnesol mostraram que 22 deles
inibiram a transio dimrfica em C. albicans, apesar do ismero trans (E,E farnesol)
apresentar a maior atividade QSM (SHCHEPIN, 2003).
Alm da sua funo QSM, a molcula de farnesol, em C. albicans, tambm
confere proteo ao estresse oxidativo, incluindo perxido de hidrognio e geradores de
superxido e, possivelmente desempenha um papel protetor contra fagcitos
(WESTWATER et al., 2005).
Farnesol tambm atua promovendo a apoptose (morte celular programada) em
Aspergillus nigger e em Fusarium graminerum, atravs da induo da produo de
espcies reativos de oxignio (ERO) (SEMIGHINI et al., 2006, 2008).
Ramage et al. (2002) estudaram a inibio da formao de biofilme por farnesol
em C. albicans e constataram que a uma concentrao de 300 M o farnesol pode
alterar drasticamente a densidade e a morfologia do biofilme formado por esta levedura.
Com a diminuio da concentrao de farnesol, o biofilme formado apresentou um
maior nmero de hifas e pseudohifas. Alm disso, Ramage e seus colaboradores
observaram que aps o incio da formao de hifas, elas no podem ser inibidas pela
adio do farnesol e a subseqente formao de biofilme no afetada. Portanto,
segundo os autores, a propriedade antibiofilme do farnesol pode ser melhor utilizada em
estratgias de preveno do que em estratgias de tratamento de infeces.
Em 2001, Hornby et al. isolaram a QSM farnesol de seis cepas de C. albicans e
observaram que a mxima produo de farnesol ocorreu a 37C, quando as celulas se
encontravam na sua forma micelial e que a molcula manteve-se estvel a temperatura
de 100C, por 30 minutos, e foi resistente autoclavao. A molcula indutora foi
produzida em um amplo intervalo de temperatura de crescimento desta levedura (23 a
43C). A sua produo foi constante durante todo o crescimento das clulas e
proporcional massa celular e foi indiferente fonte de carbono (foram testadas
glicose, sacarose, amido, glicerol, galactose e frutose) ou de nitrognio e ao indutor
utilizado. Alm disso, sua estabilidade foi mantida por 3 anos a 4C. Horbny et al. (op.
cit.) tambm observou que a produo de farnesol ocorre tambm no corpo humano,
durante a candidase.
Figura 3.2. Modelo simplificado da rota Efg1-dependente de induo da formao de hifas em Candida
albicans. (DAVIS-HANNA et al., 2008).
entanto, aps 90 minutos, a inibio das hifas foi nula. Uma vez que a formao de hifas
tenha sido iniciada, a adio de farnesol ser ineficaz para inibi-las.
3.2.
Quorum sensing
Em 1960, com o grande interesse dos pesquisadores pelas bactrias
10
3.3.
11
Yarrowia lipolytica
mitocondriais
afetados
por
altas
concentraes
de
glicose
12
13
e fungos filamentosos podem degradar leo cru, mas algumas cepas de Y.lipolytica so
as melhores degradadoras, pois conseguem degradar a poro aliftica do leo cru.
Y. lipolytica no produz etanol, mas pode utiliz-lo como fonte de carbono em
concentraes at 3%. Altas concentraes de etanol so txicas para esta levedura
(BARTH & GAILLARDIN, 1997).
Algumas espcies de leveduras exibem dimorfismo, ou seja, a habilidade de
alternar, reversivelmente, entre duas formas morfolgicas: clulas ovides e hifas
bastante alongadas. O dimorfismo tem sido estudado como um fator importante para seu
crescimento e sua proliferao (SZABO, 1999).
Y. lipolytica pode ser usada como modelo de diferenciao celular pelas suas
propriedades dimrficas. possvel obter uma populao quase homognea de
leveduras ou de miclios atravs da manipulao das condies de crescimento. Isto
inclui a fonte de carbono, componentes especficos, como o citrato ou soro, e o pH do
meio (GUEVARA-OLVERA et al., 1993; RUIZ-HERRERA & SENTANDREU, 2002;
SZABO & STOFANKOV, 2002).
3.3.1 Dimorfismo
Figura 3.3. Imagens de microscopia ptica de Y. lipolytica em aumento de 400x, apresentando clulas na
forma leveduriforme (A) e na forma de hifas (B).
14
est
diretamente
relacionado
sua
virulncia.
(SZABO
&
TOFANKOV, 2002).
Entre
os
fungos
patognicos
dimrficos
esto
Candida
albicans,
15
16
mitocondriais
bloqueiam
formao
de
hifas
em
Mucor
spp.
(FRIEDENTHAL et al., 1974). O mesmo resultado foi obtido por Szabo (1999), que
aplicou Antimicina A, um inibidor da transferncia de eltrons da coenzima Q reduzida
para o complexo III (citocromo-c redutase), em culturas de Y. lipolytica, indicando que
o processo de converso de energia e o metabolismo de carbono podem estar envolvidos
na formao de filamentos.
Szabo (1999) mostrou que o pH do meio afeta fortemente a morfologia de
clulas de Y. lipolytica, mas apenas na presena de uma fonte de nitrognio complexa,
sugerindo que as clulas respondem mais a alteraes nutritivas do meio com diferentes
valores de pH do que ao prprio valor de pH. Em um estudo posterior, Szabo &
tofankov (2002) comprovaram a importncia da presena de fontes de nitrognio
orgnico no efeito do pH na morfologia celular de Y. lipolytica em meios lquido e
slido.
17
18
4. METODOLOGIAS EXPERIMENTAIS
4.1.
Materiais
Os componentes dos meios de cultivo utilizados foram: Peptona e Extrato de
lvedo (Oxoid - Hampshire, UK), Dextrose (Quimibrs R.J., Brasil), Etanol P.A.
(Sigma-Aldrich CO, MO, USA ) e Agar bacteriolgico (Vetec R.J., Brasil).
O Soro Fetal Bovino foi obtido de Sigma-Aldrich CO (MO, USA), assim como,
N- Acetilglucosamina e Tran-Trans Farnesol, 96% .
4.2.
Equipamentos
Os equipamentos utilizados nos experimentos e nas anlises foram:
4.3.
19
Microrganismo
A levedura empregada no presente trabalho foi uma cepa selvagem de Yarrowia
Figura 4.1. Imagem obtida a partir de microscpio tico de uma amostra contendo Yarrowia lipolytica
IMUFRJ 50682 (aumento de 400x).
4.4.
Preservao
As clulas foram conservadas a 4C aps 48 horas de crescimento em tubos de
ensaio com meio YPD (Yeast Extract, Peptone, Dextrose) contendo (em p/v): extrato
de lvedo 1%, peptona 2%, glicose 2% e agar-agar 2%.
4.5.
Inculo
A partir dos tubos contendo as clulas preservadas em meio slido YPD
(descrito no item 4.4) inoculou-se, de forma estril com uma ala de platina, 200 mL de
meio de cultivo YPD em erlenmeyers de 500 mL (Tabela 4.1). Aps cerca de 48 horas
em um incubador rotatrio (shaker) a 28C, 160 rpm, a absorvncia (570 nm) de uma
amostra deste cultivo foi determinada para a determinao da concentrao celular e,
em seguida as clulas eram centrifugadas de forma estril a 3.000 g por 10 minutos e
20
21
Tabela 4.1. Composio do meio de cultivo dos experimentos para induo da formao de hifas em
meio lquido.
Meios
Glicose
Peptona
Meio YPD
Meio YPD*
Meio YP
Meio YPN
2%
1%
0
0
1%
0,64%
0,64%
0,64%
Extrato de
Lvedo
1%
1%
0,50%
0,50%
N- Acetil
glucosamina
0
0
0
0,50%
22
Variveis
Soro Fetal Bovino (%)
Agitao (rpm)
-1,41
0
60
-1
1,74
74,5
Nvel
0
6
110
1
10,26
145,5
1,41
12
160
Tabela4.3. Experimentos gerados pelo software Statistics 7.0. Cdigo das variveis independentes do
planejamento experimental 2k, com k = 2
4.7.
Ensaio
Agitao
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
-1
-1
1
1
0
0
0
0
-1,41
1,41
-1
1
-1
1
0
0
-1,41
1,41
0
0
23
Meios
Meio YPD
Meio YPD/
SFB
Meio YPN
Glicose Peptona
2%
2%
2%
2%
Extrato
de
Lvedo
1%
1%
2%
1%
N- Acetil
glucosamina
gar
bacterolgico
0
0
Soro
Fetal
Bovino
0
10%
1%
2%
2%
2%
Figura 4.2. Semeadura por esgotamento em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias
24
desejada. Alm disso, o mesmo volume do diluente puro (etanol) foi utilizado nos
experimentos controle (sem adio de farnesol). As condies de cultivo foram as
mesmas descritas anteriormente. Foram utilizados Erlenmeyers de 500 e 250 mL, com
200 e 100 mL de meio de cultivo agitados a 60 rpm, a 28C por 24 h.
Para os cultivos em meio slido foram utilizadas placas de petri contendo o meio
slido, que foram incubadas em estufa a 28C por 48 h. Foram retiradas amostras dos
meios lquidos para determinao de crescimento celular e para a anlise da morfologia
em 0, 15 e 24 h de experimento. Nos meios slidos, a morfologia colonial foi registrada
com cmera fotogrfica digital e a morfologia celular foi observada em microscpio
ptico. Todos os experimentos foram realizados em duplicata, visando
reprodutibilidade dos resultados.
Meios
Meio Lquido
Meio Slido
Farnesol (M)
300/ 600/ 900/
1200
600
4.9 Esterilizao
Todos os componentes do meio de cultivo foram esterilizados em autoclave a
0,5 atm por 15 minutos. O soro fetal bovino (estril) foi manipulado em capela de fluxo
laminar para ser adicionado ao meio de cultivo.
Os erlenmeyers, as ponteiras, os tubos de centrfuga e outros instrumentos
utilizados no manuseio do meio de cultivo foram esterilizados em autoclave a 1 atm por
15 minutos.
25
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
y = 1,8819x
R = 0,9908
0,1
0,2
0,3
26
mtodo,
absorvncia
da
reao
enzimtica
medida
em
espectrofotmetro a 500 nm, contra o branco de reao, que composto apenas pelo
Reagente Enzimtico. Tomam-se alquotas de 15 L de amostra e completa-se com
1500 L de Reagente Enzimtico. Aps a homogeneizao, incuba-se por 10min a
37oC, sendo a absorvncia da amostra e do padro mensuradas em no mximo 60
minutos.
O padro de glicose pertencente ao kit enzimtico possui uma concentrao de
100 mg.dL-1 e o Reagente Enzimtico contm: tampo fosfato (pH 7,5) 100 mmol.L-1;
4-aminofenazona 0,25 mmol.L-1; Fenol 0,75 mmol.L-1; Glicose oxidase 15000 U.L-1;
Peroxidase 1500 U.L-1; Mutarotase 2000 U.L-1.
O clculo de concentrao de glicose realizado atravs da equao 4.1:
Aa
C 100 *
Ap
(4.1)
onde:
Aa = Absorvncia da amostra;
Ap = Absorvncia do padro;
C = concentrao de glicose na amostra (mg.dL-1)
27
Figura 4.4. Sequncia da binarizao. (A) imagem RGB obtida com microscpio ptico; (B) imagem em
preto e branco; (C) imagem binarizada.
28
comprimento das hifas e a sua largura, ou seja, a razo entre Fmax e Fmin (KAVASSE
et al., 2003), como mostra a equao 4.2:
F max
..................................................................................................... (4.2)
F min
Figura 4.5. Valores de alongamento para diferentes tamanhos de clulas de Yarrowia lipolytica.
29
RESULTADOS E DISCUSSES
Com o objetivo de estudar a morfologia celular de Yarrowia lipolytica,
5.1
diferentes fontes de carbono foi realizado um estudo do seu cultivo em meio contendo,
como fonte de carbono, 1% de glicose e em meio com 1% de N-acetilglicosamina, sob
agitao de 160 rpm em agitador rotatrio.
possvel observar na Figura 5.1 que, no meio contendo glicose como fonte de
carbono, houve um crescimento celular durante 8 h muito similar ao crescimento no
meio contendo N-acetilglicosamina. A variao da concentrao de biomassa nos dois
meios de cultivo foi praticamente a mesma. Na presena de N-acetilglicosamina pode
ser observada uma pequena fase lag (1 h). Isso deve-se, provavelmente, a uma
30
adaptao das clulas ao meio com esta fonte de carbono, j que, inicialmente, no meio
de inculo, as clulas foram cultivadas em meio contendo glicose. Na Figura 5.1 isso
facilmente observado quando comparamos com o crescimento em glicose, onde no
houve necessidade de adaptao das clulas e no apresenta, portanto, fase lag.
1,9
N-acetiglicosamina
ln X
1,4
glicose
0,9
0,4
-0,1
Tempo (h)
Figura 5.1. Cintica de crescimento celular de Y. lipolytica na presena de diferentes fontes de carbono.
Fonte de Carbono
Glicose
N- acetilglicosamina
(h-1)
0,282 0,02
0,251 0,01
31
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
Tempo (h)
Figura 5.2. Cintica de consumo de glicose extracelular para o cultivo de Y. lipolytica em meio contendo
glicose como fonte de carbono.
5.2
miclio (KIM et al., 2000; PREZ-CAMPO & DOMINGUEZ, 2001). Para avaliar o
seu efeito sobre Y. lipolytica (IMUFRJ 50682) foram realizados estudos sobre o
crescimento celular e a morfologia, durante 8h de cultivo, a 160 rpm. O meio de cultivo
utilizado para estes experimentos foi meio YPD* (contendo 1% de glicose). Foram
32
realizados experimentos controle (isento de soro fetal bovino) e com 10 % de soro fetal
bovino.
Os resultados obtidos mostram que o soro fetal bovino afetou ligeiramente a
formao de biomassa quando comparamos com o resultado obtido no meio isento deste
indutor (Figura 5.3). A taxa especfica de crescimento celular foi menor no cultivo
contendo soro fetal bovino. Isto provavelmente ocorre pois as clulas precisaram de
uma maior fase de adaptao (fase lag) ao soro fetal bovino, o qual pode apresentar
constituintes mais complexos para o metabolismo da levedura. Entre os constituintes do
soro fetal bovino esto: albumina, globulina e uria. (CULTLAB, bula. Disponvel em
http://www.cultilab.com.br/paginas/meiotransf. Acesso em 04 mar. 2011).
2
10% SFB e glicose
ln X
1,5
Glicose
0,5
0
0
-0,5
Tempo (h)
Figura 5.3. Cintica de crescimento celular de Y.lipolytica em meio contendosomente glicose e em meio
com 10% de soro fetal bovino e glicose.
33
2
SFB e glicose
ln X
1,5
SFB
0,5
0
-0,5
Tempo (h)
Figura 5.4. Cintica de crescimento celular de Y. lipolytica na presena de 10% de soro fetal bovino
(SFB) em meios com e sem glicose.
Fonte de Carbono
Glicose
Soro fetal bovino
SFB e Glicose
(h-1)
0,282 0,02
0,152 0,05
0,192 0,05
34
11
10
9
7
6
5
4
3
2
1
0
Tempo (h)
Figura 5.5. Cintica de consumo de glicose extracelular para o cultivo de Y. lipolytica na presena de
10% de soro fetal bovino.
5.3
35
formao de hifas, foi utilizado o parmetro aumento relativo de hifas (H), aqui
definido segundo a equao 5.1:
H max H 0 h
H 0h
(5.1)
Tabela 5.3 Matriz do planejamento experimental DCCR 2 , com os valores codificados e reais e os
resultados experimentais
2
Ensaio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
a
Agitao
Cdigo
-1
1
-1
1
0
0
-1,41
1,41
0
0
Valor (rpm)
74,5
145,5
74,5
145,5
110,0
110,0
60,0
160,0
110,0
110,0
Ha
5,13
0,03
4,13
1,17
0,70
0,65
5,81
0,86
0,89
1,40
36
(1)Agitao (rpm)(L)
-16,9357
Agitao (rpm)(Q)
1Lby2L
9,600412
3,380731
2,068835
,9611087
p=,05
Efeito Estimado (valor Absoluto)
Constata-se que para Y. lipolytica 583 (IMUFRJ 50682) o fator que exerce maior
influncia para a formao de hifas a agitao, que pode ser devido baixa tenso de
O2. Em condies de operao com elevada agitao, a concentrao de oxignio
dissolvido maior, e como j foi mencionado na reviso bibliogrfica, Y. lipolytica
um microrganismo estritamente aerbio. Portanto, apresenta-se predominantemente na
forma oval quando submetido a altas agitaes.
OShea & Walsh (2000) estudaram a morfologia da levedura Kluyveromyces
marxianus var. marxianus em diferentes condies de cultivo, atravs do tratamento de
imagens, e constataram que esta levedura apresentava sua morfologia primria na forma
oval e esta morfologia aparecia principalmente em condies ideais de substrato e
37
Figura 5.7. Foto de microscopia ptica em aumento de 400x de amostra retirada da camada superficial do
meio de cultivo sob baixa rotao.
38
quantidades de miclio formadas sob a ao do soro foram iguais s obtidas com Nacetilglicosamina.
Tendo sido observado que Y. lipolytica formou maior nmero de hifas quando
submetida a baixas agitaes, os experimentos para a formao de hifas foram
realizados a 60 rpm. importante lembrar que foram consideradas hifas clulas com
alongamento superior a 2,0, como mostrado anteriormente na Figura 4.5.
5.4
39
<1,5
70
1,5-2,0
60
>2,0
% objetos
50
40
30
20
10
0
0
10
15
20
25
Tempo (h)
Figura 5.8. Perfil de alongamento para as clulas de Yarrowia lipolytica na presena de glicose como
fonte de carbono, nos pontos 0, 15 e 24h do experimento realizado sob agitao de 60 rpm.
40
60
1,5-2,0
% objetos
50
>2,0
40
30
20
10
0
12
16
20
24
Tempo (h)
41
uma vez que este componente pode estar sendo usado pela levedura como fonte de
carbono.
% objetos
<1,5
1,5-2,0
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
>2,0
12
16
20
24
Tempo (h)
Figura 5.10. Perfil de alongamento para as clulas de Y. lipolytica na ausncia de glicose e na presena
de 10% de soro fetal bovino, nos pontos 0, 15 e 24 h do experimento realizado sob agitao de 60 rpm.
% objetos
42
70
<1,5
60
1,5-2,0
50
>2,0
40
30
20
10
0
0
10
15
20
25
Tempo (h)
Figura 5.11. Perfil de alongamento para as clulas de Y. lipolytica na presena de glicose e de 10% de
soro fetal bovino, nos pontos 0, 15 e 24 h do experimento realizado sob agitao de 60 rpm.
5.5
43
adio de soro fetal bovino). O critrio para a escolha dos meios de cultivo, assim como
a agitao, foi a maior formao de hifas.
A soluo alcolica contendo farnesol foi adicionada aos meios YPD* (+ SFB) e
YPN em quantidade suficiente para se obter as seguintes concentraes finais de
farnesol: 300 M ,600 M ,900 M e 1200 M . A adio de farnesol foi feita no incio
do cultivo e os ensaios foram realizados a 28C, por 24 h. Acompanhou-se o
crescimento celular durante o cultivo e amostras para o processamento digital de
imagens para avaliar a morfologia das clulas foram retiradas em 0, 15 e 24 h de
cultivo.
A anlise quantitativa da morfologia celular a partir dos valores de alongamento
obtidos pelo processamento digital de imagens foi realizada atravs da porcentagem de
hifas formadas (considerando hifa as clulas com alongamento maior que 2,0) ou do
parmetro porcentagem de inibio da formao de hifas por farnesol (I). Este
parmetro foi obtido atravs da equao 5.2, segundo Chiller et al. (2000):
100
(5.2)
44
constatado atravs da taxa especfica de crescimento celular, que foi de 0,127h-1 para o
experimento a 60 rpm e 0,192 h-1 para para o experimento realizado a 160 rpm.
Muitos trabalhos na literatura mostram que a agitao e a aerao so muito
importantes para o metabolismo e o crescimento celular de Y. lipolytica. Inclusive a
aerao do meio afeta tambm a produo de lpase. Corzo & Revah (1999) realizaram
experimentos em erlenmeyers de 250 mL com volumes de meio de cultura de 30, 50 e
100 mL, com o objetivo de avaliar a influncia da disponibilidade de oxignio. A
produo de lipases foi melhor em maiores volumes de meio de cultura, devido menor
oxigenao do meio.
300M
600M
900M
1200M
ln X
controle
0
0
-1
10
12
14
16
18
20
22
24
Tempo (h)
Figura 5.12. Cintica de crescimento celular de Y. lipolytica em meio YPD* com 10% de soro fetal
bovino (experimento controle) e em meio YPD* com 10% de soro fetal bovino e diferentes
concentraes de farnesol, com agitao de 60 rpm.
45
Tabela 5.4. Concentrao final de clulas obtida aps 24h de crescimento em diferentes concentraes de
farnesol.
Farnesol
(M)
controle
300
600
900
1200
a
[Xf]a
(g/L)
5,11
2,73
2,67
2,50
1,73
46
% Hifas
50
40
30
20
0
300
600
900
1200
Farnesol(M)
Figura 5.13. Percentagem de hifas formadas (considerando hifa as clulas com alongamento maior que
2,0) nos cultivos de Y. lipolytica sob agitao de 60 rpm em meio YPD* com 10% de soro e com
diferentes concentraes de farnesol, aps 24h de experimentos.
47
40
I (%)
30
20
10
0
300
600
Farnesol(M)
900
1200
Figura 5.14. Porcentagem de inibio da formao de hifas por farnesol (I) para Y. lipolytica nos cultivos
sob agitao de 60 rpm em meio YPD* com 10% de soro fetal bovibo e com diferentes concentraes de
farnesol.
.
48
controle
3
300
600
ln X
0
0
-1
10
15
20
25
Tempo (h)
Figura 5.15. Cintica de crescimento celular de Y. lipolytica em meio YPN com 1% de Nacetilglicosamina (experimento controle) e em meio YPN com 1% de N-acetilglicosamina e diferentes
concentraes de farnesol, com agitao de 60 rpm.
49
% Hifas
40
30
20
0
300
600
Farnesol(M)
Figura 5.16. Porcentagem de hifas formadas (considerando hifa as clulas com alongamento maior que
2,0) nos cultivos de Y. lipolytica sob agitao de 60 rpm em meio YPN com 1% de N-acetilglicosamina e
com diferentes concentraes de farnesol, aps 24h de cultivo.
50
50
I (%)
40
30
20
150
300
450
Farnesol(M)
600
Figura 5.17. Porcentagem de inibio da formao de hifas por farnesol (I) para Y. lipolytica nos cultivos
sob agitao de 60 rpm em meio YPN com 1% de N-acetilglicosamina e com diferentes concentraes de
farnesol
.
5.6.
5.6.1. O efeito da fonte de carbono e de soro fetal bovino sobre a morfologia das
colnias de Yarrowia lipolytica
Foram avaliadas a utilizao de diferentes fontes de carbono (glicose e Nacetilglicosamina) e a ao de soro fetal bovino sobre a morfologia colonial de Y.
lipolytica em meio slido. A composio dos meios de cultivo est listada na Tabela
4.4. do captulo metodologias experimentais. As fotos da morfologia colonial e da
morfologia celular foram registradas aps o cultivo de Y. lipolytica em meio slido em
placas de petri por 48h em estufa a 28C. Em todos os experimentos controle (sem
farnesol) foi adicionado um volume de etanol equivalente ao utilizado para adio de
farnesol nos experimentos.
possvel observar na Figura 5.18 que na presena de glicose as colnias
apresentam colorao branca, aspecto rugoso e bordas bem definidas. Houve formao
de hifas em pequena quantidade aps 48 h de cultivo, o que provavelmente deve-se
necessidade das clulas de buscar os nutrientes no meio slido. Microscopicamente,
observa-se hifas e muitas clulas ainda na forma oval (Figura 5.19).
51
Figura 5.18. Fotos digitais das colnias (A e B) de Y. lipolytica em meio slido contendo glicose como
fonte de carbono.
Figura 5.19. Foto de microscopia ptica (aumento total de 400x ) de Y. lipolytica em meio slido
contendo glicose como fonte de carbono.
52
Figura 5.20. Fotos digitais das colnias (A e B) de Y. lipolytica em meio contendo N-acetilglicosamina
como fonte de carbono.
Figura 5.21. Foto de microscopia ptica (aumento de 400x) de Y. lipolytica em meio contendo Nacetilglicosamina como fonte de carbono.
Quando soro fetal bovino foi utilizado como indutor da formao de hifas,
associado glicose, as colnias apresentaram-se brancas, mas no apresentam bordas
definidas, como possvel notar na Figura 5.22. Nota-se facilmente que houve uma
grande formao de hifas areas e exibindo o fentipo que se assemelha a aparncia de
algodo. Portanto, o efeito do soro fetal bovino na formao de hifas em meio slido foi
bastante significativo. Atravs da microscopia possvel notar que praticamente todas
as clulas apresentam-se como filamentos (Figura 5.23).
Perez-Campo & Dominguez (2001) observaram que as colnias de Y. lipolytica
na presena de soro apresentavam crescimento de filamentos invasivos em agar e estas
colnias possuam tambm o aspecto de algodo.
A
A
53
B
A
Figura 5.22. Fotos digitais das colnias (A e B) de Y. lipolytica em meio contendo glicose como fonte de
carbono e soro fetal bovino como indutor da formao de hifas.
Figura 5.23. Foto de microscopia ptica (aumento de 400x)) de Y. lipolytica em meio contendo glicose
como fonte de carbono e soro fetal bovino como indutor da formao de hifas.
54
Figura 5.24. Foto digital da colnia de Y. lipolytica em meio slido contendo glicose, na presena de 600
M de farnesol.
Figura 5.25. Fotos digitais das colnias de Y. lipolytica em meio slido contendo N-acetilglucosamina,
na presena de 600M de farnesol.
.
Figura 5.26. Fotos digitais das colnias de Y. lipolytica em meio slido contendo glicose como fonte de
carbono e soro fetal bovino, na presena de 600M de farnesol
55
Figura 5.27. Fotos de microscopia ptica (aumento de 400x) ) de Y. lipolytica em meio slido contendo
glicose (A), N-acetilglucosamina (B) e glicose e soro fetal bovino (C) na presena de 600 M de
farnesol.
CAPTULO 6 CONCLUSES
6.
56
CONCLUSES
CAPTULO 6 CONCLUSES
57
7.
58
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
8.
59
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
60
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
61
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
62
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
63
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
64
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
65
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
66
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