Introduccin

al
Desarrollo de mtodos
en HPLC

Discutiremos:
Etapas en el desarrollo de un mtodo

Objetivos

Recoleccin de informacin

Eleccin del instrumental

Preparacin de la muestra

Seleccin del modo

Optimizacin del la fase mvil

Columnas y solventes para fase reversa y normal

Uso del gradiente

Optimizacin del mtodo

Derivatizacin

Etapas del Desarrollo de Mtodos

Recopilacin
de Datos y
Objetivos del
Anlisis

Validar el
Procedimiento

Determinar las
necesidades de
Instrumental

Optimizar la
Separacin

Preparacin de
la muestra

Seleccionar la
Columna y las
Condiciones
Iniciales de la
Separacin

Objetivos del Anlisis

Anlisis o Recuperacin?
Ser necesaria la identificacin?
Separar todos o slo algunos de los componentes?
Qu precisin (RSD) se requiere?
Qu equipamiento est disponible?
Qu personal hay disponible?
Muchas o pocas muestras?

Informacin de la Muestra
Cuntos compuestos hay en la muestra?
Estructura qumica
Pesos moleculares
Solubilidad
pKas de los compuestos
Espectro UV de los compuestos
Cul es el rango de concentracin de los compuestos?
Dilucin
Concentracin
Cul es la matriz de la muestra?
Remover sustancias interferentes
Material particulado

Necesidades de Instrumental
Suministro de Solventes
Capacidad Isocrtica o de Gradiente
Sistemas Binarios, Ternarios o Cuaternarios
Rango de Flujos
Volumen del sistema extracolumnar

Sistema de Datos
Asistencia por
Computadora
Si el anlisis UV no es el
apropiado
ndice de Refraccin
Detector Fluorescencia
Detector Electroqumico
Derivatizacin
Detectores de masa

Preparacin de la Muestra

Objetivo
Obtener los compuestos de inters libres de interferencias en un solvente apropiado a las concentraciones
apropiadas.

Muestras Slidas
Disolver la muestra en la fase mvil siempre que sea posible
Si la muestra es insoluble en la fase mvil, disolverla en un fase ms dbil
Filtrar la muestra para eliminar slidos

Muestras Lquidas
Inyectar directamente si es posible, pero puede ser necesario:
o Filtracin
o Dilucin
o Concentracin
o Reconstitucin

Tcnicas Especiales
Clean-Up automatizado de la muestra
Preconcentracin en columna
Heart-cutting

Muestra - Pretratamiento
Disolver y
Filtrar

Muestra Slida

Matriz
Desconocida

Datos de
la Matriz

Muestra
Lquida

Matriz
Compleja

Dilucin
Filtracin
microdilisis*
Liofilizacin*

Preparacin
de la
Muestra

Extraccin Lquido-lquido*
Extraccin fase slida (SPE)*
Precipitacin-centrifugacin*
Filtracin

Seleccin del Modo

Criterios

Peso molecular / Tamao

Solubilidad en agua / Polaridad
Carcter inico
Separacin de homlogos / benzlogos
Separacin de ismeros
Separacin de funcionalidades

10

Modos de Cromatografa Lquida

Tipos de compuestos
separados

Modo

Fase
estacionaria

Fase mvil

Neutros
cidos dbiles
Bases dbiles

Fase Reversa

C-18, C-8, C-4,

C-2

Inicos, Bases, cidos

Par inico

C-18, C-8

Compuestos insolubles
en agua.
Ismeros Orgnicos

Fase Normal

Slica, Amino,
Ciano, Diol

Orgnicos

Inicos.
Iones Inorgnicos

Intercambio
Inico

Intercambio
Aninico /
Catinico

Buffer acuoso

Slica,
Poliestireno

Filtracin por geles

acuoso
Permeacin por geles
orgnico

Compuestos de alto PM. Exclusin por

Polmeros
tamao

Agua / Orgnico
Algunas veces
modificadores
Agua / Orgnico
Reactivo par-inico

11

Otros Modos de Separacin

Tipos de
compuestos
separados

Modo

Fase
estacionaria

Fase mvil

Protenas
desnaturalizar

Fase Reversa

Agua / Orgnico
C-4, C-3, 300
tamao de poro cido
tricloroactico

Protenas

Interaccin
hidrofbica

Butilo, Fenilo

Acuoso
Gradiente Salino

Anticuerpos,
Inhibidores

Afinidad

Ligantes
especficos

Sal acuosa

Quiral

Orgnico / Agua

Enantimeros d,l Quiral

12

Seleccin del Modo

13

14

Rellenos

15

Tratamiento de Silanoles Residuales Fases

Recubiertas y Protegidas Estricamente
Protegidas estricamente
(no recubiertas)
R
O

Si
R

OH

* Si

Si

* Si

* Si

* Si

CH3

* Si

OH

Si
R

* Si

CH3

* Si

CH3

* Si

* Si

CH3

CH3
CH3

CH3

CH3

CH3
CH3

R
O

* Si

CH3
CH3

CH3

CH3

* Si

CH3
CH3

CH3
CH3

CH3
OH

CH3

CH3
CH3

CH3

R
OH

CH3
OH

Convencional
(recubierta)

CH3

CH3

R
O

ODS Clsica
Convencional
(no recubiertas)

* Si

CH3

* Puede producirse hidrlisis cida de la unin

16

Orden de Retencin para HPLC en

Fase Reversa

17

Separacin de Pptidos en
Diferentes Fases Unidas
300 SB-C18

300 SB-C8
Condiciones:

300 SB-C3

Columnas:
ZORBAX 300SB, 4.6 x 150mm
Fase Mvil: Gradiente, 0 - 26% B in 30min.
A = 0.1% TFA En Agua
B = 0.1% TFA En Acetonitrilo
Temperatura: 40C
Muestra:
2g de cada peptido
Velocidad de Flujo:
1.0 mL / min.
Deteccin:
UV-210nm

300 SB-CN

18

Fases Estacionarias Fase normal

Si

CH3
Si (CH2)n C
CH3

La mejor opcin para el desarrollo del mtodo de fases

normales.

CH3
Si O Si CH2 CH
CH3
OH

CH2 OH

Ms polar

H
Si

La mejor para ismeros

CH3
Si O

Si (CH2)n NH
2
CH3

Selectividad alternativa

Ventajas de las Fases ligadas:

No se necesita controlar el
agua
Es posible una elucin en
gradiente
La columna se equilibra
rpidamente
Amplia variedad de seleccin
de polaridades
Alta capacidad
Los picos no forman colas
como con slo slica

19

Orden de Retencin en fase normal

Ketonas
Aldehidos
Esteres
O

Acidos

C NH2
Amidas

C OH

Nitro

O
Alcoholes
Aminas

Halgenos

OH
NH2

C H

NO2

F, Cl

Hidrocarburos
Aromticos

CH3

Eteres

O
C OR

R O R

Polaridad
Mayor Retencin
El grupo funcional ms polar, determina la retencin
20

Generalidades en la Optimizacin de la
Fase Mvil

Definir la fuerza ptima del solvente para que

1 < k < 20
Realizar un estudio isocrtico en etapas de 20% comenzando con un 100% orgnico.
Determinar a travs del gradiente la mejor composicin de la fase mvil
Para muestras dificultosas intentar:
Modificadores
Optimizacin en tringulo
Optimizacin asistida por computadora

21

Solventes utilizados para HPLC en

Fase reversa

Agua/Buffer
Metanol
Acetonitrilo
Isopropanol
Tetrahidrofurano

Fuerza de
elucin

22

Capacidad Composicin de la fase mvil

Weaker Solvent Composition

mAU

60%
Acetonitrile
40% Water

10

Time (min.)

Stronger Solvent Composition

La forma ms importante y sencilla de cambiar

el factor de capacidad es modificando la
composicin de la fase mvil:

Incrementando la fuerza de la fase mvil

disminuye el factor de capacidad..

Para Fase Reversa, un incremento en el

10% de componente orgnico disminuye
k' para cada pico cromatografico en un
factor de 2 o 3.

mAU

80% Acetonitrile
20% Water

10

Time (min.)

23

Efecto de la Fuerza del Solvente en

la Separacin de la Banda

24

Parmetros que afectan a la selectividad

Cambios en la
composicin de la fase
mvil

Stronger
Solvents

Weaker
Solvents

IPA/Water

ACN/Water

DECREASING

MeOH/Water

INCREASING

Cambios en la fase estacionaria

Not
Easily
Overloaded

Easily
Overloaded

C-18

C-2

Low Organic
Stationary Phase

High Organic
Stationary Phase

25

Efecto de la Fase Mvil en el Espacio

de Banda (Selectividad)
BP

65% MeOH
7 mM phosphate

N
P DPP

Ac

50% ACN
7 mM phosphate

BP

Muestra de 7 componentes
Zorbax XDB-C8

DPP

N
Ac

A DPP & N
BP

38% THF
7 mM phosphate

u = uracilo
P = propranolol
BP = butilparabeno
DPP = dipropilftalato
N = naftaleno
Ac = acenafteno
A = amitriptilina

Ac

26

Fuerza de Elucin Fase normal

Fuerza de Elucin de la
Slica
fluoroalcano
-0.20
n-pentanos
0.00

Solvente

n-hexano

0.01

1-clorobutano

0.20

benceno

0.20

xileno

0.24

cloroformo

0.26

tolueno

0.28

Cloruro de metileno

0.32

Acetato de etilo

0.38

tetrahidrofurano

0.44

acetonitrilo

0.50

metanol

0.70

27

Pautas para un Mtodo Robusto de

HPLC

Solvente de Inyeccin
Utilizar la fase mvil
Usar solventes para la muestra que no sean ms fuertes que la fase mvil
Inyectar < 20 L salvo cuando el solvente sea < 50% de la fuerza de la fase mvil

Factor de Capacidad
Ajustar la fuerza de la fase mvil para que 1 < k < 20

Fase Mvil
Utilizar aditivos para controlar la ionizacin y la forma de los picos

Seleccin de la Columna
Use un guardacolumna apropiado para alargar la vida til de la columna

Test de Robustez
Chequear la columna, fase mvil y otras variables antes de comenzar a utilizar el mtodo como
rutina.

28

Separacin de cidos Dbiles

O
R C O H + H2O
Mayor retencin

O
R C O H
Bajo pH

O
R C O + H3O+
Menor retencin

O
R C O
y
O
R C O H
pH =
pKa

O
R C O
Alto pH

29

Retencin en Funcin del pH

10
9
8

O
R C O H

Dbilmente bsico

5
4

Dbilmente cido

3
2

O
R C O

1
0
2

pH = pK

pH

30

Fase Reversa para Par Inico en HPLC

para cidos y Bases Fuertes
Fase Unida

Reactivo de Par- inico

SO Na+

Muestra

+
SO
3

H2PO4

R
N

+
R

O
O C R

Separe las bases con:

Alquil Sulfonatos
Acido Triflouroactico (TFA)
Acido Heptafluorobutrico
(HFTBA)
Acido Hexanosulfnico

Separe cidos con:

AlquiltrietilaminaCuaternaria
Trietilamina (TEA)
Fosfato de Tetrametilamonio
(TMA)
Fosfato de Tetrabutilamonio
(TBA)
Acetato de Triethilamonio
(TEAA)
Nonilamina

31

32

Uso del gradiente de elucin Resolver problemas

Poca resolucin en los
primeros picos de la elucin.
Incremento en el ancho del
pico y disminucin en la
altura en los picos tardos de
la elucin.
Largo tiempo de anlisis
debido a un amplio rango
en k.
Contaminacin de la
columna con compuestos
muy fuertemente retenidos.

Elucin isocrtica La composicin de la fase mvil se mantiene

constante a lo largo del tiempo que toma para eluir a la muestra.

33

Elucin en gradiente La solucin

Elucin en gradiente La composicin
de la fase mvil cambia durante la
separacin.
Ventajas
Mejora la resolucin
Aumenta la deteccin
Tiene la capacidad de separar
muestras complejas.
Tiempos de anlisis cortos
Disminuye el deterioro de la
columna causado por componentes
fuertemente retenidos.

Otros Usos
Limpieza de la columna
Exploracin de corridas en el
desarrollo de mtodos

34

% Org

Qu ocurre durante la corrida por

gradiente?

Incremento del % de modificador

orgnico

100

Cambio de particin en la fase mvil

k'

75
50

Incremento de la velocidad
del componente

25
0
0

10

20

30

Time (min)

35

Desarrollo del gradiente Optimizacin

del gradiente del solvente
Empezar con una corrida exploratoria Un largo gradiente de aproximacin

100%

5%
Orgnico

Se tendr que determinar:

Los solventes orgnicos
La composicin inicial
El tiempo del gradiente
La pendiente del gradiente

Orgnico

La conformacin del gradiente

El caudal
La longitud de la columna
El tiempo de re-equilibrio de la
columna

36

Seleccin de la pendiente del gradiente

Empinado

100% B

100% B

tG = 5

tG = 20

0% B

0% B
100% B

100% B

tG = 10

tG = 40
0% B

0% B
0

Poca pendiente

10

10

20

30

min.

40

37

Optimizacin del Solvente a travs de la

Elucin por Gradiente
Uso de Rutina del Gradiente de
Elucin
La muestra tiene un rango de k > 20
La muestra tiene ms de 10-15
componentes

Ventajas de la Elucin por

Gradiente en el Desarrollo de
Mtodos
Menos intentos que un estudio
isocrtico sistemtico
Los primeros y ltimos picos que
normalmente se pierden son fcilmente
identificados
Proporciona datos para un anlisis por
gradiente si es necesario

38

Primer Resultado
El resultado de la primera corrida puede ser:
Sin picos/respuesta

Poca separacin entre los picos

Concentracin muy baja

Tipo de deteccin equivocada

Inyectar una concentracin mayor

O un menor volumen sin la columna

Cambiar la fase mvil

Respuesta positiva
No

Si

Optimizar el sistema
Revisar el sistema del HPLC

39

Optimizacin en Visin General

La optimizacin debe ser sistemtica, eso quiere decir que cada
parmetro debe ser cambiado paso a paso.
SOLO SE DEBE CAMBIAR UN PARAMETRO POR
CORRIDA!!
El objetivo es obtener la mejor separacin en el menor tiempo de anlisis.
Optimizar

la fuerza del solvente

Flujo
Temperatura
Largo de la columna
Fase estacionaria*

40

Separacin Isocrtica o en Gradiente?

40
38

7.43
7.89

3.86

= 10%

COMPOSICION DEL
SOLVENTE (%B)

Cambio

2.61

Primer Pico = 28%

Ultimo Pico = 38%

4.70

8.23

Si el cambio en %B desde el primero hasta el ltimo pico es

< 15%B, entonces la elucin isocrtica le ahorrar tiempo.

7.11

1.95

25

28

5.70
6.04

30

5.31

4.40

35

La elucin Isocrtica
es posible usando
agua/acetonitrilo

41

Dependencia de la Resolucin de k, N, y
Initial

Varia
k'

Se incrementa
N

Se modifica

Rango del gradiente, pendiente

Velocidad del flujo, tamao de partculas, longitud

de la columna

Temp., Fase Estacionaria, pH, comp. fase mvil

42

Desarrollo Sistematico de mtodos

1.

2.

3.

3.

4.

Elegir una columna para el punto de partida (dimetro, longitud, tamao de partculas - 4.6 x
250 mm, 5m
Usar un tamao de poro apropiado
Usar un pH bajo hace que se necesiten ciertas condiciones en la fase
mvil para las primeras corridas.
Optimizar k (retencin)
Rango de Gradiente, tiempo, pendiente
Fase mvil cambio mnimo
Optimizar la recuperacin:
Solubilizar la muestra
Efectos de la temperatura
Efectos de la fase unida
Modificadores orgnicos
Optimizar (selectividad)
Temperatura
Fase unida
pH (en ltima instancia)
Optimizar N (condiciones de la columna)
Velocidad del flujo
Longitud
Tamao de partculas

43

44

Evolucin de las columnas

y el Instrumental

1200barInstruments

SuperficiallyPorous
Particles120A,2.7m
1.8m
Particles
Microbore
CapillaryColumns
15mm
Length

Partculas ms pequeas
Mayores presiones
1000barInstruments

HighTempwith
Steric Protection
400barInstruments

SuperficiallyPorousParticles
300A,5m

Narrowbore
150m
NonPorousParticles
Length

5m
Particles

10m
Particles

3.5m
Particles

Monolith

250mm
Length

SuperficiallyPorous
Particles 40m

45

Caractersticas
Fase ligada determina la selectividad y robustez en diferentes condiciones.
Dimetro interno Capacidad de carga de muestra, flujo (Consumo de
solvente), sensibilidad y robustez.
Tamao de poro Seleccin basada en el tamao de la molcula, 80-120
para molculas pequeas y 300 para protenas y pptidos.
Tamao de partcula Eficiencia y resolucin
Largo de la Columna resolucin versus velocidad de anlisis.

46

Por qu usar diferentes columnas?

1. Necesidad de detectar compuestos con una cantida limitada de muestra
2. Necesidad de ahorro de solventes.
3. Necesidad de separaciones ms rpidas
4. Necesidad de separaciones ms eficientes
Mejor resolucin y deteccin.

47

Columnas de diametro Pequeo y

Microcolumnas

Conventional

dp= 10 m

1.00 mL/min

4.6 mm
dp= 5 m
4.6 mm

10

Microbore
2.1 mm

0.01 mL/min

dp= 5 m

or
1.0 mm

100 mm

200 mm
0

Ventajas:
Disminuye el consumo de solvente
Bueno para trazar un anlisis si la cantidad
de la muestra es limitada.
Fcil cambio de conversin de la velocidad
del flujo

Desaventajas:
La instrumentacin debe tener muy poco
volumen extra en la columna.
Los Frits deben cambiarse ms
frecuentemente.

48

10

Uso de las Columnas con diametros menores

para Tamao de muestra Limitado
4.6 mm ID

2.1 mm ID

Tiempo de Retencin, min.

07

Tiempo de Retencin, min.

Inyeccin de 2 L en cada columna

49

Nmero Aproximado de Platos tericos (N) y el

Volumen muerto (Vm) para Columnas de 3.5 y 5 m
Reduciendo el largo de la columna (N) y el tamao de las partculas (N)
simultneamente usted puede:
Mantener la resolucin
Reduccin del tiempo de anlisis
Reduccin del uso del solvente
Column Size
4.6 x 250 mm
4.6 x 150 mm
4.6 x 150 mm
4.6 x 75 mm
4.6 x 50 mm
4.6 x 30 mm
4.6 x 15 mm

Particle Size
5- m
5- m
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution
3.5- m Rapid Resolution

Plate Number (N)

20,000
12,000
20,000
10,000
6,000
3,600
2,000

Void Volume (Vm)

2.5 mL
1.5 mL
1.5 mL
0.75 mL
0.5 mL
0.3 mL
0.15 mL

50

Incrementar la Velocidad de Anlisis,

Mientras se Mantiene la Resolucin
5 m

3.5 m

Dimension 250 x 4.6 mm 150 x 4.6mm

40%

5 m

150 x 4.6 mm 75 x 4.6 mm

Analysis
time (min)

30 min Reduccin18 min

18 min

Solvent
Waste (mL)

30 mL

18 mL

20,000

40%

18 mL

Reduccin

20,000

Sin cambios

3.5 m

50%

9 min

Reduccin

9 mL

50%
Reduccin

12,000

10,000

Diferencia del 9%

51

Longitud de la Columna Largo y Resolucin

SB-C18
4.6 x 15 mm
Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100
Columnas: Zorbax SB-C18, 3.5 m
Fase Mvil: 1 mM cido sulfnico octano, Na salt, pH 2.5 : ACN (80:20)
UV: 275 nm;
Flujo: 2.0 mL / min.; 70C
Iny Vol: 1 L

4.6 x 50 mm

Absorbance

4.6 x 30 mm

4. Acetanilida
5. Aspirina (cido acetosaliciico)
6. cido Saliclico
7. Fenacetina (acetofenetidina)

Muestra:
1. Acetaminofenol (4-acetamidofenol)
2. Cafena
3. 2-Acetamidofenol

4.6 x 75 mm

4.6 x 150 mm

min

52

Instrumentacin Especializada

Todos los mdulos estn diseados para resistir

presiones hasta 600 bar.
Menor volumen en las caeras extracolumnares y
opciones de celda de flujo
Detector con velocidad de datos mayores a 80 Hz.

53

Curvas de Van Deemter para diferentes tamaos de partcula

H=

+C

0.0030

0.0025

5.0m

HETP(cm)

0.0020

0.0015

3.5m

0.0010

1.8m

0.0005

0.0000
0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

VolumetricFlowRate(mL/min)
Smallerparticlesizesyieldflattercurves,higherflowrates
withsameefficiency.

54

Efecto de partculas ms pequeas

H=

+C

Ladistancia dedifusin sereducepor partculas maspequeas.

Elensanchamiento debido altrmino Csereduceproporcionalemnte a dp2.
LaDiffusion deEddysereducedebido aunacomodamiento ms compacto.
Elensanchamiento debido altrmino Asereduceproporcionalmente adp.

55

Comparaciones entre las Columnas Estndar y

las de Rpida Resolucin HT
1

4.6 x 250 mm, 5m

Estndard

A
1

Resolucin rpida
4.6 x 150 mm, 3.5m

B
1
2

5
3

Resolucin Rpida
4.6 x 75 mm, 3.5m

C
1
2

5
3 4

6 7

Resolucin Rpida
4.6 x 50 mm, 3.5m

5
2

3 4

6 7

RRHT

Resolucin Rpida
HT
4.6 x 50 mm, 1.8m

E
0
Columnas:
Nmeros de
Partculas:

10

12 min

ZORBAX Eclipse XDB-C18 Fase Mvil:

73% MeOH, 27% 20mM Buffer de Fosfato, pH 7.0

A) 990967-902
B) 963967-902
C) 966967-902
D) 935967-902
E) 925975-902

Velocidad de Flujo:1 mL/min

Temperatura:
Ambiente
Deteccin:
UV 254 nm
Muestra:
1) uracilo, 2) naproxeno, 3) cido mefanmico, 4) butil paraben,
5) propranolol, 6) naftaleno, 7) dipropil ftalato

56

Transferencia de Mtodos de Columnas

< 2 Micrones

Longitud.

L1 L2

dp1 dp2

Escala de la inyeccin del volumen.

Vinj1 Vinj2

L1dp1 L2dp2

Aumentar la velocidad del flujo para obtener la ventaja de una curva

ms favorable de Van Deemter para tamaos de partculas menores.
Resulta un incremento en la presin.

Incrementar la temperatura, si es posible.

.
57

Efectos del volumen extracolumnar

Resolution 0.961

mAU
400

Peakwidth 0.037 min

300
200

Peakwidth 0.038 min

100
0
0.5

1.5

2.5

min

Resolution 1.902

mAU
300
250

Peakwidth 0.019 min

200
150
100

Peakwidth 0.018 min

50
0
0.5

1.5

2.5

min

58

Frecuencia de adquiscin en UHPLC

The data rate of the detector (time constant) needs to be fast enough
to accommodate narrow UHPLC chromatographic peaks.
PW=0.30sec

80Hz

80Hz versus 20Hz

30% Peak Width
+ 30% Resolution
+ 40% Peak Capacity
+ 70% Apparent Column Efficiency

PW = 0.33 sec

40Hz
PW=0.42sec

80Hz versus 10Hz

55% Peak Width
+ 90% Resolution
+ 120% Peak Capacity
+ 260% Apparent Column
Efficiency

20 Hz
PW=0.67sec

10Hz
PW=1.24sec

5Hz
0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

min

59

Requerimientos de presin incrementados

dp
(m)

P
(bar)

HMIN
(m)

5.0

14.5

10.0

25,000

3.0

66.9

6.0

41,000

1.5

531

3.0

83,000

1.0

1800

2.0

125,000

0.75

4270

1.5

166,000

0.50

14400

1.0

250,000

For a 5.0 to 0.50 m particle size reduction:

N increases 10-fold
But P increases 1000-fold

60

Poder de rango
The Power Range of an instrument is its combined
flow rate and pressure capability.

bar
1200

Agilent 1290
(planned, MVS 1000bar @2ml/min)

Power = Pressure x Flow

Rate

1000

800

600

Agilent RRLC
400

200

Standard LC
0
0

ml/min

61

62

Derivatizacin Pre-Columna
Ventajas y Desventajas

Ventajas

Las condiciones de reaccin se eligen libremente

La derivatizacin puede servir como paso de purificacin
La reaccin de derivatizacin puede ocurrir lentamente
El exceso de reactivo puede ser removido

Desventajas
Pueden aparecer artificios y picos mltiples
La reaccin debe ser muy reproducible
La separacin pude resultar ms dificultosa

63

Derivatizacin Pre-columna

64

Derivatizacin
Aminocidos Primarios y Secundarios usando o-ftalaldehdo y 9-Fluorenilmetilcloroformato a
temperatura ambiente
CHO

+HNR

+ H2 NR
=

CH
2 -O-C-Cl

CHO

HS(CH2 )2COOH
60SEC/RT

60SEC/RT

SR

NR
CH
2 -O-C-NR
=

240

ALA

PRO

GLY

220

ARG
SER

THR

GLU

180

LEU

200

ILE

VAL

PHE

140

EX/EM: 266/3135

LYS
TRP
TRY

80

ORN

100

HIS

ASP

MET

120

EX/EM: 230/455

mV

160

60

10

Tiempo (min.)

15

20

Columna: 200 x 4.6mm Hypersil-ODS, 5 m

Fase Mvil: A = 0.03M NaAc + 0.25% THF(pH
7.5)
B = CH3CN/0.1M NaAc (4:1)
Flujo: 1 ml/min
Gradiente: 3% a 40% B en 20 minutos
Temperatura de Reaccin: Ambiente
Temperatura de Columna: 46 C
Deteccin: Fluorescencia HP1046
Excitacin: 230 nm
Emisin: 455 nm
Despus de 16 minutos:
Excitacin: 266 nm
Emisin: 315nm
65

65

Derivatizacin Post-Columna
Ventajas y Desventajas

Ventajas
Pueden utilizarse varios detectores simultneamente
La generacin de artificios es menor
No se necesita el desarrollo de nuevas separaciones

Desventajas

La reaccin debe ser rpida

Ocurrir dispersin adicional
La reaccin debe tener lugar en la fase mvil
El agente derivatizante no debe aumentar el background

66

Derivatizacin Post-columna

67

Derivatizacin
Grupo Funcional Reactivo
-NH
o-Ftalaldehdo
-NHR
9-Fluorenilmetilcloroformato
-COOH
p-Bromofenilacil bromuro
2-Naftacil Bromuro
-OH
Fenilisocianato
-CHO, -CO
2, 4-Dinitofenilhidracina
-CO-COOH
2, 4-Dinitrofenilhidracina

68

Lo logramos!

69

Como seguimos?

Desarrollo

Validacin

Transferencia

70

71

72