Resumen Lab de Bioqumica

Practica #1 Azucares Reductores

Determinacin de azcares reductores con la prueba de Benedict
Reduce al cobre de Cu++ a Cu+, que reacciona y produce precipitado coloreado.
Cu++ + azcar reductor
Cu+
Cu+ + OH
Cu(OH) (precipitado amarillo)
2 Cu(OH)
H2O + Cu2O (precipitado rojo ladrillo)
Cuadro de Resultados en la Prueba Benedict
Pruebas Positivas

Resultado

Azcar ms Abundante

Glucosa 200 mg/dL

+4 (Rojo Ladrillo)

Glucosa

Glucosa 100 mg/ dL

+3 (Naranja)

Glucosa

Suero

+3 (Naranja)

Glucosa

Fructosa 200 mg/dL

+2 ( Verde con precipitado

amarillo)

Fructosa

Lactosa 200 mg/dL

+3 (Precipitado Naranja)

Glucosa

Leche (1:10)

+2 (Precipitado Amarillo)

Glucosa

Leche deslactosada (1:10)

+3 (Precipitado Naranja)

Glucosa

Prueba Negativa

Resultado

Sacarosa 200 mg/dL

Almidn 200 mg/dL

Determinacin colorimtrica de glucosa con reactivo enzimtico

La glucosa presente en la muestra es oxidada por la glucosa oxidasa (GOD), produciendo cido
glucnico y H2O2, el cual reacciona con la 4-aminoantipirina (4-AAP) y el fenol para producir
una quinonimina de color rojo, que absorbe a 546nm.
Frmula Concentracin de Glucosa
[Glucosa]Muestra (mg/dL) =

AbsMuestra
[ Glucosa ] Patrn ( mg/dL )
AbsPatrn

 Cuadro Comparativo Benedict vs Determinacin Enzimtica

Benedict

Determinacin Enzimtica

Se forma Color

Se forma Color

Mtodo Qumico

Mtodo Enzimtico

Semicuantitativo

Muy Preciso

Mucha cantidad de Volumen (mL)

Poca Cantidad de Volumen (L)

Temperatura de Ebullicin

Temperatura 37C

Prctica #2 Espectrofotometra
Principio bsico del espectrofotmetro y manejo adecuado
Blanco: Contiene todo menos lo que se va a medir (muestra)
Espectrofotmetro: Mide la luz transmitida y calcula la absorbidas
Usar una misma cubeta para minimizar error por diferencia entre ellas; medir primero las de
menor concentracin, escurrir en papel toalla entre medidas, lavar cubeta al finalizar

Espectro de Absorcin
Como es el Grfico: Abs vs longitud de onda (nm)
Pico de Absorcin: Longitud de onda a la cual la Abs es mayor
Soluciones de compuestos absorben a diferente longitud de onda segn su color
Solucin de color absorbe ms la luz del color complementario

Recta o curva de calibracin y Ley de Beer

Cmo es el grfico: Abs vs concentracin (mM, g/L), es recta y se curva al final
Se escoge la longitud de onda de mayor absorcin (pico)
Ley de Beer: A = c l Abs aumenta con concentracin y longitud de la cubeta (1cm); =
coeficiente de absortividad molar
Ley de Beer (cuacin de la recta):y= mx+b:
y= Abs
x= Concetracin
m=pendiente ( l)
La ley de Beer solo se cumple en el rango de concentracin en que la curva de calibracin ES
RECTA (rango lineal, linealidad).

Clculo de concentracin de una incgnita midiendo su Absorbancia:

[Incgnita mg/dL)=

AbsIncognita
[ Patrn ]
AbsPatrn

Practica #3 Protenas
La desnaturalizacin de una protena incluye la prdida de su estructura tridimensional, aunque
normalmente no se rompen los enlaces peptdicos. Esto implica tambin la prdida de su
funcin.
Son causas frecuentes de desnaturalizacin los cambios de pH o de fuerza inica y el aumento
de la temperatura
Precipitacin de protenas con sulfato de amonio
Las protenas se disuelven porque forman numerosos puentes de hidrgeno con el agua del
entorno. Al aumentar la concentracin salina del medio, la sal requiere de muchas molculas de
agua para disolverse, de forma que las retira de la superficie de las protenas. Esto provoca una
fuerte disminucin de su solubilidad, lo que lleva a su precipitacin.
[Protenas] Muestra (mg/dL) =

AbsMuestra
[ Proteinas ] Control ( mg/dL )
AbsPatrn

Determinacin de la concentracin de protenas por diferentes mtodos

Mtodo Biuret: se basa en la reaccin del sulfato de cobre con compuestos que tengan dos o
ms enlaces peptdicos, en medio alcalino. El producto es un compuesto de color violeta, que
absorbe alrededor de 540nm
Este mtodo es adecuado para determinar concentraciones de protenas similares a la
concentracin en suero (5,8 8,0 g/dL)
Frmula Calculo Concentracin:
AbsMuestra
[ Proteinas ] Control ( mg/dL )
[Protenas] Muestra (mg/dL) =
AbsPatrn
Mtodo Verde Bromocresol: La forma aninica del verde de bromocresol se une
especficamente a la albmina, cambiando de color. El producto es un compuesto de color azul,
que absorbe alrededor de 625nm.
Este mtodo es adecuado para determinar concentraciones de albmina similares a la
concentracin en suero (3,5 6,0g/dL)
Frmula Calculo Concentracin:
[]
AbsMuestra
[ Albuminna ] Control ( mg/dL )
[Albumina] Muestra(mg/dL) =
AbsPatrn
Determinacin de protenas por absorbancia a 280nm: los aminocidos aromticos tirosina y
triptfano absorben la luz ultravioleta alrededor de 280nm, lo cual se aprovecha frecuentemente
para detectar la presencia de protenas en una muestra y estimar0su concentracin. Este mtodo
es particularmente til durante la cromatografa en columna, para la purificacin de protenas

 Frmula Calculo Concentracin:

[Protenas] Muestra (mg/dL) =

AbsMuestra
[ Proteinas ] Control ( mg/dL )
AbsPatrn

Separacin de protenas: electroforesis de acetato de celulosa

La albmina es normalmente la banda ms prominente y la que corre ms rpido en direccin
al nodo (+)

Prctica#4 Cintica Enzimtica

Determinacin de la actividad de la enzima colinesterasa srica
Sustrato que por accin enzimtica genera un producto color amarillo
Se realizaron diversos mtodos:
1. Observacin del curso de la reaccin en el tiempo: En el caso de la colinesterasa, se observar
el incremento de la absorbancia a lo largo del tiempo.
Conforme aumenta el tiempo tambin aumenta el sustratro transformado en producto.
Mientras el aumento de la absorbancia sea lineal, el tiempo de la reaccin ser adecuado para
determinar la actividad en las condiciones especificadas para el experimento.

 Grfico: Abs450nm vs Tiempo de Reaccin

2. Efecto de la concentracin de enzima: Aumenta la velocidad de Reaccin y por consiguiente

aumenta la concentracin de enzima
Se mide la absorbancia a tiempo 0 y nuevamente cuando ya ha transcurrido 1 minuto
Para calcular la actividad (U/mL):
Act (U /mL) =Abs 450 nm en 1 minuto 23,7
Grfico: Actividad (U/mL) vs Cantidad de enzima (suero)

3. Efecto de la Concentracin del Sustrato: La velocidad de la reaccin aumenta segn se

incrementa la concentracin de sustrato presente, si las dems condiciones permanecen
constantes. Sin embargo, esto ocurre hasta cierto punto en el cual ya no aumenta la velocidad
(velocidad mxima, Vmax) aunque se incremente la concentracin de sustrato. Se dice entonces
que la concentracin de sustrato es saturante.

 Grafico de Michaelis-Menten: Actividad (U/mL) vs Concentracin de Sustrato

Grfico Lineweaver-Burk: 1/Actividad (U/mL) vs 1/Concentracin de Sustrato

Este grfico se utiliza para calcular el Km y el Vmax

4. Efecto de la Temperatura: La velocidad de las reacciones siempre aumenta con la temperatura,

ya que aumenta la energa cintica de las molculas reactantes. Lo mismo ocurre con la
velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Sin embargo, si la temperatura aumenta en
exceso, la enzima puede desnaturalizarse y perder su funcin, descendiendo drsticamente la
actividad.
Grfico: Actividad (U/mL) vs Temperatura C

5. Efecto del pH La velocidad de la reaccin es ptima en cierto rango de pH. Por encima y por
debajo de este pH ptimo, la enzima va perdiendo su conformacin nativa ptima y, por tanto,
su actividad
La eleccin del tipo de buffer tambin es un factor determinante en la ptima actividad de las
enzimas, al igual que en su estabilidad. Tambin es importante tener en cuenta que, tanto el pH
como la composicin del buffer podran interferir con el mtodo de determinacin de la
actividad, y alterar los resultados.
Grfico: Actividad (U/mL) vs pH

6. Efecto de
Inhibidores
Muchas
molculas, al estar presentes en el medio, pueden disminuir velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas. Estos inhibidores actan de diversas formas, unindose a la enzima y
modificando su estructura de forma reversible o irreversible o evitando que se una al sustrato.
Entre los diferentes tipos de inhibicin, destacan la competitiva y la no competitiva
La saturacin Enzimtica es cuando la actividad llega a mantenerse constante
Prctica #5 Purificacin y Extraccin de ADN
Pasos Generales para una extraccin de ADN
1. El primer paso para la extraccin de ADN es lisar o romper las clulas que lo contienen
2. Posteriormente, se utilizan solventes orgnicos para disolver los lpidos y desnaturalizar
protenas, de manera que estos componentes contaminantes puedan ser eliminados.
3. Seguidamente la adicin de sales y etanol a la disolucin provoca una fuerte disminucin de la
solubilidad del ADN y su precipitacin, lo que permite concentrarlo.

1.
2.
3.
4.

Funciones de los reactivos en la extraccin de ADN

Detergentes como SDS o perclorato: Sirve para romper las paredes y las membranas celulares
EDTA y Proteinasa K: Inactivan las nucleasas y eliminar proteinas contaminantes
Etanol: Disminucin de la Solubilidad del ADN
Cloroformo: Disolver lpidos y protenas

Entre las propiedades de los nucletidos que componen los cidos nucleicos, se encuentra la de
absorber la luz ultravioleta alrededor de 260nm
Ya que en la extraccin de ADN se trata de eliminar todas las protenas contaminantes de la
muestra, se debe corroborar una baja presencia de estas en el ADN final. Puesto que la mayora
de las protenas absorben a 280nm, se puede utilizar la relacin Abs260 / Abs280 para estimar si
la muestra de ADN est contaminada con protenas
Las molculas de cidos nucleicos estn cargadas negativamente de forma natural y uniforme

 Se utiliza el gel de Agarosa para separar fragmentos de ADN con diferencias entre 500 y 1000
pares de bases.
Las molculas de ADN se van a mover gracias a la corriente elctrica, a travs de los poros del
gel, segn su tamao: las molculas pequeas (menor cantidad de pares de bases) se mueven
ms y las grandes (mayor cantidad de pares de bases) se mueven menos.
Frmulas
Calcula concentracin de ADN ( g/mL)=

Absorbancia260
( 0,020 g / mL ) x 1 cm

Relacin Abs260 / Abs280

Cuanto ms pura est la muestra de ADN, mayor es la relacin Abs260 / Abs280. Relacin
cercana a 2, indica que muestra de ADN es altamente pura
El ADN migra hacia el nodo porque el ADN tiene grupos fosfatos que le dan una carga
negativa
Prctica #6 Radicales Libres
Los radicales son especies qumicas, molculas o tomos, con al menos un electrn
desapareado, que se encuentra solo en un orbital.
El radical DPPH en metanol forma una solucin de color prpura o morado, con un pico
mximo de absorcin a 517nm
Cuanto menor sea la cantidad de muestra necesaria, mayor capacidad antioxidante tendr esa
muestra.

Practica #7 Perfil Lipdico

Se llama perfil lipdico a las concentraciones de los principales lpidos en sangre: triglicridos,
colesterol total, colesterol asociado a lipoprotenas de alta densidad (HDL-colesterol) y
colesterol asociado a protenas de baja densidad (LDL-colesterol)
Fundamento del Mtodo: La determinacin de colesterol y la de triglicridos se realizan mediante un
mtodo enzimtico y colorimtrico. El reactivo contiene una serie de enzimas y un compuesto
cromognico que producir una sustancia de color rojo, en una concentracin directamente
proporcional a la concentracin de colesterol o triglicridos, respectivamente
Para la determinacin del colesterol asociado a las HDL, el procedimiento debe separar estas
lipoprotenas de las dems. Un mtodo clsico ha sido la precipitacin de las VLDL y las LDL.
Frmulas:
Colesterol VLDL
VLDL Colesterol ( mg/ dL )=

Triglicridos ( mg / dL )
5

Frmula de Friedewald
LDL colesterol ( mg/dL )=Colesterol Total HDLColesterol
Indice de Castelli
Indice de Castelli=

Colesterol Total
HDL Colesterol

Colesterol No-HDL
Colesterol No HDL ( mg/dL )=ColesterolTotal Colesterol HDL

Triglicridos
5

Prctica #8 Peroxidasa Lipdica

El Malondialdehido (MDA) se produce en la peroxidacin de Acidos Grasos.
La concentracin de malondialdehdo se determina mediante el ensayo TBARS (sustancias
reactivas del cido tiobarbitrico), que se basa en la reaccin del MDA con el cido
tiobarbitrico (TBA) en medio cido y alta temperatura, para formar un complejo rojo, que
predenta un coeficiente de absortividad de 1,56 x 105 M-1 cm-1 a 532nm.
Clculo de la Concentracin de MDA
MDA ( M )=

Absorbancia 106
5
1,56 x 10

Prctica #9 Hemoglobina
Las hemglobinas (Hb) son un grupo de protenas presentes en los eritrocitos, que se unen
reversiblemente al oxgeno y lo transportan de los pulmones a los tejidos.
El total de Hb refleja la capacidad de organismo para transportar oxgeno y depende de:
La cantidad de eritrocitos
La cantidad de Hb por eritrocito
La Hb estn compuestas por cuatro cadenas polipeptdicas, cada uno con un grupo hemo.
HbA: y (Mayoritaria en Adultos)
HbA2: y (Fraccin pequea en Adultos)
HbF: y (Periodo fetal y a la hora de nacer

Valores Normales (g/mL)

Mujeres

12-16

Hombres

13-17

Hemoglobinas Mutantes: La mayora surgen de una sustitucin de base nica, lo que resulta en le
remplazo de un solo aminocido
HbS: Cambio de glutamato por valina en la cadena , tiene efecto en la estructura, es la que
est presente en la anemia drepanoctica
HbC: Cambio de glutamato por lisina, modifica la carga de la molculas

Talasemias: Grupo Heterogneo de anemias hereditarias que constituyen el trastorno gentico ms

comn
Los Sndromes son efecto de mutaciones que disminuyen o eliminan la sntesis de las cadenas o
del tretmero de la Hb
Talasemias o: Cadena Ausente
Talasemia +: reduccin parcial de la sintesis de la cadena

Electroforesis de Hb
Se aplican pequeas cantidades de hemolizados a partir de muestras de sangre, en placas de acetato de
celulosa. Las molculas se separan segn su carga, utilizando un buffer alcalino (pH 8,2-8,6) y se
observan mediante tincin de Ponceau S.
La HbA es la que ms avanza hacia el nodo (+), seguida por la HbF y la HbS; la HbC y HbA2 son las
que menos se separan del punto de origen.

Determinacin de la concetracin de Hb en sangre

Se mide la absorbancia de la cianometahemoglobina a 540nm. El reactivo de Drabkin oxida el hierro

de Fe2+ a Fe3+, mediante ferricianuro potsico formando metahemoglobina, la cual es convertida en
cianometahemoglobina con el cianuro potsico

[ Hb ] muestra=

AbsMuestra
x [ Hb ] patrn g/ dL
AbsPatrn