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EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA

CATALASA

I. INTRODUCCIN
Las enzimas son el producto de expresin de genes; por lo tanto, su
actividad
puede verse modulada por el genotipo del individuo. El estudio de la actividad
enzimtica tiene importancia en ciencia bsica, bioqumica y biotecnologa. As
mismo, la presencia de distintas isoenzimas y su actividad enzimtica diferencial
puede ser empleada como marcador bioqumico de normalidad o anormalidad
(diagnostico
de
enfermedades).
Las enzimas son protenas (con la excepcin de los RNA catalticos) producidos por
los seres vivos que catalizan con gran eficacia las reacciones biolgicas, actuando
de forma especfica y regulada. Las anteriores propiedades hacen que las enzimas
se puedan aplicar, de forma muy eficaz, a procesos industriales tales como la
obtencin de frmacos, procesado de alimentos y en analtica. La cintica
enzimtica es la parte de la enzimologa que estudia la velocidad de las reacciones
catalizadas enzimticamente y el efecto que diferentes factores fsico-qumicos
sobre dicha velocidad.

CATALASA
Es una de las enzimas ms abundantes en la naturaleza y se encuentra
ampliamente distribuida en el organismo humano, aunque su
actividad
vara en dependencia del tejido; sta resulta ms elevada en el
hgado y
en los riones, ms baja en el tejido conectivo y los
epitelios, y prcticamente nula en el tejido nervioso.
A nivel celular se localiza en la mitocondrias y
los peroxisomas, excepto en los eritrocitos,
donde se encuentra en el citosol. Esta enzima es
una mtalo protena tetramtrica, cuyo peso
molecular se encuentra en el rango de 210- 280
KD. Consta de 4 subunidades idnticas que se
mantienen
unidas
por
interaccin
no
covalentes. Cada subunidad protohmico y el
Hierro
representa
un
1,1%
y
0,09%
respectivamente del peso molecular de la enzima.

La catalasa es una enzima antioxidante presenta en la mayora de los organismos


aerobios. Cataliza la dismutacin del perxido de hidrgeno (H 2O2) en agua y
oxgeno.
La mayora de estas enzimas son homotetrmeros con un grupo Hemo en cada
subunidad. Se ha determinado la estructura cristalogrfica de nueve catalasas.
Algunas catalasas tienen subunidades pequeas (masa molecular = 60KDa) y otras
grandes (Masa molculas >80 KDa). Entre stos dos grupos de catalasas existen
diferencias estructurales importantes. Las catalasas pequeas son menos
resistentes a la desnaturalizacin, unen NADPH, tienen hemo b y se inhiben e
inactivan por sustrato. En cambio, las catalasas grandes tienen un dominio extra en
el C- terminal que es semejante a la flavodoxina, son muy resistentes a la
desnaturalizacin, tienen hemo d, presentan enlaces covalentes inusuales cercanos
al sitio activo y son resistentes a concentraciones molares de H 2O2.
En algunas especies de enzimas se contiene molculas nicotinamn adenn
dinucletido fosfatado en su forma reducida (NADPH) ligadas estrechamente a la
enzima, as se ha demostrado que la CAT humana entre algunas y la de res estn
ligadas a molculas de NADPH, 1 en cada subunidad y que no existe interaccin
directa
entre
el
grupo
hemo
y
NADPH.
El NADPH se une a las catalasas con un plegamiento nico entre las
oxidoreductasas. Los aminocidos de la cavidad que une el NADPH estn muy
conservados en las catalasas que unen ese dinucletido (4,9). El anillo de la adenina
del NADPH est en una pequea cavidad conformada por varios aminocidos
hidrofbicos (lle177, Leu428 y Leu429 en PMC). El grupo 2 fosfato de la adenina
ribosa interacta con la cadena lateral de una arginina conservada (Arg182 en
PMC). Una histidina (His284 en PMC) interacta con el grupo pirofosfato y la
nicotidamina.

El NADPH unido a la enzima no est involucrado en su actividad cataltica o


peroxidativa. sta molcula puede invertir en la preservacin y reservacin
parcial de la inactividad de la CAT por su propio sustrato txico y estabiliza a

la enzima por tener un reservorio de NADPH, lo cual juega un papel importante


durante
el
estrs
oxidativo.
Uno de sus subproductos de la actividad de la clula viva es el perxido de
hidrgeno (Agua oxigenada). Una sustancia txica para la vida celular y que por lo
tanto ha de ser desdoblado antes que se destruya la clula y como resultado de ste
desdoblamiento se produce agua y oxgeno. En esta prctica veremos como la
velocidad de la reaccin que cataliza se ve afectada por diferentes factores como
pH,
temperatura,
y
concentracin
de
enzimas
y
de
sustrato.
Esta reaccin inmediata es catalizada por la catalasa que se encuentra en todas las
clulas
que
tiene
catabolismo
aerbico.
La catalasa o perxido de hidrogeno oxigeno reductasa en una enzima que tiene
grupo prosttico hemo (presenta hierro en el centro de un esqueleto fundamental
porfirinico) y acta sobre el perxido de hidrogeno resultante de la oxidacin del
glicolato en los peroxisomas durante la fotorespiracion en la hojas. Tambin se
encuentra con mayor actividades el hgado y en diversos microorganismos. Tambin
se encuentra en los glioxisomas principalmente en semillas secas en grasa donde,
durante la germinacin esta sustancia es utilizada parcialmente como fuente de
energa
mediante
el
ciclo
del
acido
glioxilico.
El agua oxigenada es el sustrato y al entrar en contacto con la enzima
inmediatamente empieza la reaccin, por lo tanto empez a correr el tiempo (0.5,
1.1, 2, 3, 4, 5 min) el O 2 liberando sale en forma de burbujas y puede ser
cuantificado en los distintos tiempos por la velocidad e intensidad.
La catalasa tiene como grupo activo ferriprotoporfirina IX. Por cada molcula
enzimtica hay 4 grupos hemina cada uno de los cuales va firmemente unido a la
parte proteica a travs de sus dos grupos carboxilos (grupo prosttico)

De acuerdo con la naturaleza de su grupo activo la catalasa es inhibida en forma


irreversible por las sustancias que forman complejos como el, por ejemplo el cianuro
sulfuroso, acida fluoruro, monxido de carbono, monxido de nitrgeno e

hidroxidamina. Un inhibidor interesante de la catalasa es la cianamida, que sin


embargo,
tiene
muy
poca
accin
sobre
la
peroxidasa.
La catalasa se encuentra en todas las clulas que tienen metabolismo aerobio, es
una
de
las
enzimas
conocidas
con
mayor
actividad.
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrogeno en oxigeno y
agua. Qumicamente la catalasa es una hemoproteina de estructura similar al de la
hemoglobina, excepto que los cuatro tomos de Hierro de la molcula estn en
estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++) excluyendo los estreptococos,
la mayora de las bacterias aerobios y anaerobias facultativas poseen actividad
catalasa.
La catalasa deshidrogena una molcula de perxido de hidrogeno transportando el
hidrogeno
a
otra
molcula
de
perxido
de
hidrogeno.
H2O2 + H2O2

O2 + 2H2O

La mayora de los organismos aerobios tienen catalasa monofuncionales.


Las catalasas catalizan las dismutacin del perxido de hidrgeno en agua y
oxgeno, evitando as que se forme el radical hidroxilo y el oxgeno singulete,
especies de oxgenos que son muy reactivas. En el hombre, la catalasa protege la
hemoglobina del perxido de hidrogeno que se genera en los eritrocitos. Tambin
tiene un papel de proteccin en la inflamacin, en la prevencin de mutaciones, evita
el
envejecimiento
y
ciertos
tipos
de
cncer.
Las mutaciones en el gen de la catalasa pueden resultar en la enfermedad
hereditaria denominada acatalacemia que entre otros sntomas se reconoce por un
incremento
en
la
incidencia
de
ulceraciones
bucales.
PEROXIDASA
Pertenece a la subclase de enzima oxidoreductasas que catalizan la accin de
sustratos orgnicos con perxido de hidrogeno, quedando reducida en agua.
Estas enzimas son protenas homo que se hallan frecuentemente en plantas y
ocasionalmente
en
vegetales.
Las peroxidasas son enzimas que catalizan la siguiente reaccin:
ROOH + AH2 H2O + A
La reaccin importante de las peroxidasas es la es la anterior, sin embargo existen 3
tipos de reacciones en las que puede intervenir reacciones peroxidativas, oxidativas
o hidroxilativas. Para la reaccin peroxidativa se requiere un perxido orgnico o de
agua. El nmero de compuestos que pueden ser aceptores de hidrgeno para
algunas peroxidasa es pequeo. Los compuestos donadores de hidrgeno pueden

ser fenoles, aminas y otros compuestos orgnicos. El mecanismo de la reaccin se


basa en la formacin de complejos de enzima-donador de hidrgeno y dos pasos de
oxidacin univalente.
Actividad Enzimtica
Las propiedades de las enzimas derivan del hecho de ser protenas de actuar
como catalizadores. Como protenas, poseen una conformacin natural ms
estable que las dems conformaciones posibles. As, cambios en la
conformacin suelen ir asociados en cambios en la actividad cataltica. Los
factores que influyen de manera ms directa sobre la actividad de una enzima
son:
- Ph
- Temperatura
- Cofactores
a) Efecto de la Concentracin de Enzima sobre la Actividad Enzimtica
De forma general, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente
es proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo (Fig.1),
segn:
v =

kcat Eo

Fig.1. La velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente es


generalmente proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo.

Con algunos sistemas enzimticos, en especial cuando se trabaja con 3


extractos enzimticos no purificados se observan desviaciones respecto al
patrn indicado, debido, entre otros factores a la presencia de activadores e
inhibidores,
a
enzimas
oligomtricos
disociables,
etc.

b)

Efecto

del

pH

sobre

la

Actividad

Enzimtica

La actividad de una enzima se ve afectada por el Ph al cual se lleva a cabo la


reaccin. La curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima
(Fig.
2)
En el caso ms general la curva tiene forma de campana. El valor de pH al
cual la actividad es mxima se denomina pH ptimo; dicho pH no tiene
porque coincidir con el pH intracelular. La relacin entre el pH y la actividad va
a depender del comportamiento cido-base de la enzima y el sustrato. El
sustrato y la enzima (centro activo) contienen grupos funciones cidos y
bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente del pH, lo que
determinar, entre otros aspectos, la conformacin de la protena, la
capacidad de unin del sustrato al centro activo de la enzima (Km) y la
capacidad de transformacin del sustrato (kcat). Los estudios cinticos a
diferentes valores de pH nos proporciona informacin sobre el mecanismo
cataltico de la enzima y la naturaleza de los aminocidos ms directamente
implicados
en
el
proceso
cataltico.
Fig.2. La velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente se ve
afectada por el pH.

c) Efecto de la Temperatura sobre la Actividad Enzimtica


La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima se incrementa al
aumentar la temperatura a la cual se lleva a cabo la reaccin.
Fig.3. La velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente se ve

afectada

por

la

La temperatura ejerce un doble efecto, sobre la conformacin de la enzima y


sobre la propia reaccin.
En la Fig.3. Se representa la tpica curva actividad-temperatura.
La velocidad de la reaccin se incremente al aumentar la temperatura dentro
de un determinado rango, alcanzando un valor mximo a la denominada
temperatura ptima. A valores superiores la actividad disminuye debido a que
la enzima, como cualquier otra protena, sufre procesos de desnaturalizacin
y,
por
lo
tanto,
de
inactivacin.
La relacin entre la actividad y temperatura viene determinada por la ecuacin
de Arrhenius:
v = ke-Ea/RT
Donde Ea es la energa de activacin, R la constante de los gases ( 2cal K -1
mol-1)
y
T
la
temperatura
absoluta
(K).
d) Efecto de la Concentracin de sustrato sobre la Actividad Enzimtica
En la fig.4. Se representa el efecto e la concentracin de sustrato sobre la
velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente. Aunque no con todas
las enzimas se observa dicho comportamiento (sera el caso de enzimas
alostricas), es el caso ms habitual y sencillo; las enzimas que se ajustan a
dicho modelo se conocen con el nombre de enzimas michaelianas.

Fig.4. Efecto de la S sobre la velocidad.

El anterior modelo cintico se ajusta a la ecuacin:


v = VmaxS/km S
Donde Km es la constante de michaelis e indica la afinidad de la enzima por
su sustrato, y Vmax es la velocidad mxima e indica la capacidad cataltica.
La determinacin de los parmetros cinticos Km y Vmax se puede llevar a
cabo utilizando la representacin de Lineweaver-Burk (1/v:1/S) (Fig.5.)
La correspondiente ecuacin sera:
1/v = 1/Vmax Km/Vmax

1/S

Fig.5. Representacin de Lineweave-Burk o de los dobles inversos

II. OBJETVOS

Determinar la intensidad de reaccin de la enzima catalasa de origen


animal y vegetal.
Determinar el efecto de temperatura, pH y concentracin de sales sobre
la actividad cataltica de la catalasa.
Calcular la velocidad mxima de reaccin peroxidasa.
Determinar la concentracin de sustrato necesario para alcanzar de la
velocidad mxima.
Preparar el extracto enzimtico de distintos medios biolgicos y
comprobar su actividad.
Emplear un mtodo continuo para medir la velocidad enzimtica.
Evaluar el efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad
enzimtica.

III. MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRA


a) Materiales

Pipeta, Goteros, Matraz, Cuchillos, Vaso de precipitado, Mortero y pilln,


Rallador de verduras, Termmetro, Coladores, Probeta, Agua destilada,
Piseta, Balanza diferencial.
b) Reactivos
NaCl, MgCl, Bicarbonato de Sodio, Agua Oxigenada.
c) Muestras
Hgado, Estmago, Pncreas de diversas especies, papa, camote, yuca,
nabo, zanahoria, manzana, papaya, uva, limn, sal.