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TCNICAS

DE BIOLOGA M0LECULAR
APLICADAS EN ANATOMA PATOLGICA

Ttulo original: Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


Autores: Jos ngel Alzueta. T.S.S. de Anatoma Patolgica y Citologa
Rogelio Soler Peinado. T.S.S. de Anatoma Patolgica y Citologa
Edita e imprime: FESITESS ANDALUCA
C/ Armengual de la Mota 37
Oficina 1
29007 Mlaga
Telfono/fax 952 61 54 61
www.fesitessandaluca.es
ISBN: 978-84-694-4221-0
Diseo y maquetacin: Alfonso Cid Illescas
Edicin Octubre 2011

NDICE





UNIDAD DIDCTICA I
PRESENTACIN Y METODOLOGA DEL CURSO

1.1 Sistema de Cursos a Distancia

1.2 Orientaciones para el estudio

10

1.3 Estructura del Curso

12

UNIDAD DIDCTICA II
INTRODUCCIN A LAS TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
APLICADA EN ANATOMA PATOLGICA


15

2.1 Introduccin

17

2.2 Estructura del ADN

18

2.3 Replicacin del ADN

20

2.4 Enfermedades provocadas por errores genticos.

20

2.5 Tcnicas o mtodos usados en biologa molecular

21

2.6 Hibridacin por sondas

22

2.7 Indicadores para el uso de sondas o pruebas en el laboratorio

22

2.8 Tcnicas de amplificacin

23

2.9 Tcnicas y componentes de la pcr

24

2.10 Falsos positivos debidos a la contaminacin

25

2.11 Conclusiones

25

UNIDAD DIDCTICA III


TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
APLICADAS A LA HISTOPATOLOGA


27

3.1 Introduccin

29

3.2 Aplicaciones en Anatoma Patolgica

29

3.3 Obtencin del ADN y separacin de fragmentos de ADN.

29

UNIDAD DIDCTICA IV
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
EN FASE LQUIDA Y CON MEMBRANA
4.1 Introduccin

35
37

4.2 Mtodos de Membrana

37

4.3 Blot invertido (BI)

39

4.4 El Dot/Spot Blot (DB)

39

4.5 Hibridacin Sandwich (HS)

39

4.6 Hibridacin Northern

39

4.7 Mtodos de hibridacin en la fase lquida

40

4.8 Mtodos de amplificacin genmica

40

4.9 Tcnicas moleculares en el diagnstico de la ETS

44

UNIDAD DIDCTICA V
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR IN SITU
5.1 Hibridacin in situ

49
51

5.2 PCR in situ

52

5.3 Tcnica mixta de amplificacin LCR

54

5.4 Mtodos de deteccin

55

5.5 Ligase Chain Reaction (LCR)

57

5.6 Variantes de la LCR

58

5.7 Conclusin

59

UNIDAD DIDCTICA VI
ANLISIS POR REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
6.1 Introduccin

61
63

6.2 Componentes de la PCR

64

6.3 Adyuvantes de la PCR

66

UNIDAD DIDCTICA VII


FUTURAS TECNOLOGAS: BIOCHIPS
7.1 Aplicaciones de los biochips

69
71

7.2 Aplicaciones de los biochips

72

7.3 Secuenciacin del ADN empleando microarrays

73

7.4 Citogentica

76

UNIDAD DIDCTICA VIII


TCNICAS DE ANLISIS DE ADN EN GENTICA FORENSE
8.1 Evolucin de las tcnicas de estudio de los poliformismos DE ADN

81
83

UNIDAD DIDCTICA IX
SECUENCIACIN AUTOMTICA DEL ADN
9.1 Secuenciadores automticos en geles / equipamiento

87
89

9.2 Reaccin en cadena de la Polimerasa

92

9.3 Secuenciacin de productos de PCR

93

9.4 Purificacin del producto de PCR con columnas de Centricon100

94

9.5 Mtodos clsicos de secuenciacin

94

9.6 Secuenciacin automtica empleando el mtodo enzimtico

97

9.7 Secuenciadotes automticos

99

9.8 Equipamiento

101

9.9 Glosario:

104

UNIDAD DIDCTICA X
NIVELES DE SEGURIDAD Y PELIGROSIDAD EN EL LABORATORIO

105
105

10.1 Seguridad en el Laboratorio de Anatoma Patolgica

107

10.2 Niveles de seguridad

114

10.3 Tratamiento de residuos sanitarios

116

CUESTIONARIO

121

Cuestionario

123

UNIDAD DIDCTICA I
PRESENTACIN Y METODOLOGA DEL CURSO

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Presentacin, normas y procedimientos de trabajo.


Introduccin
Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el mtodo que
se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introduccin.

Presentacin
1. Sistema de Cursos a Distancia
En este apartado aprender una serie de aspectos generales sobre las tcnicas de
formacin que se van a seguir para el estudio.
2. Orientaciones para el estudio.
Si usted no conoce la tcnica empleada en los Cursos a Distancia, le
recomendamos que lea atentamente los epgrafes siguientes, los cuales le ayudarn a
realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, slo tiene que seguir los
pasos que se indican en el siguiente ndice:
Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del
proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente.
3. Estructura del Curso
Mostramos cmo es el Curso, las Unidades Temticas de las que se compone, el
sistema de evaluacin y cmo enfrentarse al tipo test.

1.1 Sistema de Cursos a Distancia


1.1.1 Rgimen de Enseanza
La metodologa de Enseanza a Distancia, por su estructura y concepcin, ofrece
un mbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo
individual de dedicacin, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y
personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseada para adaptarse a las
disponibilidades de tiempo y/o situacin geogrfica de cada alumno. Adems, es
participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solucin de problemas
clnicos.
La Formacin a Distancia facilita el acceso a la enseanza a todos los Tcnicos
Especialistas/Superiores Sanitarios.

1.1.2 Caractersticas del Curso y del alumnado al que va dirigido


Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos,
debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarn (lo que
saben y lo que an no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se
ajustar a sus intereses y capacidades.
Un buen Curso producir resultados deficientes si lo estudian personas muy
diferentes de las inicialmente previstas.
Los Cursos se disean ajustndose a las caractersticas del alumno al que se dirige.

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

1.1.3 Orientacin de los Tutores


Para cada Curso habr, al menos, un tutor al que los alumnos podrn dirigir todas
sus consultas y plantear las dificultades.
Las tutoras estn pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se
realiza en esta formacin es totalmente individual y personalizado.
El tutor responder en un plazo mnimo las dudas planteadas a travs de correo
electrnico exclusivamente.
Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores:

Acadmicos. Sern aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso,
planteamientos sobre cuestiones test y casos clnicos. El tutor resuelve las
dudas que se plantean por correo electrnico.

Orientadores y de apoyo metodolgico. Su labor se centrar


fundamentalmente en cuestiones de carcter psicopedaggicas, ayudando al
alumno en horarios, mtodos de trabajo o cuestiones ms particulares que
puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que
se plantean por correo electrnico.

1.2 Orientaciones para el estudio


Los resultados que un estudiante obtiene no estn exclusivamente en funcin de
las aptitudes que posee y del inters que pone en prctica, sino tambin de las tcnicas de
estudio que utiliza. Aunque resulta difcil establecer unas normas que sean aplicables de
forma general, es ms conveniente que cada alumno se marque su propio mtodo de
trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento.
Por tanto, an dando por supuestas la vocacin y preparacin de los alumnos y
respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente
exponer algunos patrones con los que se podr guiar ms fcilmente el desarrollo
acadmico, aunque va a depender de la situacin particular de cada alumno y de los
conocimientos de la materia del Curso:
Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con
regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana.

10

Elegir el horario ms favorable para cada alumno. Una sesin debe durar
mnimo una hora y mximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo
que se necesita de preparacin, mientras que ms de tres horas, incluidos los
descansos, puede resultar demasiado y descendera el rendimiento.

Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminacin adecuada, espacio


suficiente para extender apuntes, etc.

Estudiar con atencin, sin distraerse. Nada de radio, televisin o msica de


fondo. Tambin es muy prctico subrayar los puntos ms interesantes a modo
de resumen o esquema.

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


a) Fase receptiva.

Observar en primer lugar el esquema general del Curso.

Hacer una composicin de lo que se cree ms interesante o importante.

Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a


otro sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen
cuestiones no tiles.

Anotar las palabras o prrafos considerados ms relevantes empleando un


lpiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean
claras y significativas.

Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de


la Unidad.

Completar el esquema con el texto.

Estudiar ajustndose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse.


Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos.

Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema.

Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos
detenidamente. No insistir de momento ms sobre ellos.

b) Fase reflexiva.

Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que


hayan podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que
siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografa recomendada y la
utilizada en la elaboracin del tema que puede ser de gran ayuda.

Seguir paso a paso el desarrollo de los temas.

Anotar los puntos que no se comprenden.

Repasar los conceptos contenidos en el texto segn va siguiendo la


solucin de los casos resueltos.

c) Fase creativa.
En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolucin de pruebas de
autoevaluacin y a los casos concretos de su vivencia profesional.

Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar


a solucionarla.

Consultar la exposicin de conceptos del texto que hagan referencia a cada


cuestin de la prueba.

Solucionar la prueba de cada Unidad Temtica utilizando el propio


cuestionario del manual.

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Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

1.3 Estructura del Curso


1.3.1 Contenidos del Curso

Gua del alumno.

Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test.

FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario.

ENCUESTA de satisfaccin del Curso.

1.3.2 Los Cursos


Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseado en Unidades
Didcticas.

1.3.3 Las Unidades Didcticas


Son unidades bsicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de
material educativo distinto:

Texto propiamente dicho, dividido en temas.

Bibliografa utilizada y recomendada.

Cuestionario tipo test.

Los temas comienzan con un ndice con las materias contenidas en ellos. Contina
con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la
redaccin del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad prctica.
El apartado de preguntas test sern con los que se trabajen, y con los que
posteriormente se rellenar el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo
test se adjuntan al final del temario.
Cuando estn presentes los ejercicios de autoevaluacin, la realizacin de stos
resulta muy til para el alumno, ya que:

Tienen una funcin recapituladora, insistiendo en los conceptos y trminos


bsicos del tema.

Hacen participar al alumno de una manera ms activa en el aprendizaje del


tema.

Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar


posteriormente el resultado de las respuestas.

Son garanta de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado


positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo.

Dentro de las unidades hay distintos epgrafes, que son conjuntos homogneos de
conceptos que guardan relacin entre s. El tamao y nmero de epgrafes depender de
cada caso.

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Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

1.3.4 Sistema de Evaluacin


Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluacin a distancia que se
encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio
del Curso, y enviada al tutor de la asignatura, con un plazo mximo de entrega para que
pueda quedar incluido en la edicin del Curso en la que se matricul y siempre
disponiendo de 15 das adicionales para su envo. Los tutores la corregirn y devolvern al
alumno.
Si no se supera el cuestionario con un mnimo del 80% correcto, se tendr la
posibilidad de recuperacin.
La elaboracin y posterior correccin de los test ha sido diseada por el personal
docente seleccionado para el Curso con la intencin de acercar el contenido de las
preguntas al temario asimilado.
Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envo de las respuestas
para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso.

1.3.5 Fechas
El plazo de entrega de las evaluaciones ser de un mes y medio a partir de la
recepcin del material del curso, una vez pasado este plazo conllevar una serie de
gestiones administrativas que el alumno tendr que abonar.
La entrega de los certificados del Curso estar en relacin con la fecha de entrega
de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalizacin del Curso.

1.3.6 Aprendiendo a enfrentarse a preguntas tipo test


La primera utilidad que se deriva de la resolucin de preguntas tipo test es
aprender cmo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensacin que algunos alumnos
tienen de se me dan los exmenes tipo test.
Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolucin
de las mismas est ms dirigida y el planteamiento es ms especfico.
Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a
conocimientos muy concretos y exigen un mtodo de estudio diferente al que muchas
personas han empleado hasta ahora.
Bsicamente todas las preguntas test tienen una caracterstica comn: exigen
identificar una opcin que se diferencia de las otras por uno o ms datos de los recogidos
en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresin de dos hechos fundamentales
con respecto a las preguntas tipo test:

Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser


necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con
exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no
consiga recordad de memoria una serie de datos que aprendi hace
tiempo; seguro que muchos de ellos los recordar al leerlos formando
parte del enunciado o las opciones de una pregunta de test.

El hecho de que haya que distinguir una opcin de otras se traduce en


muchas ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes.
Habitualmente se les pide recordar un dato que se diferencia de otros por
13

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


ser el ms frecuente, el ms caracterstico, etc. Por lo tanto, este tipo de
datos o situaciones son los que hay que estudiar.
Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma
completa y fijndose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la
resolucin de la pregunta.
La utilidad de las preguntas test es varia:

Acostumbrarse a percibir errores de conceptos.

Adaptarse a los exmenes de seleccin de personal.

Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser
planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad.

1.3.7 Envo
Una vez estudiado el material docente, se contestar la encuesta de satisfaccin, la
cual nos ayudar para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya
cumplimentado la evaluacin, enve las respuestas a la direccin indicada.

14













UNIDAD DIDCTICA II
INTRODUCCIN A LAS TCNICAS DE BIOLOGA
MOLECULAR APLICADA EN ANATOMA PATOLGICA

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

2.1 Introduccin
El paradigma gentico del cncer que los tumores surgen como consecuencia
de la acumulacin de mutaciones genticas en una misma estirpe celular- est ya
ampliamente aceptado. El anlisis funcional de los productos de los diversos genes
tumorales indica que stos juegan papeles fundamentales en procesos de transduccin de
seales implicadas en control de la proliferacin, diferenciacin, o muerte celular. Estos
estudios han esclarecido tambin cmo la progresin normal del ciclo celular es el
resultado de una interaccin cuidadosamente balanceada entre mltiples reguladores
codificados por protooncogenes y genes supresores de diversos tipos. No es
sorprendente, por tanto, que cualquier alteracin funcional a nivel de uno de estos
mltiples reguladores produzca un ciclo celular alterado que eventualmente desemboca
en una progresin neoplsica. Esta simplificacin conceptual, derivada del anlisis de
tumores a nivel molecular, ha dado lugar a la definicin del cncer como una "enfermedad
gentica del ciclo celular".
Los espectaculares avances registrados durante los ltimos aos en el estudio de
los mecanismos moleculares del cncer han supuesto un gran impulso en la comprensin
de los procesos de proliferacin celular, tanto normal como tumoral, as como la
identificacin de los diferentes componentes que constituyen los eslabones de los mismos
y la interrelacin de sus respectivas actividades.

2.1.1 Laboratorio de patologa molecular orientado al diagnstico


El diagnstico morfolgico del estudio celular y tisular con hematoxilina-eosina
precisa en muchas casos de otras tcnicas, como tinciones especiales, microscopia
electrnica, inmunohistoqumica, citometra de flujo, citogentica, biologa molecular.
Aportando el resultado de cada una de estas tcnicas, aspectos y caractersticas distintas
al estudio morfolgico de las enfermedades. La suma de todos estos resultados, junto con
los datos morfolgicos, las pruebas complementarias y la clnica, justifican y apoyan su
utilizacin.
Hoy hablamos del concepto de diagnstico morfolgico integrado, en el que se
reflejan caractersticas citoestructurales de una lesin y aspectos citogenticos y
moleculares, que apoyan al diagnstico o aportan datos pronsticos y predictivos.
Demostrada su utilidad para el diagnstico y/o pronstico, se incorporan en los
laboratorios de Anatoma Patolgica. Al igual que otras tcnicas sofisticadas se ven
influenciadas por el tipo de hospital, tanto por volumen como por tipo de casos a
estudiar. El futuro de las tcnicas en biologa molecular y citogentica corre la misma
suerte que otras tcnicas hoy imprescindibles como la Inmunohistoqumica.
Da a da la aplicacin crece, se centra en ayuda en el diagnstico y pronstico de
la patologa oncolgica tanto en tumores espordicos, como en el diagnstico precoz del
cncer familiar, en el estudio de enfermedad mnima residual y de micrometstasis, en
patologa infecciosa identificando agentes etiolgicos y en la identificacin de
enfermedades y trastornos genticos.
Las tcnicas bsicas utilizables en Anatoma Patolgica son la PCR, RT-PCR,
Souther blot y estn estandarizadas no presentando dificultades en su realizacin, su coste
no supera a la de un panel de anticuerpos de inmunohistoqumica.

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Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


La puesta en marcha de un laboratorio de biologa molecular, dentro del Servicio
de Anatoma Patolgica requiere del estudio previo del espacio para el mismo, de dotarlo
de la instrumentacin bsica y de personal que realizar dichas tcnicas.

2.1.2 Espacios
El laboratorio de biologa molecular requiere de tres espacios separados, una zona
de pretratamiento para realizar la manipulacin de las muestras y la extraccin de cidos
nucleicos, espacio que puede estar compartido en el laboratorio general. Una segunda
zona limpia y separada del resto del laboratorio en donde prepararemos y realizaremos la
amplificacin y las tcnicas de PCR. Y como tercera la zona oscura para realizar la
electroforesis y la lectura de geles.

2.1.3 Instrumentacin
La instrumentacin bsica puede ser compartida con otras tcnicas; como material
dispondremos al menos de:

Frigorfico y congelador

Bao termosttico

Centrifuga y Microcentrifuga

Campana de flujo laminar

Pipetas automticas de seguridad

Termociclador

Aparato de electroforesis

Lector digital o fotogrfico de geles

2.1.4 Personal
Profesionales Tcnicos Superiores en Anatoma Patolgica y Citologa. En relacin
al personal adecuado y necesario para la realizacin, interpretacin y puesta al da de las
tcnicas de biologa molecular, debemos considerar una experiencia mnima en dichas
tcnicas. Se precisa capacidad de interpretacin de los resultados y amplia resolucin de
problemas.

2.2 Estructura del ADN


La molcula de ADN est constituida por dos largas cadenas de nucletidos unidas
entre s formando una doble hlice. Las dos cadenas de nucletidos que constituyen una
molcula de ADN, se mantienen unidas entre s porque se forman enlaces entre las bases
nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.
Las cuatro bases nitrogenadas del ADN se encuentran distribuidas a lo largo de la
"columna vertebral" que conforman los azcares con el cido fosfrico en un orden
particular. (la secuencia del ADN). La adenina(A) se empareja con la timina (T), mientras
que la citosina (C) lo hace con la guanina. Las dos hebras de ADN se mantienen unidas por
los puentes hidrgenos entre las base.

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Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

La estructura de un determinado ADN est definida por la "secuencia" de las bases


nitrogenadas en la cadena de nucletidos, residiendo precisamente en esta secuencia de
bases la informacin gentica del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo
largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crtico para la clula, ya que este orden es el
que constituye las instrucciones del programa gentico de los organismos. Conocer esta
secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje gentico.
La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( AT; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita
automaticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son
complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena , se deduce
inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria. El modelo de la doble hlice
de Watson y Crick ha supuesto un hito en la historia de la Biologa.

19

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

2.3 Replicacin del ADN


Es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o rplicas de su molcula. Este
proceso es fundamental para la transferencia de la informacin gentica de generacin en
generacin.

Las molculas se replican de un modo semiconservativo. La doble hlice se separa


y cada una de las cadenas sirve de molde para la sntesis de una nueva cadena
complementaria. El resultado final son dos molculas idnticas a la original.

2.4 Enfermedades provocadas por errores genticos.


La disposicin exacta (secuencia) de las bases de A, C, G y T en una cadena de ADN
es la receta que codifica la secuencia exacta de una protena. Si las recetas tienen bases
adicionales o mal escritas, o si se suprimen algunas, la clula puede elaborar una protena
incorrecta, o bien demasiada o demasiado poca de la correcta. Estos errores resultan
muchas veces en enfermedades. En algunos casos, una sola base fuera de lugar es
suficiente para provocar una enfermedad.
Los errores en nuestros genes, nuestro material gentico, son los responsables de
aproximadamente entre 3.000 y 4.000 enfermedades hereditarias, entre las que se
incluyen la enfermedad de Huntington, la fibrosis qustica y la distrofia muscular de
Duchenne. An ms, actualmente se sabe que las alteraciones genticas desempean una
funcin en el cncer, en las enfermedades cardacas, en la diabetes y en muchas otras
enfermedades comunes.
Los defectos genticos aumentan el riesgo de que una persona desarrolle estos
trastornos ms comunes y complejos. Las enfermedades mismas son el producto de
interacciones entre dichas predisposiciones genticas y factores medioambientales, entre
los que se incluyen la dieta y el estilo de vida.
Algunos expertos consideran que la mitad de las personas desarrollar una
enfermedad que tiene un componente gentico.
La comprensin del cdigo gentico no condujo directamente a los investigadores
a los genes de las enfermedades. Su capacidad para descifrar los mensajes genticos

20

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


encapsulados en el ADN se vio obstaculizado por el extraordinario nmero de dichos
mensajes transportados en el ADN de cada clula.
Una clula humana (excepto las clulas sexuales, de espermatozoides y vulos, y
algunas clulas sanguneas que no tienen ncleo) contiene alrededor de 1,80 metros de
molculas de ADN enroscadas estrechamente y empaquetadas dentro de 46 cromosomas,
que son estructuras con forma de huso que se encuentran en el ncleo de la clula y estn
formadas por ADN recubierto de protenas.
Este ADN est formado por 3.000 millones de pares de bases. Si se imprimieran,
esos pares de bases llenaran ms de 1.000 directorios telefnicos. Sin embargo, cuando
los investigadores trataron de dividir las molculas de ADN en partes ms manejables,
terminaron con un caos de fragmentos aleatorios en los que se haba perdido el orden del
ADN original.
Los 46 cromosomas del
ncleo de una clula humana
guardan alrededor de 1,80 metros
de ADN, el mapa gentico de
cada individuo, en este caso un
hombre
como
denota
la
designacin XY. Este ADN est
formado por hasta 3.000 millones
de pares de bases, informacin
suficiente para llenar ms de 1.000
directorios telefnicos.

2.5 Tcnicas o mtodos usados en biologa molecular


Las ventajas de las tcnicas moleculares han sido ampliamente publicitadas en los
ltimos 7 aos, lo que sin duda ha aumentado la presin en los laboratorios clnicos para
comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades infecciosas, genticas,
oncolgicas y neurolgicas.
Actualmente existe una variedad de paquetes comerciales, especialmente en el
rea de las enfermedades infecciosas, que contienen todo lo necesario para realizar un
examen, lo que obviamente ha estimulado a los laboratorios a incluir tcnicas de biologa
molecular en el diagnstico clnico. Sin embargo, y como veremos ms adelante, estos
mtodos moleculares no estn exentos de problemas tanto en su ejecucin como en su
interpretacin, por lo que debieran estar reservados para aquellos laboratorios con
personal familiarizado con estas tcnicas y que tengan la infraestructura necesaria para su
realizacin.
En general, las tcnicas ms usadas son las de deteccin directa por hibridacin,
usando un segmento de ADN marcado, y las tcnicas de amplificacin. Estas ltimas han
tenido una verdadera explosin en su metodologa, como lo demuestra el que en la
actualidad existan por lo menos seis tcnicas diferentes, aunque todas tienen como
finalidad la amplificacin de un segmento de ADN o ARN que ha sido seleccionado como
un marcador para una determinada patologa.

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Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

2.6 Hibridacin por sondas


Las sondas (probes) son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con
enzimas, sustratos antignicos, quimioluminiscencia o radioispotos, los que se pueden
unir con una alta especificidad a una secuencia complementaria de cido nucleico. Estas
sondas pueden ser dirigidas a un segmento de ADN o ARN seleccionado, que puede tener
de veinte a miles de bases de largo. Las sondas de menos de 50 pares de bases son
denominadas oligonucletidos y pueden ser sintetizadas y purificadas con relativa
facilidad por instrumentos comerciales actualmente disponibles.
Las sondas de oligonucletidos tienen la ventaja de hibridar ms rpidamente a las
molculas blanco (target) y pueden, bajo ciertas condiciones, detectar el cambio de un
nucletido dentro de una secuencia de cido nucleico.
Existen varias condiciones que afectan el proceso de unin o hibridacin entre la
sonda y el segmento blanco, como temperatura, concentracin de sal y pH de la reaccin.
Por ejemplo bajas concentraciones de sal y altas temperaturas permiten que slo el
segmento blanco se una a la sonda, mientras que, por el contrario, si la temperatura de la
reaccin es baja, segmentos no complementarios pueden unirse a la sonda. Por lo tanto,
las condiciones deben ser cuidadosamente controladas para evitar falsos positivos.
La deteccin de la hibridacin puede hacerse de varias maneras, dependiendo del
mtodo usado para marcar la sonda. Por ejemplo, si se usa una enzima, la hibridacin se
puede visualizar por un cambio de color y si se usa quimioluminiscencia, por emisin de
luz un luminmetro.

2.7 Indicadores para el uso de sondas o pruebas en el


laboratorio
Las pruebas de hibridacin a menudo disminuyen el tiempo necesario para
identificar organismos fastidiosos. Adems, permiten que los laboratorios puedan
aumentar el nmero de patgenos que pueden ser identificados. En el estudio de costos,
debe considerarse que aunque los exmenes que usan sondas son ms caros que los
mtodos tradicionales, el hecho de tener un resultado en un mnimo de tiempo puede
significar un ahorro para el paciente y el hospital.
Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de una
muestra clnica (expectoracin, orina, etctera) o para confirmar la identificacin de un
cultivo que por otros mtodos tarda varios das (Legionella pneumophila, Chlamydia
trachomatis, etctera). Adems, las sondas pueden ser usadas para hibridacin in situ para
evaluar la respuesta del husped a un agente infeccioso en particular y tambin para
determinar la extensin de la infeccin mediante el estudio de muestras de tejidos de
varios rganos.
La Tabla 1 enumera algunos de los exmenes con sondas disponibles
comercialmente. Muchos de ellos han sido desarrollados por varios fabricantes y slo se
diferencian en la secuencia a la cual est dirigida la sonda.

22

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Tipodeprueba

Organismo
Bacterias
StreptococcigrupoA
Legionellapneumophila
Chlamydiatrachomatis

Deteccindirectadelamuestra

Neisseriagonorrheae
Tricomonasvaginalis
Virus
Papilomahumano
Bacteria
Enterococci
StreptococcigrupoB
Haemophilusinfluenzae
Listeriamonocytogenes
Neisseriagonorrhoeae
Mycobacteriumtuberculosis
Mycobacteriumavium

Confirmacindecultivo

Otrasespeciesdemycobacteria
Hongos
Cryptococcusneoformans
Histoplasmacapsulatum
Blastomycesdermatidis
Coccidioidesimmitis
Virus
Papilomahumano

Tabla 1 ejemplos de organismos que pueden ser detectados por medio de sondas de
cidos nucleicos disponibles comercialmente.

2.8 Tcnicas de amplificacin


Las tcnicas de hibridacin pueden tener una baja sensibilidad debido a que en
algunos casos existe una sola copia de la secuencia en blanco. Por esta razn las tcnicas
de amplificacin, que pueden producir millones de copias de un determinado segmento
de ADN o ARN, han tenido un impacto extraordinario en muchas reas del diagnstico
clnico.
23

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


Como fue mencionado anteriormente, existen varias tcnicas de amplificacin las
cuales varan ligeramente en su mtodo de amplificacin. Unas de las tcnicas de
amplificacin ms usadas en la actualidad, tanto elaboradas en el propio laboratorio como
comercialmente, es la reaccin de la polimerasa en cadena o PCR. Otra tcnica que ha sido
evaluada para el diagnstico es la reaccin de la ligasa en cadena o LCR, en la cual
pequeos segmentos amplificados son posteriormente ligados.
Ambas tcnicas se encuentran disponibles comercialmente y pueden ser
adquiridas en varios formatos de automatizacin. Otras tcnicas de amplificacin, la
mayora sin nombre traducido al espaol, son strand displacement amplificatin (SDA),
isothermal RNA self sustaining sequence replication. reaction, nucleic acid sequencebased amplification (TMA) y la amplificacin por QB replicasa.

2.9 Tcnicas y componentes de la pcr


Esta tcnica es una amplificacin enzimtica in vitro que resulta en una
acumulacin de la secuencia blanco (target). La PCR consiste de un nmero de ciclos
cambios de temperatura que producen:

separacin de las hebras de ADN;

unin del oligonucletido (partidor o primer) al segmento ADN;

extensin que permite a la ADN polimerasa sintetizar el resto de la hebra


complementaria.

Estos ciclos se repiten habitualmente 30 40 veces para obtener un producto que


puede ser fcilmente detectado por medio de un gel de agarosa o por hibridacin en
microplacas.
Con esta tcnica, prcticamente cualquier segmento de ADN de una determinada
bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios
deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicacin clnica que podra
tener la deteccin de un determinado organismo, as como los costos, sensibilidad y
especificidad del examen en comparacin con las tcnicas tradicionales.
En general, las tcnicas de diagnstico molecular estn indicadas cuando un
organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y
largos perodos de incubacin.
Un organismo que cumple los requisitos descritos es el Mycobacterium
tuberculosis y es por ello que existen numerosas tcnicas de amplificacin disponibles
comercialmente, algunas de ellas aprobadas por la oficina de Administracin de Drogas y
Alimentos (FDA) en EE.UU. La sensibilidad de estos exmenes en expectoracin vara de 85
a 95% y la especificidad entre 95 y 97%.
Otros organismos que pueden ser detectados directamente de una muestra clnica
mediante tcnicas de amplificacin comerciales son Chlamydia trachomatis, Neisseria
gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Candida, Tricomonas, virus VIH, virus herpes, virus
hepatitis C, enterovirus y virus papiloma. Actualmente se encuentran en evaluacin
exmenes de amplificacin para una variedad de otros organismos.

24

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

2.9.1 Interpretacin
Debido a la alta sensibilidad de estos exmenes, la interpretacin es en algunos
casos difcil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todava ser
amplificado. Adems, la presencia de un organismo en una determinada muestra no
siempre significa infeccin.
Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda
realizar la determinacin de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias
blanco presentes en el plasma de un individuo

2.10 Falsos positivos debidos a la contaminacin


Uno de los problemas ms graves que enfrenta las tcnicas de amplificacin para
su aplicacin en diagnstico, es la falsa positividad debido a la contaminacin con cidos
nucleicos, la que puede provenir de tres frecuentes:

de otras muestras clnicas que contienen un nmero elevado se secuencias


blanco (contaminacin entre muestras),

de la contaminacin de reactivos, por amplificaciones anteriores

y la ms grave de todas, de la acumulacin de productos de PCR


(amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma
frecuencia.

Por estas razones, los laboratorios que usan tcnicas de amplificacin deben tener
normas estrictas de control de calidad. El Comit Nacional de Normas de Laboratorio
Clnico de USA tiene un documento de regulacin provisorio que es bastante especifico.
En nuestro pas no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran
tratar de cumplir el mnimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el
procesamiento de la muestra y otro para la amplificacin y tener adems el personal
adecuado para realizar estas tcnicas.

2.11 Conclusiones
A pesar del innegable poder de las tcnicas de biologa molecular en el
diagnstico, es errneo pensar que van a reemplazar a los exmenes convencionales para
deteccin de agentes patgenos. Sin embargo, la capacidad de estas tcnicas para
proporcionar un diagnstico definitivo en corto tiempo tendr sin duda, un efecto en el
manejo del paciente y nos ayudarn a entender mejor la patognesis de la infeccin.
Aunque existe la posibilidad de usarlas en todos los microorganismos, las tcnicas
de diagnstico molecular tendrn un mayor impacto en algunos patgenos. Es as que
exmenes rpidos para la identificacin de Micobacterias y la deteccin de resistencia a
las drogas de primera lnea, dar la base para que se tomen ms oportunamente las
decisiones clnicas adecuadas. Tambin, la identificacin rpida de virus Herpes simplex en
el LCR de un paciente con encefalitis dar la oportunidad de comenzar oportunamente la
terapia adecuada, eliminando otros procedimientos ms invasivos.
A medida que se automaticen, con un costo menor y con regulaciones ms
precisas, los laboratorios podrn incorporar estos exmenes en el funcionamiento de
rutina y los facultativos podrn familiarizarse an ms con la interpretacin y con las
ventajas que proporcionan las tcnicas de biologa molecular en el diagnstico.
25

UNIDAD DIDCTICA III


TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
APLICADAS A LA HISTOPATOLOGA

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

3.1 Introduccin
Este conjunto de tcnicas, que han sido tomadas tanto de la gentica molecular
como de la bioqumica, nos permite analizar fenmenos biolgicos y patolgicos en el
nivel molecular. Al igual que la microscopa electrnica y la inmunohistoqumica, estas
tcnicas pueden aplicarse para refinar el diagnstico en Anatoma Patolgica.
Pueden enumerarse las siguientes tcnicas: hibridacin in situ, reaccin en cadena
de polimerasa (PCR), in situ-PCR, anlisis de polimorfismo de fragmentos de restriccin,
Southern blot, Western blot y Northern blot. Todas las tcnicas mencionadas pueden
aplicarse al material obtenido por biopsia, autopsia e incluso muestras citolgicas.
La tcnica de Southern blot permite el anlisis de ADN genmico o fragmentos
definidos de ADN despus de digestin con endonucleasas de restriccin. La tcnica de
Northern blot permite estudiar ARN en forma anloga. El Western blot es una tcnica
inmunolgica derivada , que se utiliza para analizar antgenos proteicos. Las protenas se
separan mediante electroforesis y se transfieren a una membrana slida o membrana o
filtro.
La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente con
sondas marcadas radioactivamente o con enzimas

3.2 Aplicaciones en Anatoma Patolgica


Las aplicaciones actuales de la biologa molecular para el diagnstico clnico son
muy variadas:

Diagnstico y clasificacin de neoplasias y establecimiento de un


pronstico

Detectar reordenamientos de genes

Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalas consistentes


cariotpicas

Detectar reordenamientos moleculares/anomalas de expresin gentica en


ausencia de alteraciones del cariotipo

Estudio de la estructura/expresin de oncogenes

Deteccin de amplificacin gentica/resistencia a drogas

Diagnstico de cell lineage en base a la expresin gentica

3.3 Obtencin del ADN y separacin de fragmentos de ADN.


A un laboratorio de Biologa Molecular de tipo clnico llegan distintos tipos de
muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN. A
priori se plantean dos situaciones diferentes.
Si lo que se pretende es conocer la ubicacin fsica del ADN/ARN de inters en un
corte histolgico se deber proceder a estudios in situ, mientras que si no es
necesario conocer dicha ubicacin ser suficiente con obtener el ADN celular en solucin.
El ADN en solucin es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y
viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.
29

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


Centrndose en la obtencin de ADN en solucin existen diferentes mtodos de
lisis: lisis diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solucin de ADN obtenida no
siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificacin, restriccin,
marcaje o secuenciacin, por lo que es conveniente por un lado separar el ADN del resto
de macromolculas que lo acompaan, preferentemente protenas, proceso que suele
realizarse con ayuda de solventes orgnicos (fenol y cloroformo) y, por otro separar el
ADN de aquellas molculas de pequeo tamao con actividad inhibidora presentes en la
solucin de ADN.
El ADN una vez limpio de protenas y/o pequeas molculas puede ser utilizado
directamente, si bien en la mayora de las situaciones es necesario concentrarlo mediante
ultrafiltracin o precipitacin con alcohol.
El sistema de valoracin de la concentracin de ADN ser funcin de cuales han
sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido.
Pueden emplearse desde mtodos altamente sensibles y exactos como la
espectrofotometra y fluorometra, hasta mtodos aproximativos, tales como
la
comparacin del grado de fluorescencia respecto a un control de concentracin
conocida.
Una vez conocida la concentracin del ADN, ste ser utilizado bsicamente con el
propsito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.En ciertos
casos la simple deteccin del fragmento amplificado tiene valor diagnstico por s mismo.
La metodologa empleada para la deteccin puede ser:

Separacin y visualizacin de dicho fragmento en geles adecuados de


agarosa o poliacrilamida (Ej. deteccin de infeccin por virus de la hepatitis,
SIDA, HPV oncognicos...). En otros casos el valor diagnstico se obtiene
por comparacin de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un
fragmento de caractersticas conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado
del gen supresor p53 en relacin al mismo exon normal...), o bien,

Deteccin del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado


colorimtrico o quimioluminiscente.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnstico se alcanza una vez que el
fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes tcnicas:

30

Corte con enzimas de restriccin. Los fragmentos generados en la


restriccin se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej.
Tipificacin HPV, genotipado ApoE...).

Hibridacin. Los fragmentos generados en el PCR se separan en gel de


agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y
finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificacin de los
genes HLA Clase II...).

Secuenciacin.
Los fragmentos generados durante la reaccin de
secuenciacin se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej.
Secuenciacin de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas
enfermedades...).

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

3.4 Tcnicas de anlisis gentico


Seguidamente describiremos las tcnicas genticas, tanto citogneticas como
estrictamente moleculares, sus caractersticas, ventajas y limitaciones, slo de aquellas que
se han incorporado como rutina diagnstica: cariotipo, hibridacin in situ con
fluorescencia (FISH convencional), y reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), y de
algunas de las que todava son utilizadas como investigacin: hibridacin genmica
comparada (CGH), cariotipo espectral (SKY-FISH) y multiplex-FISH (M-FISH).

3.4.1 Anlisis Citognico


3.4.1.1 Citogentica convencional (cariotipo de bandas G)
El anlisis citogentico convencional consiste en el estudio de las alteraciones
cromosmicas en las metafases de las clulas neoplsicas obtenidas tras el cultivo "in
vitro", a corto plazo y sin mitgenos de clulas de mdula sea, sangre perifrica,
ganglios, biopsias, etc. El estudio de la morfologa de los cromosomas, teidos
fundamentalmente con bandas G (Tripsina-Giemsa), permite detectar en un nico
experimento, tanto las alteraciones numricas (monosomas, trisomas, etc.), como las
estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones, etc.) presentes en todo el genoma.

3.4.1.2 Citogentica molecular (hibridacin "in situ" con fluorescencia)


Las tcnicas de hibridacin in situ con fluorescencia (FISH) se basan en la
hibridacin de una sonda de ADN marcada con una sustancia fluorescente sobre su
secuencia complementaria del genoma, bien en la metafase cromosmica o en el ncleo
en interfase. Las tcnicas de FISH vienen utilizndose desde los aos 8028, si bien no se
han incorporado en todos los laboratorios de gentica como rutina. La alta sensibilidad y
especificidad del FISH y la rapidez de los ensayos han hecho de esta tcnica una
importante estrategia diagnstica con numerosas aplicaciones. Por otra parte, otras
tcnicas derivadas del FISH han progresado hasta tal punto que hoy es posible, como
veremos ms adelante, utilizar simultneamente 24 sondas de pintado cromosmico,
consiguiendo identificar cada cromosoma por su color. Entre las tcnicas derivadas del
FISH convencional, cabe destacar, la hibridacin genmica comparada (CGH), de enorme
utilidad en tumores slidos y el cariotipo multicolor (SKY-FISH y M-FISH). Todas ellas,
constituyen una nueva disciplina a la que se ha denominado "citogentica molecular", que
complementan, pero nunca excluyen al anlisis citogentico convencional (cariotipo de
bandas G).

3.4.1.3 FISH convencional


Los dos componentes principales de la tcnica de FISH convencional son la sonda
de ADN marcada con fluorescencia y la secuencia diana en la muestra tumoral para la cual
es especfica. Es muy importante destacar que no es una tcnica de bsqueda de nuevas
alteraciones cromosmicas, sino que detecta nicamente aquello que buscamos. El resto
del genoma permanece oculto.
Podemos utilizar sondas de ADN de distintos tipos: centromricas (marcan
nicamente las zonas centrmericas), de pintado cromosmico (marcan todo un
cromosoma) o de secuencias especficas de locus ( marcan regiones cromosmicas de
secuencia nica).
Esta tcnica complementa perfectamente a la citogentica convencional en todas
aquellas situaciones en las que no ha sido posible realizar un cariotipo: al disponer de
metafases de poca calidad, o no haber obtenido metafases, o bien en los casos en los que
31

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


las alteraciones cromosmicas asociadas a un diagnstico son crpticas no visibles en el
cariotipo, como el caso de la t(12;21) en leucemia aguda linfoblstica infantil.

3.4.1.4 CGH (hibridacin genmica comparada)


Como ya se ha mencionado, uno de los mayores problemas a los que se enfrenta
la citogentica convencional, es la ausencia de metafases y su gran ventaja reside en ser
una tcnica que permite analizar todo el genoma. La tcnica de FISH convencional ha
resuelto el primer problema, ya que permite analizar ncleos en interfase, pero en cambio
su gran limitacin es que no es una tcnica de screening, como el cariotipo, ya que slo
detecta las alteraciones que buscamos. A principio de los 90, y con especial aplicacin en
tumores slidos, en donde obtener metafases de calidad es a menudo complicado, se
describi una nueva tcnica de citogentica molecular: la hibridacin genmica
comparada (CGH). Esta tcnica emplea ADN del tumor y, adems, no analiza metafases,
obviando la necesidad de clulas en crecimiento.
Esta tcnica derivada del FISH se basa en la hibridacin competitiva de dos ADNs,
(tumoral y control normal) marcados con distintos fluorocromos, sobre cromosomas
normales. En resumen: se marca el ADN del tumor con un fluorocromo verde y un ADN
normal (control) con un fluorocromo rojo. Ambos ADNs se mezclan en cantidades
equimolares y se realiza una hibridacin in situ sobre cromosomas metafsicos normales.
Ambos ADNs compiten por hibridar en los mismos lugares cromosmicos. En condiciones
normales (tumor sin alteraciones genticas), como la cantidad de ADN marcado en rojo y
verde es la misma, el resultado final son cromosomas amarillos (mezcla 1:1 de rojo y
verde). En condiciones patolgicas, si el tumor contiene alguna ganancia cromosmica, la
cantidad de ADN tumoral disponible para hibridar es mayor, y la hibridacin de esa zona
resultar en una mayor proporcin de fluorocromo del tumor (verde). Al contrario, si el
tumor contiene una delecin (prdida), la regin delecionada del tumor aparecer en rojo,
ya que habr ms cantidad de ADN normal (rojo) para hibridar en esa regin
cromosmica. La CGH permite, por tanto, la deteccin de ganancias y prdidas de
regiones cromosmicas en todo el genoma del tumor por la comparacin de las
intensidades de las seales de hibridacin.
La CGH ha contribuido significativamente al conocimiento actual de las
alteraciones genmicas en las neoplasias humanas. Adems de definir patrones de
ganancias y prdidas especficas de tumor, proporciona informacin para la identificacin
de nuevos genes implicados en el cncer. Actualmente esta tcnica se utiliza sobre todo
para detectar alteraciones cromosmicas en tumores slidos, donde la obtencin de
metafases presenta muchas dificultades tcnicas. En slo 8 aos desde su aparicin, se
han publicado ms de 3.900 trabajos de CGH en tumores, de los que slo 1/10
corresponden a leucemias y linfomas. En neoplasias hematolgicas, la CGH est casi
restringida a sndromes linfoproliferativos crnicos, ya que en stos, el ndice mittico de
las clulas tumorales es generalmente muy bajo.
Todas las alteraciones cromosmicas, ganancias y prdidas, descritas en cncer por CGH
pueden ser consultadas en la base de datos actualizada de la Universidad de Helsinki
(http://www.helsinki.fi/~lgl_www/CMG.html).

3.4.1.5 Cariotipo multicolor (SKYFISH y MFISH)


El cariotipo espectral (SKY-FISH)38 y el multi-FISH (M-FISH) son tcnicas de
citogentica molecular desarrolladas recientemente, y de momento slo se utilizan en el
campo de la investigacin. Su fundamento tcnico es sencillo. En resumen: consiste en
32

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


marcar el ADN de cada cromosoma con uno o varios fluorocromos, de manera que el
espectro de emisin de cada cromosoma sea nico y diferenciable de los dems. Esta
tcnica, por tanto, pinta a cada cromosoma de un color. Con el "cocktail" de 24 sondas de
pintado cromosmico obtenido tras el marcaje, se hibrida sobre los cromosomas de las
metafases del tumor, el cromosoma anmalo aparecer no uniforme, sino con los colores
de los cromosomas que intervienen en la translocacin. Por tanto, es una forma de realizar
un cariotipo, pero teido no con bandas G sino con colores, de forma que podamos
clasificar las alteraciones de forma unvoca.
El cariotipo multicolor se ha mostrado muy til en neoplasias hematolgicas,
donde no es difcil obtener metafases tumorales. Se han podido caracterizar
correctamente translocaciones complejas, y tambin detectar alteraciones cromosmicas
crpticas en cariotipos aparentemente normales. Esto ha permitido identificar un gran
nmero de nuevas alteraciones crommicas (Fig. 1), lo que ha facilitado la bsqueda de
nuevos genes implicados. Su uso en tumores slidos es ms limitado por la necesidad de
obtener metafases de calidad, aunque de todo lo expuesto, es la nica tcnica que
permitir averiguar el origen de las mltiples alteraciones cromosmicas que
habitualmente aparecen en los cariotipos de tumores slidos. No obstante, las
aplicaciones de esta tcnica son crecientes, y ya son cerca de 700 casos las neoplasias
humanas analizadas por SKY-FISH, de las cuales 410 son leucemias y linfomas y 146
tumores slidos. La direccin: http://www.spectral-imaging.com, proporciona informacin
tcnica, un sumario de aplicaciones y una lista actualizada de publicaciones relevantes
sobre el cariotipo espectral.

Las mejoras tcnicas del cariotipo multicolor avanzan con gran rapidez y ya se est
optimizando el M-FISH con bandas multicolor.
33

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

3.4.2 Anlisis molecular


La tcnica que habitualmente se emplea, a nivel no slo diagnstico, sino en la
monitorizacin de pacientes con neoplasias es la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Cuando los genes son de gran tamao con puntos de rotura variables o en aquellos
casos de genes muy promiscuos (MLL y BCL6, entre otros), se prefiere el Southern Blot o el
FISH convencional.

3.4.2.1 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)


Desde su descripcin en 1985 por Kary Mulis, la PCR probablemente representa
uno de los ms importantes avances metodolgicos en biologa molecular. Esta tcnica,
que tiene multitud de aplicaciones, permite amplificar secuencias especficas de ADN o
ARN multiplicando por 106 el nmero de copias que podemos obtener de un
determinado fragmento de ADN.
Una de las aplicaciones ms frecuentemente empleadas de la PCR en neoplasias es
detectar translocaciones. La caracterizacin molecular de las translocaciones
cromosmicas observadas en el cariotipo y asociadas a determinados tipos de tumor, ha
permitido la identificacin de los genes responsables. La posterior clonacin y
secuenciacin de dichos oncogenes permiten el estudio de las translocaciones a nivel
molecular, mediante el anlisis de ADN o fundamentalmente ARN con la tcnica de la RTPCR (PCR reversa).
Un ejemplo caracterstico sera analizar la reordenacin Bcl2-IgH asociada a
linfoma folicular. Actualmente, su uso es necesario como complemento al cariotipo o al
FISH convencional en el diagnstico y en la monitorizacin de pacientes con neoplasias.
Aunque la mayor parte de los anlisis mediante PCR son cualitativos, indicando
slo ausencia o presencia de la alteracin, en la monitorizacin de la respuesta al
tratamiento o de la EMR es importante la cuantificacin de sta mediante PCR en tiempo
real (real-time PCR)45, en la que se detecta el producto especfico a medida que se
produce, de manera que la comparacin de su nivel de amplificacin con los estndares
adecuados proporciona una medida cuantitativa del grado de afectacin.
Adems de la PCR utilizada en la rutina diagnstica para la deteccin de
translocaciones, existen otras muchas tcnicas moleculares de gran inters en la gentica
del cncer. Entre ellas, el anlisis de mutaciones de genes supresores tumorales y
oncogenes o la tecnologa de microarrays que, aunque de momento, se utilizan como
investigacin, en un futuro no muy lejano con la aplicacin de nuevos sistemas
robotizados como los chips o microarrays de ADN, permitirn el anlisis simultneo de un
gran nmero de genes y de sus niveles de expresin en una muestra. La aplicacin de
estos nuevos sistemas diagnsticos permitir establecer terapias especficas, de acuerdo a
la alteracin molecular detectada.

34

UNIDAD DIDCTICA IV
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
EN FASE LQUIDA Y CON MEMBRANA

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

4.1 Introduccin
Las tcnicas de biologa molecular que utilizan membranas o las que utilizan
sondas y ADN diana en medio lquido estn poco extendidas en los laboratorios de
Anatoma Patolgica. La razn fundamental es que, a pesar de sus muchas ventajas, no
permiten visualizar la morfologa del espcimen.

4.2 Mtodos de Membrana


Describiremos los ms utilizados en Anatoma Patolgica:

4.2.1 Hibridacin in situ con filtro (HISF)


Este mtodo no precisa de extraccin de ADN y analiza muestras obtenidas por
raspado o con torunda o cepillo. Las clulas se aplican directamente sobre un filtro el cual
se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalizacin del ADN. El
mtodo HISF es de muy fcil ejecucin, rpido y barato es ,sin embargo, poco especfico y,
a menudo, resulta difcil separar las seales positivas del fondo. Su uso se limita a trabajos
con gran cantidad de especimenes.

Hibridacin Southern Blot (SB)


O hibridacin con sondas. Necesita de la extraccin del ADN de la muestra con
fenol/cloroformo y de la eliminacin de ARN y protenas de la misma por digestin
enzimtica. Con la aplicacin de endonucleasas de restriccin-la enzima Pst I es la mas
utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaos
ofreciendo un patrn caracterstico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizndose
una separacin electrofortica de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser
visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una
membrana realizndose una hibridacin. El SB es el mtodo de referencia actual para el
tipaje de HPVs. La especificidad de esta tcnica es superior a cualquier otra debido a la
purificacin extra del ADN por electroforesis. Adems es el nico mtodo que permite
conocer si el genoma viral est en situacin episomal o integrado en el ADN celular. Las
desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad tcnica, duracin de la misma
y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material
fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.
Esta tcnica consta bsicamente de las siguientes etapas:

Digestin del ADN con enzimas de restriccin tras conseguir extraer un


ADN de alta molecularidad.

Separacin de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis


en gel de agarosa.

Desnaturalizacin de los fragmentos separados y cortados.

Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o


nylon y fijacin de las mismas por medio de calor (80C).

Prehibridacin con sondas de ADN inespecfico para bloquear los lugares


de unin inespecficos que pudiera haber en la membrana.

Marcaje de la sonda con nucletidos radioactivos (32 P normalmente).

37

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

Hibridacin de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de


ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el
exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.

Revelado en placa radiogrfica e interpretacin de los resultados.

El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:


-

Sondas Mono-locus (SLP): son especficas para una regin de un


determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucletidos y
presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como resultado
se observan una o dos bandas por individuo, segn sea homocigoto o
heterocigoto. El patrn de bandas obtenido con estas sondas se denomina
perfil unilocus de ADN o DNA profiling

Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatlites presentes


en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15
nucletidos que se repiten mltiples veces y tras el revelado se observan de
10 a 20 bandas por persona. Este patrn de mltiples bandas se conoce
como huella gentica multilocus o DNA fingerprint.
Sondasmultilocus

Sondasunilocus

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes


con respecto a una serie de parmetros como son:

38

Informacin aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad


discriminativa al aparecer mltiples bandas. No obstante, las mono-locus
son ms especficas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de
mayor tamao.

Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se requiere


aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no
necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el
fragmento complementario a la sonda est intacto.

Especificidad entre especies: las sondas multi-locus permiten su uso sobre


el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las
mono-locus son exclusivas de ADN humano.

4.3 Blot invertido (BI)


Es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con diferentes DNAHPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reaccin
individual para cada espcimen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias
HPV/clula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espcimen.

4.4 El Dot/Spot Blot (DB)


Consiste en la extraccin del ADN celular total y en su desnaturalizacin, despus
se fija a una membrana por medio de presin negativa en un aparato manifold. Tambin
se puede realizar la desnaturalizacin en la misma membrana. Una vez realizada la
hibridacin se produce la autorradiografa, si se emplearon sondas calientes o el revelado
enzimtico, si se utilizaron fras. Con el DB se pueden analizar de una vez ms de 100
especimenes mientras que el SB no admite ms de 15. Uno de los problemas ms
importantes del DB es el "fondo" provocado por las hibridaciones inespecficas. Este
problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los hbridos ARN-ADN
tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecficas pueden
eliminarse con la aplicacin de ARNasa.

4.5 Hibridacin Sandwich (HS)


No necesita extraccin del ADN. Esta tcnica utiliza una sonda con dos fragmentos
separados, cada uno con una regin complementaria con el cido nucleico diana. Un
fragmento se une al filtro y fija la secuencia especfica de HPV al mismo. El segundo de los
fragmentos est marcado y se fija al hbrido anclado en la membrana permitiendo su
deteccin. La HS es un mtodo con una especificidad estimada en 1-5 X 105 molculas de
ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios
inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra,
adems, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra,
superior a 5 X 105 (3).

4.6 Hibridacin Northern


Se utiliza para la deteccin de RNA de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa
por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehdo. Seguidamente se
hibridan con sondas ARN antisense o ADN.
En todos los sistemas de hibridacin descritos anteriormente el cido nucleico
diana est localizado en un soporte slido, bien una membrana o una biopsia o extendido
citolgico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el cido nucleico se
encuentra disuelto en un lquido.

39

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

4.7 Mtodos de hibridacin en la fase lquida


En la hibridacin en fase lquida, la sonda y el HPV diana estn en solucin. La
hibridacin en fase lquida ha sido utilizada para estimar la relacin gentica entre los
diferentes HPVs, hoy da es de escaso uso.
El sistema de captacin de hbridos tambin se realiza en medio lquido. Primero se
desnaturaliza el espcimen, posteriormente se hibrida el HPV ADN con la correspondiente
sonda. Los hbridos son capturados por la superficie del recipiente, cubierta con
anticuerpos anti-hbridos que reaccionan con fosfatasa alcalina, hacindose visibles tras la
aplicacin de un sustrato quimioluminiscente.
Los sistemas captacin de hbridos estn todava en fase experimental, las pruebas
iniciales permiten suponer una elevada sensibilidad y fcil manejo de la tcnica.

4.8 Mtodos de amplificacin genmica


La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza una enzima, la
polimerasa, para copiar a una determinada molcula de un cido nucleico, habitualmente
un ADN. La repeticin de este proceso origina la produccin de un gran nmero de
molculas hijas puesto que las nuevas molculas son utilizadas por la polimerasa como
moldes.
El proceso se inicia con la separacin de las dos cadenas que configuran la
molcula de ADN o por el calentamiento de solucin en la que encuentra el ADN a unos
90. Tras un descenso trmico de la solucin se produce el "anillamiento" o hibridacin de
dos secuencias diferentes de nucletidos, denominados "primers" o "cebadores" que
delimitan el fragmento de ADN a amplificar. Con el concurso de la polimerasa se van
aadiendo los nucletidos presentes en la solucin, fase denominada de "extensin" de
los cebadores. Cada uno de estos ciclos se repite un nmero determinado de veces en un
aparato denominado termociclador que permite ascensos y descensos trmicos
programables.
El hecho de que las molculas hijas sirven a su vez de molde para sintetizar nuevos
ADNs produce un efecto multiplicador, producindose aproximadamente 106 copias de
ADN en unos 30 ciclos. El ADN amplificado se puede detectar por medio de una reaccin
de hibridacin o bien por medio de una electroforesis en gel con bromuro de etidio y una
fuente de luz ultravioleta para su identificacin.
El avance que hizo posible la tcnica de la PCR fu el descubrimiento de
polimerasas capaces de actuar a temperaturas elevadas. La primera de ellas fu la que
contienen las bacterias denominadas Thermus aquaticus o polimerasa Taq y que se hallan
en manantiales donde las aguas termales estn a menudo a temperaturas superiores a
90.
Antes del descubrimiento de esta polimerasa se realizaban tcnicas de
amplificacin de ADN con el fragmento de Klenow como polimerasa ADN, pero esta
enzima es inestable a temperaturas superiores a los 37,con lo que era necesario aadir
una dosis de enzima en cada ciclo de amplificacin lo cual resultaba extraordinariamente
tedioso a la par que se acumulaban grandes cantidades de enzima degradada.
El descubrimiento de la Taq polimerasa evit la necesidad de aadir enzima en
cada ciclo de amplificacin, facilitando as la automatizacin del proceso.

40

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


La extraordinaria sensibilidad de la
tcnica de PCR, que permite detectar una copia
viral en un milln de clulas es un arma de gran
valor en la deteccin de infecciones HPV,
especialmente en aquellas con un bajo nmero
de copias vricas, como es el caso de la
infeccin oculta. El problema ms importante
de las tcnicas de amplificacin genmica es la
contaminacin de la reaccin con ADNs
extraos, en cualquiera de sus fases,
produciendo resultados falsamente positivos.
La adopcin de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de
separacin de especimenes y reactivos o de "primers" anticontaminacin permite la
obtencin de resultados fiables. Otra desventaja de la reaccin de PCR es la no
amplificacin de genomas cuando no existen "primers" especficos, con la imposibilidad
de detectar nuevos tipos de HPVs.

4.8.1 Principios de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)


La tcnica de PCR fue reportada por primera vez en 1985; de esa fecha hasta ahora
esta metodologa ha experimentado numerosas modificaciones, siendo la ms importante
de ellas la ocurrida en 1986 donde se introdujo por primera vez el uso de una polimerasa
termoestable, la Taq polimerasa, lo cual implic un cambio radical en la tcnica y su
definitiva aceptacin por la comunidad cientfica internacional.
Durante la Reaccin en Cadena de la Polimerasa "se multiplica" un fragmento de
cido nucleico hasta 109 veces, la reaccin imita un fenmeno de replicacin del ADN que
ocurre en forma natural en la clula. La reaccin "in vitro" necesita la presencia de una
cadena de ADN "diana" donde esta incluido el fragmento que se puede amplificar, un par
de cebadores (cadenas simples de ADN, entre 15-30 nucletidos) que limitan la talla del
segmento que se va amplificar, nucletidos que son precursores de las nuevas cadenas
de ADN (adenina, timina, guanina y citosina) y la enzima polimerasa, taq polimerasa, la
cual usando como inicio los cebadores va a formar las cadenas nuevas.
La reaccin tiene lugar en tres fases.
1. Durante la primera o desnaturalizacin el fragmento original de ADN se
calienta hasta una temperatura de 92 a 96 C; esto provoca la separacin
de las dos cadenas.
2. En la segunda fase, llamada hibridacin, la temperatura de la mezcla se
rebaja hasta 40-60 C para que los cebadores se enlacen con el ADN
escindido.
3. En la tercera fase de extensin o polimerizacin, la temperatura de la
mezcla se eleva hasta 72 C para la extensin, una enzima la Taq DNA
polimerasa la cual es termoestable y es la que en buena cuenta ha
permitido la optimizacin del proceso PCR en una forma relativamente
sencilla, copie rpidamente la molcula de ADN.
Estas tres fases constituyen un ciclo completo de PCR, que se realiza en menos de
dos o tres minutos. Tericamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin lmite, pero la
polimerasa, los nucletidos y los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos.
41

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones
de copias de ADN. Esta caracterstica identifica a la PCR como una herramienta poderosa
y valiosa en todos los campos de la Biomedicina.
En el terreno del diagnstico de las enfermedades infecciosas, la PCR detecta
directamente en diferentes tipos de muestras, patgenos tradicionalmente difciles de
cultivar tales como, Clamidia, Legionella y Micoplasma y/o aquellos que requieren de
largos perodos para su desarrollo in vtro y/o que se encuentra en muy baja
concentracin en los lquidos biolgicos y son difciles de aislar, como es el caso del
Mycobaterium tuberculosis, enfermedad en la que muchas veces el tratamiento emprico
tiene que iniciarse antes del diagnstico definitivo, apoyndose nicamente en el cuadro
clnico.

Figura: La tcnica de PCR. El ADN que contiene la secuencia que deseamos


amplificar debe ser sometido a altas temperaturas para provocar la desnaturalizacin
y la apertura de las cadenas del ADN; luego la temperatura desciende en forma
controlada hasta 50C (esta temperatura es variable segn cada protocolo) para
permitir la hibridacin de los cebadores especficos. Posteriormente la polimerasa
sintetizar una nueva cadena de ADN complementaria a partir de la secuencia
especfica. La repeticin de este ciclo (por lo menos 30 veces) produce un aumento
exponencial (alrededor de 106 veces) de la secuencia deseada y su posterior
visualizacin por tcnicas de electroforesis (Figura siguiente).

42

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Figura: Amplificacin por PCR empleando los oligonucletidos para la regin


VDJ del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. En el gel de
electroforesis se pueden observar 2 muestras con patrn policlonal (lneas 3 y 4)
correspondientes a infiltrados inflamatorios reactivos, 2 muestras con patrn
clonal correspondientes a un linfoma no Hodgkin B de bajo grado [linfoma
linfoctico] (en la lnea 5) y a un linfoma B de alto grado [linfoma de clulas
grandes] (en la lnea 6), dos marcadores de peso molecular (lneas 1 y 7) y un
control negativo sin amplificacin (lnea 2).

Mediante el uso de la PCR se puede identificar en una pequea muestra biolgica


al Mycobacterium tuberculosis, en tan slo 4 horas, en lugar de las 6 semanas que toman
las tcnicas del cultivo convencionales con una alta sensibilidad y especificidad
En virologa, esta tecnologa nos permite identificar al agente infeccioso
independientemente de su respuesta serolgica, una gran ventaja en el diagnstico de
algunas enfermedades virales en los cuales los anticuerpos aparecen luego de un largo
perodo de la infeccin y a veces en forma impredecible o en aquellos numerosos casos
donde se quiere precisar si la presencia de anticuerpos es seal de infeccin antigua o
activa como puede ser el caso del hallazgo de anticuerpos a Hepatitis C y la necesidad de
precisar si el virus est presente o no.
Tambin es de gran aplicacin en el diagnstico de enfermedad viral neonatal
donde el diagnstico serolgico de la infeccin es generalmente enmascarado por la
presencia de anticuerpos matermos circulantes por ejemplo el VIH.
En la actualidad ya se dispone de sistemas de identificacin de Chlamydia
trachomatis, Dengue y sus serotipos, Helicobacter pilori , HIV, Hepatitis C, Mycobacterium
tubercu-loss, Neisseria gonorrheae, Papiloma virus y sus diferentes tipos, Mycoplasma
pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, Herpes simple, Citomegalovirus, Treponema
pallidium, etc.
Adems la tcnica ofrece una alternativa novedosa para investigar la evolucin y
diversificacin de los microorganismos en una forma rpida y sencilla, las investigaciones
en esta rea bsica han tenido implicaciones muy importantes desde el punto de vista
epidemiolgico y ha implicado el desarrollo de una nueva ciencia conocida como
Epidemiologa Molecular.
43

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En el megaproyecto internacional "Genoma Humano" la PCR y las microtcnicas de
secuenciacin han permitido un avance mucho ms rpido que lo previsto.
Tambin se ha introducido el uso de PCR para el estudio del complejo mayor de
histocompatibilidad que son los antgenos HLA, especialmente, los de la regin HLA-D
conocidos en la actualidad como molculas HLA de clase II. Con ello, se puede realizar
pruebas de paternidad y la identificacin de tejidos.
En criminalstica esta tcnica ha revolucionado la identificacin de los delincuentes
ya que obteniendo una mnima muestra de los sospechosos se puede amplificar el ADN
y conocer la huella gentica de los mismos.

4.9 Tcnicas moleculares en el diagnstico de la ETS


4.9.2 PCR: Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Variantes:

RT-PCR

Nested PCR

Semi Nested PCR

Deteccin de productos de PCR en gel de agarosa y coloracin con BET

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Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

4.9.3 Equipamiento Laboratorio PCR


reaprePCR,readeextraccinde
cidosnucleicos

reapostPCR,amplificaciny
fotodocumentacin
Termociclador

Pipetasautomticas

Pipetasautomticas

Microcentrfuga

Hornodehibridacin

Bloquetrmico
Vortex

Equipodeelectroforesisen
agarosa/acrilamida/secuencia

Hielo

Sistemafotodocumentacinconsoftware

Materialdesechable:

Materialdesechable:

Puntasdepipetaconfiltro

Puntasdepipetaconfiltro

Tuboseppendorf

Tuboseppendorf

Guantes

Guantes

4.9.4 Cuidado con la contaminacin!


Contaminacinentremuestras
Utilizarmaterialdeunsolouso
Utilizarpipetasdedesplazamiento
positivopuntasconfiltro
Abrirlostubosunoauno

Contaminacinporproductoamplificado
SepararFSICAMENTElaszonasdeprey
postPCR
Utilizarmaterialdelaboratoriodiferenteen
ambaszonas.
Utilizarmtodosdedescontaminacin

Contaminacinporambiente
Notrabajarconplsmidos
recombinantes

LuzUV
HCl
Enzimas:UracilNGlycosylase(UNG)
UtilizarreactivosprePCRyapreparados,
analizadosyconservadosenalcuotas.

45

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4.9.5 Deteccin / Identificacin VPH


Amplificacin de una regin comn a todos los VPH

46

Regin L1 open reading frame (Manos et al, 1990)

Tipado por digestin con enzimas de restriccin

Bsqueda de enzimas que permitan identificar el mayor nmero de tipos


(software)

Interpretacin del patrn de bandas por electroforesis (digitalizacin +


software)

Cada tipo de virus ha de presentar un patrn de restriccin distinto y


caracterstico.

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


Tipificacin de VPH mediante enzimas de restriccin

Termociclador de efecto Peltier con bloque intercambiable (tubos y microplacas de


96 pozos)

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UNIDAD DIDCTICA V
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR IN SITU

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

5.1 Hibridacin in situ


Las tcnicas "in situ" tienen la gran ventaja de que son las nicas tcnicas de
biologa molecular que permiten en un solo acto correlacionar positividad o negatividad
con la morfologa de la lesin. Este hecho es de incalculable valor para una especialidad
esencialmente morfolgica, como es la Anatoma Patolgica.
La hibridacin in situ es la hibridacin de fragmentos marcados de ADN de una
hebra o de ARN con secuencias complementarias (sondas) a ADN/ARN celular, que en
condiciones apropiadas forman hbridos estables.
En general, la hibridacin puede hacerse sobre soportes slidos (filtros de nylon o
nitrocelulosa), en solucin (in vitro) o en cortes de tejido o preparaciones celulares (in
situ). Se pueden utilizar sondas marcadas con elementos radioactivos, pero como se
necesita proteccin y manipulacin especiales , no son de eleccin para su uso rutinario.
Las tcnicas no-isotpicas o colorimtricas son ms rpidas y permiten una
localizacin ms precisa de la reaccin. Las sondas marcadas sin elementos radioactivos
son ms estables y ms baratas. La sensibilidad es igual o levemente inferior a la de los
mtodos isotpicos. Se han utilizado sondas marcadas con biotina y digoxigenina.
La sensibilidad de la tcnica depende de:

Efecto de la preparacin del tejido sobre la retencin y accesibilidad de


ADN celular blanco o ARN.

Tipos de sondas, eficiencia de la marcacin de la sonda y sensibilidad del


mtodo utilizado para la deteccin de la seal.

Efecto de las condiciones de hibridacin in situ sobre la eficiencia de la


hibridacin.

La hibridacin in situ se utiliza primordialmente en la deteccin de bajo nmero de


copias de virus, en particular virus como agentes infecciosos (CMV) y como agentes
carcingenos (HPV, HBV, EBV).
En la tcnica de in PCR-in situ se realiza primero amplificacin de ADN blanco y
luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas ADN/ARN. De esta
manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma viral.
Se utiliza en cortes histolgicos y en extendidos citolgicos. La sonda se aplica
directamente sobre el espcimen (no requiere extraccin del ADN), previamente tratado
con una proteasa para permitir su acceso al ADN nuclear. La desnaturalizacin del ADN
diana y de sonda marcada se realiza simultneamente utilizando elevadas temperaturas
(alrededor de 100 C). La HIS es una tcnica mucho menos sensible que los mtodos de
membrana, necesitando 100 veces mas copias virales que el dot blot o que el southern
blot, aunque puede ser tan efectiva como aquellas cuando el tipo infectante es 6/11 o 16
y cuando la lesin muestra los cambios histolgicos tpicos de lesin HPV. Cuando el
condiloma se acompaa de displasia, la HIS disminuye la rentabilidad segn el grado de la
misma, lo cual refleja la disminucin del nmero de copias virales con la progresin de la
lesin. Otro problema es que precisa de tejido, puesto que aunque se puede practicar en
frotis citolgicos sus resultados no son tan buenos como con material procedente de una
biopsia. La HIS tiene la gran ventaja de que permite la visualizacin al microscopio del
lugar donde tuvo lugar la hibridacin, motivo por el cual es la tcnica de hibridacin con
cidos nucleicos preferida por los anatomopatlogos.
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5.2 PCR in situ


La tcnica PCR, como es sabido, utiliza una enzima, la polimerasa, para copiar a
una determinada molcula de un cido nucleico, habitualmente un ADN. La repeticin de
este proceso origina la produccin de
Un gran nmero de molculas hijas puesto que las nuevas molculas son utilizadas
por la polimerasa como moldes. El proceso se inicia con la separacin de las dos cadenas
que configuran la molcula de ADN o por el calentamiento de solucin en la que
encuentra el ADN a unos 90.
Tras un descenso trmico de la solucin se produce el "anillamiento" o hibridacin
de dos secuencias diferentes de nucletidos, denominados "primers" o "cebadores" que
delimitan el fragmento de ADN a amplificar. Con el concurso de la polimerasa se van
aadiendo los nucletidos presentes en la solucin, fase denominada de "extensin" de
los cebadores. Cada uno de estos ciclos se repite un nmero determinado de veces en un
aparato denominado termociclador que permite ascensos y descensos trmicos
programables.
El hecho de que las molculas hijas sirven a su vez de molde para sintetizar nuevos
ADNs produce un efecto multiplicador, producindose aproximadamente 106 copias de
ADN en unos 30 ciclos. El ADN amplificado se puede detectar por medio de una reaccin
de hibridacin o bien por medio de una electroforesis en gel con bromuro de etidio y una
fuente de luz ultravioleta para su identificacin. El avance que hizo posible la tcnica de la
PCR fu el descubrimiento de polimerasas capaces de actuar a temperaturas elevadas.
La primera de ellas fu la que contienen las bacterias denominadas Thermus
aquaticus o polimerasa Taq y que se hallan en manantiales donde las aguas termales
estn a menudo a temperaturas superiores a 90. Antes del descubrimiento de esta
polimerasa se realizaban tcnicas de amplificacin de ADN con el fragmento de Klenow
como polimerasa ADN, pero esta enzima es inestable a temperaturas superiores a los
37,con lo que era necesario aadir una dosis de enzima en cada ciclo de amplificacin lo
cual resultaba extraordinariamente tedioso a la par que se acumulaban grandes
cantidades de enzima degradada.
El descubrimiento de la Taq polimerasa evit la necesidad de aadir enzima en
cada ciclo de amplificacin, facilitando as la automatizacin del proceso.
La extraordinaria sensibilidad de la tcnica de PCR, que permite detectar una copia
viral en un milln de clulas es un arma de gran valor en la deteccin de infecciones HPV,
especialmente en aquellas con un bajo nmero de copias vricas, como es el caso de la
infeccin oculta. El problema mas importante de las tcnicas de amplificacin genmica es
la contaminacin de la reaccin con ADNs extraos, en cualquiera de sus fases,
produciendo resultados falsamente positivos.
La adopcin de medidas, como el uso de pipetas de desplazamiento vertical, de
separacin de especmenes y reactivos o de "primers" anticontaminacin permiten la
obtencin de resultados fiables. Otra desventaja de la reaccin de PCR es la no
amplificacin de genomas cuando no existen "primers" especficos, con la imposibilidad
de detectar nuevos tipos de HPVs.
La tcnica PCR in situ adapta la tecnologa habitual de la PCR a un corte
histolgico. Se puede utilizar un termociclador convencional con alguno "trucos", o bien
recurrir a un termociclador especfico para PRC in situ.
52

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


La reaccin es un proceso cclico:

La molcula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice


y se separe las dos hebras.

Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la


ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus
aquaticus, as la enzima puede trabajar a altas temperaturas).

Las cadenas recin formadas son separadas de nuevo por el calor y


comienza otro nuevo ciclo de copias. Estos ciclos se repiten hasta que se
obtiene el nmero de copias deseado.

Como curiosidad indicar que la potencialidad de esta tcnica es impresionante, a


partir de una sola molcula de ADN, la PCR puede generar 100000 millones de molculas
idnticas en una tarde.
La tcnica fue desarrollada por K.B.
Mullis a partir de 1983. Cada ciclo dura
aproximadamente 5 minutos y para conseguir
una cantidad til se requieren al menos 20
ciclos de reacciones.
Se realiza de forma automtica en un
aparato como se ve en la fotografa, con lo
que se consigue un clonaje rpido en un
sistema libre de clulas.

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5.3 Tcnica mixta de amplificacin LCR


El principio bsico de cualquier tecnologa diagnstica molecular es la deteccin
de una secuencia especfica de cidos nucleicos mediante hibridacin con una secuencia
complementaria, la sonda, seguida de la deteccin del hbrido. Sin embargo, la
sensibilidad de los tests que utilizan sondas de cidos nucleicos sin recurrir a la
amplificacin es inferior a la de los tests clsicos. Su aplicacin principal es la identificacin
de microorganismos ms que su deteccin.
La replicacin del ADN fue posible en 1958 cuando Kornberg descubri la ADN
polimerasa; durante muchos aos la principal aplicacin fue la secuenciacin de ADN
(Sanger et al.). En 1986 Mullis et al. describieron un proceso reiterativo que permita
incrementar exponencialmente el nmero de cidos nucleicos (amplificacin).
Las tcnicas de amplificacin pueden clasificarse de diferentes formas:
conceptualmente, aquellas en las que se amplifica la diana (polymerase chain reaction PCR-; strand-displacement amplification-SDA-; nucleic acid sequence-based amplificationNASBA-; transcription-mediated amplification-TMA-).
Las que se amplifica la sonda (Q replicase amplification-QRA-); y mixtas
(gapped-LCR).

5.3.1 Ligasas y mecanismos de ligacin


La enzima ADN ligasa es esencial para la replicacin del ADN, para la
recombinacin y para la reparacin de material gentico in vivo. A partir de virus y de
organismos tanto procariotas como eucariotas, se han aislado y caracterizado diferentes
ADN ligasas; ms recientemente, han sido clonadas y purificadas ADN ligasas a partir de
microorganismos termoflicos.
Las ligasas caracterizadas hasta la fecha constan de una simple cadena
polipeptdica y exhiben diferentes actividades.
La actividad de ligacin incluye:

la unin de cidos nucleicos de doble cadena con terminales cohesivos.

la unin de complejos blunt-end.

la unin de fragmentos de cidos nucleicos por medio de mecanismo de


sellado de brechas (nick-sealing)

La tecnologa diagnstica de la ligasa explota casi exclusivamente la actividad


selladora de brechas. Las ADN ligasas mejor estudiadas son las aisladas de Escherichia coli
y las codificadas por el genoma del bacterifago T4. E. coli ADN ligasa es especfica para la
unin de segmentos de ADN que estn hibridados a una secuencia de un ADN molde; por
contra, T4 ADN ligasa cataliza la unin de segmentos de ARN o ADN con cualquier molde
sea ARN o ADN.
El sustrato tpico para la actividad de sellado de brechas comprende al menos dos
segmentos de ADN que estn hibridados y en posiciones inmediatamente adyacentes en
la misma hebra del cido nucleico molde (Figura-1). La secuencia 5 debe terminar con
un grupo hidroxilo (OH) en 3; mientras que la secuencia 3 debe poseer un grupo
fosfato (P) en 5. La unin enzimtica de los dos segmentos de cidos nucleicos se lleva a
cabo por medio de una reaccin que consta de tres pasos.

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Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


El complejo ligasa-AMP esta formado por una conexin fosfoamida entre una lisina
residual en la molcula de la enzima y el AMP derivado del cofactor apropiado (cualquiera
NAD o ATP). Posteriormente, una conexin fosfodiester se forma entre el AMP del
complejo y el fosfato 5 de la sonda B. El ataque nucleoflico del fosfato 5 por el grupo
hidroxilo 3 de la sonda A resulta en un sellado de la melladura, con liberacin de AMP.

5.4 Mtodos de deteccin


La especificidad de las tcnicas moleculares es dependiente de la astringencia
(rigidez) de las condiciones de hibridacin, la cual est determinada por una
combinacin de diferentes factores incluyendo la temperatura y la concentracin de sales.
La presencia de una secuencia diana dentro de una muestra clnica se demuestra
por la formacin de un hbrido de cidos nucleicos entre la diana y la sonda. La sonda
puede marcarse directa o indirectamente, con una molcula detectable.
El marcaje directo puede realizarse con radioisotopos (ej. P32 o S35) o con molculas
fluorescentes (ej. fluorescena o rodamina). Las sondas pueden marcarse en posicin 5 o
3 por medio de reacciones enzimticas; tambin es posible el marcaje en posiciones
internas mediante la incorporacin, va polimerizacin, de nucletidos modificados.
El marcaje indirecto depende del uso de una pareja de ligandos por afinidad como
son la biotina y la estreptavidina, as, las sondas pueden ser marcadas con biotina en
alguna de las diferentes posiciones posibles, y tras la hibridacin con la secuencia diana el
complejo puede reaccionar con un conjugado estreptavidina-enzima, para,
posteriormente, llevar a cabo la deteccin del complejo resultante mediante la incubacin
con un sustrato adecuado para la enzima.
Un defecto de estos mtodos es la posibilidad de hibridacin cruzada de las
sondas con secuencias diferentes a la diana elegida. Este problema es especialmente
relevante en tcnicas de hibridacin en solucin.

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Aunque la hibridacin en solucin ofrece la ventaja de una rpida cintica, se hace
necesario separar, antes de la fase de deteccin, los hbridos sonda-diana de la sonda no
unida, lo que dificulta la automatizacin de estas tcnicas. Para reducir este problema se
recurre a mtodos como el Southern (DNA) y Northern (RNA) blotting, en los que se
produce una separacin de las molculas de cidos nucleicos por electroforesis, para,
subsecuentemente, ser transferidas a un soporte slido. Los cidos nucleicos
inmovilizados se incuban bajo condiciones cuidadosamente controladas en una solucin
que contiene la sonda para asegurar el ms alto nivel de especificidad.
Se han descrito diferentes sistemas de hibridacin con dos sondas, el formato ms
tpico es aquel en el que las dos sondas hibridan con secuencias diferentes de la misma
diana, una sonda se marca con un grupo de captura y la otra con un grupo detectable. Al
reaccionar las dos sondas con la muestra que contiene la secuencia diana se produce la
formacin de un complejo sonda de captura-diana-sonda de deteccin; posteriormente,
antes de la fase de deteccin, este complejo se separa de las sondas no unidas gracias al
grupo de captura.
La especificidad de este sistema deriva del hecho de que tienen que producirse
dos eventos de hibridacin diferentes para que se genere el complejo sonda de capturadiana-sonda de deteccin. Sin embargo, es necesario un cuidadoso control de las
condiciones de hibridacin para mantener un nivel de especificidad elevado.
A finales de los aos 80 se describi un mtodo de ligacin de oligonucletidos
para sellar brechas de ADN denominado OLA (oligonucleotide ligation assay), precisa de
un mnimo de dos sondas especficas para la misma diana que hibridan en posiciones
inmediatamente adyacentes. La sonda A contiene un grupo hidroxilo 3 libre, la sonda B
contiene un grupo 5 fosfato libre; las sondas hibridadas presentan un sustrato adecuado
para que la actividad de la ADN ligasa permita la unin mediante sellado de la brecha. La
estabilidad del producto de ligacin-diana es mayor que la del producto sonda individualdiana. Las sondas pueden ser modificadas de tal modo que una contenga una mitad con
un marcaje de captura y la otra con un marcaje de deteccin. Con esta configuracin
nicamente son capturados y detectados los productos ligados.
La presencia de errores en la zona de ligacin o bien en zonas prximas a ella
repercuten negativamente en la actividad de la ligasa; sin embargo, aunque la capacidad
de la ligasa para discriminar errores es elevada no es absoluta.
La discriminacin de errores se ve afectada por la concentracin de sales, por la
concentracin de enzima, y por la temperatura; tambin por errores especficos de bases.
La inclusin de 200 mM NaCl o 2-5 mM espermidina reduce tanto la adenilacin como los
errores de ligacin.
La tcnica de ligacin de oligonucletidos es un mtodo particularmente til para
la deteccin de anormalidades genticas especficas como son: las mutaciones puntuales,
las delecciones y los cambios estructurales.
La eficiencia de este sistema ha sido demostrada en diferentes enfermedades
(anemia de clulas falciformes, fibrosis qustica). La sensibilidad de la prueba puede ser
mejorada asociando la ligacin de oligonucletidos con la amplificacin de cidos
nucleicos mediante PCR.
Una variante consiste en la eleccin de sondas de tal modo que cuando la diana
est presente las sondas hibridarn pero en posiciones no inmediatamente adyacentes

56

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sino separadas por un hueco o gap (Figura-2). El tamao del hueco puede variar, pero
habitualmente afecta a uno o a varios pares de bases. La sonda A se extiende a travs de
la regin del gap por medio de la ADN polimerasa en presencia de los
desoxirribonucletidos trifosfato (dNTP) para conseguir que las sondas queden
adyacentes.
A la sonda B se le proporciona un grupo 5 fosfato. Las sondas, nuevamente
adyacentes, son entonces unidas por la ADN ligasa. Las secuencias de las sondas son
diseadas de tal modo que la mutacin sea identificada en la secuencia diana siempre que
est situada dentro del gap (entre las sondas hibridadas), o bien en el extremo 3 de la
sonda A o en el 5 de la sonda B. Solamente se suministran los dNTPs necesarios para
rellenar el gap, ya que la sobreextensin o la infraextensin afectaran la eficacia del paso
de ligacin.
Esta metodologa, aunque es extremadamente especfica, precisa ir asociada a una
PCR para alcanzar un grado de sensibilidad adecuado que permita su aplicacin de cara al
diagnstico de las enfermedades infecciosas.

5.5 Ligase Chain Reaction (LCR)


La LCR consta de una serie de ciclos repetidos, de hibridacin de oligonucletidos
y de ligacin, para generar mltiples copias de la secuencia de cidos nucleicos elegida
como diana. Requiere un mnimo de dos parejas de sondas oligonucletidas
complementarias (sondas A, A y sondas B, B) (figura-3). Dos sondas (A-B y A-B)
hibridarn en posiciones adyacentes en cada hebra del ADN diana. El complejo dianasondas ser el sustrato para la unin por medio de la ADN ligasa gracias a su actividad
selladora de brechas. Una vez producida la ligacin, el producto resultante puede ser
separado mediante desnaturalizacin por calor; as, tanto la hebra de ADN monocatenario
como el producto ligado servirn de moldes adicionales. En teora en cada ciclo se
duplicar el nmero de copias.

57

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


Las versiones iniciales de esta reaccin empleaban ligasas mesoflicas (E. coli ADN
ligasa, T4 ADN ligasa) con lo que era necesario agregar nuevo enzima con cada ciclo
debido a la inactivacin que experimentaba la misma por efecto del calor en la fase de
desnaturalizacin. La disponibilidad ADN ligasa clonada termoestable (Thermus
thermophilus) ha simplificado el procedimiento.
La LCR difiere de los mtodos de amplificacin basados en la polimerasa (PCR,
NASBA, SDA, TMA) en que no se produce sntesis de ADN o ARN nuevo. Con los
mtodos basados en la polimerasa se produce sntesis in vitro de nuevas molculas que
servirn de moldes para reacciones adicionales; por contra, con la LCR simplemente hay
una reorganizacin de las sondas para generar dianas que soporten el proceso de
amplificacin. La diana no es duplicada, simplemente sirve de molde para la
reorganizacin de sondas preexistentes; las sondas una vez organizadas y ligadas servirn
de sustrato para nuevas reacciones.
La eficiencia de la hibridacin y ligacin de las sondas en la LCR se consigue con
una elevada la concentracin de sondas y de ligasa en relacin a la concentracin de la
diana; como resultado, cuando la concentracin de la diana es baja la inmensa mayora de
sondas est presente en forma de duplicados de sonda, especialmente en los primeros
ciclos.
Debido al hecho de que ciertas ligasas son capaces de catalizar una reaccin de
ligacin blunt-end, podra ocurrir que segmentos de ADN de doble cadena se unieran en
ausencia de diana, (ligacin diana-independiente), y sirvieran de molde para ciclos
adicionales generando as un producto indistinguible del generado por una ligacin
diana-dependiente.
Afortunadamente, la eficiencia de este tipo de unin blunt-end es varias veces
inferior a de la reaccin de sellado de brecha. Para reducir la unin inespecfica blunt-end,
se ha recurrido a incluir en la reaccin 200 mM de NaCl 2-5 mM espermidina; aadir
grandes cantidades de ADN no especfico; y a evitar la utilizacin de reactivos como el
polietilenglicol o Ficoll que incrementan la eficiencia de la ligacin blunt-end.
La sensibilidad de la amplificacin LCR aunque es adecuada para muchas
aplicaciones, particularmente en las enfermedades genticas en las cuales es crtica la
especificidad y no tanto la sensibilidad, resulta insuficiente para su aplicacin al campo
diagnstico de las enfermedades infecciosas donde la sensibilidad es esencial.
La sensibilidad tambin puede mejorarse realizando una preamplificacin en la
cual la secuencia diana es amplificada varios ciclos con dos de las cuatro sondas, para,
posteriormente, aadir la segunda pareja de sondas.
La LCR se ha utilizado para la deteccin de varios agentes infecciosos
(papillomavirus, HIV-1, Mycobacterium tuberculosis) y enfermedades genticas,
manteniendo el elevado grado de especificidad comentado anteriormente para otras
reacciones mediadas por la ligasa. Sin embargo, todava existen numerosas aplicaciones
que requeriran mejorar la sensibilidad de esta metodologa.

5.6 Variantes de la LCR


Con ellas se trata de evitar la unin inespecfica (blunt-end) de las sondas mediante
bloqueo o eliminacin de los grupos hidroxilo 3 o fosfato 5. Una variante
denominada gapped-LCR est diseada de tal modo que las sondas hibridan con el ADN
58

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


diana pero no inmediatamente adyacentes (Figura-4), sino separadas por un hueco o gap;
as, las sondas no hidridadas no podrn ser ligadas.
Para conseguir que las sondas se vuelvan adyacentes (y con ello que puedan ser
ligadas) se emplea una ADN polimerasa y dNTPs apropiados para extender la sonda a
travs del gap (es crtico evitar la sobre o infraextensin que impediran la ligacin).
La extensin de la polimerizacin se controla con los dNTPs adecuados, la
eliminacin de uno o ms dNTPS asegura que la extensin terminar en el sitio apropiado.

5.7 Conclusin
La especificidad de la unin de segmentos de ADN catalizada por la enzima ADN
ligasa puede ser explotada en sistemas diseados para identificar la presencia de una
secuencia diana de cidos nucleicos dentro de una muestra biolgica. Los mtodos de
amplificacin basados en la ligasa permiten incrementar la sensibilidad sin producir una
merma en la especificidad. Se han descrito modificaciones de estas tcnicas que permiten
reducir la ligacin inespecfica. La automatizacin de los ensayos permitir en el futuro el
uso rutinario de este tipo de tecnologa en el laboratorio clnico.

59

UNIDAD DIDCTICA VI
ANLISIS POR REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR)

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

6.1 Introduccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en
ingls, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar ms de un milln de veces un ADN
obtenido a partir de una regin seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca
una parte de su secuencia de nucletidos. Esta tcnica fue ideada en 1989 por Kary B.
Mullis que obtuvo el premio Nobel de Qumica en 1993 por dicho invento.
Para la PCR se utilizan dos oligonucletidos sintticos de unos 15-20 nucletidos
que son complementarios a las zonas flanqueantes de la regin que se quiere amplificar.
Estos oligonucletidos (habitualmente conocidos por su nombre en ingls, "primers")
actan como cebadores para la sntesis in vitro de ADN la cual est habitualmente
catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se asla de una bacteria
termfila, denominada Thermus Aquticus, que es capaz de crecer a temperaturas
elevadas (79 - 85 C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media
de extensin de ms de 60 nucletidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La
temperatura optima a la que acta la Taq polimerasa permite el uso de elevadas
temperaturas para la unin de los primers y para la extensin, de esta manera se aumenta
el nivel de exigencia de la reaccin y se reduce la extensin de los primers unidos
inespecficamente al ADN.
La reaccin se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye
tres fases o pasos:
1. DESNATURALIZACIN: Para que comience la reaccin es necesario que el
ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue
aplicando temperaturas de 90 a 95C que producen la rotura de los
puentes de hidrgeno intercatenarios y por lo tanto la separacin de
ambas cadenas. Para conseguir la completa separacin de las hebras de
toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el
ADN solo se desnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse
rpidamente, evitando as una eficiente hibridacin de los primers y una
posterior extensin.
2. HIBRIDACIN: Esta fase se denomina tambin fase de annealing o de
emparejamiento. Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60C para que
se pueda producir la unin de los primers a las secuencias flanqueantes del
fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusin o annealing
(Tm, melting temperature) depende de varios factores y es
relativamente especfica para cada primer. La longitud de los primers y la
secuencia son crticas en la designacin de los parmetros de una
amplificacin, una frmula simple para calcular la Tm es la siguiente:

Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada primer exige una serie de estudios
experimentales para determinar su temperatura de annealing especfica ya
que si la temperatura es muy baja la unin se har de forma inespecfica y si
es muy alta no se producir una unin completa.

63

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


3. EXTENSIN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucletidos en
el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN
previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este
paso suele ser de 72C ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa
alcanza su mxima actividad. Normalmente una extensin de 20 segundos
es suficiente para fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para
fragmentos por encima de 1.2Kb.
Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de
rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y
depende del diseo y de las caractersticas del aparato donde se realiza automticamente
este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor
se ha ido optimizando para hacerlo mnimo.

6.2 Componentes de la PCR


6.2.1 Buffer de amplificacin
Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2. El
MgCl2 es el componente que ms influye en la especificidad y rendimiento de la reaccin
ya que los iones Mg2+ son necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir,
actan como cofactores de la polimerasa.
La concentracin ptima de MgCl2 est en torno a 1.5 mM si se emplean
concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es necesario
probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo origina una
acumulacin de productos inespecficos y una cantidad insuficiente hace que disminuya el
rendimiento de la amplificacin.

6.2.2 Primers
A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de
ADN hay una serie de reglas a seguir:

La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y


24 bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35
bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de
suficiente especificidad.

Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia


entre ambas temperatura debe ser de 5C).

La relacin bases pricas: bases pirimidnicas debe ser 1:1 (o como mucho
40-60%).

La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases


pricas.

Para evitar la formacin de dmeros de primers es necesario comprobar que


los primers no contengan secuencias complementarias entre s.

Los dmeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud es


muy prxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es extendido
a continuacin del otro. El mecanismo exacto por el que se forman estos dmeros no est
completamente determinado. La observacin de que primers con los extremos 3'
64

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


complementarios favorecen su formacin sugiere que el paso inicial se debe a
interacciones transitorias que aproximan los extremos complementarios. Algunas
polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una dbil actividad polimerizadora no dirigida
por un ADN patrn, la cual puede unir nucletidos adicionales al doble extremo apareado.
Si esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucletidos, resultara
una buena oportunidad para que la extensin formara un corto solapamiento en el
extremo 3' con el otro primer, suficiente para promover la formacin del dmero.

6.2.3 Desoxinucletidos Trifosfatos


Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse estn en torno a 200 M para
cada uno de ellos. En un volumen de reaccin de 25 l con esta concentracin de dNTPs
se sintetizaran entre 6-6.5 g de ADN. La concentracin de dNTPs y de MgCl2 va
relacionadas ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de
dNTPs inhibiran la reaccin al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para
incorporar dNTPs. Para una concentracin de 200 M de cada dNTP se suele aadir MgCl2
a una concentracin de 1.5 mM.

6.2.4 TaqPolimerasa
Las cantidades ptimas de Taq polimerasa necesarias para la sntesis de ADN estn
alrededor de 2 unidades en 25 l de volumen final de reaccin. La actividad de este
enzima se ve influenciada por la concentracin de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones
monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha
actividad.
Por otro lado, pequeas concentraciones de KCl estimulan la actividad sinttica de
la Taq en un 50-60% con un mximo aparente cuando su concentracin es de 50 mM.
Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean
antes de la amplificacin y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones
1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual
que concentraciones mayores del 10% de etanol.

6.2.5 Adn molde o Template"


Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto, el
ADN que la Taq polimerasa utiliza como molde para la sntesis de nuevas cadenas
polinucleotdicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores:
Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son ms
especficos o bien cuyas condiciones de amplificacin estn mejor optimizadas que las de
otros. Por esta razn puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN (sobre todo
cuando jugamos con cantidades mnimas) amplifique para unos marcadores pero no para
otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario
hacer un estudio de validacin en l que se incluye un estudio de sensibilidad. De dicho
estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusin cul es la mnima cantidad de
ADN que amplifica en condiciones estndar. De manera general, para casi todos los STR
utilizados en Gentica Forense la cantidad ptima de ADN que asegura un rendimiento
adecuado est en torno a los 5 ng.
Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es ptima no suele
haber problemas en la amplificacin y cantidades del mismo por encima e incluso por
debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la calidad del
65

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


ADN obtenido no es la idnea, bien porque est degradado o bien porque dicho ADN
vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa.
Si el ADN est degradado por la accin de enzimas de restriccin el que obtengamos o no
resultado en la amplificacin va a depender de que el fragmento a amplificar haya sido
daado o no. En el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de
contaminantes habra que intentar diluir al mximo la muestra para disminuir dichos
contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN que no est por debajo del
lmite de sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mnimas de ADN y la
presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en Criminalstica
y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la amplificacin.

6.3 Adyuvantes de la PCR


Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Aunque
algunos autores han recomendado el uso del DMSO y del glicerol, el adyuvante ms
extendido y utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA
incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como una protena captadora de iones que
pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa.
La PCR ofrece una serie de ventajas, frente al uso de las tcnicas de anlisis
gentico utilizadas con anterioridad, como son:

Su capacidad para obtener resultados en casos en los que la cantidad de


ADN es mnima o en casos en los que el ADN est parcialmente degradado.

Genera en un espacio corto de tiempo un elevado nmero de copias de la


secuencia de ADN que es objeto de estudio, lo cual permite utilizar tcnicas
de visualizacin ms sencillas y rpidas que el uso de sondas marcadas
radioactivamente.

Permite la determinacin y agrupacin allica en clases discretas, lo que


facilita la elaboracin de bases de datos al ser la estandarizacin inmediata
y posibilitar la aplicacin de mtodos bioestadsticos y programas
elaborados.

El uso de marcadores microsatlites de pequeo peso molecular aumenta las


probabilidades de obtener resultados positivos de amplificacin cuando el ADN se
encuentra degradado ya que puede ser que dichos fragmentos no hayan sido digeridos.
Esta ventaja es de gran importancia en Criminalstica ya que normalmente los indicios
biolgicos encontrados han estado sometidos a diversos factores (calor y humedad) que
favorecen el crecimiento bacteriano.
Sin embargo, una de las grandes ventajas de la PCR que es su elevada sensibilidad
puede, en ocasiones, convertirse en un gran problema ya que se podra coamplificar un
ADN extrao o ajeno al que nos interesa. No obstante, en los laboratorios de Gentica
Forense las medidas de precaucin que se toman para evitar problemas de contaminacin
por manipulacin son extremas.
Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en funcin
de su tamao por medio de un proceso de electroforesis. Actualmente se utilizan dos
tipos de electroforesis en los laboratorios de Gentica Forense:

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Electroforesis en geles verticales de poliacrilamida

Electroforesis capilar

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


La electroforesis en geles verticales de poliacrilamida, geles desnaturalizantes, se
realiza polimerizando un gel de acrilamida/bis entre dos cristales montados
adecuadamente sobre el cassette que sirve de soporte para los mismos y que
posteriormente se acopla en el secuenciador automtico para proceder a la carga de la
muestras.

El nmero de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el
nmero de pocillos que posee el peine (de dientes de tiburn) que utilicemos. Hay peines
de cuatro tamaos distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos.
La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de
unos 700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN, de la
correcta cuantificacin del mismo, de la utilizacin del primer adecuado, y de la
polimerizacin correcta del gel de acrilamida/bis principalmente.
Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb,
podemos disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la velocidad de
barrido del laser, y el resultado es igualmente optimo.
La electroforesis capilar es una tcnica relativamente novedosa en el campo de la
Gentica Forense pero que est poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis
vertical. En este caso el proceso electrofortico es llevado a cabo en un capilar de silica de
unas 50 m de dimetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que
puedan aplicarse voltajes mayores.
Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los
dideoxinucletidos (en el caso de la secuenciacin) deben ser marcados
fluorescentemente con unas molculas denominadas fluorocromos que emiten
fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por lser. El
equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir
los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus
correspondientes alelos asignados.
La electroforesis capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemas de
electroforesis vertical como son:

Rapidez: ya que permite el anlisis simultneo de varios loci aunque stos


posean alelos con tamaos solapantes.

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Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

Sensibilidad: hace posible detectar cantidades muy pequeas de ADN


amplificado.

Los resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita


problemas de interpretacin de los resultados y facilita el anlisis de los
mismos a travs de programas informticos.

Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando


electroforesisengelverticaldeacrilamida.Siseobservanlos
patrones bandas podr comprobarse como los perfiles
obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el
sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S)
coincidenconelperfilgenticodelavctima(V)

Casodeestudiobiolgicodelapaternidadrealizadoconelectroforesiscapilar.Cada
picocorrespondeaunalelo,elhijo(H)debeposeerunalelodelamadre(M)yotro
delpadre(P)paraquelapaternidadseacompatible

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UNIDAD DIDCTICA VII
FUTURAS TECNOLOGAS: BIOCHIPS

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

7.1 Aplicaciones de los biochips


Las tcnicas de anlisis gentico se encuentran hoy en da en continuo desarrollo y
evolucin. La necesidad de tcnicas que permitan el aislamiento y anlisis de los casi cien
mil genes que componen el genoma humano justifica la existencia de lneas de
investigacin destinadas al descubrimiento de nuevos mtodos que permitan monitorizar
elevados volmenes de informacin gentica en paralelo y que reduzcan tanto el tiempo
empleado como el coste por anlisis.
Desde el anlisis de los primeros polimorfismos de ADN con fines identificativos, la
Gentica Forense ha sufrido una gran evolucin. Los expertos en la materia han sido
testigos de cmo el descubrimiento de la PCR revolucion las tcnicas de identificacin
gentica. Es probable que la prxima revolucin la constituyan los llamados biochips o
microarrays.
Los biochips surgen como consecuencia de una combinacin entre tcnicas
microelectrnicas empleadas para la fabricacin de microprocesadores informticos y
materiales biolgicos. En general puede decirse que la principal caracterstica de los chips
es su capacidad para generar informacin en muy poco espacio, ya que posibilitan el
procesamiento de multitud de ensayos simultneamente. Esta caracterstica es la que hace
que los biochips sean probablemente la tecnologa del futuro en el campo de las
investigaciones biomdicas.
La fabricacin de los biochips es similar a la de los chips informticos: por medio
de la tcnica denominada fotolitografa se depositan circuitos microscpicos sobre
lminas de silicio. En el caso concreto de los biochips, estas lminas son de vidrio y lo que
se deposita en dichas lminas son cadenas de ADN. Las lminas de vidrio presentan una
serie de ventajas como son:

Posibilidad de unir las cadenas de ADN a la superficie del cristal,


convenientemente tratada, mediante enlaces covalente.

Su capacidad para aguantar altas temperaturas y lavados de elevada fuerza


inica.

Al ser un material no poroso el volumen de hibridacin puede reducirse al


mnimo.

Su baja fluorescencia evita ruidos de fondo.

Hay compaas comerciales que han desarrollado otras estrategias para la


fabricacin de biochips. No obstante, los ms usados actualmente y con mayor nmero de
aplicaciones son los basados en tcnicas fotolitogrficas.
Estos chips, como se dijo anteriormente, consisten en una pequea lmina de
vidrio que posee unos grupos reactivos, a los que posteriormente se unirn los
nucletidos, protegidos mediante una pelcula realizada con un agente qumico
fotodegradable.
Mediante una mscara que se sitan sobre el chip, se logra enfocar un haz de luz
hacia unas posiciones y regiones determinadas, degradando al agente qumico protector
en dichas zonas y dejndolo intacto en las zonas protegidas por la mscara.
A continuacin se aade al chip un medio que contiene uno de los cuatro
nucletidos que se unir, mediante enlace covalente, al cristal con los grupos reactivos
71

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


que hayan quedado desprotegidos. Cada grupo aadido lleva una molcula receptora
fotodegradable.
Todo este proceso se va repitiendo con los diferentes nucletidos y mscaras hasta
generar unos oligonucletidos con las secuencias que nos interesen. El siguiente esquema
muestra el todo el proceso explicado anteriormente.

Cada casilla del chip posee una cadena de un oligonucletido de manera que
solamente aquel fragmento de ADN que hibride perfectamente con ella permanecer
unido tras los diversos lavados.
Previamente a la hibridacin, el ADN de la muestra a estudiar debe haber sido
amplificado y marcado fluorescentemente en uno de sus extremos. Una vez marcado se
incuba en el recipiente que contiene al chip tras lo cual se lava varias veces para eliminar
los fragmentos que no hayan hibridado y se introduce el chip en un escner en el que se
detectan los patrones de hibridacin.
Esta deteccin se realiza en base a la fluorescencia emitida por los fluorocromos de
la muestra cuando son excitados por luz y en aquellos pocillos en los que la unin haya
sido completa la fluorescencia ser mayor que los que contengan alguna base
desapareada.
Un ordenador conectado al escner es el que identifica las secuencias sonda por su
posicin el chip.

7.2 Aplicaciones de los biochips


A pesar de ser una tecnologa muy reciente y que, por lo tanto, est an en vas de
experimentacin, actualmente los biochips estn siendo aplicados en:

72

Monitorizacin de expresin gnica: permite determinar cual es el patrn


de expresin gnica y cuantificar el nivel de expresin de manera
simultnea para un elevado nmero de genes. Esto permite realizar
estudios comparativos de activacin de determinados genes en tejidos
sanos y enfermos y determinar as la funcin de los mismos.

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Deteccin de mutaciones y polimorfismos: Permite el estudio de todos los


posibles polimorfismos y la deteccin e mutaciones en genes complejos.

Secuenciacin: Mientras que se han diseando algunos biochips para


secuenciacin de fragmentos cortos de ADN, no existe an en el mercado
ningn biochip que permita secuenciar de novo secuencias largas de ADN.

Diagnstico clnico y deteccin de microorganismos: Posibilitan la


identificacin rpida empleando unos marcadores genticos de los
patgenos.

Screening y toxicologa de frmacos: el empleo de los biochips permite el


analizar los cambios de expresin gnica que se dan durante la
administracin de un frmaco de forma rpida, as como la localizacin de
nuevas posibles dianas teraputicas y los efectos toxicolgicos asociados.

Seguimiento de terapia: los biochips permiten valorar rasgos genticos que


pueden tener incidencia en la respuesta a una terapia.

Medicina preventiva: El conocimiento y posible diagnstico de ciertos


caracteres genticos asociados a determinadas patologas permite una
prevencin de las mismas antes de que aparezcan los sntomas.

7.3 Secuenciacin del ADN empleando microarrays


Existen muchas variedades de microarrays o ADN-chips como tambin se les
denomina. Desde los microarrays "artesanales" realizados en el laboratorio a los ofrecidos
por compaas de biotecnologa, el principio que rige su diseo es el mismo: la
complementariedad de las cadenas aisladas de ADN: o propiedad de las citadas cadenas
de hibridarse con otras cadenas aisladas de ADN que posean una estructura
complementaria.
Bsicamente un microarray consiste en una matriz de "pocillos"
microminiaturizados sobre un substrato de vidrio en donde se implantan, utilizando
diversas tcnicas, cadenas simples de oligonucletidos. El poder adherir una cadena corta
de oligo sobre una superficie plana es decisivo en el diseo de los microarrays.

(Molecular interactions on microarrays, Edwin Southern..., Nature Genetics,


january 1999, pp..5)

En la figura se muestran esquemticamente unas pocas celdas de un microarray.


En cada celda, adherida por uno de sus extremos, existe una determinada cadena de
oligonucletido. (zona inferior izquierda de la imagen) Si se pone el microarray en
contacto con una mezcla de cadenas simples de ADN a identificar, marcadas

73

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


fluorescentemente, (zona superior izquierda) stas se hibridarn con su oligo
complementario. (zona derecha).
Dado que conocemos la secuencia y distribucin de los oligonucletidos en el
microarray podemos, al excitar el microarrray con un laser y estar las cadenas hibridadas
fluorescentemente, conocer la ubicacin de las cadenas de las mismas y su secuencia.

Visualizacin tpica de una secuenciacin


mediante microarrays

7.3.1 Fabricacin
En la fabricacin de microarrays se emplean tcnicas fotolitogrficas anlogas a las
utilizadas en microelectrnica. Un sustrato de vidrio se trata qumicamente con
determinados grupos reactivos para permitir la implantacin de los oligonucletidos
sobre el mismo; a continuacin se deposita sobre el substrato una pelcula fotodegradable
y mediante la utilizacin de una plantilla y un haz luminoso, se crea la estructuura de
celdas del microarray.

Fabricacin de las celdas del microarray

Existen dos tcnicas para para acoplar los oligos a cada una de las celdas.

74

Implantar en cada celda, mediante un brazo robotizado, el oligonucletido


presintetizado que corresponda.

Sintetizar en las propias celdas, mediante ciclos sucesivos de sntesis, los


oligonucletidos correspondientes.

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

El proceso de sntesis "in situ" de los nucletidos en el microarray se realiza en las


siguientes fases:

Elaboracin previa de un mapa de distribucin del tipo de oligonucletido


correspondiente a cada celda del microarray.

Preparacin del sustrato y deposicin de una pelcula fotodegradable. (1)

Aplicacin de una mscara que permita eliminar selectivamente la pelcula


protectora en las zonas del microarray correspondiente a un determinado
nucletido. (2 y 3)

Incubacin qumica y acoplamiento del nucletido previsto (4).

Una nueva capa fotodegradable es aplicada sobre el microarray (5)

Se repiten los pasos anteriores para cada nucletido hasta obtener la


secuencia prevista

Se elimina definitivamente la pelcula fotodegradable (10).

7.3.2 Ejemplo de utilizacin:


La localizacin e identificacin de diferencias de secuencia en relacin con
diferencias fenotpicas constituye la base de distincin entre estado normal y enfermedad.
Dada una secuencia determinada de una regin de ADN es posible disear cuatro sondas
diferentes por cada posicin. Una de ellas ser perfectamente complementaria de la
secuencia de referencia mientras que las dems lo sern en todas las posiciones salvo en
la de la posicin que se interroga donde esa base ha sido sustituida por las otras tres
posibles.
Tras la incubacin con la secuencia de referencia la mayor seal de hibridacin
fluorescente corresponder a la secuencia 100% complementaria. Si la muestra presenta
alguna mutacin en la posicin interrogada la mayor seal corresponde a la hibridacin
con la correspondiente secuencia complementaria. Mil sets de cuatro sondas cada uno se
emplean para interrogar las mil posiciones de la secuencia. Esta estrategia funciona
especialmente bien para la deteccin de polimorfismos en el ADN indicando tanto la
posicin de la sustitucin como la naturaleza de la misma.
75

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

7.4 Citogentica
Para facilitar la comprensin de la nomenclatura citogentica es necesario recordar
que la mayora de los cromosomas humanos tienen dos brazos, uno largo (q) y otro corto
(p).

ste es un ejemplo tpico de un cariotipo masculino normal a resolucin de 550


bandas. Los pares de cromosomas homlogos se han dispuesto de acuerdo con su
tamao, patrn de bandas y posicin del centrmero. Cada cromosoma puede as
compararse banda por banda con su homlogo en busca de cualquier cambio que haya
podido tener lugar en la estructura del cromosoma. Este cariotipo se escribe como 46,XY.
La clave de la descripcin del cariotipo es as:

46: el nmero total de cromosomas (46 es lo normal).

XY: los cromosomas sexuales (para un varn). Una mujer tendra dos
cromosomas X.

Las alteraciones que pueden encontrarse son de dos clases:

primarias, cuando estn ligadas especficamente a cada tipo de tumor.

secundarias, cuando se aaden a las anteriores.

Dos son tambin los tipos de alteraciones:

numricas

estructurales

En la siguiente tabla se ofrece un glosario con la nomenclatura de las alteraciones


cromosmicas. La valoracin de una clona anormal exige analizar e interpretar un nmero
suficiente de metafases. Los cromosomas y sus alteraciones se identifican de acuerdo con
las sucesivas recomendaciones del Sistema Internacional para la Nomenclatura de la
Citogentica Humana (ISNC, 1995)11.
76

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


Se considera una alteracin clonal cuando se detectan dos o ms metafases con la
misma anomala estructural o con ganancia de algn cromosoma, pero si es una prdida
ha de aparecer en al menos 3 mitosis.
En los ltimos aos se han desarrollado una serie de tcnicas complementarias de
la citogentica convencional. Por ello, en la moderna citogentica hay que incluir los
resultados obtenidos de combinar estos estudios con la hibridacin in situ12-15, con la
hibridacin genmica comparada (HGC)16 y, en un futuro prximo, con los de la
hibridacin "in situ" multicolor (cariotipaje espectral en colores17, bandeo multicolor, etc).

Tipode
alteracin

Nombre

Abreviatura

Descripcin

Trisoma

Gananciadeuncromosoma

Monosoma

Prdidadeuncromosoma

Numricas

Hiperdiploida

Nmerodecromosomas>46

Hipodiploida

Nmerodecromosomas<46

Delecin

del

Prdidadeunsegmento
cromosmico

Inversin

inv

Girode180Cdelmaterial
dentrodelmismocromosoma

Isocromosoma

Estructurales

Traslocacin

Derivativo

Duplicacindetodoelbrazode
uncromosomaconprdidadel
otrobrazo

Intercambiorecprocode
materialcromosmicoentre2o
mscromosomas

der

Intercambionorecprocoentre
doscromosomas

Tabla: Glosario de la nomenclatura citogentica

77

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

7.4.2 Ejemplos de la utilidad de la citogentica en el diagnstico de los


tumores linfoides

Figura 1. Cariotipo parcial y representacin esquemtica de una deleccin del brazo


largo del cromosoma 11 observada en un enfermo con Linfoma Linftica Crnica.

Figura 2. Cariotipo parcial de un enfermo con linfoma del manto y t(11;14).

Figura 3. Ideograma y cariotipo parcial de un enfermo con Linfoma Esplnico de la


Zona Marginal y deleccin del brazo largo del cromosoma 7

78

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Figura 4. Traslocacin t(3;22)(q27;q21) en un enfermo con LDCG-B( Linfoma difuso


de clulas grandes

79

UNIDAD DIDCTICA VIII


TCNICAS DE ANLISIS DE ADN EN GENTICA FORENSE

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

8.1 Evolucin de las tcnicas de estudio de los poliformismos


DE ADN
La Hemogentica Forense nace a principios de siglo, cuando Karl Landsteiner
describe el sistema ABO de los hemates y Von Durgen y Hirschfeld descubren su
transmisin hereditaria.
Esta ciencia surgi como una rama de la Criminalstica cuyo objetivo era la
identificacin gentica tanto en casos de investigacin criminal como en estudios
biolgicos de la paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de
antgenos eritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), protenas sricas, enzimas eritrocitarias y
sistema HLA.
Con el estudio de dichos marcadores poda incluirse o excluirse una persona como
posible sospechoso por poseer una combinacin gentica igual o diferente a la del
vestigio biolgico hallado en el lugar de los hechos.
Pero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su
estructura y al posterior avance en las tcnicas de anlisis de dicha molcula la
Hemogentica Forense evolucion considerablemente hasta el punto de que hoy en da
puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la Medicina Forense: la Gentica
Forense. Dicha ciencia estudia bsicamente unas regiones del ADN que presentan
variabilidad entre los distintos individuos, es decir, estudia regiones polimrficas del ADN.
As, analizando un determinado nmero de regiones polimrficas, la probabilidad
de que dos individuos sean genticamente iguales es prcticamente nula (excepto en el
caso de gemelos univitelinos).
Aunque la Ciencia posea las herramientas necesarias para el estudio del ADN, su
aplicacin en la resolucin de casos judiciales no se produjo hasta 1985, cuando el
Ministerio del Interior Britnico solicit la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de Gentica
de la Universidad de Leicester.
Los primeros casos de Criminalstica fueron resueltos gracias a la tcnica de los
RFLPs (Fragmentos de Restriccin de Longitud Polimrfica). Jeffreys descubri la existencia
de unas regiones minisatlites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser
tratadas con enzimas de restriccin generaban fragmentos de longitud variable. Estudios
posteriores realizados el mismo Jeffreys demostraron que las diferencias en el tamao de
estos fragmentos se deban a que estas regiones consistan en un determinado nmero de
repeticiones en tndem de una secuencia central, el cual variaba de unos individuos a
otros.
El primer locus de ADN polimrfico fu descubierto por Wyman y White en 1980
usando una sonda de ADN arbitraria.
De esta manera observaron fragmentos de ms de 15 longitudes diferentes en una
pequea muestra de individuos. Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables
como en la secuencia del gen de la insulina humana, en el oncogen ras, en el
pseudogen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina.
Estos loci hipervariables constaban de repeticiones en tndem de una secuencia de
oligonucletidos (11 a 60 pb), de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos
originados dependan del nmero de dichas repeticiones y se les denomin VNTR
(Variable Number of Tandem Repeat).
Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que stos podan ser
aplicados a la medicina forense y sustituir a los marcadores clsicos.
83

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo por medio de la
tcnica llamada hibridacin con sondas o Southern blot. Esta tcnica consta bsicamente
de las siguientes etapas:

Digestin del ADN con enzimas de restriccin tras conseguir extraer un


ADN de alta molecularidad.

Separacin de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis


en gel de agarosa.

Desnaturalizacin de los fragmentos separados y cortados.

Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o


nylon y fijacin de las mismas por medio de calor (80C).

Prehibridacin con sondas de ADN inespecfico para bloquear los lugares


de unin inespecficos que pudiera haber en la membrana.

Marcaje de la sonda con nucletidos radioactivos (32 P normalmente).

Hibridacin de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de


ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el
exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.

Revelado en placa radiogrfica e interpretacin de los resultados.

El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:

84

Sondas Mono-locus (SLP): son especficas para una regin de un


determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucletidos y
presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como resultado
se observan una o dos bandas por individuo, segn sea homocigoto o
heterocigoto. El patrn de bandas obtenido con estas sondas se denomina
perfil unilocus de ADN o DNA profiling

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatlites presentes


en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15
nucletidos que se repiten mltiples veces y tras el revelado se observan de
10 a 20 bandas por persona. Este patrn de mltiples bandas se conoce
como huella gentica multilocus o DNA fingerprint.
Sondasmultilocus

Sondasunilocus

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes


con respecto a una serie de parmetros como son:

Informacin aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad


discriminativa al aparecer mltiples bandas. No obstante, las mono-locus
son ms especficas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de
mayor tamao.

Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se requiere


aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el
caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no
necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el
fragmento complementario a la sonda est intacto.

Especificidad entre especies: las sondas multi-locus permiten su uso sobre


el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las
mono-locus son exclusivas de ADN humano.

A pesar de que el anlisis SLP ha sido y es bastante til en estudios de paternidad


no puede decirse lo mismo de su aplicacin a la Criminalstica ya que presenta una serie
de inconvenientes como son:

La cantidad de ADN que se necesita est entre 20 y 100 ng, cantidad difcil
de conseguir en casos de criminalstica en los que los indicios biolgicos
encontrados son mnimos.
85

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

En cuanto a la calidad del ADN, en la prctica forense es muy difcil


encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se
necesita para un anlisis con sondas mono-locus.

Todas estas limitaciones fueron superadas gracias a la aplicacin en Gentica


Forense de una tcnica, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), que supuso
una revolucin en muchos campos de la Biologa y de la Medicina.
El estudio de indicios biolgicos por PCR ha permitido la resolucin de un gran
nmero de casos en Criminalstica que hasta entonces eran desestimados por no poseer la
suficiente cantidad de muestra para su anlisis por RFLP. Con el uso de la PCR muestras
tan mnimas como pueden ser un pelo con raz, una minscula mancha de sangre o semen
e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un anlisis de
identificacin gentica.

86














UNIDAD DIDCTICA IX
SECUENCIACIN AUTOMTICA DEL ADN

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

9.1 Secuenciadores automticos en geles / equipamiento


9.1.1 SecuenciadoR ABI 377
(Imgenes: PE Biosystems)

El secuenciador automtico ABI Prism 377 es un sistema de electroforesis y


deteccin de fluorescencia controlado por microprocesador que se utiliza para
secuenciacin automtica o anlisis de fragmentos empleando el mtodo de
secuenciacin automtica en geles desnaturalizantes.

A:Casete.
B:Tapacubetasuperior
C:Barraprotectoradellaser
D:Cubetasuperior
E:Pinzas
FYG:Cubetainferior
H:Dispositivodecarga

El sistema de secuenciacin automtica se compone de:

Carga: Cassette del gel. Sistema de inyeccin.

Cmara para el cassette en el secuenciador.

Cristales del secuenciador, espaciadores y peines.

Separacin: Fuente de electroforesis, cubetas, electrodos.

Sistema de control de temperatura: placa calefactora, bomba, sensores.

Deteccin: Laser de Argn. Cmara CCD.

Control: Ordenador Macintosh.

89

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

9.1.2 Principio de funcionamiento

Mtodo de exploracin por laser

Codificacin cromtica de las bandas


de electroforsis

Durante la electroforesis las muestras pasan por delante de un haz de luz UV


procedente de un laser de argn. La fluorescencia emitida por cada fragmento de ADN,
correspondiente a la emisin de fluorescencia del nucletido incorporado en 3(para
secuenciacin automtica empleando terminadores fluorescentes), es recogida por una
cmara CCD, encargndose el software del equipo de asignar a la fluorescencia emitida la
base correspondiente.

9.1.3 Recogida de datos


Colocar el secuenciador, el casete con el gel y cargar en los pocillos del mismo las
muestras.de ADN a secuenciar.
Aplicar el voltaje necesario para desarrollar la electroforesis de forma que dichos
fragmentos migren y se separen en funcin de su tamao.
Cuando al migrar los fragmentos alcanzan la zona de lectura, el haz del lser, que
se est desplazando horizontalmente de forma continua a lo largo del cristal, excita los
fluoroforos. La luz emitida se proyecta hacia un espectrgrafo, dotado de una cmara
CCD, donde se separa cromticamente.
El software del sistema contiene informacin sobre los fluoroforos que se estn
utilizando, y sus longitudes de onda y proporciona los filtros adecuados para recoger las
intensidades de luz que llegan a la cmara CCD.
La pantalla del ordenador visualiza, en tiempo real, la informacin que se recibe
desde el secuenciador ABI Prism 377.

90

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Cromatograma: En el secuenciador ABI 377se pueden leer unas


setecientas bases, en la imagen unas cuarenta. Aparecen los
picos de colores y en la parte superior de estos la base con la
que se corresponden.

9.1.4 Procesado de los datos


Finalizada la fase de lectura, antes de ser analizados, a los datos se les aplica un
filtro matemtico que corrige cualquier solapamiento de los espectros de emisin ya que,
aunque los terminadores presentan mximos de emisin a diferentes longitudes de onda,
los espectros se solapan en cierta medida.
El software utilizado procesa automticamente los datos recogidos en una
secuencia de bases, los analiza y los visualiza en el monitor.

Gel de secuencia: cada uno de los carriles corresponde con una muestra, y cada
una de las bandas de colores con una de las bases del ADN. El ordenador
identifica color con base y dibuja un cromatograma con los picos de colores y su
correspondiente base

91

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

9.2 Reaccin en cadena de la Polimerasa


Las bases tericas de la reaccin de PCR son simples. En la reaccin intervienen
tres segmentos de ADN: el segmento de doble cadena que queremos amplificar, y dos
pequeos fragmentos de cadena sencilla, los oligonucletidos (primers u oligos), que
tienen la misma secuencia que los extremos flanqueantes del ADN molde. Adems,
participan en el reaccin el enzima Taq polimerasa (Taq), deoxinucletidos-trifosfato
(dNTPs), sales, y un tampn.
Los oligos se aaden a la reaccin en exceso con respecto al ADN que desea
amplificarse. Los oligos hibridarn con las regiones complementarias del ADN, quedando
orientados con sus extremos 3 enfrentados, de modo que la sntesis mediante la ADN
polimerasa (que cataliza el crecimiento de nuevas cadenas 5 3) se extiende a lo largo
del segmento de ADN que queda entre ellas.
El primer ciclo de sntesis producir nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las
cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los oligos. Este tipo de productos se ir
acumulando de forma geomtrica, con cada ciclo de sntesis, utilizando como moldes las
molculas de ADN parental de la reaccin.
Durante el segundo ciclo de sntesis, estas cadenas hijas servirn a su vez como
moldes, generndose en este caso fragmentos cuyo tamao ser el del fragmento que
engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirn de molde a su
vez para sucesivos ciclos de sntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada
ciclo, por lo que se van acumulado de forma exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrn
aparecido 270 millones de estas molculas, por cada una de ADN original que hubiese.
El primer paso necesario en este proceso de la sntesis es la desnaturalizacin del
ADN. Puesto que el molde es una molcula de ADN de doble cadena, ser necesaria la
separacin de estas para que los oligos puedan acceder a sus secuencias complementarias
y unirse a ellas en el siguiente paso, llamado de alineamiento ("annealing").
Una vez que los oligos se han unido a las cadenas, sirven como cebadores para la
accin de la ADN polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos nuevas cadenas de
ADN complementarias, en el proceso de elongacin. Estos tres pasos consecutivos
(desnaturalizacin, alineamiento y elongacin) constituyen un ciclo de sntesis.
Para las reacciones de PCR de secuenciacin se ha diseado una Taq polimerasa
especifica, Taq FS (fluorescente sequencing), a partir de la Taq polimerasa de Thermus
aquaticus y modificada genticamente de forma que posee muy baja actividad
exonucleasa 5->3 con lo que los resultados son mas limpios con menos ruido de fondo y
apenas falsas terminaciones. Adems este enzima incorpora los ddNTPs marcados
fluorescentemente ms eficientemente, con lo cual son necesarios menos ddNTPsfluorescentes y menos ADN molde para conseguir la misma seal.
En los ltimos aos, tambin se ha avanzado notablemente en la obtencin de
sondas fluorescentes cuyos espectros de emisin de fluorescencia presentan un mnimo
solapamiento.

92

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

9.3 Secuenciacin de productos de PCR


Los fragmentos de PCR que se van a secuenciar directamente por secuenciacin
automtica con terminadores fluorescentes, necesitan ser purificados con objeto de
eliminar los dNTPs y cebadores de la reaccin de PCR. La presencia de ms de un cebador
en la reaccin generara mltiples escaleras solapantes en un gel. De la misma forma, la
contaminacin con dNTPs afecta el balance de los mismos en la reaccin de secuencia.
Para purificar los productos de PCR pueden emplearse los micro-concentradores
Centricon- 100 de Amicon, que son columnas de ultracentrifugacin que permiten separar
los cebadores y dNTPs del producto de PCR que es de mayor tamao. Este tipo de
columnas puede dar problemas para productos de PCR de menos de 125 pb (Ver
Centricon- 30).
Otros productos tiles para la purificacin de bandas de PCR son:
QiaquickTM PCR Purification Columns (QIAGEN INC., Chatsworth, CA: Cat No.
28104) Precipitacin con PEG.

93

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En el caso de existir bandas de amplificacin contaminantes en la reaccin de PCR,
es necesario la extraccin previa de la banda en un gel de agarosa de bajo punto de
fusin.
Tambin pueden emplearse bolas magnticas para la purificacin del producto de
PCR (DynabeadsR M- 280 Streptavidin). Las bolas magnticas unen ADN biotinilado
generado a partir de un oligo biotinilado. La cantidad de producto de PCR recuperado tras
la purificacin puede cuantificarse por absorcin a 260 nm o en un gel de agarosa con
patrones de concentracin conocidos. Se secuencia por el extremo contrario al del primermarcado.

9.4 Purificacin del producto de PCR con columnas de


Centricon100
1. Ensamblar la columna de Centricon- 100.
2. Cargar 2 ml de dH2O en la columna
3. Aadir la muestra de PCR.
4. Centrifugar a 3000 g durante 10 minutos.
5. Quitar el recipiente de residuos y colocar el vial para recuperar el ADN.
6. Invertir la columna y centrifugar a 270 g durante 2 minutos. Se recuperaran
unos 40- 60 l de muestra.
7. Diluir hasta 100 l con dH2O.

Para secuenciacin automtica de productos de PCR Para secuenciar en el


Servicio un producto de PCR, traer en un tubo de 0.5 ml:
-

ADN (fragmento de PCR) 50-800 ng dependiendo del tamao del


fragmento de PCRCebador 3.2 pmolesbH2O hasta 10.5 l

Referencias (PERKIN ELMER) Centricon- 30: - Lmite de Pm 30000.


-

Retiene dsADN mayor de 50 pb y ssADN de 60 nucletidos o ms. - Ref:


N 930- 1381 (24 unidades). Centricon- 100: - Lmite de Pm 100000.

Retiene dsADN de ms de 125 pb y ssADN de 300 nucletidos o ms. Ref: N 930- 2119 ( 24 unidades).

9.5 Mtodos clsicos de secuenciacin

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Mtodo enzimtico de Sanger

Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico y enzimtico)


comparten etapas comunes.

Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar radiactiva o

fluorescentemente

Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN

marcadas cuyos tamaos se diferencian en una nica base. Estas cadenas


de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles
desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como
una escalera de bandas cuya longitud vara en un nico nucletido.
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:
94

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

9.5.1 Mtodo qumico de Maxam y Gilbert


Esta tcnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas
radiactivamente con reacciones qumicas especficas para cada una de las cuatro bases.
Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven, por electroforsis, en
funcin de su tamao en geles de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base
al patrn de bandas radiactivas obtenidas.
Un fragmento de ADN se marca radiactivamente en sus extremos con gamma 32P
gamma 32S dATP por accin de la polinucletido quinasa. La tcnica consiste en romper
estas molculas marcadas con reacciones qumicas especficas para cada una de las cuatro
bases.
Cuatro alcuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas,
posteriormente el tratamiento con piperidina rompe la molcula de ADN a nivel de la base
modificada.
Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven en funcin de su tamao en
geles de poliacrilamida donde la secuencia puefe leerse en base al patrn de bandas
radiactivas obtenidas. Esta tcnica permite la lectura de unas 100 bases de secuencia.


9.5.2 Mtodo enzimtico de Sanger
Este mtodo de secuenciacin de ADN fue diseado por Sanger, Nicklen y Coulson
tambin en 1977 y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi.
Para este mtodo resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y
un iniciador, cebador o "primer" complementario de una regin del ADN molde anterior a
donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN
polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de
ADN.
95

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


Se disea un oligonucletido sinttico de unos 17-20 bases complementario de la
cadena de ADN que se quiere secuenciar y situado a unos 20-30 bases de distancia del
comienzo de la secuencia que se quiere leer. Si este oligo se disea fuera de la regin de
clonaje de los plsmidos podr emplearse el mismo oligo para secuenciar distintos
insertos.
El dplex formado entre el oligo y el ADN complementario de cadena sencilla se
convierte en sustrato de la ADN polimerasa I que va a extender la cadena desde grupo OH
libre del extremo 3 del oligo, incorporando dNTPs y copiando el molde de ADN al
sintetizar la cadena complementaria. Como enzima se emplea el fragmento Klenow de la
ADN polimerasa I que carece de actividad exonucleasa 5- 3. Tambin pueden emplearse
otras polimerasas como la Taq polimerasa o la polimerasa del fago T7.
Durante la secuenciacin se llevan a cabo cuatro reacciones de sntesis separadas
incluyendo en cada una de ellas pequeas cantidades de los dideoxinucletidos (ddNTP:
ddGTP; ddATP, ddCTP, ddTTP) que carecen de extremo 3 OH libre y que al incorporarse
en la cadena de ADN que se esta sintetizando acaban con la elongacin de la misma.
La incorporacin al azar de un ddNTP en competicin con el dNTP
correspondiente, implica la formacin de una mezcla de cadenas de distintas longitudes,
todas ellas empezando en el extremo 5 y acabando en todas las diferentes posiciones
posibles donde un ddNTP puede incorporarse en lugar de un dNTP. El promedio de
longitud de las cadenas puede alterarse modificando la relacin dNTP/ddNTP en la mezcla
de reaccin. Por ejemplo, aumentando la concentracin de ddNTP aumenta el nmero de
cadenas de pequea longitud al aumentar la frecuencia de incorporacin de este tipo de
nucletidos.
La sustitucin de uno de los dNTPs por el mismo nucletido marcado
radiactivamente permite la visualizacin de las bandas de distinta longitud en un gel de
poliacrilamida donde cada una de las reacciones se carga en un carril. En el gel la
separacin de las distintas bandas se produce en funcin de su tamao y la secuencia
puede determinarse leyendo las bandas de los cuatro carriles. En este tipo de geles
pueden leerse hasta 300 bases. En carreras ms largas la lectura puede llegar a ser de
hasta 500 bases.

96

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

9.6 Secuenciacin automtica empleando el mtodo enzimtico


9.6.1 secuenciacin con cebadores fluorescentes
Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se
aade el oligonucletido marcado en 5 con una sonda fluorescente distinta, junto con la
polimerasa, los dNTPs y el ddNTP correspondiente. Las sondas empleadas son:
A

JOE

Emisin:

verde

Derivado de fluorescena

FAM

Emisin:

azul

Derivado de fluorescena

TAMRA

Emisin:

amarillo

Derivado de rodamina

ROX

Emisin:

rojo

Derivado de rodamina

Durante la electroforsis las bandas del ADN de cadena sencilla pasan a travs de
un lser de argn que excita las sondas fluorescentes, la seal de emisin de fluorescencia,
una vez amplificada, es detectada a travs de un filtro y asignada a la base
correspondiente

97

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

9.6.2 Secuenciacin con terminadores fluorescentes

Introducir en un tubo de PCR la muestra de ADN de doble cadena, el


primer a utilizar y la mezcla de reaccin

Programar la reaccin de PCR (multiplicacin del ADN) sometiendo la


mezcla anterior a 25 ciclos de las siguientes caractersticas: 30s a 94C
(desnaturalizacin), 15s a 45C (anillamiento) y 4min. a 60C (elongacin).

Enfriar el tubo a 4C

Purificar el resultado de la reaccin de secuencia de PCR, en una solucin


de etanol y cloruro magnsico: dejar precipitar la mezcla, centrifugar y
eliminar por aspiracin el etanol.

Resuspender el resultado de la reaccin de PCR en un pequeo volumen de


formamida: azul de dextrano. Desnaturalizar la muestra calentndola
durante 2 min. a 90C. Enfriar en hielo.

Cargar los fragmentos de ADN fluorescentes en el gel de secuencia.

De modo alternativo, la secuenciacin puede llevarse a cabo empleando


terminadores marcados cada uno con un fluorforo diferente. Esta qumica es ms sencilla
porque permite llevar a cabo la reaccin en un solo tubo, en que se aaden los cuatro
terminadores marcados.

98

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

9.7 Secuenciadotes automticos


9.7.1 Secuenciadores capilares
El equipo funciona de forma completamente automtica inyectando las muestras
(que se preparan exactamente igual que durante la secuenciacin en geles y se colocan en
una placa de 96 pocillos), en un capilar previamente cargado con un cierto polmero que
funciona como lo hace la matriz de acrilamida: bisacrilamida:urea de los geles de
secuencia, permitiendo resolver fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian
en una nica base.
A una altura determinada el lser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena
sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisin de fluorescencia en la secuencia
correspondiente. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se
vaca rellenndose nuevamente con polmero fresco: Se inyecta a continuacin una
segunda muestra, se procede a desarrollar nuevamente la electroforesis y as
sucesivamente.

Fotografa: ABI Prism 310

Las principales ventajas de estos nuevos equipos son:

Automatizacin completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera


la presencia de un tcnico que cargue las muestras en los diferentes
capilares del equipo.

Rapidez en el anlisis de cada muestra: dado el pequeo dimetro de los


capilares, se pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de
acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo que pueden leerse del orden de 450
nucletidos en el plazo de una hora mientras que esta misma longitud de
secuencia necesita unas 2-4 horas en un secuenciador en gel.

El tiempo necesario del proceso es. para la polimerizacin del mismo, unas
dos horas y para la preelectroforesis, una hora aproximadamente.

99

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

9.7.2 Secuenciadores en geles desnaturalizantes


Secuenciacin automtica en geles desnaturalizantes de acrilamida/bis. La
secuenciacin automtica mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un
gel de acrilamida/bis entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que
sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acopla en el secuenciador
automtico para proceder a la carga de la muestras.
El nmero de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el
nmero de pocillos que posee el peine (de dientes de tiburn) que utilicemos. Hay peines
de cuatro tamaos distintos: de 36, 48, 64 y 96 pocillos.
La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de
unos 700pb aproximadamente, dependiendo siempre de la calidad del ADN, de la
correcta cuantificacin del mismo, de la utilizacin del primer adecuado, y de la
polimerizacin correcta del gel de acrilamida/bis principalmente.
Cuando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 400pb,
podemos disminuir el tiempo de la electroforesis a 3.5 horas, aumentando la velocidad de
barrido del lser, y el resultado es igualmente ptimo.

100

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

9.8 Equipamiento
Secuenciador en geles ABI 377
Modo operativo: Preparacin del ADN para secuenciacin automtica.

9.8.1 Preparacin del adn para secuenciacin automtica


Lisis alcalina y precipitacin con PEG (polietilenglicol)

Una de las modificaciones de este mtodo con relacin a una lisis alcalina normal
consiste en crecer las bacterias en Terrific Broth en lugar de Luria Broth (LB), con lo cual se
aumenta de 4 a 8 veces el nmero de bacterias por ml de cultivo, consiguindose mayores
rendimientos en la obtencin de plsmido.
Otra de las modificaciones, consiste en introducir una precipitacin con PEG, con lo
cual se enriquece la preparacin en ADN sper enrollado, libre de contaminaciones de
ADN cromosmico y RNA. De hecho, ADN plasmdico aislado empleando otros protocolos
de purificacin no ha podido ser secuenciado empleando Taq polimerasa y dideoxiterminadores fluorescentes.

9.8.1.1 Protocolo:
1. Incubar los cultivos O/N a 37C en Terrific Broth con el antibitico
adecuado. El volumen de cultivo en los frascos no debe exceder 1/4 del
volumen total, con el fin de conseguir una buena aireacin.
2. Centrifugar alcuotas de 1.5 ml durante 1 minuto en una minifuga. El tubo
puede rellenarse hasta tres veces sin necesidad de modificar los volmenes
empleados en la lisis y extraccin del plsmido.
3. Quitar el sobrenadante lo ms posible, aspirando con una pasteur.
4. Resuspender el pellet en 200 l de GTE.
5. Aadir 300 l de una solucin 0.2 N NaOH/ 1% SDS recin preparada.
Mezclar el contenido por inversin e incubar en hielo durante 5 minutos.
6. Neutralizar la solucin aadiendo 300 l de AcK 3 M, pH 4.8. Mezclar
invirtiendo el tubo. Incubar en hielo 5 minutos.
7. Eliminar los restos celulares centrifugando 10 minutos a temperatura
ambiente. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
8. Aadir RNasa (libre de DNasa) hasta una concentracin final de 20 g/ml e
incubar a 37C durante, al menos, 20 minutos.
9. Extraer el sobrenadante dos veces. Para ello aadir en la primera extraccin
400 l de fenol. Mezclar las fases con la mano durante 30 segundos.
Centrifugar 5 minutos para separar las fases. Recoger la fase superior.
Extraer nuevamente esta fase con 400 l de cloroformo: Alcohol isoamlico
(24: 1). Centrifugar y recoger la fase acuosa.
10. Precipitar e ADN aadiendo un volumen de isopropanol (100%) y
centrifugar inmediatamente de 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.
11. Lavar el ADN con 500 l de Etanol 70%. Secar los pellets.

101

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12. Resuspender el pellet de ADN en 32 l de agua desionizada, y precipitar
nuevamente, aadiendo 8 l de NaCl 4 M y 40 l de PEG8000 13%/NaCl 4
M.
13. Mezclar bien. Incubar en hielo durante 20 minutos y centrifugar 15 minutos
a 4C en una minifuga.
14. Cuidadosamente retirar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500 l de
Etanol 70%. Secar el pellet. Resuspender en 20 l de agua desionizada.
Cuantificar en un gel de agarosa.

9.8.1.2 Terrific Broth:

SOLUCION A:
PO4H2K 0.17M-PO4HK2 0.72 M

SOLUCIN B:
12 gr de bacto triptona
24 gr de extracto de bacto-levadura (Bacto-yeast extract)
4 ml de glicerol (aproximadamente 5 gr)
H2O desionizada hasta 900 ml. AUTOCLAVAR

TERRIFIC BROTH = 100 ml de Solucin A + 900 ml de Solucin B

9.8.2 Otros mtodos de secuenciacin automtica de ADN


9.8.2.1 Pirosecuenciacin
Etapas del proceso:

102

Un cebador especfico se une a una cadena de ADN sencilla en presencia de


dNTPS, ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa as como de los
sustratos APS (adenosina 5 fosfosulfato) y luciferina.

El primero de los cuatro dNTPs se aade a la reaccin. La ADN polimerasa


cataliza su incorporacin a la cadena; si este dNTP es complementario de la
secuencia del ADN molde se libera PPi en una cantidad equimolar a la
cantidad de nucletido incorporado.

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el Ppi en ATP en presencia de


APS. Este ATP media la conversin de luciferina en oxiluciferina por parte
de la luciferasa, producindose luz visible en intensidad proporcional a la
cantidad de ATP. Esta luz es detectada por una cmara CCD y se visualiza
en el pirograma como un pico, siendo la altura del pico proporcional al
nmero de nucletidos incorporados.

La apirasa degrada de forma continua tanto el ATP como los dNTPs no


incorporados apagando de esta forma la emisin de luz y regenerando las
condiciones para que pueda ser aadido un nuevo nucletido en la
reaccin.

La adicin de nucletidos ocurre de uno en uno. Se sustituye el dATP por


dATPalfaS porque este sustrato es reconocido eficientemente por la ADN
polimerasa pero no por la luciferasa.

103

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

9.9 Glosario:

ADN de cadena simple: Polmero no ramificado, compuesto por cuatro tipos de
subunidades: los desoxiribonucletidos que contienen las bases adenina(A),
citosina(C), guanina(G) y timina(T).
ADN Polimerasa: Enzima que cataliza la incorporacin de los nucletidos
complementarios a la cadena molde durante el proceso de replicacin del ADN.
Bacterifago (Fago): Cualquier virus que
ampliamente utilizada como vector de clonaje

infecte

bacterias.

Herramienta

Cebador / Oligo / oligonucletido o "primer": Molcula corta de ADN de una


sola cadena (Unos 18-24 nucletidos)
Delecin: Ausencia de un nmero de bases (1.2,3...N) en una secuencia de ADN
terminada.
Desoxiribonucletido: Unidad bsica del ADN constituida por una base
nitrogenada: adenina, guanina (purinas), citosina o timina (pirimidinas), un azucar
(desoxiribosa) y un grupo fosfato.
Electroforesis: Mtodo de fraccionamiento molecular basado en diferencias de
movilidad en un campo elctrico.
Gel desnaturalizante: Gel al que se ha incorporado urea como agente
desnaturalizante y en el que las molculas de ADN (previamente desnaturalizadas
por calentamiento a 90C) se someten a electroforesis a 45C con objeto de evitar
su renaturalizacin ( Formacin espontnea de la doble hlice). De esta forma la
velocidad de migracin en el gel es directamente proporcional al tamao de la
cadena sencilla de ADN.
Gel de acrimamida/bisacrilamida.; Gel copolimerizado que gracias a la formacin
de una malla de un tamao de poro concreto permite separar diferentes molculas
en funcin de su tamao.
Terminadores o dodeoxirribonucleotids (ddNTPs): Desoxirribonucletido que no
posee el OH en posicin del anillo de desoxiribosa y por tanto no permite continuar
la reaccin de elongacin de la cadena de ADN.

104




UNIDAD DIDCTICA X
NIVELES DE SEGURIDAD Y
PELIGROSIDAD EN EL LABORATORIO

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10.1 Seguridad en el Laboratorio de Anatoma Patolgica


10.1.1 Precauciones universales en el trabajo del Laboratorio
Las denominadas precauciones universales constituyen la estrategia
fundamental para la prevencin del riesgo laboral para todos los microorganismos
vehiculizados por la sangre.
Su principio bsico es que la sangre y otros fluidos corporales deben considerarse
potencialmente infecciosos.
Debe aceptarse que no existen pacientes de riesgo sino maniobras o
procedimientos de riesgo, por lo que se han de adoptar precauciones utilizando las
barreras protectoras adecuadas en todas las maniobras o procedimientos en los que
exista la posibilidad de contacto con la sangre y/o fluidos corporales a travs de la piel o
las mucosas.
Es de especial importancia que:

todo el personal est informado de dichas precauciones,

todo el personal conozca las razones por las que debe proceder de la
manera indicada y se promueva el conocimiento y la utilizacin adecuados.

Se pueden distinguir las siguientes precauciones universales:

Vacunacin (inmunizacin activa).

Normas de higiene personal.

Elementos de proteccin de barrera.

Cuidado con los objetos cortantes.

Esterilizacin y desinfeccin correcta de instrumentales y superficies

10.1.1.1 Vacunacin
El personal de un hospital est sometido a numerosos riesgos biolgicos,
producidos por bacterias, hongos, virus, etc., frente a los cuales se dispone de vacunas que
hacen posible su prevencin y, a veces, su tratamiento.
La inmunizacin activa frente a enfermedades infecciosas ha demostrado ser, junto
con las medidas generales de prevencin, una de las principales formas de proteger a los
trabajadores.
Deber vacunarse todo el personal que desarrolle su labor en ambientes que
tengan contacto, tanto directo como indirecto, con la sangre u otros fluidos biolgicos de
otras personas infectadas (por ejemplo, la vacuna contra la Hepatitis B para el personal
que desarrolle su labor en ambiente hospitalario y que tenga contacto directo o indirecto
con la sangre u otros fluidos de los pacientes).

107

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10.1.1.2 Normas de Higiene Personal


A continuacin se resumen un conjunto de normas de higiene personal a seguir
por los trabajadores:

Cubrir heridas y lesiones de las manos con apsito impermeable, al iniciar la


actividad laboral.

Cuando existan lesiones que no se puedan cubrir, deber evitarse el


cuidado directo de los pacientes.

El lavado de manos debe realizarse al comenzar y terminar la jornada y


despus de realizar cualquier tcnica que puede implicar el contacto con
material infeccioso. Dicho lavado se realizar con agua y jabn lquido.

En situaciones especiales se emplearn sustancias antimicrobianas. Tras el


lavado de las manos stas se secarn con toallas de papel desechables o
corriente de aire.

No comer, beber ni fumar en el rea de trabajo.

El pipeteo con la boca no debe realizarse.

10.1.1.3 Elementos de Proteccin de Barrera


Todos los trabajadores de la salud deben utilizar rutinariamente los elementos de
proteccin de barrera apropiados cuando deban realizar actividades que los pongan en
contacto directo con la sangre o los fluidos corporales de los pacientes. Dicho contacto
puede producirse tanto de forma directa como durante la manipulacin de instrumental o
de materiales extrados para fines diagnsticos como es el caso de la realizacin de
procesos invasivos

10.1.1.4 Objetos Cortantes y Punzantes


Se deben tomar todas las precauciones necesarias para reducir al mnimo las
lesiones producidas en el personal por pinchazos y cortes.
Precauciones para la prevencin de estos riesgos:

108

Tomar precauciones en la utilizacin del material cortante, de las agujas y


de las jeringas durante y despus de su utilizacin, as como en los
procedimientos de limpieza y de eliminacin.

No encapsular agujas ni objetos cortantes ni punzantes ni someterlas a


ninguna manipulacin.

Disponer de una buena proteccin para las cuchillas en microtomos y


criostatos

Los objetos punzantes y cortantes (agujas, jeringas y otros instrumentos


afilados como cuchillas de microtomo, cuchillos, etc.) debern ser
depositados en contenedores apropiados con tapa de seguridad, para
impedir su prdida durante el transporte, estando estos contenedores cerca
del lugar de trabajo y evitando su llenado excesivo.

El personal sanitario que manipule objetos cortantes se responsabilizar de


su eliminacin.

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10.1.1.5 Desinfeccin y Esterilizacin correcta de Instrumentales y


Superficies
Haremos una descripcin de las normas relativas a desinfeccin y esterilizacin

Desinfeccin:

El empleo de productos qumicos permite desinfectar a temperatura ambiente los


instrumentos y superficies que no resisten el calor seco o la temperatura elevada.
Para llevar a cabo una desinfeccin del tipo que sea, es necesario tener en cuenta:
1. La actividad desinfectante del producto.
2. La concentracin que ha de tener para su aplicacin.
3. El tiempo de contacto con la superficie que se ha de descontaminar.
4. Las especies y el nmero de grmenes que se han de eliminar.
El producto desinfectante debe tener un amplio espectro de actividad y una accin
rpida e irreversible, presentando la mxima estabilidad posible frente a ciertos agentes
fsicos, no debiendo deteriorar los objetos que se han de desinfectar ni tener un umbral
olfativo alto ni especialmente molesto.
Una correcta aplicacin de los desinfectantes ser, en general, aquella que permita
un mayor contacto entre el desinfectante y la superficie a desinfectar.
El producto desinfectante se debe poder aplicar de tal manera que no presente
toxicidad aguda o crnica para los trabajadores que puedan entrar en contacto con l.
Debe tenerse en cuenta que por su propia funcin, destruccin de
microorganismos, muchos desinfectantes tienen caractersticas de toxicidad importantes
para el hombre, por lo que se debern adoptar las medidas de proteccin y prevencin
adecuadas y seguir siempre las instrucciones para su aplicacin, contenidas en la etiqueta
y en las fichas de seguridad.
Los desinfectantes que se utilicen deben estar adecuadamente etiquetados segn
la normativa correspondiente (RD 1078/1993, RD 363/1995 y RD 1893/1996), tanto si se
han adquirido comercialmente, como si son de preparacin propia.
Al adquirir productos qumicos, debe exigirse siempre la entrega de la ficha de
seguridad correspondiente.
La eficacia de los desinfectantes est limitada por la presencia de materia orgnica,
por lo que los tiempos de aplicacin de los mismos disminuir cuando el instrumental que
se deba desinfectar est limpio.
En funcin de los microorganismos manipulados, se redactarn las instrucciones de
desinfeccin en las que consten los desinfectantes y las diluciones a las que se deban
emplear.
Hay que tener en cuenta que las frmulas de los productos desinfectantes
comerciales presentan grandes diferencias, por lo que es esencial seguir las indicaciones
del fabricante.

109

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En la tabla adjunta se presenta un listado de productos qumicos empleados
habitualmente como desinfectantes:

TIPO

ALCOHOLES
(etanol,
isopropanol)

COMPUESTOS
DEAMONIO
CUATERNARIO

COMPUESTOS
FENLICOS

IODFOROS

GLUTARAL
DEHIDO

CONC.
ACCIN
UTILIZADAS

6090%

0,41,6%

0,40,5%

75ppm

2,0%

B,F,V

B*,F,V*

MECANISMO

DESNATURALIZACIN NOMANCHA
PROTEINAS
NIIRRITA

INCREMENTOS
PERMEABILIDAD
CELULAR

DESNATURALIZACIN
B.F,V(T)
PROTEINAS

B,F,V,T

VENTAJAS

IODACINY
OXIDACINDE
PROTEINAS

INCONVENIENTES

INACTIVADOPOR
MATERIA
ORGNICA;
INFLAMABLE

BARATO

IRRITANTE;
TXICO

BARATO

TXICO;
CORROSIVO;
PERMISO
RESIDUOS

IRRITANTE
TXICO;
CORROSIVO

ESTABLE;
ACCIN
RESIDUAL

CARO;
INACTIVADOS
PORMATERIA
ORGNICA

IRRITANTE
DEPIELY
MUCOSAS

VAPORES
IRRITANTES;
TXICO

TXICO;
IRRITANTE

NO
CORROSIVO;
ENTRECRUZAMIENTO
B,F,V,T,E
INAFECTADO
DEPROTEINAS
POROTROS
COMPUESTOS

500ppm
(Clorolibre)

B,F,V,T

INACTIVACIN
ENZIMTICA

BARATO

PERXIDODE
HIDRGENO

3,0%

B,F,V,T,E

RADICALESLIBRES

ESTABLE

TXICO:
CORROSIVO;
TXICO;
INACTIVADOPOR
CORROSIVO
MATERIA
ORGNICA
CORROSIVO;
CARO

NOTAS: F: Fungicida; B: Bactericida; V: Virucida; T: Tuberculocida; E: Esporicida; *: Efectividad


limitada;():Notodaslasformulaciones

Esterilizacin:

Con la esterilizacin se produce la destruccin de todos los grmenes, incluidos


esporas bacterianas, que pueda contener un material.Se debe recordar que, en ciertos
casos, los instrumentos son sometidos a la accin de soluciones detergentes o
antispticas para diluir sustancias orgnicas o evitar que se sequen. Dado que este paso
no es una verdadera desinfeccin, estos instrumentos no debern ser manipulados ni reutilizados hasta que se efecte una esterilizacin.
110

NOBACTERIAS
GRAM();PUEDE
ACTUARCOMO
FUENTEDEN;
INACTIVACIN
MATERIA
ORGNICA

HIPOCLORITO

EFECTOS
SOBRE
HUMANOS

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


Existen diferentes tipos de esterilizacin de los cuales, a continuacin, se ofrece un
listado:

Esterilizacin por calor hmedo bajo presin (autoclave):

Es el mtodo de eleccin, por ser el ms fiable, eficaz y de fcil empleo. Se


introduce el material a esterilizar en bolsas adecuadas y cerradas, dejndose durante 20
minutos a 121C (para algunos agentes pueden ser necesarias otras condiciones),
teniendo la precaucin de que la atmsfera del autoclave est a saturacin y desprovista
de aire.
En este sentido es recomendable disponer de un manual de procedimiento para el
trabajo con el autoclave, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Si no se dispone de autoclave, para instrumental de pequeo volumen, cabe
recurrir a ebullicin del agua, preferentemente conteniendo bicarbonato sdico, durante
30 minutos, o bien al empleo de una olla a presin al nivel mximo de presin de trabajo.
-

Esterilizacin por calor seco:

Debe mantenerse por dos horas a partir del momento en que el material ha
llegado a los 170C.
-

Radiaciones ionizantes

Basan sus efectos en la capacidad de destruccin celular. Debido a su poder de


penetracin, la radiacin g es la empleada en la esterilizacin del material sanitario, sobre
todo en el mbito industrial.
La instalacin de esterilizacin por rayos g ha de cumplir unos requisitos especiales
como instalacin radiactiva, lo que limita totalmente su aplicacin en los laboratorios, a
menos que estn dentro de una institucin (por ejemplo, un hospital) que disponga de
una instalacin adecuada para ello.
-

Esterilizacin con vapores qumicos

Los agentes gaseosos, tales como el formaldehdo o el xido de etileno, tienen una
actividad bactericida y esporicida en el intervalo de 30-80C.
La esterilizacin, en este caso, se lleva a cabo en esterilizadores diseados
especficamente, que tambin se llaman autoclaves, y que permiten obtener las
condiciones de presin, de temperatura y de humedad adecuadas. Funcionan de manera
automtica, por ciclos, e incluyen la evacuacin de los fluidos.
-

Esterilizacin por xido de etileno

Este tipo de esterilizacin slo debe aplicarse a aquel material que no pueda ser
esterilizado al vapor y debe llevarse a cabo por personal cualificado, informado de los
riesgos que presenta su utilizacin, disponiendo de un protocolo de actuacin bien
establecido y, cuando el caso lo requiera, de los equipos de proteccin individual
adecuados.
Los autoclaves de xido de etileno deben ser de estanqueidad contrastada, a ser
posible de doble puerta con extraccin por encima de la de descarga y con aireacin
incorporada. Deben ubicarse en reas aisladas, bien ventiladas y mantenidas a depresin
con las adyacentes, procedindose a un control ambiental peridico de la presencia en
aire del compuesto.
111

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


Actualmente se estn desarrollando sistemas denominados de Plasma de baja
temperatura basados en el empleo de perxido de hidrgeno y radiofrecuencias, como
alternativa al empleo de xido de etileno y formaldehdo, considerados como compuestos
peligrosos para la salud.

10.1.1.6 Laboratorio Bsico. Instalacin del Laboratorio


Sin duda, la seguridad dentro del laboratorio debe tenerse en cuenta desde la fase
de diseo del mismo, aunque esto no siempre es posible. Los laboratorios de tipo medio
o pequeos se ubican muchas veces en locales no pensados para este uso y con el
agravante que con el paso del tiempo se van ampliando con nuevas tecnologas
quedando los locales pequeos y llenos de aparatos. La aplicacin de una poltica de
seguridad en el laboratorio, cuando ste ya lleva tiempo en funcionamiento y creciendo,
es complicada y cara e incluso puede que no sea viable en muchos casos sin recurrir a un
rediseo del laboratorio.
Algunas normativas s deben ser tenidas necesariamente en cuenta antes de
disear y estructurar un laboratorio. La "Ordenanza General de Seguridad e Higiene en el
Trabajo", Orden de 9 de marzo de 1971 es una de ellas, as como la Norma Bsica de la
Edificacin (NBE CPI 91 y la anterior, NBE CPI 82).
Segn recomienda la O.M.S. en el "Manual de Bioseguridad" y tambin segn la
Directiva del Consejo 90/679/CEE, para la proteccin de los trabajadores expuestos a
agentes biolgicos, hay que tener en cuenta las siguientes recomendaciones:

112

El laboratorio debe tener techos, paredes y suelos fciles de lavar,


impermeables a los lquidos y resistentes a la accin de las sustancias
qumicas y productos desinfectantes que se usan ordinariamente en ellos.
Los suelos deben ser antideslizantes.

Las tuberas y conducciones no empotradas deben estar separadas de las


paredes y evitar tramos horizontales para,no acumular el polvo.

Las superficies de trabajo tienen que ser impermeables y resistentes a los


cidos, lcalis, disolventes orgnicos y al calor moderado. En las poyatas
hay que evitar las baldosas con juntas de cemento. Adems hay que
calcular una longitud de 2 metros lineales por persona.

Se instalar una iluminacin adecuada y suficiente y que no produzca


reflejos. El nivel recomendado para el trabajo de laboratorio es de 500 lux,
segn la Norma Tcnica DIN 5053.

El mobiliario ser robusto. Los espacios entre mesas, armarios, campanas y


otros muebles sern suficientemente amplios para facilitar la limpieza.

En cada unidad del laboratorio debe haber lavabos de manos, a ser posible
con agua corriente, instalados preferentemente cerca de la salida.

Las puertas deben estar protegidas contra incendios y cerrarse


automticamente. Adems, estarn provistas de mirillas con cristal de
seguridad de 40 por 23 cm, situado a la altura de la mirada. Su misin es
evitar accidentes y poder examinar el interior del laboratorio sin abrir la
puerta.

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Fuera de las zonas de trabajo debern estar los vestuarios, comedores o


zonas de descanso y, caso de que el edificio donde se halle ubicado el
laboratorio lo permita, espacios reservados para fumadores.

En el mismo laboratorio o local anexo deber colocarse un autoclave para


la descontaminacin del material de desecho infeccioso.

Deber reservarse espacio para guardar los artculos de uso inmediato,


evitando su acumulacin desordenada sobre las mesas y pasillos. Para el
almacenamiento a largo plazo se recomienda un local fuera de la zona de
trabajo.

Habr que prever espacio e instalaciones para manejar y almacenar


disolventes, material radioactivo y gases comprimidos en condiciones
adecuadas de seguridad y siguiendo las normativas especficas para ello.

Deben existir medios de proteccin contra incendios, a nivel de prevencin,


evitando que se inicie el incendio y a nivel de proteccin, evitando que se
propague el incendio. As mismo debe haber un sistema de deteccin de
humos y/o fuego con alarma acstica y ptica.

Debe disponerse de una instalacin elctrica segura y de suficiente


capacidad. Se necesita un sistema de iluminacin de emergencia para
facilitar la salida del laboratorio en condiciones de seguridad. Conviene que
haya un grupo electrgeno de reserva para alimentar el equipo esencial
(estufas, congeladores, etc.).

Se dispondr de un botiqun suficiente e informacin sobre primeros


auxilios.

No existen normas concretas de ventilacin, aunque se recomienda trabajar


en depresin y una renovacin de aire de 60 m3 por persona y hora.

No debe haber ninguna conexin entre las conducciones de agua


destinada al laboratorio y las del agua de bebida. El abastecimiento de
agua potable al laboratorio estar protegido contra el reflujo por un
dispositivo adecuado.

10.1.1.7 Tcnicas de Laboratorio


Las tcnicas de laboratorio son los procedimientos de trabajo recomendados. Hay
que tener en cuenta que un procedimiento ordenado de trabajo es indispensable para la
seguridad.

Nunca se pipetear con la boca, emplendose los dispositivos de tipo


mecnico.

Deben utilizarse guantes adecuados en todos los trabajos que entraen


algn contacto con sangre, material infeccioso o animales infectados.

Hay que utilizar batas o uniformes de trabajo para evitar la contaminacin


de los vestidos de calle. No se utilizar la ropa de laboratorio fuera de ste
(cafetera, biblioteca, etc.).

Siempre que haya peligro de salpicaduras se utilizarn gafas de seguridad,


pantallas faciales u otros dispositivos de proteccin.

113

Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa

A fin de evitar los cortes accidentales, se preferir el uso de material


plstico al de cristal.

En la zona del laboratorio no se permitir comer, guardar alimentos, beber,


fumar ni usar cosmticos.

El uso de agujas hipodrmicas y de jeringas debe evitarse. Cuando ello no


sea posible, las agujas se recogern en recipientes adecuados que eviten
los pinchazos accidentales.

Las superficies de trabajo se descontaminarn por lo menos una vez al da y


siempre que haya un derrame. Una nota debe especificar el modo de
empleo de los desinfectantes, la naturaleza del desinfectante a utilizar y su
concentracin.

Todos los desechos biolgicos, ya sean lquidos o slidos, tienen que ser
descontaminados antes de su eliminacin y se seguirn las normas
existentes sobre la gestin de residuos contenidos en las reglamentaciones
referentes a residuos sanitarios.

Todo el personal se lavar las manos despus de haber manipulado


material o animales infecciosos, as como al abandonar el laboratorio.

El acceso al laboratorio debe ser controlado.

El material contaminado, que deba ser descontaminado en un lugar exterior


al laboratorio, se colocar en un contenedor especial, y se cerrar antes de
sacarlo del laboratorio.

Deber existir un programa de lucha contra insectos y roedores que se


pondr en prctica.

Hasta aqu se han descrito las medidas y tcnicas recomendadas para el


laboratorio bsico, donde se manipulan agentes biolgicos. Dichas medidas se aplicarn
tambin en los niveles de seguridad superiores, pero no se repetirn en la descripcin de
cada nivel; slo se indicarn las precauciones suplementarias a tener en cuenta para cada
nivel de riesgo

10.2 Niveles de seguridad


Segn el riesgo relativo que entraan los microorganismos infectantes que se
manipulan en el laboratorio, la construccin, el diseo y tambin los medios de
contencin el Manual de Bioseguridad de la O.M.S. los clasifica en cuatro categoras:
1. Laboratorio bsico.
2. Laboratorio bsico con cabina de seguridad biolgica u otros dispositivos
apropiados de proteccin personal o contencin fsica.
3. Laboratorio de contencin.
4. Laboratorio de contencin mxima.
Cuando se trate de un agente biolgico que no haya sido objeto de una
evaluacin concluyente para clasificarlo, pero se sospecha que su manipulacin puede
comportar un riesgo para la salud, las actividades debern desarrollarse en un lugar de
trabajo cuyo confinamiento fsico corresponda como mnimo al nivel de contencin 3.
114

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


Muchas tcnicas que se emplean en los laboratorios de investigacin
(manipulacin de grandes volmenes, concentraciones y experimentacin animal entre
otras) son susceptibles de aumentar los riesgos de contaminacin de los manipuladores,
por lo que en estos casos deben aumentarse los niveles de proteccin.
En la Directiva 90/679/CEE, en el Anexo V se dan las indicaciones relativas, a partir
del Nivel de Riesgo 1, de las medidas de contencin y de los niveles de contencin segn
la naturaleza de las actividades, de la evaluacin del riesgo para los trabajadores y de las
caractersticas del agente biolgico de que se trate.

10.2.1 Reduccin de riesgos


El riesgo de exposicin se reducir al nivel ms bajo posible para garantizar la
proteccin sanitaria y la seguridad de los trabajadores, en particular por medio de las
siguientes medidas:

Reducir al mnimo posible en nmero de trabajadores expuestos.

Establecer procedimientos de trabajo adecuados y la utilizacin de medidas


tcnicas para evitar o minimizar la liberacin de agentes biolgicos en el
lugar de trabajo.

Establecimiento de planes para hacer frente a los accidentes que incluyan


agentes biolgicos.

Utilizacin de una seal de peligro biolgico tal como se ha descrito


anteriormente y otras seales de aviso pertinentes.

Medidas de proteccin colectivas o de proteccin individual cuando la


exposicin no pueda evitarse por otros medios.

Medidas de higiene compatibles con el objetivo de prevenir o reducir el


transporte o la liberacin accidental de un agente biolgico fuera del lugar
de trabajo.

Verificacin, si fuera necesaria y tcnicamente posible, de la presencia de


agentes biolgicos utilizados en el trabajo fuera del confinamiento fsico
primario.

Medios seguros que permitan la recogida, el almacenamiento y la


evacuacin de residuos por los trabajadores, incluyendo la utilizacin de
recipientes seguros e identificables, previo tratamiento adecuado si fuera
necesario.

Medidas seguras para la manipulacin y transporte de agentes biolgicos


dentro del lugar de trabajo.

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10.3 Tratamiento de residuos sanitarios


Est cientficamente demostrado que la cantidad de residuos, que cualitativamente
pueden considerarse peligrosos, representa una pequea proporcin de los que se
producen en los establecimientos sanitarios. Si bien, el riesgo potencial, tanto para la
poblacin de profesionales sanitarios, como para los ciudadanos en general, es lo
suficientemente importante como para que desde las Instituciones y desde los propios
profesionales, se tomen todas las medidas necesarias para garantizar los procesos de
gestin ms adecuados en cada caso.
La correcta ordenacin y normalizacin de los residuos sanitarios permite disminuir
el posible riesgo hacia la salud y el medio ambiente derivado de una deficiente gestin
intracentro a la vez que minimiza los costes de la gestin global de residuos sanitarios.

10.3.1 Clasificacin
En todo proceso de gestin de residuos es de capital importancia la clasificacin
que hagamos de los distintos grupos generados, porque de ella dependern las dems
etapas. Como hemos visto, no existe una norma reguladora de carcter especfico, por lo
tanto la clasificacin que se propone es orientativa, si bien est comnmente aceptada
por la comunidad cientfica.

Grupo I. Residuos generales asimilables a Urbanos.

Son Los producidos fuera de la actividad asistencial, por lo que no presentan una
contaminacin especfica.
Por tanto son residuos como restos de comidas, alimentos, embalajes, mobiliario
en desuso, jardinera, colchones, papelera generados en reas administrativas, de
mantenimiento, almacenes y muelles de carga y descarga...

Grupo II. Residuos Sanitarios asimilables a Urbanos.

Son los producidos como consecuencia de la actividad asistencial y/o


investigacin asociada, que no estn incluidos en el Grupo III. Pueden eliminarse con
mismas precauciones y en las mismas instalaciones que los del grupo anterior, lo que
significa descuidar las precauciones. No obstante estaran excluidos de las lneas
reciclado.

de
las
no
de

Los residuos seran: restos de curas, pequeas intervenciones quirrgicas, bolsas de


orina vacas y empapadores, recipientes desechables de aspiracin vacos, yesos, sondas,
paales... y, en general todos aquellos cuya recogida y eliminacin no ha de ser objeto de
requisitos especiales para prevenir infecciones.
Se incluye en este grupo todo el material que habiendo estado contaminado se
haya tratado especficamente para su descontaminacin y/o esterilizacin, bien en
instalaciones generales, o bien en los autoclaves o cualquier otro sistema que, a tal efecto
pudieran estar instalados en las dependencias de los centros de salud o consultorios.

Grupo III. Residuos Peligrosos.


-

III a .Residuos Peligrosos Sanitarios

Son los producidos en la actividad asistencial y/o de investigacin asociada,


que conllevan algn riesgo potencial para los trabajadores expuestos o para el
medio ambiente, siendo necesario observar medidas de prevencin en su
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manipulacin, recogida, almacenamiento, transporte, tratamiento y eliminacin.
Existen clasificaciones en las que se refiere el Grupo III como Biosanitarios
especiales, mientras que los que incluimos en el Grupo III b quedaran incluidos en
un Grupo IV de residuos qumicos.

Infecciosos: Son todos aquellos residuos que puedan transmitir las


infecciones que se relacionan en el cuadro que se inserta a continuacin.

Agujas y otro material punzante y/o cortante: Se trata de cualquier objeto


cortante y/ o punzante que se utilice en la actividad sanitaria, con
independencia de su origen. Son fundamentalmente: Agujas, lancetas,
pipetas, hojas de bistur, portaobjetos, cubreobjetos, tubos capilares y otros
tubos de vidrio...

Vacunas vivas y atenuadas: Restos de la vacuna. No quedaran incluidos los


materiales de un solo uso manchados con el producto administrado.

Sangre y hemoderivados en forma lquida: Recipientes que contengan


sangre o hemoderivados u otros lquidos biolgicos. Se trata siempre de
residuos lquidos, en cantidades mayores a 100 ml., en ningn caso de
materiales manchados o que hayan absorbido dichos lquidos.

Cultivos y reservas de agentes infecciosos: Recipientes con residuos de


actividades de anlisis o experimentacin microbiolgicas. Cultivos de
agentes infecciosos y material de desecho contaminado. Reservas de
agentes infecciosos.

Residuos de animales infecciosos: Cadveres, partes del cuerpo y otros


residuos anatmicos. Lechos de estabulacin de animales de
experimentacin que hayan sido inoculados con los agentes infecciosos
citados con anterioridad.

El riesgo potencial ms elevado se centra en enfermedades de escasa frecuencia


entre nuestra poblacin. Entre stas cabe destacar: el ntrax, el muermo, las producidas
por virus del grupo de las fiebres hemorrgicas africanas (Enfermedad de Marburg, la
fiebre hemorrgica de bola y la fiebre de Lassa), y las enfermedades lentas producidas
por agentes no convencionales (Creutzfeld-Jacob).
-

III.b. Residuos qumicos y citostticos.

Se incluyen residuos qumicos sometidos a la legislacin especfica de residuos


txicos y peligrosos, tales como Citostticos, restos de sustancias qumicas txicas, aceites
minerales, residuos con metales txicos, restos de lquidos de revelado de radiologa y
fotografa.
Tambin estn incluidos en este grupo los medicamentos caducados que por una
gestin ineficiente del servicio responsable no hayan sido retirados por los proveedores
de los mismos.

Grupo IV. Residuos Radiactivos.

Quedaran incluidos dentro de este grupo el material de desecho contaminado por


sustancias radiactivas, no tendran esta consideracin las placas o los lquidos de revelado
de radiodiagnstico, que en su caso, perteneceran al grupo anterior. Su recoleccin y
eliminacin es competencia exclusiva de ENRESA. En nuestro ordenamiento legal existe
un amplio soporte normativo que regula la proteccin radiolgica, si bien , no le daremos
cabida en este curso.
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Grupo V. Restos anatmicos humanos.

Comprende los cadveres y restos humanos de entidad suficiente, procedentes de


abortos, mutilaciones u operaciones quirrgicas. Su gestin queda regulada por el
Reglamento de Polica Sanitaria Mortuoria aprobada por el R.D. 2263/74 (20,7) ,
debiendo eliminarse por inhumacin o cremacin.

10.3.2 Recogida
El primer paso a seguir en el tratamiento de los residuos sanitarios es su
clasificacin, por lo que no se depositarn en un mismo recipiente residuos sanitarios de
tipos diferentes, respetando la clasificacin establecida, consiguindose as minimizar la
cantidad de residuos.
Al mismo tiempo, la recogida de residuos sanitarios deber atender a los criterios
de asepsia, inocuidad y economa. Su recogida se realizar, segn los grupos:

Grupo I: Se recogen en bolsas de color negro que cumpla la norma UNE 53147-85, con galga mnima 200.

Grupo II: Se recogen en bolsas de color marrn que cumpla la norma UNE
53-147-85, con galga mnima 200.

Grupo III.a: Se recogen en bolsas de color rojo que cumpla la norma UNE
53-147-85, con galga mnima 400, y/o contenedores de un solo uso,
elaborados con material que garantice su total eliminacin, rgidos,
impermeables, resistentes a agentes qumicos y a materiales perforantes y
que dispongan de un cierre provisional que garantice su estanqueidad
hasta su llenado y de un cierre hermtico definitivo.

Los residuos cortantes y punzantes se recogern en contenedores de las mismas


caractersticas y cuya tapa est dotada de un mecanismo adecuado de desactivacin de
los dispositivos dotados con elementos cortantes o punzantes insertados en forma de
lanza o roscadas.

10.3.2.1 Residuos tipo sangre y hemoderivados


La opinin que predomina en el mbito internacional (Centers for Disease Control,
Ministerio de Sanidad del Canad, Ministerio de Medio Ambiente de Holanda, OMS, etc.),
es que el mejor mtodo de eliminacin de la sangre, derivados y secreciones orgnicas es
el de verterlos por el desage conectado a la red de saneamiento del centro sanitario y
que por lo tanto no es necesaria la desinfeccin previa de los residuos. Se ha de tener en
cuenta que las cloacas estn concebidas para recibir grandes cantidades de materias
orgnicas infecciosas. Por otro lado, los residuos biolgicos sanitarios lquidos representan
un volumen nfimo en comparacin con las materias orgnicas fecales que se eliminan
normalmente para la red de saneamiento.
La nica excepcin a esta prctica la constituyen los residuos sanitarios especficos
lquidos procedentes de pacientes con infecciones no endmicas en Espaa y los cultivos
lquidos de microbiologa, que han de tratarse como a residuos sanitarios especficos
slidos.
Es importante que el vertido por el desage se haga con especial precaucin, de
forma que se eviten al mximo las salpicaduras y la formacin de aerosoles. Por lo tanto, si

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Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


el recipiente con lquido biolgico es difcil de abrir, no se ha de intentar agujerearlo o
forzarlo, sino que se ha de eliminar como residuo sanitario especfico slido (grupo III).

Grupo III.b: Para la recogida de los residuos de Citostticos se utilizar


contenedor de un solo uso, elaborado con material que garantice su total
eliminacin, rgido impermeable, resistente a agentes qumicos y materiales
perforantes y que dispongan de un cierre provisional que garantice su
estanqueidad hasta su llenado y un cierre hermtico definitivo. El
contenedor se identificar con el pictograma de residuo citosttico.

Los residuos qumicos, Xilol, Formol, se recogern en contenedores de


caractersticas iguales a la de los Citostticos

10.3.2.2 Contenedores para la Recogida


Las dotaciones de contenedores para la recogida de residuos de los distintos
grupos de residuos generados, seguirn los siguientes criterios generales:

Contenedores de residuos del grupo I. En las Zonas Administrativas:


Papeleras con bolsa de color negro de las caractersticas establecidas
anteriormente. Las dependencias intermedias se podrn dotar de
contenedores negros de suficiente capacidad para albergar la produccin
que se genere. Se estudiaran procedimientos de segregacin selectiva para
el posterior reciclaje de los residuos de papel, cartn, etc.

Contenedores de residuos del grupo II. En las Zonas de Actividad Sanitaria:


Contenedores dotados de una bolsa marrn cuyas caractersticas se ajusten
a las fijadas en el apartado anterior. Estos contenedores tambin recogern
los residuos del Grupo I que se generen en estas zonas. De esta forma
facilitaremos el proceso de segregacin al evitar un nmero excesivo de
contenedores que en muchos casos habra dificultades para ubicarlos de
una forma ergonmicamente aceptable

Contenedores de residuos del grupo III.a. Dentro del Grupo IIIa hemos
hecho referencia a punzantes y otros residuos infecciosos, las diferencias
que existen entre ellos tambin se pueden ver reflejadas en el tamao de
los contenedores, no as en lo relativo a sus caractersticas generales:
estanqueidad, opacidad, resistencia a golpes, desgarros, dotacin de doble
cierre y todas aquellas cuyo manejo no suponga riesgos para sus
manipuladores.

Contenedores de cortantes y punzantes: Se colocar un contenedor en


cada control de enfermera, carro de curas, quirfano, consulta, box de
urgencias, en general en todo local en el que se realice actividad sanitaria y
tpica la utilizacin frecuente de material cortante o punzante. Es
recomendable establecer un circuito especfico de recogida de estos
contenedores independiente del procedimiento general. La capacidad de
los contenedores se establecer en funcin de la produccin de esta clase
de residuos.

Contenedores de residuos del grupo III.b: Se ubicar un contenedor por


cada laboratorio.

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Contenedores para residuos citostticos: Como norma general existir UN


CONTENEDOR por cada Centro de Salud o Consultorio. La capacidad de los
contenedores se establecer en funcin de la produccin de esta clase de
residuos.

Una vez que los residuos han sido depositados en los contenedores respectivos se
inicia la siguiente fase, consistente en el itinerario por el Centro Sanitario desde el lugar de
generacin del residuo al de su almacenamiento previo o definitivo antes de entregarlo al
gestor externo autorizado: ser el servicio municipal de basuras para los grupos I y II o
empresa contratada para el resto de los grupos.
El circuito comenzar por el rea de produccin ms alejado del almacn de sucio
para los del Grupo III a o del lugar por el que sern depositados en los contenedores del
servicio municipal para los Grupos I y II, ambos recorridos no podrn ser simultneos. Se
comenzar por estos ltimos, sirviendo este primero por las reas de produccin, para
evaluar las necesidades de reposicin de contenedores del Grupo III a, que se retirarn en
el segundo recorrido. Los circuitos deben mantener las reas de limpio y sucio separadas.
Es necesario fijar un horario de recogida que al menos se realizar cada doce horas,
teniendo en cuenta los mximos de produccin y la menor afluencia de pblico.
Una vez practicada la retirada de los distintos residuos generados, se proceder a
la limpieza y desinfeccin exhaustiva de suelos y superficies.

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CUESTIONARIO

Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica

Cuestionario












1. La molcula de ADN est constituida por?
a. Dos largas cadenas de nucletidos formando una hlice
b. Una cadena corta de nucletidos helicoidal
c. Dos cadenas cortas de nucletidos formando una hlice entre si
2. La secuencia del ADN est compuesta por:
a. Cuatro bases fosfatadas
b. Cuatro bases nitrogenadas
c. Infinitas bases nitrogenadas
3. Los errores genticos provocan enfermedades, cul de los siguientes patrones
afirma este postulado:
a. Disposicin exacta de las bases
b. Elaboracin exacta de protenas
c. Bases fuera de lugar
4. El nmero de cromosomas corresponde a:
a. 44
b. 45
c. 46
5. Que son las sondas?
a. Segmentos de ADN o ARN marcados
b. Segmentos reticulares
c. Secuencias plsticas polimrficas
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Tcnico Superior Sanitario de Anatoma Patolgica y Citologa


6. Qu condiciones afectan el proceso de unin o hibridacin entre la sonda y el
segmento blanco? Indique la incorrecta
a. Temperatura
b. Concentracin salina
c. Luz
7. Como instrumentacin bsica dispondremos al menos de uno de los siguientes:
a. Campana de flujo laminar
b. Micrtomo
c. Batidor
8. Las tcnicas de amplificacin son delicadas, pues amplifican tambin el nmero de
errores del proceso, los falsos positivos pueden provenir de tres fuentes, indique la
incorrecta:
a. Otras muestras
b. Muestras inocuas sin secuencias blanco
c. Acumulos de amplicones
9. Una de las aplicaciones ms frecuentemente empleadas de la PCR en neoplasias es
detectar
a. Translocaciones
b. Sondas
c. Membranas
10. Las aplicaciones actuales de la biologa molecular para el diagnstico clnico son
muy variadas seale la incorrecta:
a. Diagnstico y clasificacin de neoplasias y establecimiento de un pronstico
b. Deteccin de amplificacin gentica/resistencia a drogas
c. Deteccin de mielina en el cortex
11. Cul de las siguientes etapas no se producen en la Hibridacin Southern Blot
SB?
a. Digestin
b. Prehibridacin
c. Macrofotografa
12. Las sondas Mono-Locus SLP utilizadas en SB son:
a. Especificas para una regin de un determinado cromosoma
b. Hibridan con secuencias minisatlites
c. Son sondas que se repiten mltiples veces

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Tcnicas de Biologa Molecular aplicadas en Anatoma Patolgica


13. Uno de los problemas ms graves al que se enfrentan las tcnicas de
amplificacin para su aplicacin en diagnstico, es la falsa positividad debido a la
contaminacin con
a. Protenas
b. Grasas
c. cidos nucleicos
14. Las siguientes caractersticas diferencian a la siguiente tcnica, Hibridacin
Sndwich HS, indique la incorrecta:
a. Precisa la extraccin de ADN
b. Utiliza una sonda con dos fragmentos separados
c. Es un mtodo ms especfico que la SB
15. Treinta ciclos completos de PCR nos pueden dar:
a. Diez millones de copias de ADN
b. Mil millones de copias de ADN
c. Un milln de copias de ADN
16. Las tcnicas HIBRIDACIN NORTHERW, HIBRIDACIN SANDWICH, DOT/SPOT
BLOT Y SOUTHERN BLOT, poseen una caracterstica compartida, indquela
a. El cido nucledo diana est en un slido
b. Utilizan todas unas membranas
c. Desinfectando con una solucin acuosa de Glutaraldehdo
17. Los Primeros cebadores permiten:
a. Aumentar el fragmento de ADN
b. Delimitar el fragmento de ADN
c. Multiplicar el fragmento de ADN
18. De las siguientes ventajas que ofrece la Polimeras Taq, una no es correcta:
a. Actan a temperaturas altas
b. No precisa aadir enzima en cada ciclo
c. No produce contaminacin alguna
19. Las tcnicas de biologa molecular in situ permiten:
a. Situar la positividad morfolgicamente
b. Situar la negatividad morfolgicamente
c. Todas son correctas
20. La hibridacin in situ permite realizar la tcnica sobre material:
a. En solucin
b. Slido
c. Todas son correctas

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21. El problema ms importante de las tcnicas de amplificacin genmica es la
contaminacin de la reaccin con ADNs extraos, en cualquiera de sus fases,
produciendo resultados
a. Falsamente positivos
b. Falsamente negativos.
c. Las dos son correctas
22. La sensibilidad de la Tcnica de Hibridacin in situ depende de los siguientes
factores menos uno:
a. Retencin de ADN
b. Tipos de sondas
c. Malformaciones
23. La electroforesis se desarrolla durante 7 horas, y se puede realizar una lectura de:
a. Unos 700pb aproximadamente
b. 650pb
c. 550pb aproximado
24. Debe aceptarse que no existen pacientes de riesgo sino maniobras o
procedimientos de riesgo. Cul de estas precauciones se denominan universales:
a. Vacunacin (inmunizacin activa).
b. Normas de higiene personal
c. Todas son correctas
25. Deber vacunarse todo el personal que desarrolle su labor en ambientes que
tengan contacto, tanto directo como indirecto, con la sangre u otros fluidos
biolgicos de otras personas infectadas
a. Si es necesario
b. No es necesario
c. En ningn caso
26. Que productos qumicos son empleados habitualmente como desinfectantes:
a. Iodforos
b. Etanol
c. Todas son correctas
27. A continuacin se resumen un conjunto de normas de higiene personal a seguir
por los trabajadores, indique la incorrecta:
a. Cubrir heridas y lesiones de las manos con apsito impermeable, al iniciar la
actividad laboral.
b. No comer, beber ni fumar en el rea de trabajo.
c. El lavado de manos debe realizarse con leja.

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28. Para llevar a cabo una desinfeccin del tipo que sea, es necesario tener en
cuenta:
a. La actividad desinfectante del producto
b. La concentracin que ha de tener para su aplicacin
c. Todas son correctas
29. Al adquirir productos qumicos, debe exigirse siempre la:
a. La ficha de seguridad
b. La fecha de caducidad
c. La formula de preparacin
30. Las tcnicas de laboratorio son los procedimientos de trabajo recomendados.
Hay que tener en cuenta que un procedimiento ordenado de trabajo es
indispensable para la seguridad, indique el proceso incorrecto:
a. Nunca se pipetear con la boca
b. Deben utilizarse guantes adecuados solo si manipulamos sangre.
c. En la zona del laboratorio no se permitir comer, guardar alimentos, beber, fumar
ni usar cosmticos.

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