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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA

CARRERA DE ALIMENTOS

AISLAMIENTO, SELECCIÓN, IDENTIFICACIÓN, Y CONSERVACIÓN DE


LOS MEJORES MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITRÓGENO,
SOLUBILIZADORES DE FÓSFORO Y ANTAGONISTAS (contra hongos
fitopatógenos), AISLADOS DE SUELOS, RAÍCES Y DE UN
BIOINOCULANTE APLICADO EN LOS CULTIVOS DE UNA FLORÍCOLA.

Plan de Tesis para optar por el Título Profesional de Químico en Alimentos

Autor: Del Hierro Valencia Pablo Israel


Tutor: Dra. Bravo Blanca Estela
Quito, Mayo del 2010
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA

CARRERA DE ALIMENTOS

ACEPTACIÓN DEL TUTOR

Por la presente, dejo constancia que he participado en la elaboración del Plan


de Tesis presentado por el Señor Pablo Israel Del Hierro Valencia para optar
por el título profesional Químico de Alimentos cuyo tema es AISLAMIENTO,
SELECCIÓN, IDENTIFICACIÓN, Y CONSERVACIÓN DE LOS MEJORES
MICROORGANISMOS FIJADORES DE NITRÓGENO, SOLUBILIZADORES
DE FÓSFORO Y ANTAGONISTAS (contra hongos fitopatógenos),
AISLADOS DE SUELOS, RAÍCES Y DE UN BIOINOCULANTE APLICADO
EN LOS CULTIVOS DE UNA FLORÍCOLA ; y en tal virtud, acepto asesorar al
estudiante, en calidad de tutor, durante la etapa del desarrollo de la
investigación hasta su presentación y sustentación.

En la ciudad de Quito, a los días del mes de Mayo de 2010

Dra. Blanca Esthela Bravo


·#Cedula:
INDICE DE CONTENIDOS

...........................................................................................................................................1

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR............................................................1

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS.....................................................................1

ESCUELA DE BIOQUÍMICA.......................................................................................1

CARRERA DE ALIMENTOS........................................................................................1

Plan de Tesis para optar por el Título Profesional de Químico en Alimentos...................1

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS.....................................................................2

ESCUELA DE BIOQUÍMICA.......................................................................................2

CARRERA DE ALIMENTOS........................................................................................2

CAPITULO I ...................................................................................................................6

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA................................................................................6


1.2 FORMULACION DEL PROBLEMA....................................................................................7
1.3 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION...............................................................................7
1.3.1 Objetivo General:...........................................................................................................7
1.3.2 Objetivos Específicos:..................................................................................................7
1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION...........................................8

CAPITULO II................................................................................................................11

2.1ANTECEDENTES..............................................................................................................11

................................................................................................................................................14
2.2 DEFINICIONES CONCEPTUALES .................................................................................14
2.2.1 Inoculantes biológicos................................................................................................14
2.2.1.1 Bioinoculantes..........................................................................................................14
2.2.1.2 Bioinoculante EMAS.................................................................................................15
2.2.1.3 Microorganismos autóctonos..................................................................................16
2.2.2 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno.................................................................16
2.2.2.1 Generalidades...........................................................................................................16
2.2.2.2 Aislamiento ...............................................................................................................17
2.2.2.3 Selección...................................................................................................................18
2.2.2.4 Antagonismo.............................................................................................................19
2.2.2.5 Identificación.............................................................................................................19
2.2.2.6 Preservación.............................................................................................................20
2.2.2.7 Microorganismos Relacionados..............................................................................20
................................................................................................................................................21
2.2.3 Microorganismos Solubilizadores de Fósforo..........................................................21
2.2.3.1 Generalidades...........................................................................................................21
2.2.3.2 Aislamiento de Microorganismos............................................................................23
2.2.3.3 Selección de Microorganismos ..............................................................................24
2.2.3.4 Antagonismo.............................................................................................................25
2.2.3.5 Identificación.............................................................................................................25
2.2.3.6 Preservación.............................................................................................................26
2.2.3.7 Microorganismos Relacionados..............................................................................26
2.2.4 Microorganismos Antagonistas..................................................................................27
2.2.4.1 Introducción..............................................................................................................27
Mecanismos de acción.........................................................................................................28
Competencia.........................................................................................................................28
2.2.4.2 Aislamiento de Microorganismos............................................................................30
2.2.4.3 Selección de Microorganismos ..............................................................................30
2.2.4.4 Antagonismo.............................................................................................................31
2.2.4.5 Identificación............................................................................................................31
2.2.4.6 Preservación.............................................................................................................32
2.2.4.7 Microorganismos Implicados.................................................................................32

CAPITULO III..............................................................................................................33

3.1 TIPO DE INVESTIGACION..............................................................................................33


3.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN...................................................................................33
3.3 FACTOR EN ESTUDIO....................................................................................................35
3.4 VARIABLES.....................................................................................................................35
3.4.1 Variables Independientes............................................................................................35
3.4.2 VARIABLE DEPENDIENTE..........................................................................................35
3.5 TECNICAS E INSTRUMENTOS ANALITICOS................................................................36
3.5.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS......................................................................36
3.5.1.1 UBICACIÓN................................................................................................................36
3.5.1.2 MUESTREO ...............................................................................................................36
3.5.1.2.1 Tipo de Muestreo...................................................................................................36
3.5.1.2.2 Programa de Muestreo..........................................................................................36
3.5.1.2.3 Toma de Muestras..................................................................................................37
3.5.1.2.3.1 Toma de Muestra en la Captura.........................................................................37
3.5.1.2.3.2 Toma de Muestra en la Solución Madre y Solución de Propagación ............37
3.5.1.2.3.3 Toma de Muestras de Raíces.............................................................................38
3.5.1.2.3.4 Toma de Muestra de Suelos...............................................................................38
3.5.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS....................................................................38
3.5.2.1 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno..............................................................38
3.5.2.1.1 Aislamiento.............................................................................................................38
3.5.2.1.2 Selección................................................................................................................39
3.5.2.1.3 Antagonismo..........................................................................................................39
3.5.2.1.4 Identificación.........................................................................................................39
3.5.2.1.5 Preservación..........................................................................................................40
3.5.2.2 Microorganismos Solubilizadores de Fosforo.......................................................40
3.5.2.2.1 Aislamiento.............................................................................................................40
3.5.2.2.2 Selección................................................................................................................41
3.5.2.2.3 Antagonismo..........................................................................................................41
3.5.2.2.4 Identificación.........................................................................................................41
3.5.2.2.5 Preservación.........................................................................................................42
3.5.2.3 Microorganismos Antagonistas...............................................................................42
3.5.2.3.1 Aislamiento.............................................................................................................42
3.5.2.3.2 Selección ...............................................................................................................43
3.5.2.3.3 Antagonismo..........................................................................................................43
3.5.2.3.4 Identificación.........................................................................................................44
3.5.2.3.5 Preservación..........................................................................................................44

CAPITULO IV...............................................................................................................45

4.1 Recursos..........................................................................................................................45
4.2 Presupuesto....................................................................................................................48
4.3 Cronograma.....................................................................................................................48

5. BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................49

6. ANEXOS.....................................................................................................................54

CAPITULO I
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La Empresa Florícola ha venido utilizando y aplicando a sus cultivos por más


de un año un Bioinoculante basado en el uso de microorganismos autóctonos
tomados del suelo rizosférico de su propia hacienda, que gracias al uso de un
medio de cultivo ha permitido su multiplicación y elaboración; el cual es
utilizado en sus cultivos de flores en fase de enraizamiento así como de
producción de camas.18

Por sondeo a los responsables de dicho proceso se conoce que la producción


del bioinoculante se ha venido dando con el afán de disminuir en un 30% de
uso de fertilizantes y plaguicidas y de ayudar de una manera biológica al suelo,
teniendo un costo anual aproximado de 4000 dólares, aplicando un litro por
semana a cada cama logrando aparentemente plantas más vigorosas y no
causando inconvenientes a los cultivos. 19

Los métodos, técnicas y procedimientos que se realizan para la obtención de


los microorganismos son de forma artesanal, los cuales no permiten evaluar los
rendimientos por carecer de caracterizaciones cualitativas y cuantitativas de la
flora autóctona responsable del fitomejoramiento de los cultivos.

En este contexto no se obtiene los datos reales de rendimientos y demás


características de la flora responsable relacionada aparentemente con la
nutrición y control vegetal, mientras que si se utiliza cepas previamente
caracterizadas con funciones específicas como fijadores de nitrógeno,
solubilizadores de fósforo y antagonistas para control de hongos fitopatógenos,
que favorecen su aplicación como inoculantes y que propician un efecto
positivo en los cultivos agrícolas como promotores de crecimiento.

1.2 FORMULACION DEL PROBLEMA

18 Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha, 2008

19 Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha, 2009


¿Caracterizar la flora autóctona del bioinoculante en su elaboración y
propagación mediante la aplicación de técnicas microbiológicas de aislamiento,
selección, identificación y conservación de microorganismos fijadores libres de
nitrógeno, solubilizadores de fósforo inorgánico y antagonistas (contra hongos
fitopatógenos) para la elaboración posterior de inoculantes biológicos?

1.3 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION

1.3.1 Objetivo General:

 Aislar, seleccionar, identificar, y conservar los mejores microorganismos


fijadores de nitrógeno, solubilizadores de fósforo y antagonistas (contra
hongos fitopatógenos), aislados del suelo, raíces y del bioinoculante
que serán utilizados en trabajos posteriores en la elaboración de
inoculantes.

1.3.2 Objetivos Específicos:

 Elaborar el Bioinoculante.
 Realizar un muestreo del Bioinoculante en la fase de captura, solución
madre y solución de propagación.
 Realizar un muestreo de suelos y raíces de los bloques 8 y 9 donde se
aplica el bioinoculante.
 Aislar microorganismos fijadores de nitrógeno, solubilizadores de
fósforo, y antagonistas.
 Seleccionar los mejores microorganismos fijadores de nitrógeno,
solubilizadores de fosforo y antagonistas.
 Evaluar el antagonismo entre las cepas seleccionadas de cada grupo
 Caracterizar las cepas evaluadas por género
 Conservar los mejores microorganismos fijadores de nitrógeno,
solubilizadores de fósforo y antagonistas.

1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION

En el uso y manejo de bioinoculantes, uno de los principales problemas es el


desconocimiento de las especies presentes en los agroecosistemas, para su
posible utilización eficiente. Desde el punto de vista ecológico, es importante
conocer los integrantes de la comunidad bacteriana que favorecen su
aplicación como inoculantes y propician un efecto positivo en los cultivos
agrícolas. 43

Por lo cual el aislamiento de microorganismos con potencial para ser


promotores de crecimiento vegetal, aquellos capaces de establecerse en el
suelo, aportando nutrientes esenciales como el fósforo y nitrógeno,
transformando sus formas no asimilables en asimilables para las plantas y que
generan a la par un control biológico, que en la última década, se ha convertido
es una estrategia importante para el desarrollo de bioinsumos.9

El estudio de estos microorganismos es útil para posteriores ensayos y para


establecer un cepario con microorganismos promisorios, aislados de suelos,
con el fin de generar alternativas viables en la producción de biofertilizantes
útiles en la actividad agrícola y explorar la biodiversidad microbiana.9

Por esto el desarrollo de biotecnologías alternativas como los biofertilizantes,


requieren de estrategias y procesos de investigación e innovación a corto y
mediano plazo, los cuales incluyen aislamientos de cepas, evaluación,
43 http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=2351591

9 CASTELLANOS, Diana. CUBILLOS, Ricardo , Selección de Microorganismos Promotores de Crecimiento Vegetal (Ácido
Indol Acético) a partir de Muestras de Suelo Rizosférico, como Primera Etapa en el Desarrollo de un Biofertilizante, Pontificia
Universidad Javeriana
selección, multiplicación y producción.25

Así el aprovechamiento de los microorganismos presentes en la naturaleza,


permiten sustituir los productos químicos. Se estima que el uso de los
biofertilizantes contribuya a sustituir en un 70% el uso de fertilizantes fosfóricos
y entre un 30%-50% de nitrogenados; mejorando así los cultivos.22
Efectos relacionados con el uso de biofertilizantes han aportado sustanciales
datos para su estudio y aplicación en campo, en cultivos de gran importancia
agrícola en los cuales se ha demostrado rendimientos favorables por su
aplicación21:

Maíz: Mejora de rendimiento de 20,1 %. (Kg/Ha)

Sorgo: Mejora de rendimiento de 58,7 % (Kg/Ha)

25 López Marisol, Efecto de biofertilizantes bacterianos sobre el crecimiento de un cultivar de maíz en dos suelos contrastantes, Centro Nacional de
Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), Maracay, estado Aragua. Venezuela.

22 Introducción, Rentabilidad De Las Empresas Productoras De Bioinsumos Registradas Ante El ICA

21 GREEN QUALITY | F.A.Q, mejoras en rendimientos a campo respecto de un control sin Biofertilizar , Gráficos de rendimiento
Trigo: Mejora en rendimiento de 12,3 % en Trigo. (Kg/Ha)

Girasol: Mejora en rendimiento de 19,7 %.


Soja: Mejora en rendimiento de 11,7 %.

CAPITULO II

2.1 ANTECEDENTES

De acuerdo con diferentes estudios realizados y sus resultados, junto con la


toma de conciencia sobre los efectos adversos de los pesticidas químicos
propiciaron el surgimiento a escala mundial de la investigación sobre el uso
de inoculantes bacterianos para controlar patógenos y mejorar el crecimiento
vegetal.

La revista Colombiana de Biotecnología, vol. VII N: 2, Diciembre 2005, publica


el tema, “Microorganismos Benéficos como biofertilizantes eficientes para
el cultivo del Tomate (Lycopersicon esculentum, Mill), esta investigación se
desarrollo con el objetivo de evaluar la efectividad agrobiológica de
Azospirillum sp, en el crecimiento, desarrollo, y rendimiento en el cultivo de
tomate. Para ello, se partió de seleccionar el género microbiano predominante
en la rizósfera del cultivo y posteriormente se evaluó el efecto de su
inoculación a partir de la respuesta del cultivo. Los resultados demostraron que
Azospirillum sp era el género dominante. Y que inoculación artificial causo un
efecto positivo sobre el crecimiento de las plántulas, con un rendimiento
superior al 11%.16

La revista Chilena del Bosque, 2006, publica el tema, “Selección de hongos


antagonistas para el control biológico de Botrytis cinerea en viveros
forestales en Chile”, El objetivo de este estudio fue seleccionar hongos
antagonistas de B. cinerea, mediante ensayos in vitro y de invernadero, y
determinar su capacidad como agentes biocontroladores de este hongo en
viveros forestales. Donde se evaluó su capacidad para reducir la colonización
y esporulación del patógeno en ensayos in vitro, mediante bioensayos. Estos
resultados permitieron concluir el potencial de los antagonistas seleccionados
en el control de B. cinerea7.

16 Elein Terry Alfonso, Microorganismos Benéficos como biofertilizantes eficientes para el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum, Mill), Revista
Colombiana de Biotecnología, volumen VII N: 2, Diciembre 2005, pág. 47-54

7 BORRERO, C. A, Efectos de Trichoderma (in vitro) en los microorganismos no patógenos descomponedores de la materia orgánica de un suelo oxisol
clase IV del piedemonte llanero, Ingeniería Agronómica de la Unillanos, VOLUMEN 9 Nº 2 ,2005
En Colombia se han realizado investigaciones en la Universidad Javeriana y la
Nacional de Colombia, Castellanos, D: con el tema “Selección de
Microorganismos Promotores de Crecimiento Vegetal (Ácido Indol
Acético) a partir de Muestras de Suelo Rizosférico, como Primera Etapa
en el Desarrollo de un Biofertilizante”, En este estudio se evaluaron 34
cepas de bacterias no filamentosas y 6 de actinomicetos, a partir de muestras
de suelo rizosférico de diferentes plantas, con el fin de evaluar su capacidad
productora in-vitro de AIA (Ácido Indol Acético) y así establecer un cepario de
posibles Microorganismos Promotores de Crecimiento Vegetal.13

En Cuba se han realizado investigaciones en la Universidad de Camagüey


Instituto de Suelos, Ing. Marilú González Parra con el tema “Efecto de un
inoculante microbiano a partir de cepas nativas de Azotobacter
chroococcum sobre el rendimiento en secuencias de cultivos hortícolas”,
se condujeron experimentos con el propósito de conocer el efecto de diferentes
cepas nativas de Azotobacter chroococcum para lo cual se llevó a cabo la
prospección de las mismas en cuatro zonas edafoclimáticas de la provincia de
Camagüey. Se realizó la selección por el método de screening en condiciones
controladas; las cuatro cepas seleccionadas se evaluaron y compararon con el
testigo de referencia (cepa INIFAT-12) y un testigo absoluto (plantas sin
inocular). Los resultados evidencian en general una estimulación en los
parámetros evaluados (rendimiento, altura de la planta, porcentajes de materia
seca, vitamina C, sólidos solubles totales, N, P y K en el fruto y el follaje) así
como los contenidos de fósforo, potasio y materia orgánica en el sustrato. Se
destaca por sus efectos positivos, estimuladora del desarrollo y rendimiento de
los cultivos evaluados incremento en los rendimientos de 53 % respecto a la
cepa de referencia INIFAT-1234 .

13 Chirinos Jenny, Leal Ángel y Montilla Joan, Uso de Insumos Biológicos como Alternativa para la Agricultura Sostenible en la Zona Sur del Estado
Anzoátegui, El Tigre estado Anzoátegui .Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Revista Digital CENIAP HOY Nº 11 ,2006

34 STEFANOVA N., M. 1998. Métodos de aplicación y efectividad de Trichoderma sp. Como antagonista de hongos fitopatógenos. Curso internacional
de control biológico BIOSAV- 4. Instituto de investigaciones de Sanidad Vegetal. La habana-Cuba.
En Venezuela se han realizado investigaciones por el Centro Nacional de
Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), López, M, con el tema “Efecto de
Biofertilizantes Bacterianos sobre el Crecimiento de un Cultivar de Maíz
en dos Suelos Contrastantes Venezolanos”, se evaluó el efecto de cepas
nativas fijadoras de N2 (FN) de forma asociativa y solubilizadoras de fósforo
(SF) sobre el crecimiento de maíz. Hubo efecto EPR (rizobacterias promotoras
de la emergencia) con la cepa FN en el suelo A, lográndose 30% más de
germinación y 24% más de plantas con primera hoja verdadera a los 6 días. En
el suelo B el efecto fue más tardío. La evaluación de altura de la planta,
diámetro del tallo, largo y ancho de la hoja y biomasa de raíces y partes aéreas
puso de manifiesto la efectividad de la inoculación con bacterias FN en ambos
suelos y la de SF en el suelo de baja fertilidad (B).26

Es por esto que países como Cuba, Colombia, Chile, Venezuela entre otros;
demostraron que con la utilización de microorganismos eran capaces de
mejorar la disponibilidad de nutrientes y generar alternativas amigables con el
ambiente y aumentar el rendimiento agrícola.

2.2 DEFINICIONES CONCEPTUALES

2.2.1 Inoculantes biológicos

2.2.1.1 Bioinoculantes

El uso de bioinoculantes biológicos en los sistemas productivos, es una


alternativa viable e importante para lograr un desarrollo agrícola
ecológicamente sostenible, ya que permite una producción a bajo costo, no

26 López M, Evaluación de un Medio de Cultivo no comercial para la producción de un bioinoculante empleado en un cultivo de flores, Carrera de
Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006
contamina el ambiente, y mantiene al suelo desde el punto de vista de fertilidad
y biodiversidad (ICA, 2004).
Dentro de los beneficios que presenta el uso de microorganismos en la
agricultura están su capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, la
descomposición de residuos orgánicos, la detoxificación de plaguicidas, el
control de las enfermedades de las plantas, el aporte de nutrientes al suelo, y la
producción de compuestos bioactivos como vitaminas y hormonas que
estimulan el crecimiento de la plantas (Loredo et al., 2004); del mismo modo es
importante incentivar estudios para la búsqueda de nuevas fuentes de
bioinoculantes y por supuesto nuevas aplicaciones.
En la actualidad el uso de bioinoculantes, aplicados como inoculantes dentro
de los sistemas de producción agrícola, está teniendo un gran auge,
especialmente para lograr una mayor disponibilidad de nutrientes que permitan
un rendimiento sostenible de los cultivos, con la conservación del medio
ambiente y una mayor producción.29

2.2.1.2 Bioinoculante EMAS

El bioinóculo EMAS es un insumo líquido implementado en floricultura y


actualmente es producido por la Florícola Hacienda Santa Fe. La composición
general del medio consta de melaza, harina de pescado, leche, sal y agua, los
cuales son fermentados en tanques de 200 litros, donde se obtiene un
compuesto, cuya función principal se basa en el aporte de microorganismos
benéficos para las rosas tanto en fase de enraizamiento como de producción
en camas. Su uso se combina con la aplicación de compost, bioles y aditivos
químicos (Hacienda Santa Fe, 2008).

La producción se hace en tres etapas: 1) Captura de microorganismos, 2)


Solución Madre, 3) Solución de Propagación; este proceso dura 58 días. Este
29 Mantilla Cardenas Miguel Eduardo, Evaluación de la Acción de un Bioinoculante sobre un Cultivo de Crisantemo en Periodo de Enraizamiento,
Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007
bioinoculante poco tecnificado ha sido empleado especialmente para promover
y mantener el crecimiento y la calidad de las flores que cultivan proporcionando
una fuente de nutrientes solubles obtenida a través de la acción metabólica
ejercida por los microorganismos allí presentes.18

2.2.1.3 Microorganismos autóctonos


El término “microorganismos autóctonos” ha sido atribuido por productores
agrícolas a la combinación de microorganismos presentes en un área de cultivo
determinada, los cuales han sido “capturados” mediante procesos artesanales
sencillos y potenciados posteriormente con soluciones de azúcares y proteínas.

El microorganismo autóctono es efectivo, puesto que al pertenecer al mismo


suelo donde se realiza el cultivo, no necesita ser reactivado con anticipación, y
su adaptación al ecosistema del suelo es completa.4

2.2.2 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno

2.2.2.1 Generalidades

El nitrógeno molecular N2 que existe en la atmósfera no es fácilmente


asimilable por las plantas debido a que el triple enlace que une a los átomos
que forman la molécula es difícil de romper, la única forma de aprovechar el
nitrógeno atmosférico es mediante el proceso metabólico conocido como la
Fijación Biológica de Nitrógeno FBN, lo cual asegura la disponibilidad de
nitrógeno en los ecosistemas naturales (Zuberer, 1998).
18 Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha, 2008

4 Arias Vega Carlos Aurelio , Estudio de 2 Grupos de Microorganismos como Agentes Aceleradores de Descomposición de los Desechos
Sólidos Orgánicos Originados en los Comedores de ESPOL, Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción, ESPOL,
Guayaquil. 2007
El proceso es llevado a cabo ciertos microorganismos del suelo que se
conocen como microorganismos fijadores de nitrógeno, todos los
microorganismos que convierten el nitrógeno en amoniaco lo hacen gracias a la
actividad del complejo enzimático llamado nitrogenasa que está constituido por
dos metaloprotreinas, la proteína (I) llamada: hierro-molibdato-proteína, y la
proteína (II): llamada hierro- proteína( Baca et ál, 2000), la enzima requiere la
colaboración de otras dos proteínas ferrodoxina y flavodoxina, que actúan
como donadores de electrones y reductores naturales de la nitrogenasa. Los
electrones son trasportados a la nitrogenasa por la ferrodoxina y llegan a la
hierro-proteína, esta activa a la Mo-Fe- proteína y se produce la reducción del
nitrógeno, y luego siendo fijado como compuesto aminado (Hernández, 1998).24

2.2.2.2 Aislamiento

24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), Revista
Colombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-14

6 bnLec33, pdf
Técnica del cultivo de enriquecimiento selectivo:

El aislamiento de microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico, implica


confeccionar un medio de cultivo minimal , al cual se le quita la fuente de
nitrógeno para que los microorganismos utilicen como única fuente el nitrógeno
atmosférico , sacarosa como fuente de carbono, cloruro de calcio para regular
la presión osmótica, sulfato de magnesio, cloruro férrico, y molibdato de sodio
como cofactores enzimáticos, y que sus condiciones de incubación como
atmosféricas, de temperatura, de pH, les otorgue ventajas frente al resto de
microorganismos.

Para la obtención de cultivos puros, se hacen varias transferencias en el medio


diseñado, seguidas por siembras por agotamiento en placas de agar 8, las
cepas responsables capaces de utilizar al nitrógeno atmosférico como fuente
de nitrógeno para su crecimiento se distinguen por crecimiento de colonias
traslúcidas y mucilaginosas.23

2.2.2.3 Selección

La selección de microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico, se realiza


a partir de cultivos puros.

• Determinación Indirecta de la Fijación de Nitrógeno

Para evaluar la capacidad fijadora de nitrógeno de las poblaciones aisladas, se


utiliza el método indirecto de valoración del ión amonio empleando la técnica
colorimétrica de Berthelot (fenol-hipoclorito) (Weatherburn, 1967; Martínez,

8 Brook D.T, y T.M Madigan, Microbiología, 6ta edición, México, Printice Hall Hispanoamérica S.A , 1993

23 Jiménez Avella Diego Javier, Caracterización Molecular de Cepas Nativas Colombianas de Azotobacter spp Mediante el Análisis de
Restricción del ADN Ribosomal 16S, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007
2003).24

El cual se basa en la formación de un compuesto azul intenso de indofenol, y


que resulta de la reacción de ión amonio (NH4+), con compuestos fenólicos en
presencia de un agente oxidante el cual puede ser hipoclorito de sodio
(Scheiner, 1976; Van Staden y Taljaard, 1997) u o-fenilfenol (Kanda, 1995); y
también se utilizan catalizadores, principalmente nitroprusiato de sodio (Kanda,
1995; Standard Methods, 1998), o ferrocianato de potasio (Verdouw et ál ,
1977). El cual es cuantificado a 633 nm en un espectrofotómetro UV-Vis.24

2.2.2.4 Antagonismo

Con el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladas


fueron sometidas a prueba, que se realizaron en el medio diseñado, mediante
la técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze, 1967). El criterio de
la eliminación de las cepas se determino por la presencia de halos de inhibición
de crecimiento con halos mayores a 5 mm entre la cepa sembrada
masivamente y la cepa enfrentada.5

2.2.2.5 Identificación

Se basa principalmente en el estudio de las características morfológicas,


fisiológicas, bioquímicas, patogénicas e inmunológicas del microorganismo, es
decir aquellos aspectos que constituyen el fenotipo bacteriano y que toma en
cuenta los siguientes aspectos:
 Tipo de reacción a tinción Gram y otras coloraciones empleadas para la
observación microscópica.

24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), Revista
Colombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-14

5 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir de
Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008
 Tipo de metabolismo.
 Forma y características del crecimiento en el medio de cultivo.
 Determinación del perfil bioquímico mediante pruebas de diagnostico.

2.2.2.6 Preservación

Los objetivos de la conservación de los cultivos son los siguientes:


 Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus
propiedades bioquímicas.
 Preservar los niveles de su productividad inicial
 Lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad.
Los métodos de preservación de cepas se basan en los cambios observables
como pigmentación, morfología, reacciones fermentativas, propiedades
microscópicas; brindan la información necesaria para la correcta evaluación de
la técnica de conservación a elegir.
Los métodos más importantes son los siguientes:
 Subcultivos
 Mantenimiento bajo una capa de aceite
 Mantenimiento en agua destilada estéril.
 Criopreservación
 Cultivos en tierra
 Preservación en celulosa

2.2.2.7 Microorganismos Relacionados


2.2.3 Microorganismos Solubilizadores de Fósforo

2.2.3.1 Generalidades

El fósforo es, después del nitrógeno, el elemento nutricional mineral más


importante para el crecimiento de plantas y microorganismos, incluso puede ser
limitante en muchos ecosistemas forestales (Attiwill y Adams, 1993). Forma
parte de los ácidos nucleicos, y constituye una parte esencial de la molécula de
ATP, además se encuentra en los fosfolípidos, componentes esenciales de las
membranas biológicas (Atlas y Bartha, 1987). La mayoría del fósforo total del
suelo se encuentra en la materia orgánica (Speir y Ross, 1978) en forma de
nucleótidos, fosfolípidos o inositol fosfato (Anderson, 1975).
No obstante, las plantas sólo pueden usar la forma inorgánica en forma de ión
ortofosfato (PO3-4) (Rao et al., 1996). Dichos iones son liberados a la solución
del suelo como consecuencia de la mineralización del fósforo orgánico, proceso
catalizado por las enzimas fosfatasas. La presencia en el suelo de otros iones
como Ca, Fe, Al y Mg junto con el pH del suelo va a condicionar la solubilidad
del ión ortofosfato (Beever y Burns, 1980).

Los compuestos inorgánicos de fósforo del suelo pueden agruparse en: 1)


fosfatos de calcio, 2) fosfatos de hierro y 3) fosfatos de aluminio. Los fosfatos
monocálcico y bicálcico son solubles (aunque el bicálcico es parcialmente
insoluble), siendo asimilables por las plantas pero se combinan con otros
compuestos haciéndose insolubles. El fosfato tricálcico es insoluble por lo que
no está disponible para las plantas. Por tanto, la mayoría del fósforo del suelo,
debido a su insolubilidad, no es asimilable por las plantas. Solamente es
absorbido un 0.1% del total (Scheffer y Schachtschabel, 1992).
Los microorganismos capaces de mineralizar el fósforo inorgánico son
considerados microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPR).
Estos microorganismos convierten los compuestos minerales insolubles en
solubles que pueden ser absorbidos (solubilización de fósforo); mineralizan el
fósforo orgánico en fósforo mineral asimilable; transforman el fósforo mineral
inasimilable en fósforo orgánico (mineralización), transforman el fósforo mineral
en fósforo orgánico, cuando toman el fósforo para constituir sus propios
cuerpos (inmovilización). Este fósforo volverá a mineralizarse cuando estos
microorganismos mueran (Fuentes Yagüe, 1989).
Los principales mecanismos de solubilización de fosfato en el suelo llevados a
cabo por estos microorganismos son:

1. Producción de ácidos orgánicos:


El metabolismo microbiano, la descomposición de la materia orgánica y
los exudados radicales van a producir una serie de ácidos orgánicos de
bajo peso molecular, tales como oxálico, fórmico, cítrico o acético, que
son considerados como la causa más importante de la solubilización de
fosfatos (Hayman, 1975).
Los ácidos orgánicos aumentan la solubilización de compuestos
fosforados y disminuyen la adsorción de fósforo, incrementando de esta
manera la disponibilidad de fósforo en el suelo (Bolan et al., 1990).
La solubilización de compuestos fosforados inorgánicos se produce a
través de la formación de complejos entre ácidos orgánicos y aniones e
iones metálicos como Fe, Al y Ca (Bolan et al., 1990). Se han indicado
tres posibles mecanismos del efecto de los ácidos orgánicos en la
adsorción de fósforo: 1) Competición por los sitios de adsorción de
fósforo; 2) disolución de absorbentes; y 3) cambios en la carga
superficial en los adsorbentes (Traina et al., 1986).

2. Producción de ácidos inorgánicos:


Durante la oxidación de compuestos inorgánicos de nitrógeno y azufre
se producen ácidos nítrico y sulfúrico que reaccionan con los fosfatos
insolubles causando su solubilización.

3. Mineralización del fósforo orgánico:


Aunque algunas plantas son capaces de asimilar directamente ciertos
compuestos orgánicos de fósforo, la mayoría lo toma en su forma
inorgánica (Somani et al., 1990). El fósforo orgánico del suelo está
formado por ácidos nucleicos y derivados, fosfolípidos, y varios inositol
fosfatos clasificados como fitinas y sustancias relacionadas, siendo estas
fitinas sintetizadas por la microbiota y las plantas, las formas de fósforo
orgánico del suelo (Paul y Clark, 1989)5

2.2.3.2 Aislamiento de Microorganismos


5 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir de
Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008
Técnica del cultivo de enriquecimiento selectivo:

El aislamiento de microorganismos solubilizadores de fosfatos insolubles,


implica confeccionar un medio de cultivo minimal que contenga fosfato
tricálcico como fuente inorgánica de fósforo, glucosa fuente de carbohidratos,
extracto de levadura y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno, cloruro de
sodio y potasio para regular la presión osmótica, sulfato de magnesio y de
hierro como cofactores enzimáticos, y que sus condiciones de incubación
como atmosféricas, de temperatura, de pH, le otorgue ventajas frente al resto
de microorganismos.

Para la obtención de cultivos puros, se hacen varias transferencias en el medio


diseñado, seguidas por siembras por agotamiento en placas de agar. Las
cepas responsables de la solubilización se detectan por una zona clara
alrededor de la colonia.5
2.2.3.3 Selección de Microorganismos

La selección es un proceso en el que aquellos individuos que son los más


dotados para sobrevivir en su entorno generan el mayor número de
descendientes, llevando a cabo sus reacciones bioquímicas y manteniendo su
herencia genética dentro de la colonia.
La selección de microorganismos solubilizadores de fosfatos insolubles a partir
del suelo, se realiza a partir de cultivos puros.

• Pruebas de Solubilización de fósforo

Determinación de fósforo soluble

Este elemento ha sido estudiado, tanto por la importancia que tiene en la


nutrición vegetal como por las limitaciones en su determinación.

Existen varios métodos para su determinación y por lo general son métodos


colorimétricos.

El Método Mo – Blue o método del Molibdato, es utilizado para determinación


de fósforo en solución acuosa, se basa en la formación del ácido
fosfoantimolibdeno azul en la presencia de ácido ascórbico (Murphy y Riley,
1962); en solución sulfúrica los iones ortofosfato reaccionan con los iones
molibdato, dando ácido molibdofosfórico, el cual con ácido ascórbico, se reduce
a azul de fosfomolibdeno presentando al cabo de 5 minutos una coloración
azul, y cuantificándose espectrofotométricamente a 660nm.5

2.2.3.4 Antagonismo

Con el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladas


fueron sometidas a prueba, que se realizaron en el medio diseñado, mediante
la técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze, 1967). El criterio de
la eliminación de las cepas se determino por la presencia de halos de inhibición
de crecimiento con halos mayores a 5 mm entre la cepa sembrada
masivamente y la cepa enfrentada.5

2.2.3.5 Identificación

Se basa principalmente en el estudio de las características morfológicas,


fisiológicas, bioquímicas, patogénicas e inmunológicas del microorganismo, es

5 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir de
Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008

5 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir de
Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008
decir aquellos aspectos que constituyen el fenotipo bacteriano y que toma en
cuenta los siguientes aspectos:

 Tipo de reacción a tinción Gram y otras coloraciones empleadas para la


observación microscópica.
 Tipo de metabolismo.
 Forma y características del crecimiento en el medio de cultivo.
 Determinación del perfil bioquímica mediante pruebas de diagnostico.

2.2.3.6 Preservación
Los objetivos de la conservación de los cultivos son los siguientes:
 Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus
propiedades bioquímicas.
 Preservar los niveles de su productividad inicial
 Lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad.

Los métodos de preservación de cepas se basan en los cambios observables


como pigmentación, morfología, reacciones fermentativas, propiedades
microscópicas; brindan la información necesaria para la correcta evaluación de
la técnica de conservación a elegir.
Los métodos más importantes son los siguientes:
 Subcultivos
 Mantenimiento bajo una capa de aceite
 Mantenimiento en agua destilada estéril.
 Criopreservación
 Cultivos en tierra
 Preservación en celulosa

2.2.3.7 Microorganismos Relacionados


Bacillus Serratia
Pseudomonas Acinetobacter
Chryseomonas
Aerobacter Ralstonia
Erwinia Sphingomonas
BACTERIAS
Alcaligenes Micrococcus
Achromobacter Rhizobium
Agrobacterium Flavobacterium
Escherichia Enterobacter
Klebsiella
Aspergillus Fusarium
Penicillium Trichoderma
HONGOS Monesporium
Cephalosporium
Scopulariopsis

2.2.4 Microorganismos Antagonistas

2.2.4.1 Introducción

Existe un grupo importante de hongos y bacterias que presentan efectos


antagónicos con otros microorganismos y esta acción puede ser aprovechada
como una forma de control biológico de patógenos vegetales.
Entre los microorganismos más importantes se encuentran las bacterias de los
géneros Pseudomonas y Bacillus y hongos de los géneros Gliocladium y
Trichoderma.
En el mundo biológico existe una interacción continua entre los patógenos
potenciales y sus antagonistas, de forma tal que estos últimos contribuyen a
que en la mayoría de los casos no se desarrolle la enfermedad. En condiciones
naturales los microorganismos están en un equilibrio dinámico en la superficie
de las plantas.

Las enfermedades producidas por organismos fitopatógenos tales como


bacterias, nematodos, u hongos constituyen generalmente la mayor causa de
pérdidas en la producción agrícola (Benítez et al., 2004). Dentro de éstos, los
hongos comprenden uno de los principales grupos tanto por la diversidad como
por las pérdidas que originan a nivel económico (Benítez et al., 2000). La
persistencia de varias especies de hongos fitopatógenos tales como Phythium,
Phytophthora, Brotrytis, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solana y Fusarium
han aumentado durante los últimos años debido a los cambios que se han
presentado en las prácticas agrícolas; principalmente por el uso indiscriminado
de químicos y también por la contaminación que se origina a causa de su
empleo, con efectos perjudiciales no solo sobre los cultivos de importancia
económica sino sobre los demás organismos, a través de la adquisición de
resistencia a las estrategias desarrolladas en los últimos años para su
control(Benítez et al., 2000).
• Mecanismos de acción

Se han descrito varios mecanismos de acción de los antagonistas para


controlar el desarrollo de patógenos.
Algunos de estos son antibiosis, competencia por espacio o por nutrimentos,
interacciones directas con el patógeno (mico parasitismo y lisis enzimática) e
inducción de resistencia.
No es fácil determinar con precisión los mecanismos que intervienen en las
interacciones entre los antagonistas y los patógenos en la planta .En general,
los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de estos
es una característica importante para su selección como agentes de control
biológico.
Si el antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de
desarrollo de resistencia en el patógeno. Este riesgo de resistencia también se
reduce mediante el uso de combinaciones de antagonistas con diferente modo
de acción.

• Competencia
Esta constituye un mecanismo de acción antagónica muy importante. Puede
definirse como el comportamiento desigual de dos o más organismos ante un
mismo requerimiento, siempre y cuando la utilización del mismo por uno de los
organismos reduzca la cantidad disponible para los demás. Un factor esencial
para que exista competencia es la escasez o limitación de un elemento porque
si hay exceso no hay competencia.

 Competencia por nutrimentos:


La competencia más común es por nutrimentos, oxígeno o espacio.
Botrytis cinerea y Penicillium expansum que son dos hongos de
poscosecha típicamente dependientes de los nutrimentos, como
hongos necrotróficos sus esporas requieren de estas sustancias
para germinar y comenzar el crecimiento de las hifas antes de
penetrar al sustrato. Esos nutrimentos se encuentran en las
heridas de las frutas y es allí donde la competencia microbiana
actúa inhibiendo el desarrollo de estos patógenos.

 Competencia por espacio:

Este tipo de competencia también ha sido evaluado. Las levaduras son


eficaces colonizadoras de la superficie de plantas y se destaca la
producción de materiales extracelulares (especialmente polisacáridos) que
restringen el espacio para la colonización por otros microorganismos.

 Interacción directa con el patógeno:

Un tipo de interacción directa entre los antagonistas y los patógenos es el


parasitismo (Lecuona 1996).
El parasitismo es la acción de un microorganismo parasitando a otro y
puede ser definido como una simbiosis antagónica entre organismos. Este
consiste en la utilización del patógeno como alimento por su antagonista.
Generalmente, están implicadas enzimas extracelulares tales como
quitinasa, celulasa, b1, 3 – glucanasa y proteasa, que rompen las
estructuras de los hongos parasitados.17

2.2.4.2 Aislamiento de Microorganismos

Técnica del cultivo de aislamiento en medios generales para hongos y


bacterias:

Los métodos para aislamiento que se usan más ampliamente son métodos
clásicos. Para hongos y bacterias antagonistas se siembra en medios
generales con antibacterianos y antifúngicos respectivamente.
Se emplea PDA (Anexo 2) para hongos antagonistas y Agar nutritivo (Anexo 1)
para bacterias, incubando por 7 días a temperatura ambiente y por 48 horas a
37 oC respectivamente.12

2.2.4.3 Selección de Microorganismos

Enfrentamiento en cultivos duales entre el patógeno y el antagonista

Para determinar la capacidad antagónica sobre un patógeno, se emplea la


técnica de cultivos duales entre los patógenos y los antagonistas.
Se realizan pruebas de enfrentamiento sobre el hongo fitopatógeno. Se
procede a tomar discos de 1cm de diámetro, colonizados con el micelio tanto

17 Fernández Orietta / Larrea Vega, Microorganismos antagonistas para el control Fitosanitario, Manejo Integrado de Plagas, Costa Rica,
No. 62 p , pág. 96 - 100 , 2001

12 Chávez García Mónica Paola, Producción de Trichoderma sp y Evaluación de su Efecto en Cultivo de Crisantemo, Bogotá, PUJ,
Facultad de Ciencias ,2006
del hongo antagonista como del hongo patógeno. Los cuales son colocados en
platos Petri contentivos de (PDA) uno frente al otro de manera equidistante.
Las observaciones se realizaron cada 24 horas por siete días consecutivos a
25oC, y se evalúa el crecimiento radial (cm/día) de las colonias de ambos
hongos. Con estos datos se determinó el porcentaje de inhibición de
crecimiento (PIC).El porcentaje de inhibición se determinó utilizando la fórmula:
J. M. Vincent, empleada por Latiegue (1990).
PIC = 100 (C –T)/C
Donde:
PIC: Porcentaje de Inhibición de Crecimiento del fitopatógeno
C: Crecimiento del Control
T: Crecimiento del Tratamiento

Para las bacterias se utilizo el mismo método de enfrentamiento pero utilizando


como medio de crecimiento agar Topping.

2.2.4.4 Antagonismo

Se realizan pruebas de enfrentamiento. Se procede a tomar discos de 1cm de


diámetro, colonizados con el micelio de los hongos a enfrentar. Los cuales se
colocan en platos Petri contentivos de (PDA) uno frente al otro de manera
equidistante. Las observaciones se realizaron cada 24 horas por siete días
consecutivos a 25oC, y se evaluó el crecimiento radial (cm/día) de las colonias
de ambos hongos.

2.2.4.5 Identificación

• Observación del tiempo (velocidad) de crecimiento de la colonia, desde


que se siembra.
• Examen macroscópico de la colonia: color (tanto en el anverso como en
el reverso), radial, producción de pigmentos y exudados.
• Examen microscópico de la colonia: se lleva a cabo por técnicas de
tinción con azul de lactofenol.
• Tipo de micelio, la presencia o no de septos, esporas.30

2.2.4.6 Preservación

• Conservación por suspensión en agua destilada estéril

Es un método alternativo muy utilizado y que altos porcentajes de viabilidad en


especies de Phytophthora, Pythium, Ascomicetos, Basidiomicetos, y hongos
mitospóricos (Smith & Onions, 1994); han alcanzando viabilidades entre dos y
siete años (Jong & Birmingham, 2001).
Consiste en suspender en agua estéril células del cultivo como conidias,
esporas picnidios, esclerocidos, etc.11

2.2.4.7 Microorganismos Implicados

30 Micología, Características generales de los hongos, pdf

1 Ángel Alarcón Dilia Irney, Evaluación de Técnicas de Conservación de Hongos Filamentosos y Lavaduriformes en el Cepario de la
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006
Agrobacterium

Agrobacter

Pseudomona fluorescens

BACTERIAS Burkbolderia cepacia

Bacillus subtilis

Pseudomonas spp

Serratia spp

Gliocladium virens

HONGOS Trichoderma haziarium

Trichoderma viride

CAPITULO III

3.1 TIPO DE INVESTIGACION

El tipo de investigación para este proyecto es del tipo experimental ya que se


realizará en condiciones de laboratorio realizando análisis de tipo
microbiológico e instrumental con la aplicación de equipos y técnicas
adecuadas, y encontrando resultados acorde con la metodología de la
investigación.

3.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

Materiales de
Recolección
INICIO

TOMA DE
MUESTRA
Materiales de
Recolección

Muestras

Medios de Cultivo,
materiales y reactivos DILUCION DE
MUESTRA

Diluciones Tº, tiempo

Medios de Cultivo,
materiales y reactivos AISLAMIENTO
PRIMARIO

Cepas útiles Tº, tiempo


Cepas no útiles

Medios de Cultivo,
materiales y reactivos AISLAMIENTO Cepas no útiles
SECUNDARIO

Cepas Útiles Tº, tiempo

Medios de Cultivo,
materiales y reactivos Cepas con baja
SELECCIÓN actividad

Cepas Seleccionadas

Medios de Cultivo,
materiales y reactivos
EVALUACIÓN DEL
ANTAGONISMO
Cepas Evaluadas Tº, tiempo

Medios de Cultivo,
materiales y reactivos IDENTIFICACIÓN

Cepas Identificadas

Medios de Cultivo,
materiales y reactivos CONSERVACIÓN

3.3 FACTOR EN ESTUDIO

El Factor de estudio es el aislamiento, selección, identificación, y conservación


de las mejores cepas de los grupos microbianos fijadores de nitrógeno,
solubilizadores de Fósforo y antagonistas (contra hongos fitopatógenos).

3.4 VARIABLES

3.4.1 Variables Independientes


• Métodos de Aislamiento, Selección, y Antagonismo de microorganismos
fijadores de nitrógeno, solubilizadores de fosforo y antagonistas (contra
hongos fitopatógenos).

3.4.2 VARIABLE DEPENDIENTE


• Las mejores cepas Fijadoras de Nitrógeno.
• Las mejores cepas solubilizadoras de Fósforo.
• Las mejores cepas Antagonistas contra hongos fitopatógenos.

3.5 TECNICAS E INSTRUMENTOS ANALITICOS

3.5.1 METODOS GENERALES DE ANALISIS

3.5.1.1 UBICACIÓN

La fase experimental de laboratorio se llevará a cabo en el laboratorio de


Microbiología General, Alimentos y Biotecnología de la Facultad de Ciencias
Químicas (UCE).Las muestras del bioinoculante, suelos y raíces serán
suministradas por la Florícola Hacienda Santa Fe ubicada en Sigsipamba –
Pifo.

3.5.1.2 MUESTREO

3.5.1.2.1 Tipo de Muestreo

No probabilístico, de tipo selección intencional o de juicio.

3.5.1.2.2 Programa de Muestreo

Fecha de
No Código Ubicación Cantidad
Muestreo

1 C1 Captura 250 g 17-02-09


2 C2 Captura 250 g 17-02-09
3 C3 Captura 250 g 17-02-09
4 SM1 Solución Madre 250 ml 19-03-09
5 SM2 Solución Madre 250 ml 19-03-09

6 SM3 Solución Madre 250 ml 19-03-09

Solución 26-03-09
7 SP1 250 ml
Propagación
Solución 26-03-09
8 SP2 250 ml
Propagación
Solución 26-03-09
9 SP3 250 ml
Propagación

10 S1 Suelos bloq 8 1kg


02-04-09
11 S2 Suelos bloq 9 1kg 02-04-09
12 S3 Suelos Captura 1kg 02-04-09
13 R1 Raíces bloq 8 500g 10-04-09

14 R2 Raíces bloq 9 500 g 10-04-09

15 R3 Raíces Captura 500 g 10-04-09

3.5.1.2.3 Toma de Muestras

3.5.1.2.3.1 Toma de Muestra en la Captura

Las muestras se toman al momento de la cosecha de las tarrinas, se toma 250


g en frascos estériles. Los frascos son sellados, etiquetados y almacenados a
4ºC durante 24 horas hasta el momento del análisis.29

3.5.1.2.3.2 Toma de Muestra en la Solución Madre y Solución de


Propagación

Las muestras son tomadas a partir de los tanques de almacenamiento del


producto (EMAS). Cada muestra constituida de 250 ml, son tomadas a partir
del tanque que estuviese listo (sol. Madre produce al final; sol. Propagación se
produce al momento de ser aplicado al cultivo), sumergiendo frascos de vidrio
estériles hasta aproximadamente la mitad del tanque con ayuda de
29 Mantilla Cardenas Miguel Eduardo, Evaluación de la Acción de un Bioinoculante sobre un Cultivo de Crisantemo en Periodo de Enraizamiento,
Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007
instrumentos que faciliten el muestreo. Los frascos son sellados, etiquetados y
almacenados a 4ºC durante 24 horas hasta el momento de su análisis. 29

3.5.1.2.3.3 Toma de Muestras de Raíces

Para la toma de plantas con sistema radicular y suelo adherido (plantas no


enfermas, ni deshidratadas), considerando no realizar movimientos bruscos
que hicieran desprender el suelo de la raíz. Las plantas obtenidas con sus
correspondientes datos de ubicación de colecta; durante el recorrido se
guardaron un recipiente térmico para mantenerlas a una Tº entre 4 y 10 ºC. 29

3.5.1.2.3.4 Toma de Muestra de Suelos

Anexo 6

3.5.2 METODOS ESPECIFICOS DE ANALISIS

3.5.2.1 Microorganismos Fijadores de Nitrógeno

3.5.2.1.1 Aislamiento

Técnica de diluciones seriadas: se toman 10 ml o 10 g de cada muestra, los


cuales son adicionados a 90 ml de agua de peptona estéril, tomando esta como
la dilución 101, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 0,1 ml
hasta el factor 10-8.

Técnica de enriquecimiento selectivo: De las diluciones 10-4, 10-6, 10-8 se


pasaron inóculos a un medio sólido por el método de estriación en placa8 en el
29 Mantilla Cardenas Miguel Eduardo, Evaluación de la Acción de un Bioinoculante sobre un Cultivo de Crisantemo en Periodo de Enraizamiento,
Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007

8 Brook D.T, y T.M Madigan, Microbiología, 6ta edición, México, Printice Hall Hispanoamérica S.A , 1993
medio minimal sin fuente de nitrógeno (medio Lipman o Ashby Sacarosa-
Anexo 3), se incubó durante 7 días a 30ºC.

3.5.2.1.2 Selección

Método de Cuantificación de la producción del ión amonio a partir de


aislados microbiano

Se preparó, a partir de una solución estándar de 80 ppm de NH4Cl, y el rango


de trabajo de 0,8 – 5,6 ppm. Para evaluar la capacidad fijadora de nitrógeno de
las poblaciones aisladas, se inocula cada cepa en 25 ml de medio libre de
nitrógeno (Park, et ál, 2005), durante 72 horas en agitación constante a 180
rpm a 30oC y se utiliza el método indirecto de valoración del ión amonio
empleando la Técnica colorimétrica de Berthelot (fenol-hipoclorito)
(Weatherburn, 1967; Martínez, 2003), a 633 nm en un espectrofotómetro UV-
Vis.24

3.5.2.1.3 Antagonismo

Con el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladas


son sometidas a prueba de antagonismo, que se realiza en el medio diseñado,
mediante la técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze, 1967).5

3.5.2.1.4 Identificación

Identificación Macroscópica: se realizo una identificación macroscópica que


consistió en observar forma, elevación, margen, superficie y opacidad de cada
colonia de las cepas seleccionadas.

24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), Revista
Colombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-14

5 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir de
Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008
Identificación Microscópica: Tinción Gram, realizada a través de métodos
estándar de cada cepa seleccionada.

Biotipo: con los resultados anteriores se pudo identificar las pruebas


bioquímicas que se realizaron a cada cepa, estas pruebas son color de
pigmentos utilizando medios específicos, producción de ácidos indicado por el
cambio de color en el medio, pruebas de asimilación utilizando diferentes
fuentes de carbono, test de catalasa, oxidasa y desnitrificación en caldo
nitrato.24

3.5.2.1.5 Preservación

Se conserva las cepas a -80 ºC, en viales con medio crioprotector


(M.L.Muruaga, N.I.Perotti y M.E. Lucca; 2001).
Se utiliza la técnica de conservación en viales con crioprotector y provenientes
de un cultivo joven en placa.1

3.5.2.2 Microorganismos Solubilizadores de Fosforo

3.5.2.2.1 Aislamiento

Técnica de diluciones seriadas: se toman 10 ml o 10 g de cada muestra, los


cuales son adicionados a 90 ml de agua de peptona estéril, tomando esta como
la dilución 101, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 0,1 ml
hasta el factor 10-8.
Técnica de enriquecimiento selectivo: De las diluciones 10-4, 10-6, 10-8 se

24 Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), Revista
Colombiana de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-14

1 Ángel Alarcón Dilia Irney, Evaluación de Técnicas de Conservación de Hongos Filamentosos y Lavaduriformes en el Cepario de la
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006
pasaron inóculos a un medio sólido por el método de estriación en placa8 en el
medio minimal con fosfato tricálcico como fuente de fósforo (medio PVK- Anexo
4), se incubó durante 7 días a 30ºC, con la observación diaria en busca de
halos claros alrededor de la colonia.

3.5.2.2.2 Selección

Determinación Cuantitativa de fósforo soluble

Se preparo, a partir de una solución estándar de fosfato hidrógeno


monopotásico (100 mg/L), un set de soluciones con diferentes concentraciones:
0; 0,4; 1; 2; 3 y 5 ppm de P. Para la medición del P solubilizado, de cada cepa
se homogenizan a 0,3 de absorbancia en caldo peptona y se agrego 1000 μl a
matraces con 100 ml de caldo PVK, y se determino P solubilizado
colorimétricamente, con el método de Murphy y Riley (1962), cada día, por 7
días.5

3.5.2.2.3 Antagonismo

Con el objetivo de realizar un análisis de antagonismo entre las cepas aisladas


fueron sometidas a prueba de antagonismo, que se realiza en el medio
diseñado, mediante la técnica de difusión en agar (Beltrán et al., 2005; Gauze,
1967).5

3.5.2.2.4 Identificación

Identificación Macroscópica: se realizo una identificación macroscópica que


8 Brook D.T, y T.M Madigan, Microbiología, 6ta edición, México, Printice Hall Hispanoamérica S.A , 1993

5 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir de
Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008
consistió en observar el color, forma, borde, elevación, superficie en un medio
sólido de cada colonia de las cepas seleccionadas.

Identificación Microscópica: esta identificación consistió en realizar a cada


cepa seleccionada tinción Gram.

Biotipo: con los resultados anteriores se pudo identificar las pruebas


bioquímicas que se realizaron a cada cepa, estas pruebas fueron las
siguientes: Motilidad, Prueba de la catalasa, Prueba de la oxidasa, Producción
de pigmentos, Citrato, TSI (triple sugar iron), Oxidación – fermentación (O/F),
Hidrólisis del almidón, Licuación de la gelatina, Reducción del nitrato, Prueba
de la ureasa.5

3.5.2.2.5 Preservación

Se conserva las cepas a -80 ºC, en viales con medio crioprotector


(M.L.Muruaga, N.I.Perotti y M.E. Lucca; 2001).
Se utiliza la técnica de conservación en viales con crioprotector y provenientes
de un cultivo joven en placa.1

3.5.2.3 Microorganismos Antagonistas

3.5.2.3.1 Aislamiento

Técnica de diluciones seriadas: se toman 10 ml o 10 g de cada muestra, los


cuales son adicionados a 90 ml de agua de peptona estéril, tomando esta como
la dilución 10-1, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 0,1
ml hasta el factor 10-8.

5 Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina, Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir de
Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008

1 Ángel Alarcón Dilia Irney, Evaluación de Técnicas de Conservación de Hongos Filamentosos y Lavaduriformes en el Cepario de la
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006
Técnica de aislamiento en medios generales : De las diluciones 10-4, 10-6,
10-8 se pasaron inóculos a un medio sólido por el método de estriación en
placa8, se emplea PDA (Anexo 2) para hongos antagonistas y Agar nutritivo
(Anexo 1) para bacterias, incubando por 7 días a temperatura ambiente y por
48 horas a 37 oC respectivamente.

3.5.2.3.2 Selección

Enfrentamiento en cultivos duales entre el patógeno y el antagonista

Se realizan pruebas de enfrentamiento sobre Brotitys cinerea. Se procede a


tomar discos de 1cm de diámetro, colonizados con el micelio tanto del hongo
antagonista como del hongo patógeno. Los cuales fueron colocados en platos
Petri contentivos de (PDA) uno frente al otro de manera equidistante. Los
platos Petri se incubaron a temperaturas de 25 ºC.
Cada prueba de enfrentamiento se realizaran dos repeticiones por tratamiento
y se consideraron como testigo el aislamiento patógeno en medio de cultivo, en
el cual se colocó solamente un disco con micelio del hongo; las observaciones
se realizaron cada 24 horas por siete días consecutivos, y se evaluó el
crecimiento radial (cm/día) de las colonias de ambos hongos.
Para las bacterias se utilizo el mismo método de enfrentamiento pero utilizando
como medio de crecimiento agar Topping.

3.5.2.3.3 Antagonismo

Se realizan pruebas de enfrentamiento. Se procede a tomar discos de 1cm de


diámetro, colonizados con el micelio de los hongos a enfrentar. Los cuales se
colocan en platos Petri contentivos de (PDA) uno frente al otro de manera
8 Brook D.T, y T.M Madigan, Microbiología, 6ta edición, México, Printice Hall Hispanoamérica S.A , 1993
equidistante. Las observaciones se realizaron cada 24 horas por siete días
consecutivos a 25oC, y se evaluó el crecimiento radial (cm/día) de las colonias
de ambos hongos.

3.5.2.3.4 Identificación

• Observación del tiempo (velocidad) de crecimiento de la colonia, desde


que se siembra.
• Examen macroscópico de la colonia: color (tanto en el anverso como en
el reverso), radial, producción de pigmentos y exudados.
• Examen microscópico de la colonia: se lleva a cabo por 3 técnicas:
 Se trocea el hongo (con una aguja imantada), se pone en el porta, y se
tiñe con una gota de azul algodón de lactofenol (que mata, fija y
conserva). El inconveniente es que rompe muchas estructuras.
 Partiendo de 1 cm3 de papel adhesivo, con la parte que pega se pone
sobre el hongo, se adhiere a él su crecimiento y sus estructuras, de ahí
se lleva el papel adhesivo al porta, y se tiñe también con azul algodón de
lactofenol. Éste es el que usaremos nosotros en prácticas.
 El mejor método consiste en poner sobre una placa de Petri un porta con
una placa de agar y una U de vidrio. El hongo empieza a crecer por
arriba y por abajo, pegándose al porta. Se tiñe también con azul algodón
de lactofenol y se observa al microscopio. El inconveniente es que se
duplica el tiempo de crecimiento.
·
Se apuntan los datos significativos: tipo de micelio, la presencia o no de septos,
esporas.30

3.5.2.3.5 Preservación

Conservación en agua destilada estéril


30 Micología, Características generales de los hongos, pdf
Se realiza a partir de tubos de 7 días de crecimiento de cada a cepa; se
adicionan 10 ml de agua destilada esterilizada tres veces en autoclave a 121oC
a 15 libras de presión por 15 minutos. Para la separación de las conidias se
utilizó un agitador vortex; a partir de la suspensión de conidias obtenidas se
toma 1.8 ml el cual se coloca en frascos ambar de tapa rosca en condiciones
de esterilidad. Seguidamente se rotulan y se colocan en refrigeración a 4 oC. 1

CAPITULO IV

4.1 Recursos

 Materiales:

CANTIDAD VALOR UNITARIO VALOR TOTAL


MATERIALES
Matraz 1000 ml 3 7,00 21,00
Matraz 500 ml 8 3,92 31,36
Matraz 250 ml 4 3,35 13,40
Matraz 100 ml 2 1,73 3,46
Asa de inoculación 7 1,51 10,57
Aguja de inoculación 2 1,24 2,48
Asa de disgrasky 8 2,00 16,00
Cajas petri 1500 0,15 225,00
Pipeta 10ml 15 1,67 25,05
Pipeta 1ml 20 1,25 25,00
Pipetas pasteur 100 0,1 10,00
Pipeta 0,1ml 10 1,50 15,00
Tubos de ensayo (10x1) 600 0,08 48,00
Tubos nessler 51 2,50 127,50
Pipeta Volumétrica 25 ml 1 15,00 15,00
Balones aforados 25 ml 10 4,50 45,00
Balón aforado de 1000 ml 1 20,00 20,00
Balones aforados 50 ml 2 7,25 14,50
Goteros 3 0,60 1,80
Fundas blancas(paquete) 2 0,40 0,80
Fundas negra (paquete) 2 0,50 1,00
Fundas plásticas estériles 20 0,05 1,00
Frascos plásticos estériles 217 0,20 43,40
Kohler 1 2,50 2,50
Papel aluminio (100m) 1,5 11,27 16,91
Algodón cargado 1 2,20 2,20
Jabón líquido(vajilla) 1 1,50 1,50
Jabón líquido(manos) 1 1,10 1,10
Bajalenguas(paquete) 1 1,20 1,20
Fósforos(paquete) 1 1,20 1,20
Piola 1 0,80 0,80
Cinta Adhesiva 1 0,80 0,80
Marcadores permanentes 2 0,60 1,20
Capillo para tubos 1 0,30 0,30
Capillo para matraz 1 0,60 0,60
Papel empaque 1 10,00 10,00
Gasa 1 2,50 2,50
Tijeras 1 0,35 0,35
Papel absorbente 1 3,20 3,20
Alcohol 2 0,80 1,60
Cubre y portaobjetos 15 0,10 1,50
Guantes 5 0,20 1,00
Cofia 1 0,50 0,50
Mandil 1 15,00 15,00
Mascarilla 1 0,50 0,50
frasco de vidrio 100 0,25 25,00
Gradilla 8 2,50 20,00
Frascos de conservación 16 0,39 6,24
Crioviales 50 1,12 56,00
Material de Identificación ** …….. 250,00 250,00
Prep. De los bioinoculantes** …….. 100,00 100,00
REACTIVOS
Sacarosa (g) 500 0,08 40,00
Fosfato monopotásico (g) 10 0,25 2,50
Sulfato de magnesio (g) 20 0,75 15,00
Cloruro férrico (g) 10 0,75 7,50
Glucosa (g) 500 0,12 60,00
Cloruro de magnesio (g) 10 0,5 5,00
Sulfato de amonio (g) 20 0,12 2,40
Fosfato dipotásico (g) 10 0,25 2,50
Cloruro de calcio (g) 10 0,50 5,00
Molibdato de sodio (g) 10 1,20 12,00
Carbonato de calcio (g) 20 0,05 1,00
Fosfato tricálcico (g) 200 0,03 6,00
Cloruro de sodio (g) 20 0,08 1,60
Cloruro de potasio (g) 20 0,12 2,40
Sulfato de manganeso (g) 10 0,80 8,00
Sulfato de hierro (g) 10 0,80 8,00
Fenol (g) 40 0,20 8,00
Nitroprusiato de sodio (g) 10 1,00 10,00
Citrato de sodio (g) 100 0,10 10,00
Hidróxido de sodio 1,5 N (ml) 20 0,10 2,00
Hidróxido de sodio (g) 100 0,08 8,00
Hipoclorito de sodio (ml) 100 0,06 6,00
Molibdato de amonio (g) 50 0,25 12,50
Tartrato de sodio y potasio (g) 10 0,75 7,50
Acido Sulfúrico (g) 500 0,03 12,50
Acido Ascórbico (g) 50 0,10 5,00
Cloruro de amonio (g) 10 0,10 1,00
Agua destilada (litros) 100 0,85 85,00
OTROS MATERIALES Y EXTRAS
Impresiones B/N ** 400 0,1 40,00
Impresiones color** 50 0,25 12,50
Hojas de papel bond 100 0,03 3,00
Internet 400 0,7 280,00
Transporte ciudad 480 0,25 120,00
Transporte fuera de la ciudad 40 0,55 22,00
Subsistencia 240 1,50 360,00
MEDIOS DE CULTIVO
Agar nutritivo (500g - frasco) 1 52,29 52,29
Agar PDA (500g - frasco) 1 60,36 60,36
Glicerol (ml) 20 0,25 5,00
Caldo TSA (ml) 90 0,25 22,5
Agua de peptona (g) 100 0,09 9,00
Extracto de levadura (g) 100 0,11 11,00
Peptona (g) 20 0,15 3,00
Agar-Agar (500g - frasco) 1 71,45 71,35
SUBTOTAL 2658,42
IMPREVISTOS 5% 132,92
TOTAL 2791,34

 Equipos

• Cocineta
• Balanza 0,1g
• Incubadora 25°C, 30°C, 37°C
• Shaker orbital 30°C, 180 rpm
• Refrigeradora 10°C± 1°C
• Congelador -80°C± 1°C
• Mechero
• Autoclave 121°C, 30 min
• Baño de agua 45± 1°C
• Centrifuga
• Microscopio
• Espectrofotómetro, etc.

4.2 Presupuesto

El presupuesto para la investigación será proporcionado por la Florícola


Hacienda Santa Fe y con recursos propios, que podría llegar a un costo de
2800 dólares aproximadamente.

4.3 Cronograma

Meses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Actividad
Recolección de
información
Aprobación
Toma de
muestras
Siembra
Aislamiento
Selección
Identificación
Conservación
Defensa del
Plan de Tesis
5. BIBLIOGRAFÍA

1. Ángel Alarcón Dilia Irney, Evaluación de Técnicas de Conservación de


Hongos Filamentosos y Lavaduriformes en el Cepario de la Pontificia
Universidad Javeriana, Bogotá, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006.

2. Agrobiológicos, CONTROL BIOLOGICO Y SU EFECTO COMO


BIOFERTILIZANTE, 2008

3. Aguirre Mantilla Juan Francisco, Los biofertilizantes microbianos:


alternativa para la agricultura en México, INIFAP, Folleto Técnico n.- 5,
Tuxtla Chico, Chiapas, Marzo 2009

4. Arias Vega Carlos Aurelio , Estudio de 2 Grupos de Microorganismos


como Agentes Aceleradores de Descomposición de los Desechos
Sólidos Orgánicos Originados en los Comedores de ESPOL, Facultad de
Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción, ESPOL,
Guayaquil. 2007

5. Bobadilla Henao Catalina / Rincón Vanegas Sandra Carolina,


Aislamiento y Producción de Bacterias Fosfato Solubilizadoras a Partir
de Compost obtenido de Residuos de Plaza, Bogotá, PUJ, Facultad de
Ciencias, 2008

6. bnLec33, pdf

7. BORRERO, C. A, Efectos de Trichoderma (in vitro) en los


microorganismos no patógenos descomponedores de la materia
orgánica de un suelo oxisol clase IV del piedemonte llanero, Ingeniería
Agronómica de la Unillanos, VOLUMEN 9 Nº 2 ,2005

8. Brook D.T, y T.M Madigan, Microbiología, 6ta edición, México, Printice


Hall Hispanoamérica S.A, 1993.

9. CASTELLANOS, Diana. CUBILLOS, Ricardo , Selección de


Microorganismos Promotores de Crecimiento Vegetal (Ácido Indol
Acético) a partir de Muestras de Suelo Rizosférico, como Primera Etapa
en el Desarrollo de un Biofertilizante, Pontificia Universidad Javeriana.

10. Castillo C, D. 2001. Optimización de algunos parámetros para la


producción de conidios de Trichoderma sp. en fermentación de estado
sólido. Tesis de Maestría. U.N.T., Trujillo, Perú.

11. Celis Bautista Lina Ximena, Estandarización de Métodos de detección


para Promotores de Crecimiento Vegetal en Cultivos Microbianos,
Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2008.

12. Chávez García Mónica Paola, Producción de Trichoderma sp y


Evaluación de su Efecto en Cultivo de Crisantemo, Bogotá, PUJ,
Facultad de Ciencias ,2006.

13. Chirinos Jenny, Leal Ángel y Montilla Joan, Uso de Insumos Biológicos
como Alternativa para la Agricultura Sostenible en la Zona Sur del
Estado Anzoátegui, El Tigre estado Anzoátegui .Instituto Nacional de
Investigaciones Agrícolas, Revista Digital CENIAP HOY Nº 11 ,2006
14. Cruz Martínez Lina Carolina, Estandarización del Proceso de Producción
masiva del Hongo Trichoderma Koningii Th003 Mediante Fermentación
Bifásica a escala piloto, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007.

15. Difco, Manual Difco, Medios de cultivo deshidratados y reactivos para


microbiología, Madrid, 1984

16. Elein Terry Alfonso, Microorganismos Benéficos como biofertilizantes


eficientes para el cultivo del tomate (Lycopersicon esculentum, Mill),
Revista Colombiana de Biotecnología, volumen VII N: 2, Diciembre
2005, pág. 47-54

17. Fernández Orietta / Larrea Vega, Microorganismos antagonistas para el


control Fitosanitario, Manejo Integrado de Plagas, Costa Rica, No. 62 p ,
pág. 96 - 100 , 2001

18. Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha,


2008

19. Florícola Hacienda Santa Fe, Comunicación Personal, Pifo – Pichincha,


2009

20. Guzmán Jessica, Control de la pudrición carbonosa en caraota causada


por el hongo Macrophomina phaseolina, Agroca.

21. GREEN QUALITY | F.A.Q, mejoras en rendimientos a campo respecto


de un control sin Biofertilizar , Gráficos de rendimiento
22. Introducción, Rentabilidad De Las Empresas Productoras De
Bioinsumos Registradas Ante El ICA

23. Jiménez Avella Diego Javier, Caracterización Molecular de Cepas


Nativas Colombianas de Azotobacter spp Mediante el Análisis de
Restricción del ADN Ribosomal 16S, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias,
2007.

24. Lara Mantilla Cecilia, bacterias fijadoras asimbióticas de nitrógeno de la


zona agrícola de San Carlos (Córdova – Colombia), Revista Colombiana
de Biotecnología. Volumen IX N.- 2, Diciembre 2007, pág. 6-14

25. López Marisol, Efecto de biofertilizantes bacterianos sobre el crecimiento


de un cultivar de maíz en dos suelos contrastantes, Centro Nacional de
Investigaciones Agropecuarias (CENIAP), Maracay, estado Aragua.
Venezuela.

26. López M, Evaluación de un Medio de Cultivo no comercial para la


producción de un bioinoculante empleado en un cultivo de flores,
Carrera de Microbiología Industrial, Facultad de Ciencias, PUJ, 2006

27. Los Microorganismos Eficientes Autóctonos (EMA), Florícola Hacienda


Santa Fe, 2009

28. M.A. Osorio Nila / L.M Vásquez García /M.L Salgado Siclán / C.E
González Esquivel, Efecto de Dos Enmiendas Orgánicas y Trichoderma
sp, para Controlar Sclerotinia sp en Lechuga, Chapingo-México,
Universidad Autónoma Chapingo, 2005, pág. 203-208.
29. Mantilla Cardenas Miguel Eduardo, Evaluación de la Acción de un
Bioinoculante sobre un Cultivo de Crisantemo en Periodo de
Enraizamiento, Bogotá, PUJ, Facultad de Ciencias, 2007.

30. Micología, Características generales de los hongos, pdf

31. M. Planes-Leyva, la biofertilización como herramienta biotecnológica de


la agricultura sostenible, Centro Universitario de Guantánamo, Cuba
32. Noceti, Juan J. Ing. Quim., Biofertilizantes - Un nuevo desafio en nuestro
país y en la región.

33. Orestes Elósegui Claro, Métodos Artesanales de Producción de


Bioplaguicidas a Partir de Hongos Entomopatógenos y Antagonistas,
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) , Ciudad de La
Habana, Cuba ,2006.

34. STEFANOVA N., M. 1998. Métodos de aplicación y efectividad de


Trichoderma sp. Como antagonista de hongos fitopatógenos. Curso
internacional de control biológico BIOSAV- 4. Instituto de investigaciones
de Sanidad Vegetal. La habana-Cuba.

35. www.fao.org

36. www.monografías.com

37. www.inia.cl

38. www.fondef.cl

39. www.infoagro.com/flores/flores/rosas.htmt
40. www.ute.edu.ec/posgrados/dia_de_campo.html

41. www.inta.gov.ar/barrow/info/documentos/agricultura/Maiz/informe_inocul
_solubiliz.pdf

42. www.upch.edu.pe/.../Hormonas%20vegetales%201y2+Otros.ppt

43. http://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=2351591

6. ANEXOS

Anexo 1
Anexo 2

Anexo 3
Medio Lipman o Ashby - Sacarosa

FUENTE COMPUESTO CANTIDAD


Fuente de C y
energía Sacarosa 20 g
Fosfato di
0.05 g
potásico
Fosfato
0.15 g
monopotásico
Cloruro de calcio 0.01 g
Sulfato de
0.2 g
magnesio
Molibdato de
0.002 g
Base mineral sodio
Cloruro férrico 0.01 g
Carbonato de
0.1 g
calcio
Agua Agua destilada 1000 ml
pH = 7

Anexo 5
Medio Pikovskaya

FUENTE COMPUESTO CANTIDAD


Fuente de C y
energía Glucosa 10 g
Ca3(PO4)4 0.05 g

(NH4)2SO4 0.15 g

NaCl 0.01 g

MgSO4.7H2O 0.2 g

KCl 0.002 g
Base mineral Ext. Levadura 0.01 g
MnSO4.H2O 0.1 g
FeSO4.H2O
Agua Agua destilada 1000 ml
pH = 7
Anexo 6
Procedimiento para la toma de muestras de suelos

Héctor M. Coraspe*; Sergio Tejera**

El análisis de suelos es una herramienta muy importante en nuestra agricultura, utilizado como una
referencia excelente para el uso correcto, tanto de fertilizantes químicos y orgánicos, como de enmiendas.
El costo actual de los fertilizantes obliga a su empleo en las dosis adecuadas y balanceadas, en función
de los nutrimentos que contienen, principalmente en aquellos que deben ser importados, ya que ello
ocasiona una fuga de divisas para el país. Todavía esta práctica no es usada ampliamente por los
productores, motivado, en parte, al desconocimiento que existe sobre la manera correcta de tomar las
muestras para el análisis, falta de información sobre la disponibilidad de laboratorios y el relativo bajo
precio que por muchos años presentaron los fertilizantes y enmiendas, debido a los subsidios que
recibían.
El análisis de suelos será tan bueno como la calidad de las muestras tomadas, pues la muestra enviada al
laboratorio, de 0,5 a 1,0 kg, representa millones de kilogramos de suelo.
Por este motivo, una torna de muestra cuidadosa asegura unos resultados de análisis correctos y de gran
utilidad.

1. Pasos a seguir en el muestreo de suelos

1.1. Delimitación de las áreas

Recorra la finca y haga un plano o croquis sencillo de las superficies más o menos homogéneas, en
cuanto al tipo de suelo, apariencia física y clase de manejo recibido anteriormente, donde ubique los
detalles más importantes de la finca como lo son partes altas o bajas, planas o inclinadas, coloración del
suelo, si es arenoso o pesado, vegetación alta, media o baja, riesgo de aguachinamiento, áreas que no se
han trabajado ni fertilizado, y áreas trabajadas y fertilizadas. En todo caso, procure tomar siempre en
forma separada, muestras de áreas que usted ha observado le producen diferentemente.

1.2. Herramientas y materiales necesarios

Para la toma de muestra en cada lote utilice los implementos necesarios como barreno, pala, bolsa
plástica, y balde.

1.3. Toma de la muestra

Recorra los lotes al azar en forma de zig-zag y cada 15 o 30 pasos tome una submuestra, limpiando la
superficie del terreno y depositándola en el balde. Las submuestras deben ser tomadas entre 20 y 30 cm
de profundidad. Luego de tener todas las submuestras en el balde (de 15 a 20 por ha) se mezclan
homogéneamente y se toma 1 kg aproximadamente. Esta es la muestra compuesta requerida para el
análisis. El proceso se ilustra en las siete figuras que acompañan este artículo.
1.4. Identificación de la muestra

Para identificar la muestra se debe colocar: el nombre del propietario, nombre de la finca, ubicación
geográfica, número de muestra y lote, superficie que representa y algunas informaciones
complementarias como lo son: pendiente del terreno, riesgo de aguachinamiento, color del suelo, tipo de
vegetación, cultivo anterior, rendimiento obtenido, disponibilidad de residuos, tipo de fertilizante usado, si
encaló y forma y época de aplicación.

2. Factores a considerar en el muestreo de suelos

2.1. Tamaño de la unidad de muestreo

El tamaño dependerá de la variabilidad del terreno y de la intensidad y tipo de uso del lote. En áreas muy
uniformes, con el mismo uso agrícola y vegetación, el lote puede estar representado por 10 ha. En áreas
de uso muy intensivo con fuertes aplicaciones de fertilizantes, abonos orgánicos y con riego (hortalizas y
frutales) el lote no debe ser mayor de dos hectáreas.

2. 2. Número de submuestras

Dependerá del tamaño del lote de muestreo y de la intensidad de uso. Mientras mayor sea el lote, mayor
número de submuestras serán necesarias. El mínimo puede ser entre 15 20 y lo ideal entre 30 40
submuestras.

2. 3. Precauciones a tornar cuando se tomen muestras para análisis de suelos

• Evite muestrear suelos muy mojados.

• Use bolsas plásticas nuevas y limpias, no de papel.


• No fume durante la recolección de muestras, para evitar contaminarlas con las cenizas del cigarro, ricas
en potasio.

• No tome muestras en áreas recién fertilizadas, sitios próximos a viviendas, galpones, corrales, cercas,
caminos, lugares pantanosos o erosionados, áreas quemadas, lugares donde se amontonan estiércol,
fertilizantes, cal u otras sustancias que pueden contaminar la muestra.

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