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Introduccin:

Las molculas ms grandes y probablemente las de mayor inters que se


encuentran en los seres vivos actuales son los cidos Nucleicos. Todas las
evidencias experimentales recientes indican que los cidos Nucleicos son las
molculas que ejercen el control primario sobre los procesos bsicos de todos los
organismos vivos. Estas sustancias forman el enlace qumico entre las
generaciones, para entender como este tipo de molcula puede controlar todas las
reacciones de los seres vivos, los cientficos han estudiado cuidadosamente la
estructura de los cidos nucleicos. Los cidos nucleicos se descubrieron en la
poca en que se llevaron a cabo intensa investigaciones qumicas sobre la materia
viva, a fines del siglo XIX.
El bioqumico suizo Friedrich Miesches fue el primero en descubrir sustancia,
cidos asociados con las protenas del ncleo celular. Al estudiarlas mejor,
Miesches comprendi que estas sustancias son bastante diferentes de las
protenas y de otros compuestos conocidos. La unidad bsica de un cido nucleico
es el nucletido, cada molcula de cido nucletido se forma como una larga
cadena de 4 clases de nucletidos, a su vez lo nucletidos pueden ser
fragmentados en 3 partes; una de esas partes es siempre un azcar de 5
carbonos y que son la ribosa y la desoxirribosa, los cidos nucleicos que
contienen ribosa se denomina cido ribonucleico o ARN y los cidos nucleicos que
contienen desoxirribosa se denominan cido desoxirribonucleicos o ADN. El ADN
existe como un duplo de dos cadenas de polidesoxirribonucletidos, excepto en
algunos virus bacterianos formado de una solo cadena de ADN o ARN. Las
cadenas complementarias de la doble hlice muestra polaridad opuesta y por lo
tanto son antiparalelas: una cadena progresa en la direccin 5 3 y la cadena
opuesta progresa en la direccin 3 5. Por cristalografa de rayos X se han
identificado tres formas de ADN: A, B y Z la forma B de ADN, que es la forma
predominante en las clulas, es una doble hlice derecha con 10 pares de base en
cada vuelta de la hlice. La forma A, que se forma en el laboratorio con baja
humedad, existe como doble hlice derecha con casi 11 pares de base por vuelta.

La forma Z, que puede presentarse fisiolgicamente en dobleces del ADN que


contiene purina y pirimidinas alternadas, es una doble hlice izquierda en 12 pares
de base por vueltas. El ADN se organiza en cromosomas que son estructuras
intranucleares con la propiedad de autoduplicarse y de transmitir la informacin
gentica de los seres vivos.
Las clulas procariotas son clulas sin ncleo, por lo cual su ADN se encuentra
disperso en el citoplasma, lo cual facilita su estudio y anlisis. Dentro de los
microorganismos ms estudiados por el ser humano se encuentra la Escherichia
coli, la cual fue originalmente descripta por Theodore Escherich en 1885 y
llamada Bacterium coli commune. Algunas cepas poseen diversos grados de
patogenicidad, lo que llevo a profundizar los mecanismos relacionados a ella.
Otros patgenos se adhieren a la clula husped pegndose a protenas
preexistentes pero, en Escherichia coli enteropatognico se encontr

un

mecanismo diferente, ya que manufactura e inyecta su propio receptor en la clula


husped para adherirse a continuacin.
Objetivo:
Obtencin de DNA plsmido a partir de clulas procariotas (E. Coli).
Metodologa:
Paso1: Obtencin de bacterias Escherichia coli
1.- Prepara cajas con agar estndar o nutritivo, cultivar las bacterias de E. coli por
24 horas a 37C.
2.- Preparar medio de cultivo estndar o nutritivo tomar varias colonias de
bacterias E. coli, cultivarlas en agitacin constante a 24 horas a 37 C.
3.- Esterilizar tubos ependorf en un frasco grande de boca ancha, pipetas de vidrio
de 5mL, una mosca magntica.
Paso2: Extraccin de DNA de Escherichia coli

1.- Transfiere aspticamente 1.5mL del cultivo de E. coli a un tubo ependorf de


1.5mL. Centrifugar a 3000 rpm x 10 min, en la microcentrifuga. Este paso se repite
tres veces, la ltima eliminacin del sobrenadante se aspira con pipeta pasteur
cuidando de que no quede nada de sobrenadante.
2.- Resuspender el precipitado de clulas bacterianas con 800 microlitros de
reactivo TRIZOL, mezclar con la pipeta suavemente, hasta que desaparezca el
botn de bacterias, posteriormente incubar a temperatura ambiente por 5 min.
3.- Se adicionan 200 microlitros de cloroformo, se mezcla por inversin durante 15
seg, y se incuba durante 3 min a temperatura ambiente.
4.- Despus se centrifuga en la microcentrifuga durante 20 min a 13000 rpm.
5.- Una vez que termina de centrifugar, se observan dos fases, y entre las fases se
observa una lnea blanca. Se toma la fase superior y se transfiere a otro tubo
ependorf estril.
6.- Se adicionan 200 microlitros de cloroformo mezclar por inversin 15 seg, y
centrifugar a 13500 rpm por 30 min. Este paso se repite 3 veces.
7.- decantar el sobrenadante y adicionar 500 microlitros de isopropanol absoluto,
se incuba la mezcla por 10 min a temperatura ambiente.
8.- Decantar el sobrenadante dejar el tubo ependorf abierto y con la boquilla hacia
abajo sobre el papel absorbente.
9.- Resuspender el precipitado con 50 microlitros con solucin inyectable.
Paso3: Centrifugacin del DNA por el mtodo espectrofotomtrico
La solucin de DNA puro de doble cadena a una concentracin de 50
microgramso/mL tiene una densidad ptica (DO) a 269nm de 1.0 y una relacin de
DO260/DO280 de 1.8. El clculo de esta relacin es una manera de expresar la
pureza del DNA, por lo tanto permite determinar la presencia de contaminantes,
los valores por debajo de 1.6 indican la contaminacin con protenas o fenol y los

valores por arriba de 2.0 indican la presencia de RNA. Dependiendo de la


composicin nucleica, un valor de 1.65 a 2.0 indican una muestra pura.
1.- Colocar 5 microlitros de la muestra de DNA en una celda de cuarzo
conteniendo 1mL de agua inyectable, mezclar suavemente y leer a 260 y 280nm.
2.- calibrar a cero el espectrofotmetro con agua inyectable.
3.- Mediante la aplicacin de la frmula se determina la concentracin del DNA a
260nm y aplica la frmula para 280nm.
DNA ng/mL = DO260nm x dilucin (1005/5 microlitros) x 50 (factor constante)
Pureza = DO260nm/DO280nm
50 es el coeficiente de extincin molar de 50 ng/mL de DNA que tiene la mxima
absorbancia de 1.0 unidad de desviacin ptica a 260nm.
Resultados:

Discusin:
Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una
lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los
restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio
de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial
complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el
cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los
siguientes:

rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);


tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con
tioles,etc.);
digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).

Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al


mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que
solubilicen las membranas celulares y sales caotrpicas fuertes que inactiven las
enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los
restos de clulas se eliminan fcilmente por filtracin o precipitacin.
Extraccin/precipitacin
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los
contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
combinacin de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las protenas. Para
concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol
o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede aadirse a la
mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la precipitacin.
Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas
elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante
cambios del pH.
Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y precipitacin
Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de
cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos
nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos
fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la
concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol. En esta seccin se
describirn los principios de las tres etapas principales: la lisis de la membrana
celular, la extraccin del ADN genmico y su precipitacin.
Lisis de la membrana celular: Tal como se ha mencionado anteriormente, la
primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la membrana celular y
nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampn de
extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biolgicas
presentan la misma estructura general, integrada por molculas de lpidos y de
protenas, unidas por interacciones no covalentes.

Figura 1. Representacin simplificada de las membranas celulares1.


Tal como muestra la figura 1, las molculas lipdicas estn ordenadas en una
doble capa continua, en la que las molculas protenicas estn disueltas. Las
molculas lipdicas estn formadas por extremos hidrfilos, denominados
cabezas, y extremos hidrfobos, denominados colas. En este mtodo, el
detergente (CTAB) contenido en el tampn de extraccin provoca la lisis de la
membrana. Dado que la composicin de los lpidos y del detergente es similar, el
componente de CTAB del tampn de extraccin captura los lpidos que integran la
membrana celular y nuclear.
La figura 2 ilustra el mecanismo de solubilizacin de los lpidos con un detergente.

La figura 3 ilustra cmo se libera el ADN genmico cuando el detergente captura


los lpidos y las protenas al entrar en contacto la membrana celular y el tampn de

extraccin con CTAB. Con una concentracin salina (NaCl) determinada, el


detergente forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos. El EDTA es un
componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio
es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad
de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solucin la
capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daa el ADN). Es
importante sealar que, como los cidos nucleicos se degradan fcilmente en esta
fase de la purificacin, debe reducirse al mnimo el tiempo transcurrido entre la
homogeneizacin de la muestra y la adicin de la solucin tampn con CTAB. Una
vez que se han roto las membranas de la clula y de los orgnulos (como los que
se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN.

Figura 3. Rotura de la membrana celular y extraccin del ADN genmico.


Extraccin - En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos
nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y
los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente
importante eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden
inhibir numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl
< 0,5 M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y
pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo. El cloroformo
desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases acuosa y orgnica.
La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es
densa debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase inferior. Adems,
si el pH de la solucin acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 8,0), los

cidos nucleicos tendern a repartirse en la fase orgnica. Si es preciso, la


extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar por
completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los
cidos nucleicos, puede retroextraerse la fase orgnica con una solucin acuosa,
que se aade a continuacin al extracto anterior. Una vez purificados los
complejos de cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin, ltima etapa
del procedimiento.
Precipitacin - En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del
detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de
precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin
elevada (NaCl >
0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un
precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en
lugar de NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el detergente, que
es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que
los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite
una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual.
El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden
cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir,
midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin
puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene
cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la
medicin espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases
es sencillo y exacto. En este mtodo, los tampones acuosos con escasa
concentracin inica (por ejemplo, tampn TE) resultan idneos. La concentracin
de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un
blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un
cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente
A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes

respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una
absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de
carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente
A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.
Conclusin:
Debido a la ausencia de reactivos con alto ndice de confiabilidad, no se pudo
obtener el DNA de la clula procariota estudiada. Sin embargo, se observ las
caractersticas que afectan a los microorganismos y como ciertas condiciones
interfieren en la vida de estos. Al ser sometidos estos a condiciones inestables
producen la destruccin de la clula, permitiendo

interactuar con el material

gentico que estos presentan; as mismo, el material gentico presente es


identificado mediante frmulas que despus de una serie de pasos permite ser
cuantificado, al igual que el grado de pureza que este contiene.
Cuestionario:
1.- Cmo est conformado el genoma bacteriano?
El genoma bacteriano est formado por una sola molcula de DNA bacteriano de
forma circular, cerrada, y gran tamao (cromosoma). Esta molcula de DNA no
se encuentra separada del citoplasma por una membrana nuclear sino que est
directamente inmersa en el mismo, por lo que no se puede hablar con propiedad
de ncleo bacteriano, refirindose a este acumulo de material gentico como
nucleoide.
2.- Qu es un plsmido?
Los plsmidos son molculas de DNA extracromosomal los cuales estn
presentes en algunas clulas bacterianas, levaduras y hongos. Los mismos
poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero tambin se han
encontrado plsmidos lineales. Los plsmidos no son esenciales para el desarrollo
o supervivencia de la clula pero le proveen una ventaja competitiva a las clulas
que los poseen, dado a que los plsmidos poseen genes que le confieren

caractersticas selectivas a su husped tales como resistencia a antibiticos,


nuevas habilidades metablicas como degradacin de carbohidratos, factores de
virulencia y produccin de toxinas entre otros. De manera natural se encuentran
en las bacterias en tamaos que van desde 5,000 hasta 400,000 pb. Pueden ser
introducidos

en

las

clulas

bacterianas

por

un

proceso

denominado

transformacin.
3.- Cul es la importancia de realizar la extraccin de DNA plsmido?
Los plsmidos poseen un inters singular en Ingeniera Gentica por ser uno de
los sistemas vectores ms sencillos de usar. Un vector de clonacin es un sistema
que permite introducir en una clula hospedadora un fragmento de DNA que se
pretende clonar; en esta clula hospedadora el vector se replica y expresa, en su
caso. La replicacin de los plsmidos es independiente de la replicacin del
cromosoma del husped ya que los plsmidos poseen su propio origen de
replicacin. El nmero de copias de un plsmido en la clula es variable, todo
depende del origen de replicacin del que posea el mismo y su regulacin.
4.- Cules son las aplicaciones de la E. coli en ingeniera gentica?
El clonado de genes y su expresin en forma de productos proteicos por clulas
de E. coli o de levaduras hace posible la produccin comercial de muchas
protenas de utilidad prctica que, de otro modo, son muy difciles de obtener en
abundancia. Los genes de algunas protenas necesarias en medicina han sido
clonados. La insulina, que se obtena a partir de pncreas de cerdo, se puede hoy
obtener de cultivos bacterianos que contienen el gen humano clonado, con lo cual
proporcionan una insulina con la misma secuencia de aminocidos que la
humana, cosa que no ocurra con la insulina porcina. La insulina obtenida en E.
Coli se utiliza actualmente en el tratamiento de la diabetes mellitus. Igualmente
ocurre con la hormona de crecimiento (somatotropina) que se administra a
pacientes que padecen enanismo. Otro ejemplo es el gen que codifica la
proinsulina humana se ha recombinado adecuadamente y se ha hecho reproducir
en E. coli. El resultado es que la bacteria produce proinsulina.

5.- Qu funcin tiene el cloroformo?


El cloroformo genera una fase acuosa (con el RNA) y una fase orgnica (con
protenas desnaturalizadas), quedando el DNA en la interface de la solucin.
6.- Cmo acta el reactivo TRIZOL en la reaccin?
El trizol es un reactivo listo para utilizarse en el aislamiento de RNA de clulas y
tejidos, es una solucin mono-fsica de fenol e isocianato de guanidina que
durante la homogenizacin o lisis de la muestra mantiene la integridad del RNA, al
mismo tiempo que altera la estabilidad de las clulas y disuelve los componentes
celulares.
Referencias:
Eng F, Novikova EG, Kuroki K, Ganem D, Fricker LD (1998) gp 180, a protein that
binds duck hepatitis B virus particles, has metallocarboxypeptidase D-like
enzymatic activity. J Biol Chem 273, 8382-8388.
Quian Y, Varlamov O, Fricker LD (1999) Glu300 of rat carboxypeptidase E is
essential for enzymatic activity but not substrate binding or routing to the regulated
secretory pathway. J Biol Chem 274, 11582-11586.
Birnboim HC, Doly J (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research 7: 1513-1523. Artculo original
que describe el mtodo de lisis alcalina.
TRI-REAGENT (1999) Technical Bulletin MB-205. SIGMA. Boletn tcnico de la
casa comercial que describe el mtodo TRI-REAGENT para la purificacin de RNA
total.
Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry
162: 156-9. Artculo original que describe el mtodo de paso nico (single-step)
en el que se basa el TRI-REAGENT.