Universidad de Jan, Dpto.

Biologa Experimental, rea de Gentica

Gentica Aplicada
Curso 2010-2011

TEMA 4: AMPLIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS IN VITRO

OBJETIVOS
-

Conocer el fundamento de la PCR.

Saber analizar el resultado de una PCR.
Conocer los problemas que plantea la PCR (especificidad, contaminacin y
errores de las polimerasas) y sus soluciones.
Saber aplicar la tcnica de PCR a distintas situaciones experimentales.

RESUMEN
1. INTRODUCCIN
2. FUNDAMENTO DE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
- La PCR se basa en:
1. La hibridacin de cidos nucleicos
2. La replicacin del ADN realizada por una ADN polimerasa a partir de extremos 3'-OH libres
y de ADN molde
3. La repeticin de dicha replicacin del ADN durante un determinado nmero de ciclos a partir
de unos cebadores sintticos, dNTPs y ADN polimerasa termoestable
- Ingredientes
* Molde
* Cebadores
* Mezcla de dNTPs
* ADN polimerasa
* Tampn
* Magnesio
- Cada ciclo de amplificacin consta de los siguientes pasos
* Desnaturalizacin
* Unin de cebadores
* Extensin
Al final se consigue una acumulacin exponencial del ADN situado entre los sitios de unin de
ambos cebadores sintticos
- ADN polimerasas termoestables:
* Taq polimerasa
VENTAJAS: Automatizacin y especificidad
INCONVENIENTES: elevada tasa de mutacin por carecer de actividad Exo 3-5
* Otras ADN polimerasas termoestables con actividad exo 3'-5': Pwo, Pfu
- Anlisis del resultado de una PCR
* Cualitativo: electroforesis en gel
* Cuantitativo: PCR en tiempo real
3. PROBLEMAS DE LA PCR
* Amplificacin exponencial: necesidad de conocer los cebadores
* Especificidad: PROBLEMAS y SOLUCIONES
Aumentar la temperatura de unin de los cebadores
Empleo de cebadores anidados
Disminuir la concentracin de iones Mg++
Arranque en caliente (Hot-start PCR)

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Curso 2010-2011

* Errores de la polimerasa. SOLUCIN: empleo de polimerasas con actividad correctora de

pruebas (Exo 3-5)
* Contaminacin: SOLUCIN: Empleo de mtodos de prevencin (fsicos, qumicos y
enzimticos)
4. ALGUNAS VARIACIONES DE LA PCR
1. Amplificacin de ARN: RT-PCR
2. Generacin de molculas de ADNcs (ej. para sondas): PCR asimtrica
3. Bsqueda de zonas flanqueantes: PCR inversa
5. APLICACIONES
1.
2.
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4.
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9.
10.
11.

Produccin de grandes cantidades de fragmentos de ADN concretos

Marcaje de sondas
Secuenciacin del ADN
Diagnstico de enfermedades genticas
Deteccin de partculas infecciosas
Diagnstico prenatal
Gentica forense, identificacin
Clculos de % de recombinacin en clulas germinales
Amplificacin de genes con expresin diferencial
Mutagnesis dirigida
Cuantificacin (PCR cuantitativa en tiempo real)

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA

Ingenieria genetica vol.I. Preparacion, analisis, manipulacion y clonaje de DNA. J.

Perera, A. Tormo Garrido y J.L. Garcia. Ed. Sntesis (2002). Tema 8.

BIBLIOGRAFA ADICIONAL

Principles of gene manipulation and genomics. (2006, 7 ED.). S.B. Primrose and R.M.
Twyman.
Blackwell
Science.
ISBN:
1-4051-3544-1.
http://www.blackwellscience.com/primrose.

Recombinant DNA : Genes and genomes A short course. (2006, 3 Ed.) J.D. Watson,
A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. Cold Spring Harbour Press and Freeman.
ISBN: 0-7167-2866-4.

Gene cloning and dna analysis, an introduction (2006, 5 ED.) T.A Brown. Blackwell
Science. ISBN: 978-1-4051-1121-8.

Analysis of genes and genomes (2004, 1 ED.) Richard J Reece. Wiley. ISBN: 0-47084380-2.

Understanding dna and gene cloning. A guide for the curious (2004). Karl Drlica. Wiley.
ISBN: 0471-43416-7.

From genes to genomes. Concepts and applications of DNA technology. J.W. Dale y M.

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Gentica Aplicada
Curso 2010-2011

von Schantz. Wiley (2002). ISBN: 0-471-49783-5.

LECTURAS ADICIONALES
-

Tcnicas nucleotdicas: nuevas alternativas a la PCR Investigacin y Ciencia. Junio 1992. Pg:
36-38.

Nucleic Acid Sequence-based Amplification J. Compton. Nature, vol 350, 7 Marzo 1991. Pg: 9192.