TEMA 15: PRODUCCION DE

ANTIBIOTICOS
Dr. Pedro F. Mateos

I. INTRODUCCION
Los antibiticos son productos del metabolismo microbiano que son capaces de
matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones.
Durante la II Guerra Mundial la demanda de agentes quimioteraputicos para
tratar las infecciones de las heridas condujo al desarrollo de un proceso de
produccin para la penicilina y al inicio de la era de investigacin sobre los
antibiticos. En la actualidad continua siendo una de las reas ms importante de
investigacin dentro de la Microbiologa Industrial.
El nmero de antibiticos descritos contina aumentando debido a los programas
intensivos de bsqueda en todos los pases industriales. En 1961 eran conocidos
513 antibiticos, 4076 en 1972, 7650 en 1985 y en 1990 alrededor de 8000. Cada
ao se detectan aproximadamente 300 nuevas sustancias con actividad
antibitica, de las que el 30-35% son componentes secundarios de las
fermentaciones de antibiticos conocidos. Del gran nmero de antibiticos
conocidos de origen microbiano, solamente 123 se producan por fermentacin
en 1984. Adems, ms de 50 antibiticos se producan como compuestos
semisintticos y 3 antibiticos (cloranfenicol, fosfomicina y pirrolnitrina) se
producen en forma completamente sinttica.
Los antibiticos son producidos por bacterias y hongos. Entre los hongos,
solamente 10 de los antibiticos conocidos se producen comercialmente y
solamente las penicilinas, cefalosporina C, griseofulvina y cido fusdico tienen
importancia clnica. En las bacterias existen muchos grupos taxonmicos que
producen antibiticos. La mayor variedad en estructura y nmero de antibiticos

se encuentra en los actinomicetos, especialmente en el gnero Streptomyces.

La produccin mundial de antibiticos en 1979 estaba por encima de las 100.000
toneladas por ao. Las ventas brutas anuales, slo en USA, eran de 1000 millones
de dlares, con la cefalosporina en la posicin de cabeza, seguida de la
ampicilina y las tetraciclinas.
Antes de 1960 aproximadamente el 5% de los antibiticos recientemente aislados
eran tiles teraputicamente. En los aos siguientes fueron descubiertos nuevos
antibiticos a una velocidad aproximadamente constante, pero el porcentaje de
los nuevos antibiticos que realmente llegaban al mercado descendi desde el
2,6% entre 1961-1965 al 1% entre 1966-1971. Esto se debe fundamentalmente a
un aumento severo en los costes del desarrollo y de las pruebas clnicas, de forma
que muchos fabricantes producen solamente aquellos compuestos que claramente
muestran un progreso teraputico prometedor. Por trmino medio se necesitan
alrededor de 8-10 aos para desarrollar un nuevo antibitico a un coste medio de
10x106 - 20x106 dlares (2500 millones de pesetas; 15 millones de euros).
La obtencin de mejores antibiticos se lleva a cabo por modificacin de los
compuestos conocidos utilizando medios qumicos o genticos (mutasntesis,
fusin de protoplastos, tecnologa del DNA recombinante). Sin embargo,
solamente por procesos de Screening pueden esperarse encontrar antibiticos con
estructuras bsicas enteramente nuevas, especialmente por la utilizacin de
nuevos procedimientos de prueba y por la investigacin en nuevos grupos de
microorganismos.

II. PRODUCCION DE PENICILINAS

Los antibiticos -lactmicos se caracterizan por poseer en su estructura el anillo
-lactmico que est compuesto por 3 tomos de carbono y 1 tomo de nitrgeno.
Los antibiticos -lactmicos se pueden dividir en cinco clases diferentes:
Penicilinas
Clavamas
Cefalosporinas
Monobactamas
Carbapenemas

Las penicilinas y cefalosporinas pertenecen a los ms efectivos de todos los

agentes teraputicos usados en el control de las enfermedades infecciosas.
La penicilina fue descrita por Fleming en 1929. Un grupo de investigacin en
Oxford, bajo la direccin de Florey y Chain, la aisl a partir de cultivos
de Penicillium notatum en 1940 y la primera aplicacin clnica de la penicilina se
realiz en 1941. Las penicilinas son producidas por muchos hongos,
particularmente especies de Penicillium y Aspergillus.
Las penicilinas naturales son efectivas contra numerosas bacterias Gram +. Son
lbiles en medio cido y pueden ser inactivadas por hidrlisis del anillo lactmico con penicilinasas. Debido a su baja toxicidad pueden ser utilizadas
grandes dosis de penicilina, solamente un pequeo porcentaje de pacientes
desarrollan alergia (0,5-2%).
Los antibiticos -lactmicos son inhibidores especficos de la sntesis de
peptidoglicano, componente de la pared celular bacteriana. Son anlogos
estructurales de la D-alanil-D-alanina y por ello se considera que estos frmacos
se unen a las transpeptidasas a las que inactivan irreversiblemente. Algunas
penicilinas son menos efectivas frente a Bacterias G - debido a que la membrana
externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas sintticas y
cefalosporinas tienen efecto tambin frente a Bacterias G -.

1.- Estructura qumica

La estructura bsica de las penicilinas es el cido 6-aminopenicilnico (6-APA),
que consiste en un anillo tiazolidnico con un anillo -lactmico condensado. El
6-APA lleva una parte variable acilada en la posicin 6.
Si la fermentacin de penicilina se lleva a cabo sin adicin de precursores de la
cadena lateral se producen las penicilinas naturales. A partir de esta mezcla
solamente es til teraputicamente la bencilpenicilina; los otros compuestos
deben ser eliminados durante la etapa de recuperacin del producto. La
fermentacin puede ser controlada mejor aadiendo un precursor de la cadena
lateral, de forma que solamente se produzca una penicilina deseada. Ms de
100 penicilinas biosintticas han sido producidas de esta forma. En los procesos
comerciales, sin embargo, solamente han sido producidas la penicilina G y
la penicilina V, y cantidades muy limitadas de penicilina O. Utilizando el cido
fenoxiactico, como precursor de la cadena lateral, se consigui la obtencin de
penicilina V (fenoximetilpenicilina), penicilina que es particularmente estable en

medio cido y que puede, por tanto, suministrarse por va oral al contrario de lo
que ocurre con la penicilina G ya que debido a su sensibilidad a los cidos no se
puede administrar oralmente puesto que es hidrolizada en el estmago.
A diferencia de las anteriores, las penicilinas semisintticas incluyen diversas
penicilinas obtenidas al aadir qumicamente una gran variedad de cadenas
laterales al cido 6-APA.Penicillium chrysogenum puede sintetizar este cido si
el medio de cultivo carece de precursores de la cadena lateral. Sin embargo, la
produccin de 6-APA en estas condiciones es tan pequea que hace inviable este
procedimiento. La deacilacin qumica tampoco es rentable pues este proceso
comprende tres etapas que deben llevarse a cabo a baja temperatura y en
condiciones anhidras estrictas, requirindose adems varios solventes qumicos.
Por estas razones, la produccin industrial del 6-APA necesario para la
fabricacin de penicilinas semisintticas se realiza por deacilacin enzimtica de
la penicilina G. Este proceso biolgico se basa en la produccin por ciertas
bacterias de acilasas que eliminan el grupo bencilo. La deacilacin se realiza en
H2O a 37C, lo que reduce considerablemente los costes. Despus de la
deacilacin se obtiene una solucin de sales sdicas del cido fenilactico y 6APA. El fenilactico recuperado se puede utilizar posteriormente para la
produccin de penicilina G. Debido a sus mejores caractersticas (estabilidad a la
acidez, resistencia a -lactamasas, mayor espectro antimicrobiano), las
penicilinas semisintticas han llegado a ser extensamente utilizadas en terapia.
Aproximadamente el 38% de las penicilinas naturales producidas
comercialmente se utilizan en medicina humana, el 12% en veterinaria y el 43%
como material de partida para la produccin de penicilinas semisintticas.

2.- Biosntesis y regulacin

El anillo -lactmico-tiazolidnico de la penicilina se produce a partir de Lcistena y L-valina. La biosntesis se produce por medio de un dipptido
compuesto de cido L-a-aminoadpico (L--AAA) y L-cistena.
Subsecuentemente se conecta la L-valina mediante una reaccin de
epimerizacin, dando lugar a la formacin del tripptido d-(L--aminoadipil)-Lcisteinil-D-valina. El primer producto de la ciclacin del tripptido que puede ser
aislado es la isopenicilina N, pero no se conocen las reacciones bioqumicas que
conducen a este intermediario. La bencilpenicilina se produce en el intercambio
de L--AAA (L-a-aminoadpico) con cido fenilactico activado. El 6-APA, que
no es un producto intermediario de biosntesis, se excreta en ausencia de un
precursor de la cadena lateral.

Se conocen varios mecanismos reguladores en la biosntesis de la penicilina. El

aminocido lisina es sintetizado a partir de la va que origina el cido L-aminoadpico de forma que la penicilina y la lisina comparten una ruta
biosinttica ramificada comn. La lisina inhibe la sntesis de penicilina debido a
que inhibe por retroalimentacin a la homocitrato sintasa, un enzima implicado
en la sntesis de L--AAA. Si el L--AAA es deficiente, no puede sintetizarse
penicilina. Sin embargo, la retrorregulacin por lisina no parece ser una etapa
limitante en la biosntesis de penicilina. La biosntesis de penicilina se ve
afectada por la concentracin de fosfato y tambin muestra una clara represin
catablica, particularmente por glucosa.

3.- Desarrollo de cepas

La produccin de penicilina por la cepa aislada por Fleming era de
aproximadamente 2 u.i./ml; los procesos actuales producen un ttulo de penicilina
de aproximadamente 85.000 u.i./ml. Este es un aumento desde 0,0012 g/l hasta
50 g/l e ilustra bien el valor y el poder de un programa de seleccin de cepas.
La mejora del cultivo inicial se produjo en 1943 con el aislamiento de la
cepa Penicillium chrysogenum NRRL1951. Este microorganismo era ms
adecuado para la produccin en cultivo sumergido que la cepa
original, Penicillium notatum. Mediante posterior mutagnesis fu aislada la cepa
WisQ176, la cepa original de la lnea de cultivos Wisconsin. WisQ176 fu
adoptada por la mayor parte de los fabricantes de penicilina y fu utilizada como
cepa original en los distintos programas comerciales de mejora de cepas, acerca
de los que se ha publicado poco (secreto industrial). Si bien los aumentos de
rendimiento han sido el objetivo principal del desarrollo de las cepas, tambin
han sido optimizados otros factores que tienen un efecto sobre la fermentacin y
la eficiencia de recuperacin del producto.
Los principales avances en el procesamiento han sido obtenidos a travs
del screening emprico de mutantes. Hasta mitad de los aos 60 los mutgenos
utilizados ms frecuentemente eran los rayos X, mostaza
nitrogenada y radiaciones de longitud de onda corta. Ms recientemente han sido
utilizados como mutgenos la nitrosoguanidina, los agentes alquilantes y
losnitritos. A principios de los 70 la mejora de cepas por el mero uso de la
mutacin haba alcanzado su lmite. El descubrimiento de un ciclo parasexual
en Penicillium chrysogenumproporcion una forma de utilizar la recombinacin
gentica para el desarrollo de cepas. Se describieron diploides heterozigticos
que tenan ttulos de penicilina superiores a los de las cepas haploides parentales.

Sin embargo, el mayor porcentaje de cepas con produccin superior de penicilina

se produjo a partir de los haploides segregantes de los cruces entre mutantes de
diferentes lneas. La tcnica de fusin de protoplastos abri un nuevo enfoque en
el desarrollo de cepas de alta produccin obtenindose rendimientos del 8%
superiores a los obtenidos por mutacin y seleccin. Adems, algunas de las
cepas resultantes han tenido mejores caractersticas de crecimiento, como
esporulacin ms estable y mejor crecimiento para la produccin del inculo. El
uso de la ingeniera gentica para aumentar la sntesis de enzimas que catalizan
pasos limitantes, mediante la amplificacin gnica o mejora de la transcripcin,
no ha sido todava posible en Penicillium chrysogenum debido a la ausencia de
datos biosintticos precisos y a la ausencia de buenos sistemas vectorhospedador. Sin embargo, se ha construido un banco de genes para Penicillium
chrysogenum y se ha desarrollado un sistema de transformacin.

4.- Mtodos de produccin

La penicilina G y la penicilina V son producidas utilizando procesos sumergidos
en fermentadores de 40.000-200.000 litros. Debido a las dificultades en el
suministro de oxgeno no pueden ser empleados tanques mayores. La
fermentacin de penicilina es un proceso aerbico con una velocidad de
absorcin volumtrica de oxgeno de 0,4-0,8 mM/l min. La velocidad de
aireacin requerida est entre 0,5-1,0 vvm dependiendo de la cepa, del
biorreactor y del tipo de impulsor. Para el mezclado se suelen utilizar varios
impulsores de tipo turbina (120-150 rpm). El rango de temperatura ptima es de
25-27C.
Un esquema tpico de produccin de penicilina se muestra en la figura.
El inculo se inicia utilizando esporas liofilizadas. Debido a la gran variabilidad
de las cepas de alta produccin, es necesario el mantenimiento cuidadoso de las
cepas. La concentracin de esporas (ptima 5x103/ ml) y la formacin de
agregados son cruciales para el rendimiento subsecuente. Si se quiere conseguir
una velocidad ptima de formacin de penicilina, los agregados (pellets) no
deben crecer como bolas compactas sino de una forma suelta.
Despus de varias etapas de crecimiento est preparado el cultivo de produccin.
En la fermentacin tpica de penicilina existe una fase de crecimiento de c.a. 40h
con un tiempo de duplicacin de 6h, durante la cual se forma la mayor parte de la
masa celular. El suministro de oxgeno es crtico en el cultivo en crecimiento ya
que el aumento de la viscosidad dificulta la transferencia de oxgeno. Despus de
la fase de crecimiento, el cultivo llega a la fase real de produccin de penicilina.
Debido al aporte de distintos componentes al medio, la fase de produccin puede

extenderse hasta 120-160h.

El medio de un cultivo tpico alimentado puede variar dependiendo de la cepa, y
generalmente consiste en:
Lquido de maceracin de maiz (4-5% peso seco).
Una fuente de Nitrgeno adicional, harina de soja, extracto de levadura o suero.
Una fuente de carbono, lactosa.
Varios tampones
El pH se mantiene constante a 6,5.
El cido fenilactico o el fenoxiactico se alimentan continuamente como
precursores (0,5-0,8% del total).
Los procesos con alimentacin de glucosa o melazas tambin tienen xito. En
estos casos las velocidades de alimentacin son de 1.0-2.5 kg*m -3*h-1, con una
concentracin de glucosa de 500 kg*m-3.
Aproximadamente el 65% de la fuente de carbono metabolizada se utiliza para el
mantenimiento energtico, el 25% para el crecimiento y slo el 10% para la
produccin de penicilina.
Se ha intentado la produccin de penicilina por fermentacin continua, pero ha
sido difcil debido a la inestabilidad de las cepas de produccin. Como alternativa
se ha sugerido un sistema de "tanque de llenar y sacar". En este procedimiento el
20-40% del contenido de la fermentacin se saca y se reemplaza con solucin
fresca de nutrientes; este proceso puede ser repetido hasta diez veces sin
reduccin del rendimiento.
Se est llevando a cabo una intensa investigacin para producir penicilina
con clulas inmovilizadas. En un estudio a escala de laboratorio se demostr la
ventaja de este enfoque sobre el uso de sistemas discontinuos alimentados, pero
esta tcnica no ha sido introducida todava a nivel comercial.
La penicilina es excretada al medio y menos del 1% permanece unida al micelio.
Despus de la separacin del micelio, la recuperacin del producto se lleva a
cabo por medio de dos etapas de extraccin continua en contracorriente del caldo
de fermentacin con acetato de amilo o de butilo a 0-3C y pH: 2,5-3,0. El
rendimiento es de alrededor del 90%.