You are on page 1of 53

I.

Introduccin
En Michoacn, la ganadera ocupa el segundo lugar en importancia dentro del
sector agropecuario, slo despus de la agricultura, por lo que es considerada
como uno de los pilares de la economa familiar y base socio-cultural de la
poblacin campesina, lo cual se refleja en el elevado nmero de productores
ganaderos registrados, quienes hasta la fecha suman ms de 60,000. Dentro de la
actividad ganadera bovina destaca la lechera familiar como una de las actividades
ms importantes en algunas regiones del estado, principalmente en la
denominada cuenca lechera de La Cinega de Chapala, Michoacn (Ruiz, 2007).
En esta cuenca se le ha dado valor agregado a la leche, mediante la produccin
de yogurt, rompope, cajeta y la produccin de quesos regionales (Cotija, Ranchero
y Adobera); siendo estas actividades, algunos de los principales canales de
comercializacin de la leche (Snchez y Snchez, 2006).
Sin embargo, al igual que todas las actividades de origen pecuario, la produccin
lechera est expuesta a una serie de problemticas que traen como consecuencia
generalizada rezagos en la produccin. En este sentido, la mastitis bovina
(definida como la inflamacin de la glndula mamaria) es un problema
epidemiolgico importante, ya que esta enfermedad infecciosa afecta el
funcionamiento de la ubre, provocando reduccin en el volumen de produccin de
la leche; adems de la alteracin de su sabor y composicin nutrimental, lo que
finalmente afecta su calidad (Pinzn, 1989).
Esta enfermedad puede manifestarse en formas diversas segn su severidad. Una
de ellas es la mastitis subclnica, en la cual no hay inflamacin de la glndula
mamaria, ni cambios macroscpicos de la leche; no obstante, se afecta la calidad
de la misma. Este tipo de mastitis slo se detecta por pruebas especiales como la
prueba de California o CMT (por sus siglas en ingls California Mastitis Test). La
mastitis clnica, en cambio, presenta alteraciones evidentes, tanto de la glndula
mamaria, como de la leche, por lo que su produccin disminuye. Las
manifestaciones van desde la presencia de grumos y cogulos en la leche, hasta
una marcada inflamacin de los cuartos afectados, sensibilidad al tacto, debilidad
1

del animal, depresin y prdida de apetito, por lo que el productor puede


detectarla (Mateus, 1983).
La mastitis es ocasionada por mltiples factores; no obstante, destaca la
ocasionada por factores biticos, principalmente microorganismos pertenecientes
al grupo de las bacterias Gram positivas como Staphylococcus aureus y
Streptococcus agalactiae. Por otra parte, aunque tienen menor importancia,
sobresalen algunas bacterias Gram negativas como Escherichia coli y Klebsiella
pneumonie, las cuales estn incrementando su prevalencia. Finalmente, existen
otras bacterias menos frecuentes como causa primaria; por ejemplo, Bacillus
cereus,

Clostridium

perfringens,

Salmonella

sp.,

Listeria

monocytogenes,

Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, entre otras (Morales, 2011).


S. aureus es uno de los principales agentes patgenos causantes de la mastitis
bovina, debido a que posee diferentes factores de patogenicidad (factor
aglutinante, coagulasa, DNAsa, hemolisina, etc), los cuales causan la enfermedad
en la glndula. Dado el alto grado de supervivencia e internalizacin de esta
bacteria, los cuartos infectados de la ubre juegan un papel decisivo en la
trasmisin de la infeccin entre los animales del hato lechero (Wolter, Castaeda,
Kloppert, y Zschoeck, 2002).
El municipio de Venustiano Carranza se encuentra ubicado en la cuenca lechera
de La Cinega de Chapala, Michoacn, en donde la produccin de ganado bovino
lechero es una de las principales actividades econmicas; no obstante, la mastitis
es un problema epidemiolgico importante, ya que algunos autores como Carrin
(2002), Eulloque (2012) y Flores (2013), han reportado la prevalencia de la
enfermedad, adems de las prdidas econmicas que sta ocasiona. Sin
embargo, no existe informacin sobre las bacterias prevalecientes, por ejemplo S.
aureus, ni de sus caractersticas biolgicas, como la resistencia a antibiticos, lo
cual es esencial para el planteamiento y puesta en marcha de estrategias de
manejo integral de la enfermedad.

Por lo anterior, en el presente trabajo de investigacin se plante realizar el


aislamiento y la caracterizacin parcial de aislados de S. aureus asociados a
vacas con mastitis clnica y subclnica del municipio de Venustiano Carranza,
Michoacn.

II. Antecedentes
2.1. Importancia de la ganadera bovina lechera en el estado de
Michoacn y problemticas de salud animal
La ganadera bovina del estado de Michoacn fue de las primeras en establecerse
en el pas en el ao de 1567, prcticamente despus de la conquista de
Tenochtitlan. Esta actividad comenz cuando el gobierno de la Colonia otorg
concesiones de tierra a familias de espaoles para la cra de ganado bovino y
caballar en la regin noroeste del Estado (Barragn, 1990). A partir de entonces,
surgi la primera semilla que sirvi para la expansin de la ganadera en el estado,
incluyendo La Cinega de Chapala, en la que numerosas familias de rancheros
conformaron un sistema de vida con cultura propia, compartiendo el predominio de
la empresa familiar, a travs de la diversificacin productiva y la flexibilidad de las
unidades de produccin (Ruiz, 2007).
Desde aquellos tiempos, hasta el ao de 1950, la produccin de leche de ganado
bovino adquiri mayor importancia para la poblacin y para los pequeos y
grandes productores, quienes la posicionaron como la actividad primaria de la
regin, lo que permiti el nacimiento de una de las principales cuencas lecheras
del estado (Bello, 2009). La cuenca lechera de La Cinega de Chapala,
Michoacn se localiza en la zona noroeste del estado, en los lmites con Jalisco.
Esta cuenca comprende toda el rea de influencia de los Distritos de Riego (DDR)
089 (Venustiano Carranza, Villamar, Jiquilpan, Pajacuarn, Cojumatln de
Rgules, Briseas, Vista Hermosa, Sahuayo y Marcos Castellanos); 088 Zamora
(Ixtln, Chavinda, Tangamandapio, Cotija, Tingindn, Jacona, Tanganccuaro y
Chilchota); y 090 (Tanhuato, La Piedad) (Figura 1) (Ruiz, 2007).
De 1950 a la actualidad, la mayor parte de la ganadera destinada a la produccin
de leche se caracteriza por ser un sistema de produccin familiar, en donde el
principal ingreso lo representa la venta de leche caliente por boteros, quienes
se encargan de su comercializacin en las localidades cercanas a los centros de
produccin. Asimismo, esta actividad reviste gran importancia para el desarrollo de
4

la entidad, ya que esta zona se considera como la puerta de ingreso para la


comercializacin de productos y subproductos de origen animal hacia los centros
de consumo del occidente del pas, como la leche pasteurizada, produccin de
quesos, crema, yogurt, etc. (Carrin, 2002). Sin embargo, es importante destacar
que la esta leche comercializada se obtiene bajo condiciones de higiene
deficiente, a travs de ordea manual (Figura 2) (Snchez y Solorio, 2004).

Figura 1. Ubicacin de los municipios que conforman la cuenca lechera de


La Cinega de Chapala.

Estos aspectos de higiene insuficiente y malas prcticas de ordeo determinan la


prevalencia de enfermedades infecciosas y parasitarias en el ganado bovino con
tasas de incidencia elevadas que impactan negativamente el volumen y calidad de
la leche producida, as como la viabilidad de cuartos productivos, la tasa de
segregacin de vacas en produccin, los costos asociados al tratamiento de
animales enfermos, e inclusive el inventario animal por la muerte, o por la
eliminacin temprana de vacas afectadas (Snchez y Solorio, 2004).

Figura 2. Ordea manual por un productor lechero.


Dichas enfermedades han sido reportadas mediante diagnsticos clnicos y de
laboratorio, entre las que destacan las parasitosis internas (coccidiosis,
tripanosomiasis, anaplasmosis, piroplasmosis) y externas (gusaneras, garrapatas).
Por

otro

lado,

entre

las

enfermedades

infecciosas

resalta

la

diarrea,

neumoenteritis, fiebre aftosa, estomatitis vesicular, brucelosis, septicemia


hemorrgica, tuberculosis, mastitis y otras, siendo esta ltima una de las de mayor
prevalencia en el mundo y de las ms costosas (Gonzalo, 1985).
2.2. Caractersticas de la mastitis bovina
La mastitis es una enfermedad altamente prevalente en el ganado bovino lechero
de todo el mundo y es una de las principales causas de prdidas econmicas
dentro de un hato, ya que disminuye la produccin de leche hasta un 70% y
genera mayores costos por la leche descartada debido a tratamientos con
antibiticos y otros costos veterinarios (Bedolla, 2004; Pinzn, Moreno y
Rodrguez, 2007). De forma general, se estima que entre el 15 y 20% de las vacas
de un hato lechero estn afectadas por alguna forma de mastitis en uno o ms
cuartos (Philpot y Nickerson, 1992).

Adems, la enfermedad representa el 26.5% de los sacrificios de vacas lecheras


en el continente americano (Wolter, y otros, 2002). La mastitis bovina es la
inflamacin de la glndula mamaria y sus tejidos secretores, se presenta como
respuesta a la invasin por microorganismos patgenos y se caracteriza por daos
en el epitelio glandular, produciendo a su vez alteraciones fsicas y qumicas en la
leche, como reduccin de fsforo, calcio, protena y grasa, y un aumento en el
nmero de clulas somticas (Caldern y Rodrguez, 2008).
La mastitis es una enfermedad que se genera cuando hay una interaccin
favorable de los factores que disminuyen la resistencia natural de la ubre y le
permiten a un agente patgeno infectarla, entre los cuales se encuentran los
siguientes:
a) Dao en los pezones. Si el canal del pezn se lesiona, literalmente se abre
la puerta a la invasin por patgenos. Este canal puede lesionarse debido a
un manejo deficiente que cause heridas en los pezones o por una ordea
muy brusca (defectos tcnicos en el aparato de ordea, o un mal ordeo
manual).
b) Elevada presencia de microorganismos. Los ambientes con elevadas
concentraciones de bacterias hacen que sean mayores las posibilidades de
infeccin de la ubre. Este problema puede ser causado por un ambiente
antihiginico en el establo (pisos y superficies, las bacterias se reproducen
mejor en medios hmedos y clidos), o durante la ordea (manos del
ordeador) (Figura 3).
c) Deficiencias en la alimentacin. El ganado bovino es ms vulnerable a
enfermedades cuando no se le proporciona una alimentacin adecuada y
presentan una deficiencia de vitaminas y minerales.
d) Factores estresantes. Cualquier tipo de estrs puede ser daino a la larga y
debilitar el sistema inmune del animal; por ejemplo, una sobrepoblacin de
vacas en el establo, cambiar frecuentemente el personal, entre otros
(Wolter, y otros, 2002).

Figura 3. Las manos, principales fuentes de microbios en ordeos


tradicionales (FAO, 2010).
Cuando no se tienen medidas preventivas contra estos factores, la incidencia de la
enfermedad aumenta y es ms probable que el animal sea infectado. La invasin
del canal se presenta durante la ordea, cuando los organismos presentes en la
leche o en la punta del pezn son impulsados dentro del canal y de la cisterna,
debido a la entrada de aire en la unidad del ordeo, hasta llegar a los conductos
lcteos y espacios alveolares, produciendo cicatrices e inflamacin (Figura 4)
(Agrobit Gestin Agropecuaria, 2004).

Cicatriz

Bacterias
Leucocito
Sangre
Cicatriz

Figura 4. Mecanismo de infeccin de la glndula mamaria (Alta, 2012).

El curso de esta enfermedad es muy variado, definindose dos formas principales


de infeccin conocidas como mastitis clnica y subclnica (Novoa, 2003). En casos
de mastitis clnica, el cuarto infectado se inflama (Figura 5), hay dolor al tacto, la
leche se encuentra visiblemente alterada por la presencia de cogulos,
descamaciones o sueros descoloridos y algunas veces sangre en la leche. En
contraste, la mastitis subclnica es sutil y ms difcil de corregir, ya que la vaca
parece saludable, la ubre no muestra ningn signo de inflamacin y la leche
parece ser normal. Pero, a pesar de ello, los microorganismos y las clulas
somticas que combaten las infecciones se encuentran presentes en gran nmero
en la leche (Wattiaux, 2002).

Figura 5. Vaca con glndula mamaria inflamada a causa de mastitis clnica


(Bahena, 2007).
Las clulas somticas, en este caso clulas epiteliales e inmunes (neutrfilos
polimorfonucleares, granulocitos, macrfagos, linfocitos), participan en la defensa
contra infecciones de la ubre. Cuando hay estmulos o patgenos de la glndula
mamaria, sta manda una respuesta inmunitaria mediante glbulos blancos para
neutralizar a las bacterias invasoras. Los glbulos blancos son en esencia lo que
constituye los conteos de clulas somticas, por lo que un alto contenido significa
que las bacterias han invadido la ubre, lo que es un indicativo de la presencia de
mastitis (Wattiaux, 1999).
9

2.2.1. Diagnstico de la mastitis bovina


Actualmente, el conteo de clulas somticas es ampliamente aceptado como
mtodo clsico para monitorear el estado de salud de la glndula mamaria, en
donde menores conteos de clulas somticas estn asociados a un menor grado
de infeccin e inflamacin, mayor produccin de leche, mayores porcentajes de
grasa y casena, mayor produccin de queso, leche ms segura (menos
contaminada) y una mejor conservacin de los productos lcteos (Monardes y
Barria, 1995).
La CMT o prueba de california de mastitis, es una prueba rpida y sencilla
indicadora de clulas somticas en la leche, con el fundamento de que a mayor
inflamacin de la ubre, mayor contenido de estas clulas en la leche. El reactivo
(Diagmastin) usado en esta prueba, se compone de un detergente (Alquil-AriSulfonato) y un indicador de pH (prpura de bromocresol), que cuando se mezcla
con la leche, el mayor o menor contenido de clulas en la leche determina mayor o
menor viscosidad de la mezcla, ya que el reactivo lisa las clulas y deja salir el
ADN fuera de la membrana celular y forma un gel viscoso. El cambio de color de
la mezcla indica la variacin del pH de ligeramente cido a alcalino y por lo tanto el
nivel de inflamacin (Ferraro, Scaramelli y Troya, 1999; Talavera, 2009).
La estimacin de las clulas somticas con la CMT puede ser la base para
comenzar con un buen diagnstico de mastitis en los hatos lecheros. Posterior a
esto, es importante establecer un esquema de monitoreo que permita el
diagnstico y control de la enfermedad. Es decir, llevar a cabo un manejo
adecuado de los animales, especialmente durante el ordeo, condiciones
ambientales apropiadas, funcionamiento adecuado del equipo de ordeo y buenas
prcticas de ordea manual. Todo esto puede ser posible realizando un
diagnstico integral en los hatos, llevando a cabo un monitoreo permanente con
pruebas de campo y laboratorio (identificacin del microorganismo causante,
tratamiento a aplicar y respuesta esperada en un tiempo dado) (Acua y
Rivadeneira, 2008).
10

Una parte importante del monitoreo permanente incluye tambin el reconocimiento


de los elementos bsicos de un proceso inflamatorio de origen infeccioso
(alteraciones fsicas en el animal y en qumicas la leche) y en el aislamiento de
uno o varios agentes etiolgico que colonizan la glndula mamaria (Velsquez,
2012). Observar los primeros chorros de leche, permite al ordeador la deteccin
de leche anormal que debe ser retirada del consumo. Esta leche puede mostrar
decoloracin, descamaciones o cogulos, si esto sucede, al remover esta leche
contaminada de la ubre se debe evitar salpicar las patas, cola o ubre del animal.
As mismo, el operador no debe recolectar estos primeros chorros de leche en la
palma de su mano debido al riesgo de realizar una transferencia de bacterias de
un cuarto a otro y de una vaca a otra (Wattiaux, 2002).
Cuando la leche presenta anormalidades es importante comenzar con el
monitoreo de mastitis. Los casos de mastitis clnica resultan ms fciles de
reconocer debido a las evidentes alteraciones que ocurren en la glndula mamaria
y su secrecin. Al hacer una inspeccin en la ubre puede revelarse un
engrosamiento o estrechamiento (cambios en el grosor del epitelio) de algunos de
los cuartos, alteraciones de la piel, pezones y lesiones traumticas, las cuales
causan trastornos en la emisin de la leche. Si la inflamacin es aguda, el cuarto
correspondiente aparece aumentado de tamao, es doloroso y muestra
enrojecimiento con elevacin de temperatura (considerando temperatura elevada
a partir de 39 C). Segn la gravedad de la mastitis, el valor del pH de la leche
vara de normal (6.6) a alcalino (8.8). Estas alteraciones pueden ser detectadas
con un papel indicador de pH (Kleinschroth, Rabold y Deneke, 1991; Acua y
Rivadeneira, 2008).
2.3. Agentes patgenos causantes de mastitis bovina
Si bien existen causas no infecciosas que pueden desencadenar los mecanismos
que caracterizan una respuesta inflamatoria, el 80% de los casos de mastitis son
ocasionados por agentes patgenos. Una gran variedad de microorganismos han
sido involucrados como agentes causales de mastitis bovina, los cuales de
acuerdo a su habitad, interaccin con el pezn, con el canal del pezn y
11

patogenicidad, se clasifican en contagiosos y ambientales (Porporatto y Felipe,


2010).
Los principales microorganismos contagiosos son: S. aureus, Streptococcus
agalactiae, Corynebacterium bovis y Mycoplasma spp., cuyos reservorios estn en
la glndula mamaria y en la leche de las vacas infectadas. Su transmisin puede
ocurrir en el momento de la ordea por el uso compartido de toallas para lavar y
secar las ubres; por medio de las manos contaminadas de los ordeadores; y por
el uso de pezoneras no desinfectadas compartidas entre varios animales durante
los ordeos mecnicos. Por otra parte, los microorganismos ambientales son: E.
coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Pseudomonas spp., Proteus
spp., Streptococcus uberis y Streptococcus dysgalactiae, cuyo reservorio principal
se encuentra en los alrededores del establo, incluyendo materia fecal, suelo, agua,
alimentos ensilados, corrales y material vegetal. Su distribucin y sus posibilidades
de alcanzar el tejido glandular aumentan en condiciones de mala higiene, con
ordeos realizados en ubres hmedas, uso de esponjas sucias y camas
inadecuadas (Caldern y Rodrguez, 2008; Porporatto y Felipe, 2010).
Streptococcus agalactiae era considerado el mayor agente etiolgico, pero se ha
logrado reducir su incidencia mediante tcnicas de prevencin, control y
tratamiento, incluyendo medidas profilcticas y de higiene (Fox, Bayles, y Bohach,
2001). No obstante, en la ltima dcada, el patgeno contagioso ms importante
de mastitis a nivel mundial es S. aureus, cuya infeccin puede convertirse en
crnica y permanente durante toda la vida del animal (Hogan y Smith, 2003).
2.4. Caractersticas de S. aureus
El gnero Staphylococcus se compone de 35 especies y 17 subespecies
conocidas y se ha clasificado tradicionalmente en la familia Micrococcaceae. Se
describen como bacterias en forma de cocos de 0.5 a 1.5 m de dimetro, se
presentan sueltos, en parejas, en pequeas cadenas (de 3 o 4 clulas) y,
principalmente, en grupos irregulares en forma de racimos de uva. Son anaerobios
facultativos,

positivos

catalasa,

generalmente

oxidasa

negativos,

no
12

esporulados, inmviles y generalmente no forman cpsulas (Vadillo, Priz, y


Mateos, 2002). Son bacterias productoras de enterotoxinas termoestables, estn
ampliamente distribuidas en el medio ambiente y se presentan en la mucosa de
los animales y personas, transmitindose al ser humano a travs de alimentos
contaminados, generndole una toxiinfeccin alimentaria (Elika, 2013). Otra
caracterstica importante es que muchas de las cepas de S. aureus aisladas de
leche de vacas con mastitis, son resistentes a la penicilina, ya que se han
realizado tratamientos con infusiones intramamarias con este antibitico y no han
sido efectivos (Mateus, 1983).
Una de las caractersticas que distingue a S. aureus de las dems bacterias que
integran su gnero es la produccin de carotenoides, lo cual le da un color amarillo
dorado caracterstico, de ah su nombre estafilococo dorado o aureus, que deriva
del latn oro. S. aureus es un microorganismo que crece a una temperatura entre
6 y 46C, con el ptimo entre 30 y 37 C, adems de que es muy resistente a la
desecacin y tiene la capacidad de crecer en medios con elevada salinidad (NaCl
7.5%). As mismo, crece bien en medios de cultivo no selectivos, como Agar
sangre, Agar chocolate o Agar infusin cerebro-corazn. Esta es una bacteria
productora de catalasa (lo que la hace resistente a condiciones ambientales
adversas), la cual descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y
oxgeno. De esta manera, la bacteria se protege del efecto txico del H2O2, que es
un producto final del metabolismo aerbico de los azcares (Seija, 2008).
De manera estructural, como en todas las Gram positivas, la pared de S. aureus
est formada por una gruesa capa de peptidoglucano, a la que estn unidas
molculas de protenas y otros compuestos. Tambin produce cidos teicoicos,
polmeros de ribitol fosfato con sustituyentes de D-alanina y N-acetil glucosamina.
Son antgenos especficos de especie, lo que quiere decir que son compuestos
caractersticos de esta especie de bacteria. La membrana celular es de una
estructura trilaminar convencional, cuya capa ms externa est parcialmente
sustituida por cidos lipoteicoicos. Estos compuestos son similares a los cidos
teicoicos; es decir, polmeros de glicerol fosfato, que estn unidos por un puente
13

disacrido a un glicolpido, mientras ste constituye la unin a la membrana, el


polmero penetra en la pared y la atraviesa sobresaliendo en la superficie. En la
patogenia podra cumplir un papel de adherencia (Chans, 2002).
Desde el punto de vista de sus factores de virulencia, tanto bioqumicos como
estructurales, se le puede definir como un patgeno perfecto, magnficamente
equipado para colonizar, invadir, diseminarse y causar enfermedades graves. No
obstante, normalmente convive en armona con el husped humano o animal,
formando parte de su flora sin causar dao. Inclusive en algunos casos se
encuentran personas sanas colonizadas, definindose como portadores y
pudiendo en ocasiones ser reservorio y fuente de infeccin. El principal reservorio
en humanos es a nivel nasofaringeo y en zonas hmedas como pliegues
inguinales y axilas, lo que facilita el contagio si no hay medidas de higiene
correctas (Chans, 2002).
S. aureus es el agente causal de muchas infecciones oportunistas en los humanos
y animales, infecciones de gran importancia en la medicina veterinaria y humana
(Yugueros, Cascn, Snchez, Hernanz, Surez, Smeltzer, y Naharro, 1999). El
hombre puede infectarse mediante el consumo de leche contaminada, causando
un cuadro txico, con sntomas de intoxicacin alimentaria, sndrome de choque
txico, septicemia y endocarditis (Zschck, Botzler, Blcher, y Sommerhauser,
2000).
La mayora de las cepas de S. aureus estn recubiertas uniformemente por una
protena, denominada protena A, la cual se utiliza para una prueba especfica de
aglutinacin con anticuerpos monoclonales para su identificacin. Otra protena
asociada a la pared celular es la coagulasa, que puede encontrarse ligada a la
clula (coagulasa ligada o clumping factor) o de forma libre en el medio (coagulasa
libre). La coagulasa ligada es capaz de convertir directamente el fibringeno en
fibrina, produciendo la coagulacin del plasma. La deteccin de la protena A, el
clumping factor, o la coagulasa libre, son factores que ayudan a la identificacin de
S. aureus (Pahissa, 2009).
14

En el caso de la mastitis, esta bacteria puede contaminar la piel del pezn, las
manos del ordeador y el equipo de ordeo, pero se aloja dentro de la glndula
mamaria (especialmente si hay lesiones cerca de la punta de la misma), por lo que
la mastitis puede persistir durante varias lactancias, durante las cuales el tejido
normal de las ubres es reemplazado progresivamente por tejido fibrtico o
cicatrizal; el cual impide que los medicamentos penetren en los lugares infectados,
haciendo que el tratamiento sea ineficaz y la produccin de leche sea cada vez
menor (Mateus, 1983).
2.4.1. Mtodos de caracterizacin de S. aureus
Los esquemas tradicionales de identificacin fenotpica bacteriana se basan en
sus caractersticas observables como su morfologa, desarrollo, propiedades
bioqumicas y metablicas (Bou, Fernndez, Garca, Sez, y Valdezate, 2011).
Tras 24 horas de incubacin, S. aureus crece formando colonias lisas, elevadas,
brillantes y de borde enteros. En Agar sangre, casi todas las cepas tienen un halo
de -hemlisis o hemlisis completa alrededor de la colonia; no obstante, el medio
selectivo ms empleado para aislarla es el medio Agar de Sal y Manitol, que por
su elevado contenido de sal inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias
Gram negativas. Adems, este medio contiene un indicador de pH a base de rojo
fenol, el cual permite realizar una identificacin presuntiva basndose en el viraje
de color del rojo al amarillo, que indica que hubo produccin de cido, debido a la
fermentacin de manitol por las colonias de S. aureus. Este indicador color rojo
tiene un pH de 8.2 y cuando cambia a amarillo est por debajo de 6.8 (Figura 6A)
(Pahissa, 2009).
Otro medio de cultivo selectivo es el Agar Baird Parker, el cual contiene peptona,
extracto de carne y levadura que participan como la fuente de carbono, azufre,
nitrgeno, vitaminas y minerales. El piruvato de sodio y la glicina estimulan
selectivamente

el

crecimiento

de

Staphylococcus

coagulasa

positivos,

principalmente S. aureus. El cloruro de litio y telurito actan como inhibidores de


microorganismos contaminantes, adems de que la reduccin de telurito a teluro
producida por esta bacteria, hace que las colonias se desarrollen de un color
15

negro. As mismo, las colonias presentan dos caractersticas: liplisis y protelisis,


por lo que la yema de huevo se usa para evidenciar la accin bacteriana sobre la
lecitina y sobre la lipovitelina (lipoprotena), siendo tambin responsable de la
opacidad del medio.

Estas actividades hacen

que se observen

halos

caractersticos con un anillo opaco dentro del mismo, por el contenido de yema de
huevo (Figura 6B) (Dibico, 2010).

Figura 6. A) S. aureus en Agar de Sal y Manitol. B) S. aureus en Agar Baird


Parker.
S. aureus ha mostrado repetidamente su habilidad para desarrollar rpidamente
resistencia a los antibiticos. La resistencia a penicilina es una de las ms
estudiadas, ya que es uno de los antibiticos de mayor uso en terapias contra la
mastitis. Se han encontrado entre un 40 y 50% de cepas resistentes a este
antibitico (Calvinho, 2007).
2.5. Ensayo de susceptibilidad a antibiticos y resistencia bacteriana
Los antibiticos usados en el tratamiento de la mastitis son una preocupacin
industrial y de salud pblica importante, ya que la presencia de residuos de
antibiticos en la leche interfiere con el proceso de fabricacin de muchos
16

productos lcteos (quesos y otros productos fermentados), adems de que puede


causar problemas de salud en los consumidores (Snchez, 2005). Dentro de los
problemas de salud pblica destacan las alergias, la toxicidad y las infecciones
recurrentes por la resistencia bacteriana. Los problemas alrgicos son conocidos y
afectan a la poblacin susceptible (consumidores de leche bronca o sin
pasteurizar, principalmente). En general las bajas concentraciones de antibiticos
alergnicos (por ejemplo, los beta lactmicos) no son suficientes para causar un
efecto en pacientes sensibles (aunque puede haber excepciones), pero s para
desencadenar reacciones que en general, no son graves, aunque, eventualmente,
pueden llegar a serlo (anafilaxia) (FAO, 2004).
Los problemas toxicolgicos, por su parte, son bastantes difciles de probar, dadas
las bajas concentraciones residuales de estos antibiticos. En cambio, la
resistencia

bacteriana,

es

un

problema

gravsimo

que

representa

una

preocupacin mundial. Esta resistencia puede, por supuesto, dar lugar a fallos
teraputicos en tratamientos veterinarios, y al riesgo de transferencia de bacterias
resistentes de los animales al hombre, o de genes portadores de informacin que
codifican resistencia, de bacterias de animales a bacterias humanas (FAO, 2004).
A lo largo de los aos, S. aureus ha desarrollado mltiples mecanismos de
resistencia a los antimicrobianos y, aunque actualmente su resistencia a la
meticilina constituye el principal problema teraputico, se han descrito aislados
con resistencia frente a todos los antimicrobianos utilizados para el tratamiento de
la infeccin estafiloccica. En esta bacteria, la evolucin de la resistencia se ha
producido de forma lenta y continuada, desde la deteccin de los primeros
aislados con resistencia a la penicilina en 1944, hasta las ms recientes
descripciones de aislados con resistencia a vancomicina a partir de 2002, e
incluso de aislados resistente a nuevos antimicrobianos como el linezolid o la
daptomicina (Cercenado, 2006).
Las pruebas de susceptibilidad in vitro pueden ser cuantitativas (se mide la mnima
concentracin capaz de inhibir el desarrollo de las bacterias) o semicuantitativas
(se mide si las cepas son resistentes o sensible segn los halos de inhibicin que
17

producen en una placa de agar). Para propsitos prcticos, las pruebas


semicuantitativas de difusin en agar proporcionan la informacin suficiente para
servir de gua en el tratamiento (Barry y Thornsberry, 1985). Las combinaciones
de antimicrobianos que tienen los multidiscos Gram positivos, Gram negativos y
multidiscos combinados, incluyen, tanto los antibiticos que han sido usados hace
algunos aos y cuya utilidad permanece vigente (penicilina, ampicilina,
gentamicina), como antibiticos de reciente introduccin (ceftriaxona, ceftazidima,
cefuroxima, pefloxacina, enoxacina y netilmicina). Esta prueba se fundamenta en
que al colocar un disco impregnado con determinada cantidad de antimicrobiano
sobre un medio slido inoculado con bacterias, el antibitico se difundir
formndose un gradiente de concentracin, el cual inhibir o permitir el
crecimiento del microorganismo. Las cepas se clasificarn en resistentes (R),
intermedias (I) y susceptibles (S), dependiendo del dimetro de inhibicin
(Snchez, 2005).
Las bacterias pueden presentar resistencia a antibiticos como resultado de
mutaciones cromosomales o por intercambio de material gentico, mediante el
transporte de genes de resistencia a travs de varios mecanismos como los
siguientes:
a) Transduccin: transferencia de cualquier parte de un genoma bacteriano,
cuando un fago atemperado (bacterifago cuyo genoma se ha incorporado
a la bacteria husped) durante su fase de ensamblaje, encapsula este
material. Si el fragmento de ADN que queda envuelto es totalmente
bacteriano se denomina transduccin generalizada y si slo se encapsula
parte del genoma bacteriano, pero se conserva el genoma viral, se habla de
transduccin especializada.
b) Conjugacin: transferencia de material gentico contenido en plsmidos, de
una bacteria a otra, a travs de un pili sexual; estos plsmidos usualmente
contienen genes que le confieren resistencia a antibiticos, antispticos y
desinfectantes.

18

c) Transformacin: transferencia de genes desde un ADN desnudo de una


bacteria previamente lisada, a otra que lo recibe y lo incorpora a su
genoma.
d) Transposicin: movimiento de una seccin de ADN (transposn) que puede
contener genes para la resistencia a diferentes antibiticos y otros genes
cassette unidos en equipo, bajo la expresin de un promotor en particular
(Cabrera, Gmez y Ziga, 2007).
Estos fenmenos de transferencia gentica y la aparicin de bacterias mutantes,
han dado lugar a nuevas cepas resistentes a uno o varios agentes
antimicrobianos, lo que lleva a la necesidad de conocer el patrn de
susceptibilidad de las cepas aisladas en los casos clnicos frente a los
antimicrobianos disponibles, teniendo en consideracin que tal patrn vara
ampliamente, dependiendo del gnero, la especie y aun del sitio donde se asla el
microorganismo. Entre los grupos de bacterias que presentan patrones variables
de susceptibilidad se encuentran las enterobacterias, bacilos Gram negativos no
fermentadores de carbohidratos, estafilococos, enterococos y bacterias del gnero
Pseudomonas (Snchez, 2005).
2.6. Importancia de la caracterizacin bacteriolgica de la mastitis
bovina en el municipio de Venustiano Carranza, Michoacn
El mejoramiento de la calidad de produccin lechera en todos los hatos debe ser
una labor y compromiso que empieza desde el primer eslabn de la cadena de
produccin. Mediante campaas educativas enfocadas a productores, basadas en
el conocimiento del problema de la mastitis, se podra disminuir su prevalencia en
los hatos. Pero, para conocer el problema hay que estudiarlo y una parte
importante de este estudio es saber cules son los agentes etiolgicos
comprometidos en la aparicin de la enfermedad y su prevalencia, para elaborar
los programas de control y prevencin.
En el municipio de Venustiano Carranza, Michoacn, se han documentado casos
de mastitis bovina, pero hasta el momento, no hay ningn reporte, en lo que a
19

estudios epidemiolgicos se refiere, sobre cules son los principales agentes


causantes de la enfermedad; por ejemplo, el patgeno prevaleciente a nivel
mundial, S. aureus; ni cul es el perfil de resistencia que estos agentes presentan
a los antibiticos que generalmente se usan para combatir la enfermedad. Por lo
anterior, es importante realizar la caracterizacin de las bacterias asociadas a la
mastitis en los hatos del municipio, lo cual podra dar la pauta para realizar un
programa de prevencin y control eficiente de la enfermedad.

20

III. Hiptesis
La bacteria Gram positiva S. aureus est presente en la leche de vacas con
mastitis, proveniente del municipio de Venustiano Carranza, Michoacn.

IV. Objetivos

4.1. Objetivo general

Realizar el aislamiento y la caracterizacin parcial de S. aureus asociados a


la leche de vacas con mastitis provenientes del municipio de Venustiano
Carranza, Michoacn.

4.2. Objetivos especficos

Realizar visitas a los establos lecheros del municipio y aplicar la prueba de


California a vacas en ordea.

Determinar la prevalencia de la enfermedad y tomar muestras de leche de


las vacas enfermas de mastitis.

Aislar bacterias a partir de la leche de vacas con mastitis.

Realizar la identificacin parcial de los aislados de S. aureus asociados a la


enfermedad, mediante pruebas bioqumicas.

Obtener el patrn de resistencia a antibiticos de los aislados de S. aureus.

21

V. Materiales y mtodos
5.1. Prueba de California (CMT) y toma de muestras
Se realizaron visitas a los hatos lecheros del municipio de Venustiano Carranza y
se aplic una prueba de deteccin de la mastitis, la cual se realiz mediante la
CMT (se utiliz el producto Diagmastin de la marca Sanfer, cuyo ingrediente
activo es el Alquil-Aril-Sulfonato) (Figura 7A). Para esto, se tom una muestra de
leche (de 3 a 5 ml) de cada cuarto bajo condiciones de asepsia, misma que fue
colocada en una paleta de plstico limpia, que contena cuatro pozos
correspondientes a los cuartos del animal (Figura 7B). Posteriormente, a cada
muestra se le aadi lentamente un volumen aproximadamente igual del reactivo
(proporcin 1:1). Despus, mediante movimientos circulares, se mezcl la leche
con el reactivo por un espacio de 10 a 15 segundos (Mellenberger y Roth, 2000).

Figura 7. A) Reactivo Diagmastin para la CMT. B) Paleta de recoleccin de


leche.
Los resultados se interpretaron de acuerdo a los datos del fabricante de la
siguiente manera: Negativo (-), la mezcla permanece lquida y sin formacin de
22

precipitados (50,000-200,000 clulas somticas por centmetro cbico). Dbil


positivo o sospechoso (+/-), se observa la formacin de un precipitado, pero sin la
tendencia a formar un gel, si se mantiene el movimiento de rotacin, el precipitado
puede desaparecer (200,000-400,000 clulas somticas por centmetro cbico).
Positivo y fuerte positivo (+), la mezcla se espesa inmediatamente con tendencia a
la formacin de un gel, que tiende a adherirse al fondo del pozo (arriba de 500,000
clulas somticas por centmetro cbico).
Las muestras de leche que mostraron un resultado dbil positivo o sospechoso,
as como positivo y fuerte positivo, fueron elegidas para su anlisis. Los pezones
correspondientes fueron desinfectados con gasas impregnadas con alcohol al
70%. Despus de descartar los primeros chorros, se colectaron de 20 a 30 ml de
leche en tubos Falcon estriles, y fueron colocados en una hielera a 4 C. Con
un marcador indeleble se identificaron las muestra en cada tubo (Porporatto y
Felipe, 2010) y, finalmente, fueron transportadas al Laboratorio de Biologa
Molecular de la UCEM para su procesamiento.
5.2. Aislamientos bacterianos
Para realizar el aislamiento de las bacterias asociadas a la enfermedad, las
muestras de leche fueron inoculadas en un medio de cultivo no diferencial (Agar
Nutritivo, BD Bioxon) (Cuadro 1), el cual se prepar suspendiendo 23 gramos (g)
del medio en 1 litro (L) de agua destilada, despus se calent con agitacin
frecuente y se dej hervir de 1 a 2 minutos hasta que se disolvi. Posteriormente,
se esteriliz a 121 C [15 libras (lb) de presin], durante 20 minutos (min.) en un
autoclave (Felisa). Luego, en una campana de flujo laminar (Tecno Lab), el
medio fue vaciado en cajas Petri (90 x 15 mm) y se reserv hasta su solidificacin.
Mientras tanto, las muestras de leche fueron colocadas a temperatura ambiental
antes de ser sembradas. Las muestras fueron homogenizadas manualmente y se
realizaron diluciones seriales (1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000; 1:10000; 1:1000000),
mismas que fueron inoculadas en el medio de cultivo (Calvinho, 2001).
Posteriormente, las cajas Petri fueron incubadas en aerobiosis a 37 C
(incubadora BINDER) por un periodo de tiempo de 24 a 48 h.
23

Cuadro 1. Componentes del Agar Nutritivo.


Frmula para 1 L de agua

(g)

Peptona de gelatina

5.0

Extracto de carne

3.0

Agar

15.0

pH

6.8

0.2

5.3. Caracterizacin morfolgica y prueba de Agar de Sal y Manitol


Se realizaron observaciones de las colonias que crecieron en el medio de cultivo
Agar Nutritivo y se anotaron sus caractersticas morfolgicas. Para identificar
especficamente aislamientos correspondientes a S. aureus, stos se cultivaron en
el medio Agar de Sal y Manitol (BD Bioxon) (Cuadro 2), cuya composicin
incluye al indicador de pH rojo fenol, el cual es de color rojo a un pH de 8.2 y
cambia a amarillo cuando el pH est por debajo de 6.8 (Durn, Zhurbenko y Viera,
2004). Para esto, se rehidrataron 111 g del medio en 1 L de agua destilada y se
dej reposar de 10 a 15 min. Despus, la mezcla se calent y agit
frecuentemente hasta llegar al punto de ebullicin (1 min) para que se disolviera
por completo. El medio se esteriliz en autoclave a 121 C a 15 lb de presin,
durante 20 min y por ltimo se vaci en cajas Petri, en campana de flujo laminar.
La prueba en el Agar Sal y Manitol se interpreta como positiva para S. aureus
cuando la bacteria logra crecer satisfactoriamente en el medio y este cambia su
color del rojo al amarillo. Cuando la prueba es negativa el cultivo no crece, o si
llega a crecer no cambia el color del medio.

24

Cuadro 2. Componentes del medio Agar de Sal y Manitol.


Frmula para 1 L de agua

(g)

Cloruro de sodio

75.0

Extracto de carne

1.0

D-Manitol

10.0

Peptona especial

10.0

Rojo de fenol

0.025

pH

7.4 0.2

5.4. Prueba de coagulasa


Los aislados correspondientes a S. aureus, segn el medio de Agar de Sal y
Manitol, fueron caracterizados mediante la prueba de coagulasa. Para realizar lo
anterior, las colonias correspondientes fueron sembradas en el medio de cultivo
Agar Sangre (Dibico) (Cuadro 3). El medio se calent por 15 min agitando
frecuentemente hasta el punto de ebullicin. Se esteriliz en autoclave a 121 C a
15 lb de presin durante 20 min. Se dej enfriar a 45 C aproximadamente y se le
agreg de 5 a 10 % de sangre humana estril desfibrinada, girando suavemente el
matraz para homogenizar la mezcla y evitar la formacin de burbujas. Por ltimo,
se vaci en cajas de Petri estriles, las cuales se utilizaron para la siembra. Los
cultivos se incubaron a 37 C por un periodo de tiempo de 24 a 48 h. Un resultado
positivo de la prueba de coagulasa constituye por lo comn un criterio de
diagnstico importante para la identificacin de S. aureus, que con frecuencia se
utiliza para indicar la virulencia o patogenicidad de este microorganismo
(MacFaddin, 2003). Esta prueba se interpreta como positiva si en el medio se
logra ver un halo de hemlisis alrededor de la colonia bacteriana.

25

Cuadro 3. Componentes del medio Agar Base Sangre.


Frmula para 1 L de agua

(g)

Agar

15.0

Cloruro de sodio

5.0

Infusin de msculo cardiaco

10.0

Peptona

10.0

pH

7.3 0.2

5.5. Caracterizacin microscpica


De igual manera, se confirm la morfologa de las bacterias identificadas como S.
aureus, mediante observacin microscpica. Esto se llev a cabo colocando una
gota de agua en un portaobjetos y con un asa bacteriolgica se tom una muestra
pequea del aislado correspondiente y se dej secar. Despus, las preparaciones
se montaron en el microscopio ptico (Leica) para hacer la observacin con los
objetivos de 10x, 40x y 100x, este ltimo usando aceite de inmersin (Hycel).
5.6. Tincin de Gram
La tincin de Gram se llev a cabo extendiendo la muestra bacteriana sobre un
portaobjetos y se dej secar. Se fij al portaobjetos pasando la muestra 2 o 3
veces por la llama de un mechero evitando el exceso de calentamiento. El
portaobjetos se coloc sobre un soporte y se cubri con el colorante primario, el
cristal violeta (Meyer), durante un minuto. En este paso, segn lo indica la
literatura, todas las clulas se tien de morado. Despus, se lav con agua
corriente y se dej secar. El siguiente paso fue colocar el yoduro o lugol de Gram
(Golden Bell) durante 1 min., el cual reacciona con el cristal violeta y forma un
complejo cristal violeta-yoduro. Se lav nuevamente con agua corriente. Para la
26

decoloracin, se adicion al portaobjetos una mezcla de solventes (alcoholacetona) (Golden Bell ) por 5 segundos y se retir el exceso lavando con agua
corriente. Estos solventes actan lavando el complejo cristal violeta-yoduro de la
clulas Gram negativas, dejando las Gram positivas an teidas de morado. Para
la contra-tincin, la muestra se ti con safranina (Hycel) durante un minuto, de
manera que las bacterias Gram negativas, que haban sido decoloradas, se
tieron de rosa a fucsia. Posterior a esto, la muestra se lav con agua corriente y
se dej secar al aire (Rodrguez, Gamboa, Hernndez, y Garca, 2010). Cuando
se sec, se observ al microscopio en el objetivo de 100x con aceite de inmersin,
con el condensador abierto totalmente para que la luz pasara y se obtuviera buena
iluminacin.
5.7. Prueba de catalasa
Siguiendo con la caracterizacin de los aislamientos se realiz la prueba de
catalasa. Para llevarla a cabo se coloc una gota de perxido de hidrgeno (H2O2)
(Lasa ) al 3% sobre un portaobjetos y luego se transfiri una porcin de la
colonia sobre el H2O2, hasta realizar una emulsin, esperando observar un
burbujeo al contacto de la muestra con el H2O2. Esto con el objetivo de evaluar si
la enzima catalasa, caracterstica de S. aureus, estaba presente en nuestros
aislados. Si se observa un burbujeo al contacto de la muestra con el H2O2 la
prueba se considera positiva.
5.8. Medio de cultivo Agar Baird Parker
Se utiliz el medio Agar Baird Parker Base (Dibico) como mtodo de
confirmacin de los aislados que correspondieron a S. aureus, segn la prueba de
Agar de Sal y Manitol. Para realizar lo anterior, las colonias correspondientes
fueron sembradas en este medio de cultivo (Dibico) (Cuadro 4), el cual es
especfico para la especie. Se rehidrataron 63 g del medio en 950 ml de agua
destilada. Se calent frecuentemente hasta el punto de ebullicin. Se esteriliz en
autoclave a 121 C (15 lb de presin) durante 15 min. Se dej enfriar a 45 C
aproximadamente y se le agregaron 10 ml de telurito de potasio 1% (Golden Bell
27

) y 50 ml de emulsin de yema de huevo, girando suavemente el matraz para


homogenizar la mezcla y evitar la formacin de burbujas. Por ltimo, se vaci en
cajas Petri estriles. Los cultivos se incubaron a 37 C por un periodo de tiempo
de 24 a 48 h.
Cuadro 4. Componentes del medio Agar Baird Parker Base
Frmula para 1 L de agua destilada

(g)

Agar

15.0

Cloruro de litio

5.0

Extracto de carne

5.0

Extracto de levadura

1.0

Glicina

12.0

Peptona de casena

10.0

Piruvato de sodio

10.0

pH

6.8 0.2

Para la preparacin del telurito de potasio, se pes 1 g del reactivo y se disolvi en


100 ml de agua destilada. Se esteriliz usando un filtro de membrana de 0.45 de
tamao de poro (Millex). Por otro lado, para la emulsin de yema de huevo, se
parti de un huevo de gallina, se lav bien y se dej 2 h, aproximadamente,
sumergido en alcohol al 70%. Posteriormente, en campana de flujo laminar se
rompi el huevo y se separ la yema de la clara. La emulsin se obtuvo
mezclando el mismo volumen de yema con solucin salina estril, despus se
procedi a homogenizar la muestra (Pascual y Caldern, 2000).

28

5.9. Prueba de sensibilidad a antibiticos


Entre los mtodos para determinar la sensibilidad de las bacterias a los
antibiticos en condiciones in vitro, est la difusin de caldo en agar, al cual se le
integran discos impregnados con antibiticos, lo que aporta una estimacin
cualitativa de la sensibilidad de un microorganismo en particular a un determinado
antimicrobiano (Goodman, 2006). Para esto, se tomaron muestras de los
aislamientos y se suspendieron en 4 ml de Caldo Nutritivo marca Bioxon (Cuadro
5) estril, el cual se prepar rehidratando 8 g del medio en 1 L de agua destilada,
se dej reposar de 10 a 15 minutos para que se disolviera completamente, se
agit y distribuy en tubos de ensayo para someterse al proceso de esterilizacin
en autoclave a 121 C a 15 lb de presin, durante 20 minutos. Cuando alcanz
una temperatura de 37 C, aproximadamente, el caldo se inocul con cada una de
las muestras, se cerraron los tubos y se incubaron a 37 C, con agitacin
frecuente (150 rpm) por 24 h.

Cuadro 5. Componentes del Caldo Nutritivo.


Frmula para 1 L de agua

(g)

Extracto de carne

3.0

Peptona de gelatina

5.0

pH

6.9 0.2

Posterior a esto, se prepar agar Mueller-Hinton (Fluka) (Cuadro 6),


suspendiendo 38 g del medio en 1 L de agua destilada, se calent hasta el punto
de ebullicin y se esteriliz en autoclave a 121 C a 15 lb de presin, durante 15
min. Se vaciaron 25 ml del medio en cajas Petri de plstico estriles y se
mantuvieron a 4 C hasta su uso. Para inocular este medio se tomaron 100 l del
29

caldo previamente inoculado y ajustado a la escala de McFarland (1.5 x 108


UFC/ml) y se le adicionaron al medio, este caldo se extendi en toda la caja Petri
con una varilla de vidrio, se dej secar de 10 a 15 min, se le agreg el sensidisco
Gram positivo (Cuadro 7) y se dej reposar para despus meter a incubar a 37 C
durante 12-24 h. Transcurrido este tiempo, se observaron y midieron los halos de
inhibicin de acuerdo a las instrucciones del fabricante, como lo muestra el cuadro
7.

Cuadro 6. Componentes del medio de cultivo Mueller-Hinton.


Frmula para 1 L de agua

(g)

Agar

17.0

Almidn

1.5

Infusin de carne de res

2.0

Peptona de casena cida

17.5

pH

7.3 0.1

30

Cuadro 7. Caractersticas de los antibiogramas para Gram positivas


utilizados.
Agente

Cantidad de

antimicrobiano

antibitico

Dimetro del halo de inhibicin en mm

en el disco
R

Ampicilina

10 g

28

29

Cefalotina

10 g

14

15-17

18

Cefotaxima

30 g

14

15-22

23

Levofloxacina

30 g

13

14-16

17

Cefuroxima

5 g

14

15-22

23

Dicloxacilina

30 g

10

11-12

13

Eritromicina

1 g

13

14-22

23

Gentamicina

15 g

12

13-14

15

Cefepime

10 g

14

15-17

18

Penicilina

30 g

28

29

Tetraciclina

10 U

14

15-18

19

Trimetoprim-

30 g

10

11-15

16

sulfametoxazol

R = Resistente
I = Intermedio
S = Susceptible

31

VI. Resultados y discusin


6.1. Prueba de CMT y cultivos de bacterias
Se realizaron visitas a los establos lecheros de 21 productores (Cuadro 8), los
cuales contaban con un total de 384 vacas en ordea, mantenidas en sistemas de
produccin de traspatio y semi-intensivos. Se aplic la CMT al 15.8% de las vacas
(61) elegidas al azar, de las cuales el 57.3% (35) dieron positivo a la prueba. Con
relacin a este resultado, se observa una alta prevalencia de mastitis en los hatos
lecheros muestreados, si se compara con lo reportado por Luna (2010), quien en
su estudio realizado en La Comarca Lagunera observ que el 39.5% de los
animales analizados mostraron una reaccin positiva. No obstante, el resultado es
similar al reportado por Aguilar, Bauelos, Pimienta, Aguilar, y Torres, (2014),
quienes revelaron una prevalencia de mastitis del 64.3% en la regin Cinega del
Estado de Jalisco.
La alta prevalencia de esta enfermedad es un verdadero problema, ya que podra
estar repercutiendo en la produccin de leche y en los costos econmicos, como
la compra de antibiticos, gasto en mdicos veterinarios y la prdida de las vacas
enfermas si el productor no invierte en la salud del animal. Adems, esta alta
prevalencia podra ser un problema de salud pblica, ya que la infeccin del
animal puede afectar al consumidor si la leche no es correctamente pasteurizada.
Por otro lado, los residuos de antibiticos son un problema a mediano y largo
plazo, ya que un mal uso ocasiona que las bacterias generen resistencia, adems
de que sus residuos pueden afectar las propiedades organolpticas de productos
no pasteurizados como los quesos, as como la salud de los consumidores
(Carrin, 2002).
A partir de las vacas que dieron positivo a la CMT, se colect un total de 124
muestras de leche, las cuales fueron inoculadas en Agar Nutritivo para permitir el
crecimiento bacteriano y realizar su caracterizacin.

32

Cuadro 8. Ganaderos que participaron en el proyecto y nmero de vacas en


ordea.
No.

Nombre del ganadero

Nmero de vacas en
ordea

25

Jos Luis Cervantes Jimnez


Adolfo Zepeda Torres

Francisco Navarrete

18

Marco Padilla Fernndez

12

Cesar Arredondo Romero

Miguel ngel Lpez

Csar Orozco Gudio

16

Jaime Ramos

16

Emilio Gudio Contreras

38

10

Sergio Gudio Contreras

24

11

Alfredo Romero

26

12

Feliciano Arredondo Nez

13

Alberto Arredondo Nez

12

14

Ricardo Arredondo Nez

12

15

Israel Ceja Cervantes

40

16

Gabriel Macas

15

17

Francisco Macas

15

18

Luis Gerardo Macas

24

19

Francisco Rodrguez Moreno

16

20

Antonio Lpez Meja

14

21

Jos de Jess Garca Lpez


Total:

35
384

Total de vacas muestreadas:

61

33

6.2. Caracterizacin morfolgica, tincin de Gram y prueba de Agar de


Sal y Manitol
Del total de las muestras de leche obtenidas en los hatos del municipio de
Venustiano Carranza, se obtuvieron 298 aislados bacterianos de gnero
indefinido, muchos de los cuales tenan la misma morfologa macroscpica y
pigmentacin, por lo que se seleccionaron aquellos que presentaban morfologa
diferente, obteniendo de esta manera 36 aislados bacterianos (Figura 8),
identificados bajo la clave AVC, seguida del nmero arbigo correspondiente. A
estos aislados se les realiz la tincin de Gram, cuyos resultados mostraron que
26 (72%) pertenecieron al grupo de las Gram positivas, las cuales han sido
reportadas como las bacterias predominantes en casos de mastitis bovina (Figura
9) (Florentin, 2007; Ochoa-Zarzosa, Loeza-Lara, Torres-Rodrguez, Loezangeles, Mascot-Chiquito, Snchez-Baca, y Lpez-Meza, 2008). Asimismo,
presentaron el color violeta caracterstico, una morfologa microscpica esfrica
(cocos) y una agrupacin en forma de racimos, diplococos y algunos en cadenas.
Por otro lado, las 10 bacterias restantes (28%) correspondieron al grupo de las
Gram negativas, las cuales no fueron estudiadas en este trabajo (Figura 9).

Figura 8. Aislados obtenidos despus de la seleccin por morfologa y


pigmentacin.
34

28%
Gram positivas (26)

72%

Gram negativas (10)

Figura 9. Porcentaje de bacterias Gram positivas y Gram negativas aisladas


de los hatos del municipio de Venustiano Carranza, Mich.
Puesto que la literatura indica que dentro de las Gram positivas S. aureus destaca
a nivel mundial como el patgeno prevaleciente, se utiliz el medio diferencial
Agar de Sal y Manitol para identificar a los aislados correspondientes a esta
especie bacteriana, observndose que 17 de los 26 aislados (65.3%) dieron
positivo a esta prueba especfica, lo que indica que el mismo nmero de bacterias
correspondieron a S. aureus, mientras que los 9 restantes recayeron en el gnero
Staphylococcus sp. (Cuadro 9 y 10).
Asimismo, como puede observarse en el ejemplo de la figura 10B (resultado
positivo), el aislado AVC-9 ferment manitol, por lo que se observ un cambio de
coloracin en el medio, de rojo a amarillo, de la misma manera como lo hizo la
cepa de referencia S. aureus ATCC 27543 (Figura 10A); no as el aislado AVC-8,
el cual, de acuerdo a las instrucciones del fabricante, corresponde a otra especie
del gnero Staphylococcus (Figura 10C).
Estos resultados identifican al gnero Staphylococcus, particularmente a la
especie S. aureus, como el principal agente etiolgico de la mastitis bovina en el
municipio de Venustiano Carranza. En este sentido, se destaca que la prevalencia
de la bacteria es mayor que la reportada por Caldern y Rodrguez (2008),
quienes reportaron una prevalencia del 29% en hatos lecheros colombianos. Al
35

igual que en Ecuador, donde Acua y Rivadeneira (2008) encontraron que de un


total de 141 aislados, el 34.6% correspondi a S. aureus.
Cuadro 9. Identificacin de bacterias Gram positivas mediante la prueba de
Agar de Sal y Manitol.
No

Aislamiento Agar de Sal y Manitol

AVC-1

S. aureus

AVC-2

S. aureus

AVC-3

S. aureus

AVC-4

Staphylococcus sp.

AVC-5

S. aureus

AVC-6

S. aureus

AVC-7

S. aureus

AVC-8

Staphylococcus sp.

AVC-9

S aureus

10

AVC-10

S. aureus

11

AVC-11

S. aureus

12

AVC-12

S. aureus

13

AVC-13

S. aureus

14

AVC-14

S. aureus

15

AVC-15

S. aureus

16

AVC-16

S. aureus

17

AVC-17

S. aureus

18

AVC-18

S. aureus

19

AVC-19

Staphylococcus sp.

20

AVC-20

Staphylococcus sp.

21

AVC-21

Staphylococcus sp.

22

AVC-22

Staphylococcus sp.

23

AVC-23

Staphylococcus sp.

24

AVC-24

S. aureus

25

AVC-25

Staphylococcus sp.

26

AVC-26

Staphylococcus sp.

27

Control
ATCC 27543

S. aureus

36

Figura 10. Resultados de la prueba con Agar de Sal y Manitol, A) S. aureus


ATCC 27543 (control). B) Aislado AVC-9 positivo a la prueba. C) Aislado
AVC-8 negativo a la prueba.
Para el caso de nuestro pas, esto mismo sucedi en el municipio de Tarmbaro,
Michoacn, en donde Lpez, Higuera, Ochoa, Valdez, Bravo, y Baizabal (2006),
reportaron que de 20 vacas con mastitis clnica se obtuvieron 20 aislados de S.
aureus positivos a la prueba de Agar de Sal y Manitol reportndose en estos
trabajos como el principal agente etiolgico que ocasiona la enfermedad.
En este sentido S. aureus es una bacteria con una amplia distribucin en la
naturaleza, con gran capacidad de adaptacin y supervivencia, por lo que produce
infecciones crnicas en los rebaos, as como cuadros clnicos muy severos y
difciles de tratar. Adems, es un microorganismo que responde pobremente a los
tratamientos con antibiticos convencionales, lo que dificulta a los productores
llevar a cabo un control adecuado.
6.3. Caracterizacin microscpica, prueba de coagulasa y catalasa
Para confirmar los resultados anteriores, los 17 aislados fueron caracterizados
mediante microscopio ptico compuesto, observndose que todos presentaron
una morfologa esfrica, o en forma de cocos. Asimismo, de acuerdo a las
propiedades hemolticas de S. aureus, a los aislados se les realiz la prueba de
coagulasa en Agar Sangre. Los resultados de esta prueba mostraron que los 17
37

aislamientos presentaron un halo de hemlisis (Figura 11, Cuadro 10), lo que


caracteriza a estas bacterias como organismos coagulasa positivos.

Figura 11. Resultado del aislamiento AVC-9 en Agar Sangre con halo
hemoltico.

La actividad de la enzima catalasa sirve para diferenciar al gnero Staphylococcus


(catalasa positivo) de los gneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa
negativos), por lo que en este estudio se analiz la actividad de dicha enzima. El
resultado muestra que la enzima est en los 17 aislados, descomponiendo el
perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, mostrando efervescencia al contacto
del perxido con las colonias (Cuadro 10). Esta enzima le sirve a la bacteria para
protegerse del efecto txico del perxido de hidrgeno, producto del metabolismo
de los azcares, una de las muchas caractersticas que hacen que S. aureus
presente alta supervivencia y sea tan resistente.

38

Cuadro 10. Resultados de la caracterizacin de aislados de S. aureus


mediante morfologa microscpica, prueba de coagulasa, prueba de catalasa
y prueba en Agar Sal y Manitol.
No Aislamiento Morfologa Coagulasa Catalasa

Prueba de
Agar de Sal y
Manitol

AVC-1

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-2

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-3

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-5

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-6

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-7

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-9

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-10

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

AVC-11

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

10

AVC-12

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

11

AVC-13

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

12

AVC-14

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

13

AVC-15

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

14

AVC-16

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

15

AVC-17

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

16

AVC-18

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

17

AVC-24

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

18

Control ATCC

Cocos

Positivo

Positivo

Positivo

27543

Otra prueba de confirmacin fue con Agar Baird Parker en el que las 17 colonias
de S. aureus crecieron presentando un color de gris oscuro a negro, debido a la
reduccin de telurito a teluro (Cuadro 11). Esta bacteria produce lecitinasa, la cual
descompone la yema de huevo, por lo cual se ven halos transparentes alrededor
de las colonias (Figura 12). Con los resultados de estas pruebas bioqumicas se
pudo confirmar parcialmente la identidad de los 17 aislados.
39

Cuadro 11. Resultados de la identificacin de S. aureus mediante su


crecimiento en el medio Baird Parker.
No

Aislamiento

Agar Baird Parker

AVC-1

++

AVC-2

++

AVC-3

++

AVC-5

++

AVC-6

++

AVC-7

++

AVC-9

++

AVC-10

++

AVC-11

++

10

AVC-12

++

11

AVC-13

++

12

AVC-14

++

13

AVC-15

++

AVC-16

++

15

AVC-17

++

16

AVC-18

++

17

AVC-24

++

18

Control ATCC 27543

++

+ Positivo para la reduccin de teluro. + Positivo a la produccin de lecitinasa.

Halo

Figura 12. Resultado del aislamiento AVC-9 en el medio de cultivo Agar Baird
Parker, con colonias negras y un halo transparente rodendolas.
40

6.4. Sensibilidad ante antibiticos


Para determinar el patrn de resistencia o susceptibilidad a antibiticos de los
aislados de bacterias obtenidos de vacas con mastitis bovina, se llevaron a cabo
ensayos en los que se utilizaron sensidiscos (Figura 13) para bacterias Gram
positivas. El cuadro 12 muestra los perfiles de resistencia o susceptibilidad que
presentaron los 17 aislados de S. aureus ante los antibiticos, mientras que el
cuadro 13 muestra slo el perfil de resistencia para destacar a aquellas bacterias
con multirresistencias. Como puede observarse, todos fueron resistentes al menos
a 2 antimicrobianos. Asimismo, el 100% de las bacterias present resistencia a
penicilina y 83% a ampicilina, resultados similares a los presentados por San
Martin, Kruze, Morales, Agero, Esppinoza, Iragen, Len, Puga, y Borie (2002).
No obstante, los aislados fueron susceptibles a antibiticos como trimetoprimsulfametoxasol, cefalotina y levofloxacina, lo que indica que el uso de estos
antibiticos podra resultar til para el control de la mastitis. Estas pruebas de
susceptibilidad pueden servir de gua a los productores o veterinarios al momento
de seleccionar el tratamiento ms adecuado para el control de esta enfermedad,
siempre y cuando usen los compuestos de manera racional, para evitar los
problemas de resistencia bacteriana.

Figura 13. Resultado de la prueba de susceptibilidad a antibiticos.


41

Cuadro 12. Resultados del perfil de resistencia y/o susceptibilidad a


antibiticos de bacterias aisladas de vacas con mastitis.
No.

Aislamiento

PE

DC

FEP

CXM

GE

CTX

SXT

TE

AM

LEV

CF

AVC-1

AVC-2

AVC-3

AVC-5

AVC-6

AVC-7

AVC-9

AVC-10

AVC-11

10

AVC-12

11

AVC-13

12

AVC-14

13

AVC-15

14

AVC-16

15

AVC-17

16

AVC-18

17

AVC-24

18

Control
ATCC 27543

PE= Penicilina, DC= Dicloxacina, FEP= Cefepime, CXM= Cefuroxima, GE=


Gentamicina,

CTX=

Cefotaxima,

Tetraciclina, AM= Ampicilina, E=

SXT=

Trimetoprim-sulfametoxasol,

TE=

Eritromicina, LEV= Levofloxacina, CF=

Cefalotina.

42

Cuadro 13. Patrn de resistencia antimicrobiana.


No.

Aislamiento

Antibiticos

AVC-1

PE, AM

AVC-2

PE, DC, TE, AM

AVC-3

PE, DC, AM

AVC-5

PE, DC, AM

AVC-6

PE, DC, AM

AVC-7

PE, DC, AM

AVC-9

PE, FEP, AM

AVC-10

PE, DC, FEP, CTX, AM

AVC-11

PE, AM

10

AVC-12

PE, AM

11

AVC-13

PE, DC, CTX

12

AVC-14

PE, AM

13

AVC-15

PE, DC, AM

14

AVC-16

PE, FEP, CXM, CTX

15

AVC-17

PE, DC, AM

16

AVC-18

PE, DC, AM

17

AVC-24

PE, FEP, AM, E

18

Control

PE, AM

ATCC27543

Finalmente, en el municipio de Venustiano Carranza, Michoacn era nula la


informacin sobre los patrones de sensibilidad y resistencia que los patgenos
bacterianos asociados a la mastitis bovina presentan ante los antibiticos, por lo
cual, estos resultados podran favorecer la eleccin de opciones antimicrobianas
adecuadas y la realizacin de una terapia ms efectiva. Adems, este estudio de
sensibilidad antibitica es importante, ya que proporciona la informacin bsica
que conducir a la identificacin y caracterizacin del gen o grupo de genes que
43

confieren resistencia a un tipo particular de antibitico, teniendo en cuenta que los


datos de resistencia hacia antibiticos deben ser considerados como parte de una
estrategia integral de manejo de los hatos lecheros si se quiere tener xito en el
control de la mastitis bovina.
Con esto, es importante reforzar la urgencia de aplicar, en el corto plazo, la
racionalizacin, control y/o restricciones del uso de estos frmacos, los cuales son
una importante herramienta teraputica. Adems, este estudio podra servir para
orientar a los productores en cuanto a una seleccin de antibiticos ms eficaz
para el tratamiento y la prevencin de mastitis bovina. Asimismo, esta informacin
aporta datos relevantes para el municipio, que destacan a S. aureus como el
patgeno prevaleciente.

44

VII. Conclusiones
Los resultados de la CMT indicaron que en los hatos lecheros del municipio de
Venustiano Carranza, Michoacn hay una alta prevalencia de la mastitis bovina
(57.3%). Asimismo, se aislaron bacterias de la leche de vacas con mastitis, cuya
identificacin parcial mostr que stas pertenecen a la especie S. aureus, por lo
que representa el principal patgeno asociado con la enfermedad en el municipio.
El anlisis de resistencia-susceptibilidad de estos aislados a antibiticos, mostr
que todos los aislamientos fueron susceptibles a trimetoprim-sulfametoxasol,
cefalotina y levofloxacina; no obstante, el 100% present resistencia a penicilina y
83% a ampicilina. Lo anterior muestra que el uso de antibiticos como terapia en
el ganado lechero del municipio no es ajeno a la problemtica mundial de la
resistencia bacteriana.

45

VIII. Referencias
Acua, M.V.L. y Rivadeneira, E.A.P. (2008). Aislamiento, identificacin y
antibiograma de patgenos presentes en leche con mastitis en ganaderas
bovinas de la provincia de Pichincha. Tesis de Licenciatura, Escuela
Politcnica del Ejrcito, Sangolqu, Ecuador.
Agrobit Gestin Agropecuaria (2004). Mastitis: Enfermedad y Transmisin.
Recuperado

el

18

de

Enero

de

2014

de

Agrobit:

http://www.agrobit.com/Info_tecnica/Ganaderia/enfermedades/GA000009en
.htm
Aguilar, A.B., Bauelos, P.J., Pimienta, B.E., Aguilar, F.A. y Torres, M.P. (2014).
Prevalencia de mastitis subclnica en la regin Cinega del Estado de
Jalisco. Abanico Veterinario, 4: 2007-4204.
Alta (2012). Bsicos Lecheros. Recuperado el 14 de Noviembre de 2014 de Alta.
http://web.altagenetics.com/chile/DairyBasics/Details/3015_Como-sedesarrolla-la-mastitis-en-la-ubre.html
Bahena, J. (2007). PROSEGAN. Recuperado el 02 de Diciembre de 2014, de
Productos y servicios ganaderos: http://jairoserrano.com/2010/02/mastitispor-coliformes/
Barragn, L.E. (1990). Ms all de los Caminos. Editorial El Colegio de
Michoacn. Zamora, Michoacn, Mxico.
Barry, A.L. y Thornsberry, C. (1985). Susceptibility test: Diffusion test procedures.
Washington: American Society for Microbiology.
Bedolla, G.E.A. (2011). Resistencia antibitica de Staphylococcus aureus aislados
de leche de vacas con mastitis de Tjaro Michoacn. Tesis de Licenciatura,
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de
San Nicols de Hidalgo, Morelia, Michoacn, Mxico.
46

Bello, O.R. (2009). El sistema agroalimentario localizado (SIAL): Otra visin de la


lecheria de la regin centro de Michoacn. Tesis de Doctorado, CIESTAAM,
Universidad Autnoma de Chapingo. Chapingo Estado de Mxico.
Bou, G., Fernndez, O.A., Garca, C., Sez, N.J. y Valdezate, S. (2011). Mtodos
de identificacin bacteriana en el Laboratorio de Microbiologa. (2 Ed.).
Espaa.
Cabrera, C.E., Gmez, R.F. y Ziga, A.E. (2007). La resistencia de bacterias a
antibiticos, antispticos y desinfectantes una manifestacin de los
mecanismos de supervivencia y adaptacin. Colombia Mdica, 38: 149158.
Caldern, A., y Rodrguez, C.V. (2008). Prevalencia de mastitis bovina y su
etiologa infecciosa en sistemas especializados en produccin de leche en
el altiplano cundiboyacense. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias,
21: 583-584.
Calvinho, L.F. (2001). Diagnstico bacteriolgico de mastitis y su importancia en
los programas de control. Recuperado de: http://aprocal.com.ar/wpcontent/uploads/diagnostico_de_mastitis.htm.pdf
Calvinho, L.F. (2007). Terapia de mastitis causada por Staphylococcus aureus.
Revista de Informacin Sobre Investigacin y Desarrollo Agropecuario, 7:
174-179.
Carrin, C.R. (2013). Mastitis subclnica y conteo de clulas somticas.
Recuperado

el

09

de

enero

de

2015,

de

Engormix:

http://www.engormix.com/MA-ganaderia-leche/sanidad/articulos/mastitissubclinica-conteo-celulas-t5235/165-p0.htm
Carrin, G.M. (2002). Formacin y capacitacin contina a los integrantes de la
red de innovacin de la cadena de bovinos leche del Estado de Michoacn.

47

Tesis de Maestra en Ciencias, CIIDIR-IPN-MICH, Jiquilpan, Michoacn,


Mxico.
Cercenado, M.E. (2006). Epidemiologa de la resistencia de Staphylococcus
aureus a los antimicrobianos. Revista Espaola Quim., 19: 83-84.
Chans, G.R. (2002). Estafilococos. Recuperado el 17 de diciembre de 2012, de
EducaMadrid:http://www.educa2.madrid.org/web/educamadrid/principal/files
/6046b373-a0b6-4737-8f6b-4553dfefcd53/16.- %20Estafilococos.pdf
Chavero, E.L. (2007). Determinacin higinico-sanitaria de la leche de cabra en la
regin de Ecuandureo, Michoacn. Tesis de Licenciatura, Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicols
de Hidalgo, Morelia, Michoacn, Mxico.
Dibico (2010). Base de Agar Baird Parker. Laboratorios Conda S.A. Madrid,
Espaa.
Durn, V. A., Zhurbenko, R. y Viera, O. D. (2004). Propuesta de una modificacin
en la formulacin del medio agar manitol salado utilizado en el aislamiento
de estafilococos de importancia clnica. Revista Cubana de Medicina
Tropical, 56: 1561-3054.
Elika (2013). Staphylococcus aureus. Recuperado el 16 de enero de 2015, de:
Fundacin

Vasca

para

la

Seguridad

Agroalimentaria:

http://www.elika.net/datos/pdfs_agrupados/Documento95/7.Staphylococcus
pdf .
Eulloque, G.J. (2012). Calidad sanitaria de la leche cruda entera en explotaciones
bovinas del noroeste de Michoacn. Tesis de Licenciatura. Universidad de
La Cinega del Estado de Michoacn de Ocampo. Sahuayo, Michoacn,
Mxico.

48

FAO (2004). Uso de antimicrobianos en animales de consumo, incidencia del


desarrollo de resistencias en salud pblica. En: Produccin y sanidad
animal. Editorial FAO, Roma, Italia.
FAO (2010). Manejo Sanitario Eficiente del Ganado Bovino: Principales
Enfermedades.

Folleto:

Programa

Especial

para

la

Seguridad

Alimentaria. Managua, Nicaragua.


Ferraro, L., Scaramelli, A. y Troya, H. (1999). Prevalencia de la mastitis subclnica
bovina en Venezuela y evaluacin de la prueba de Mastitis de California
(CMT) como prueba diagnsticada. Revista Cientfica, 9: 81-90.
Florentin, A.C. (2007). Perfil de resistencia in vitro a antimicrobianos de cepas
causantes de mastitis aislada de leche cruda bovina en establecimientos de
pequea y mediana produccin. Revista Memorias del Instituto de
Investigaciones en Ciencias de la Salud, 3: 19-25.
Flores, M.R. (2013). Evaluacin y anlisis de residuos de antimicrobianos
detectados en canales bovinas y porcinas del rastro municipal de
Venustiano Carranza, Michoacn. Tesis de Licenciatura, CIIDIR-IPN-MICH,
Jiquilpan, Michoacn, Mxico.
Forbes, B., Sahm, D.F. y Weissfeld, A.S. (2009). Diagnstico microbiolgico.
(12. Ed.). Editorial Medica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
Fox, L.K., Bayles, K.W. y Bohach, G.A. (2001). Intracellular Staphylococcus
aureus escapes the endosone and induces apoptosis in epithelial cells.
Infection and Inmmunity, 66: 336-342.
Gonzalo, F. (1985). Enfermedades Infecciosas en el Ganado Bovino Prevencin y
Control. FONAIAP, 17: 17-18.
Goodman, L.S. (2006). Las bases farmacolgicas de la teraputica. (11. Ed.).
Editorial McGraw-Hill. Mxico, D.F.

49

Hogan, J. y Smith, L.K. (2003). Coliform mastitis. Veterinary Research, 34: 507519.
Kleinschroth, E., Rabold, K. y Deneke, J. (1991). La Mastitis. Editorial: Edimed 76.
Barcelona, Espaa.
Len, B.P. (2008). Prdidas economicas ocasionadas por la mastitis bovina en la
industria lechera. Revista Electrnica de Veterinaria, 9: 1695-7504.
Lpez, M.J.E., Higuera, R.J.E., Ochoa, Z.A., Valdez, A.J.J., Bravo, P.A., y
Baizabal, A.V.M. (2006). Caracterizacin molecular de aislamientos de
Staphylococcus spp. asociados a mastitis bovina en Tarmbaro, Michoacn.
Tcnica Pecuaria en Mxico, 44: 92-106.
Luna, E.A. (2010). Cantidad de clulas somticas y caractersticas nutricionales
de la leche de bovinos de La Comarca Lagunera. Tesis de Licenciatura,
Universidad de Papaloapan, Loma Bonita, Oaxaca, Mxico.
MacFaddin. (2003). Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de
Importancia Clnica. (3. Ed.). Editorial Mdica Panamericana. Buenos
Aires, Argentina.
Mateus V.G. (1983). Mastitis en bovinos. Boletn divulgativo. Centro Agronmico
Tropical de Investigacin y Enseanza, Departamento de Produccin
Animal. Turrialba, Costa Rica.
Mellenberger, R. y Roth, C.J. (2000). Prueba de Mastitis California (CMT). Hoja
de informacin. Universidad de Wisconsin-Madison, Michigan.
Monardes, H. y Barria, N. (1995). Recuento de clulas somticas y mastitis.
TecnoVet.

Recuperado

el

01

de

marzo

de

2015

de:

http://www.tecnovet.uchile.cl/index.php/RT/article/view/5141/5024
Morales, L.H. (2011). Mastitis Bovina: Enfoque Biotecnolgico. ReCiTeIA, 11: 212242.

50

Novoa, Q.R.M. (2003). Evaluacin epizootiolgica y econmica de la mastitis


bovina en rebaos lecheros especializados de la provincia Cienfuegos.
Tesis de Maestra en Ciencias. Universidad Agraria de La Habana.
Cienfuegos, Cuba.
Ochoa-Zarzosa, A., Loeza-Lara, P.D., Torres-Rodrguez, F., Loeza-ngeles, H.,
Mascot-Chiquito, N., Snchez-Baca, S. y Lpez-Meza, J.E. (2008).
Antimicrobial susceptibility and invasive ability of Staphylococcus aureus
isolates from mastitis from dairy backyard systems.

Antonie van

Leeuwenhoek, 94: 199-206.


Pahissa, A. (2009). Infecciones producidas por Staphylococcus aureus. (1. Ed.).
Editorial Marge. Barcelona, Espaa.
Pascual, A.M.R. y Caldern, P. (2000). Microbiologa Alimentaria, metodologa
analtica para alimentos y bebidas. (2. Ed.). Editorial Daz de Santos.
Madrid, Espaa.
Philpot, W.N. y Nickerson, S.C. (1992). Mastitis: contra ataque, una estrategia
para combatir la mastitis. Editorial Babson Bros.
Pinzn, G.J.L. (1989). Mastitis Bovina. FONAIAP, 31: 1.
Pinzn, T.A., Moreno, V.F.C., Rodriguez, M.G. (2007). Efectos de la mastitis
subclinica en algunos hatos de la cuenca lechera del alto Chicamocha
(departamento de Boyac). Revista Medica Veterinaria, 17: 23-35.
Porporatto, C. y Felipe, V.I. (2010). Mastitis, Confort Animal y Calidad de Leche.
(1. Ed.). Villa Mara: Eduvim.
Rodrguez, C.E., Gamboa, C.M., Hernndez, C.F. y Garca, H.J. (2010).
Bacteriologa General. (1. Ed.). Editorial EUCR. Costa Rica.
Ruiz, M.P. (2007). Efecto de la transferencia de tecnologa (ggavatt), sobre la
produccin de leche en la regin de la cuenca lechera Cinega de Chapala
de Michoacn. Tesis de Licenciatura, Falcultad de Medicina Veterinaria y
51

Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo, Morelia,


Michoacn, Mxico.
Snchez, G.L.G. y Solorio, R.J.L. (2004). Descripcin del sistema de ganadera
bovina en Cotzio y Tjaro, Michoacn. Tesis de Licenciatura, Falcultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicols
de Hidalgo, Morelia, Michoacn, Mxico.
Snchez, R.G. y Snchez, V.A. (2006). La ganadera bovina del Estado de
Michoacn: ms de cuatro siglos de tradicin y cultura ante los retos del
nuevo milenio. Fundacin Produce Michoacn, Mxico.
Snchez, V.M.G. (2005). Tipificacin de bacterias aisladas de leche de vacas con
un cuadro de mastitis clnica. Tesis de Licenciatura, Falcultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia, Universidad Michoacana de San Nicols de
Hidalgo, Morelia, Michoacn, Mxico.
San Martin, B., Kruze, J., Morales, M.A., Agero, H., Esppinoza, S., Iragen, D.
Len, B., Puga, J. y Borie, C. (2002). Resistencia bacteriana en cepas
patgenas aisladas de

mastitis en vacas lecheras de la V Regin,


a

Regin Metropolitana y X Regin, Chile. Archivos de Medicina Veterinaria,


34: 221-234.
Seija, S.V. (2008). Temas de bacteriologa y virologa medica: Gnero
Staphylococcus. (3. Ed.). Editorial: FEFMUR. Montevideo, Uruguay.
Talavera, S. (2009). Test de California (CMT). Recuperado el 02 de diciembre de
2014,

de

Servet

Talavera:

http://www.servettalavera.es/documentos/CMT.pdf
Vadillo, M.S., Priz, D.S. y Mateos, Y.E. (2002). Manual de Microbiologa
Veterinaria. Editorial: McGraw Hill Interamericana. Madrid, Espaa.
Velsquez, R.M. (2012). Mastitis bovina, un problema en el campo. Recuperado
el

22

de

enero

de

2014,

de

Diagnstico

de

la

mastitis:
52

http://mazovelasquezenelcampo.blogspot.mx/2012/09/diagnostico-de-lamastitis.html
Wattiaux, M.A. (1999). Mastitis: prevencin y deteccin. Recuperado el 18 de
diciembre de 2013 de Babcock: http://babcock.wisc.edu/es/node/219
Wattiaux, M.A. (2002). Composicion de la leche. Recuperado el 18 de diciembre
de 2013 de Babcock: http://babcock.wisc.edu/es/node/199
Wolter, W., Castaeda, V.H., Kloppert, B. y Zschoeck, M. (2002). La mastitis
bovina. Recuperado el 16 de marzo de 2014 de Hesse: http://bibd.unigiessen.de/gdoc/2002/uni/p020003.pdf
Yugueros, M.J., Cascn, S.A., Snchez, S.M., Hernanz, M.C., Surez, R.S.,
Smeltzer, S.M. y Naharro, C.G. (1999). Rapid Indentification and Typing of
Staphylococcus aureus by PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism
Analysis of the aroA Gene. Journal of Clinical Microbiology, 37: 570574.
Zschck, M., Botzler, D., Blcher, S. y Sommerhauser, J. (2000). Detection of
genes for enterotoxins (ent) and Toxic Shock Syndrome Toxin (tst) in
mamary isolates of Staphylococcus aureus by Polymerase chain reaction.
International Dairy Journal, 10: 569-574.

53