El espectrofotmetro

Uno de los instrumentos principales del laboratorio de biologa celular es el espectrofotmetro. Este
instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica (de un largo de onda
particular) a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto
le permite al fisilogo realizar dos funciones:

1.
Nos da informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo
midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y graficar estos valores en funcin del largo
de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales nicas,
distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un
arreglo de tomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga caractersticas nicas. Al
ser expuestos a la luz del especrofotmetro, algunos electrones de los tomos que forman las molculas
absorben energa entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energa absorbida es
emitida en forma de fotones. Esa emisin de fotones es distinta para cada sustancia, generando un patron
particular, que vara con el largo de onda usado. Dependiendo del largo de onda, ser la cantidad de
energa absorbida por una sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs l
2.
Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra. La
concentracin es proporcional a la absorbancia, segn la Ley Beer-Lambert: a mayor cantidad de
molculas presentes en la muestra, mayor ser la cantidad de energa absorbida por sus electrones.
Abs = K C L
Abs: absorbancia
K: coeficiente de extincin molar
C: concentracin
L: distancia que viaja la luz a traves de la muestra. (normalmente es de 1 cm)
La cuveta promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centmetro (L). La
ecuacin describe una lnea recta, donde el origen es cero. Si L es constante (1.0 cm) y se conoce
el valor de K, podemos calcular C en base a Abs:
Abs / K L = C
El espectrofotmetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta y visible
(200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de
acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del
haz. Este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotogrfico, donde es medido. La cantidad de luz que
atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de tramitancia. Podemos usar esta unidad o cambiarla a
absorbancia usando la siguiente ecuacin.
%T = - Log Abs.
El espectrofotmetro nos puede dar ambos valores a la misma vez, ahorrando la necesidad de hacer los
clculos. (Tramitancia= cantidad de luz que atravieza la mezcla).
Una caracterstica del instrumento es la necesidad de "blanquear" el aparato antes de cada lectura. Esto
se hace colocando una cuveta con una solucin control que tenga todos los componentes de la reaccin
menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia. El
propsito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que puedan presentar los dems

componentes de la reaccin a ese largo de onda particular. Todas las molculas presentan absorbancia
porque todas interfieren con el paso de la luz. Slo que la absorbancia ser ptima a un largo de onda de
luz especfico para cada tipo de sustancia.
Cubetas

Las cuvetas son unos viales de plstico transparente o cuarzo que dejan pasar la luz. Los mejores para
trabajos de investigacin son las de cuarzo porque su interferencia al paso de la luz es mnimo. Son ms
costosas inicialmente pero bien tratadas pueden ser reusables. Las de plstico vienen con distintas
caractersticas. Por lo general son desechables, aunque pueden reusarse. El tipo de cuveta plstica a
usar depende del rango de luz en el que se van a analizar las muestras. Vienen unas para luz visible, que
son las ms econmicas, y otras para el rango de visible a ultravioleta. Estas son ms verstiles.
Ambos tipos de cuvetas deben manejarse con cuidado para evitar rallazos sobre la superficie por donde
pasa la luz. Si la cuveta est rallada, los rayos de luz que incidan en la zona se difractan y no pasan por la
muestra, por lo que puede dar lecturas de absorbancia errneas. Esto es especialmente crtico cuando
queremos determinar concentracin en una muestra. Antes de tomar una lectura, debemos observar que
la cuveta no tenga rallazos ni est sucia. Si se ven marcas de polvo u otro tipo de sucio la cuveta debe
limpiarse con papel tis (Kimwipes). Si la cuveta se manipula mucho, debemos sostenerla usando papel
tis para evitar pegarle los aceites que normalmente tenemos en las manos. No debemos usar ningn
otro tipo de papel para limpiar las cuvetas, puesto que pueden soltar fibras que pudieran caer en la
muestra o rallar la superficie.
Las cuvetas viene en distintos volmenes, desde 1 ml hasta 4 ml. El volumen a escoger depende de la
cantidad de muestra disponible. Si la muestra disponible es poca o difcil de conseguir, lo mejor es usar
una cuveta de menor volumen para perder la menor cantidad posible de la muestra. Por lo general, la
muestra utilizada para hacer la lectura se pierde, sobre todo si es una sustancia bien sensitiva, como
el ADN.

Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos93/materiales-e-instrumentos-laboratorio/materiales-einstrumentos-laboratorio.shtml#ixzz4H7HfEugN

Un espectrofotmetro es un instrumento usado en el anlisis qumico que sirve para

medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud
fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentracin o reacciones qumicas
que se miden en una muestra. Tambin se utiliza en laboratorios de qumica para
la cuantificacin desustancias y microorganismos.1
Hay varios tipos de espectrofotmetros, que son de absorcin atmica, de absorcin
molecular (que comnmente se conoce como espectrofotmetro UV-VIS), y no debe ser
confundido con un espectrmetro de masa.

Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de

una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le
permite al operador realizar dos funciones:
1. dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra,
2. indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente
en la muestra.
ndice
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1Componentes de un espectrofotmetro
o

1.1Fuente de luz

1.2Monocromador

1.3Compartimiento de Muestra

1.4Detector

1.5Fotodetectores

1.6Celdas

2Historia

3Vase tambin

4Referencias

Componentes de un espectrofotmetro[editar]
Fuente de luz[editar]
La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes condiciones:
estabilidad, direccionabilidad, distribucin de energa espectral continua y larga vida. Las
fuentes empleadas son: lmpara de wolframio (tambin llamado tungsteno), lmpara de
arco de xenn y lmpara de deuterio que se utilizan en los laboratorios atmicos.

Monocromador[editar]
Artculo principal: Monocromador

El monocromador asla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se

reflejan desde el conjunto, se usa para obtener luz monocromtica.
Est constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de
dispersin. El colimador se ubica entre la rendija de entrada y salida. Es un lente que lleva
el haz de luz que entra con una determinada longitud de onda hacia un prisma el cual

separa todas las longitudes de onda de ese haz y la longitud deseada se dirige hacia otra
lente que direcciona ese haz hacia la rendija de salida.

Compartimiento de Muestra[editar]
Es donde tiene lugar la interaccin con la materia (debe producirse donde no haya
absorcin ni dispersin de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante
este proceso, se aplica la ley de Lambert-Beer en su mxima expresin, con base en sus
leyes de absorcin, en lo que concierne al paso de la molcula de fundamental-excitado.

Detector[editar]
El detector, es quien detecta una radiacin y a su vez lo deja en evidencia, para posterior
estudio. Hay de dos tipos:

a) los que responden a fotones;

b) los que responden al calor.

Fotodetectores[editar]
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 fotodetectores para percibir la
seal en forma simultnea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto
reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes mviles del equipo.

Celdas[editar]

Celdas de espectofotometra. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo con luz
ultravioleta; en segundo plano, de plstico, para colorimetra (es decir, empleando luz visible).

Son los recipientes donde se depositan las muestras lquidas a analizar. El material del
cual estn hechas vara de acuerdo a la regin que se est trabajando; son de vidrio o
plstico si se trabaja en la regin visible, de cuarzo si se trabaja en la ultravioleta y

de NaCl si se trabaja la regin de infrarrojo. Se caracterizan por tener dos paredes

correspondiente a los lados pticos por donde cruza el haz de luz.

Historia[editar]
En 1940 estaban disponibles en el mercado varios espectrofotmetros, pero los primeros
modelos no podan trabajar en el ultravioleta.Arnold O. Beckman desarroll una versin
mejorada en el National Technical Laboratorios Company, ms tarde la empresa Beckman
Instrument y en ltima instancia Beckman Coulter. Se desarrollaron los modelos A, B, y C
(se produjeron tres unidades del modelo C), y luego el modelo D, que se convirti en el
DU. Toda la electrnica estaba contenida dentro de la caja del instrumento y tena una
nueva lmpara de hidrgeno con continuum ultravioleta, y un mejor monocromador. Este
instrumento fue producido desde 1941 hasta 1976 con esencialmente el mismo diseo;
ms de 30 000 unidades fueron vendidas. El precio en 1941 fue de US$723. El laureado
con el Nobel de qumica Bruce Merrifield dijo que era probablemente el instrumento ms
importante que se ha desarrollado para favorecer la realizacin de la biociencia. 2