CATLISIS ENZIMTICA

Fundamentos Qumicos de la Vida

Anbal R. Lodeiro

(Coordinador)

Facultad de Ciencias Exactas

A nuestros maestros, que nos ensearon a caminar

A nuestros alumnos, sin quienes no podramos seguir el camino

Agradecimientos
A los organismos de Ciencia y Tcnica que hacen posible nuestro trabajo: CONICET, CICBA y ANPCyT.
A todos los colegas con quienes nos nutrimos diariamente en nuestro trabajo.
A los docentes del Area de Biotecnologa y Biologa Molecular (presentes y pasados), quienes siempre
colaboraron desinteresadamente para hacer que la docencia en el Area mejorara permanentemente.
A la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata por darnos el trabajo y la infraestructura.
A todos y todas quienes consideraron que la Ciencia, la Tecnologa y la Educacin son importantes para
el desarrollo del pas, y lo plasmaron en los hechos y no se quedaron solo en las palabras.

Son cosas chiquitas.

No acaban con la pobreza,
no nos sacan del subdesarrollo,
no socializan los medios de produccin y de cambio,
no expropian las cuevas de Al Bab.
Pero quiz desencadenen la alegra del hacer,
y la traduzcan en actos.
Y al fin y al cabo, actuar sobre la realidad
y cambiarla,
aunque sea un poquito,
es la nica manera de probar
que la realidad es transformable.
EDUARDO GALEANO

ndice

Prefacio
Anbal R. Lodeiro _________________________________________________________9
Introduccin
Anbal R. Lodeiro ______________________________________________________ 11-13
Conceptos generales de cintica enzimtica
Alberto Capparelli y Antonio Lagares ______________________________________ 15-38
Relacin estructura-funcin en la unin de ligando a enzimas
Gustavo Parisi _______________________________________________________ 39-51
Fundamentos de cintica enzimtica
Anibal R. Lodeiro ______________________________________________________ 53-74
Inhibicin y activacin reversible
Anibal R. Lodeiro ______________________________________________________ 75-89
Reacciones con ms de un sustrato
Anibal R. Lodeiro _____________________________________________________ 91-103
Efectos del pH y la temperatura
Daniela Hozbor y Anibal R. Lodeiro _____________________________________ 105-112
Alosterismo y cooperativismo
Gustavo Parisi ______________________________________________________ 113-122
Anlisis del control metablico
Augusto A. Melgarejo ________________________________________________ 123-133
Mtodos empleados en la purificacin de enzimas
Daniela Bottero y Daniela Hozbor _______________________________________ 135-148
Protocolos de ensayos de activacin enzimtica
Daniela Hozbor y Daniela Bottero _______________________________________ 149-157
Bsqueda de nuevas enzimas con actividades de inters (por qu?, para qu?,cmo?): Minera de
nuevas actividades naturales. Ingeniera de protenas hacia la creacin de enzimas de diseo
M. J. Lozano y A. Lagares _____________________________________________ 159-169
Los autores ________________________________________________________ 171-172

PREFACIO

Este libro tiene dos objetivos principales. Por un lado, llenar un vaco existente en libros sobre Catlisis
Enzimtica en lengua castellana, y por el otro lado, volcar por escrito nuestras experiencias con alumnos de
las carreras de Bioqumica, Biotecnologa, Ciencia y Tecnologa de los Alimentos, Farmacia, Fsica Mdica,
Optica Ocular y Optometra, Qumica y Qumica y Tecnologa Ambiental, en las que nos venimos desempeando desde hace muchos aos en la Facultad de Ciencias Exactas. Esa experiencia nos seal cules
son los conceptos que debemos reforzar, cules son los temas ms difciles de comprender, y cul es la
mejor forma de encararlos. Asimismo, hemos intentado actualizar los conocimientos de Catlisis Enzimtica
con los desarrollos ms recientes. Esperamos que este texto sea de ayuda a todos los que se inician en el
estudio de la Bioqumica y la Biologa Molecular y brinde la base para un aprendizaje autnomo y con sentido crtico al futuro profesional de estas reas.
El libro es fruto de un trabajo colaborativo con un equipo de docentes de primer nivel, que han contribuido con total dedicacin y entrega a la preparacin de los captulos que lo conforman, a quienes por ello
estoy profundamente agradecido.

Anbal R. Lodeiro
La Plata, 16 de Diciembre de 2015

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INTRODUCCIN
Anbal R. Lodeiro

Pienso, por lo tanto soy

REN DESCARTES, DISCURSO DEL MTODO

No estaras leyendo este libro si no existieran las enzimas. Claro... es un libro sobre enzimas, y si no
existieran las enzimas, no podra existir un libro que habla de las enzimas. Pero el problema es que tampoco existiras vos. La vida en este planeta es fundamentalmente un complejo metabolismo que ocurre dentro
de las clulas y tambin entre las clulas que forman los tejidos, entre los tejidos que forman los rganos,
entre los rganos que forman los cuerpos, y finalmente entre los cuerpos no slo de la misma especie, sino
tambin, y muy fundamentalmente, entre los cuerpos de especies distintas. Por ejemplo, el oxgeno que
respiramos es producido por plantas, algas y bacterias en el proceso de la fotosntesis; nuestro intestino
est lleno de bacterias que metabolizan parte de lo que comemos y digerimos, y como producto nos devuelven nutrientes que no podramos producir por nosotros mismos; el nitrgeno que forma parte de nuestras
protenas y nuestro ADN proviene del aire, para lo cual primero debe ser transformado por bacterias que
trabajan solas o asociadas a algas o a plantas y luego ingresar en un ciclo biogeoqumico que lo usa para
producir los aminocidos que ingerimos en nuestro alimento. Todos estos niveles metablicos (clula, tejido,
rgano, cuerpo, comunidad) son intrincadas redes de reacciones qumicas catalizadas por enzimas. Por lo
tanto, una caracterstica sobresaliente de las enzimas es que son catalizadores.
Como veremos en el Cap. 1, los catalizadores son sustancias que aceleran la velocidad de las reacciones qumicas, sin transformarse ellos mismos en el proceso. Decir que aceleran la velocidad de las reacciones no quiere decir de ninguna manera que alteren la termodinmica de las reacciones. Pese a que en
su nombre se incluye el sufijo -dinmica en las leyes de la termodinmica clsica, o de los sistemas cerrados, no interviene el tiempo. Un proceso es termodinmicamente espontneo si su variacin de energa libre
de Gibbs (G) entre el estado final y el estado inicial es menor que cero. Qu significa esto? Por qu le
decimos energa libre? Quiere decir que no est presa?
El trmino energa libre se emplea para sealar la parte de la energa de un proceso que puede ser utilizada para generar trabajo. Por ejemplo, si alzo una piedra y la coloco arriba de la puerta, evidentemente
estoy usando energa, porque tengo que hacer fuerza. Si despus alguien entra y abre la puerta, la piedra
le puede caer en la cabeza. Pero puedo hacer otra cosa: atar la piedra que est sobre la puerta al picaporte
haciendo pasar la soga por una roldana, de modo que la puerta se pueda cerrar sola, nada ms tocndola.
El trabajo de empujar la puerta ahora lo va a hacer la piedra que cuelga de la soga una vez que yo toque la
puerta y libere la piedra. Pero la piedra no va a subir sola otra vez a su posicin sobre la puerta. Esto es as
porque la energa libre de la piedra despus que la puerta se cerr es menor que antes de cerrarla; es decir
que la energa libre del estado final es menor que la del inicial y por lo tanto, la variacin de energa libre
entre el estado final y el inicial tiene signo negativo. Ahora fijate bien en esto: No importa cunto tiempo
pase desde que toquemos la puerta hasta que la misma se cierre. Nadie habl de eso. No dijimos que el
movimiento de la puerta tiene que ser rpido o lento. Lo nico que dijimos es que la variacin de energa
libre entre dos estados tiene que tener signo negativo. As, una reaccin qumica puede ser muuuuuuy lenta
en ausencia de enzima, pero eso no significa que no sea espontnea. Un catalizador solo la acelera, pero
no le cambia las variables termodinmicas. Dicho al revs: si una reaccin no es espontnea termodinmicamente, el agregado de un catalizador no la vuelve espontnea.
Las enzimas son pues catalizadores, y adems son catalizadores biolgicos. Son muy verstiles y adaptables porque en la mayora de los casos son protenas con estructuras muy complejas y flexibles. Por su
parte, la "intrincada red de reacciones qumicas" a que hicimos referencia, y que constituyen los seres vivos,
no es un desorden total, sino que se trata de miles de reacciones ocurriendo simultneamente en forma
ordenada y eficiente. Por ejemplo: date una mirada mientras segus leyendo. Dnde ests? en una silla?
en el asiento de un micro? en un parque? Y con qu ests sosteniendo el libro? con una mano? lo
tens sobre tus piernas? Ahora fijate un poco en tus msculos. Est claro que no estn haciendo ejercicio,
pero sin embargo estn trabajando a pleno; si no lo hicieran, te caeras como una bolsa de papas. Los
msculos de tu espalda estn trabajando, lo mismo que los de tus brazos y piernas para mantener tu posi-

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cin y eso requiere que all se est produciendo energa mediante el catabolismo de la glucosa, que involucra varias decenas de reacciones en las clulas musculares. Pero adems ests leyendo, lo cual quiere
decir que la luz est incidiendo en tus ojos en una variedad de colores que son captados por millones de
clulas de tu retina. All adentro hay clulas denominadas bastones y conos, que reciben la intensidad y el
color de la luz y mediante otras decenas de reacciones qumicas las transforman en seales que son decodificadas en tu cerebro para transformarlas en la imagen del libro y de todo lo que hay alrededor. Podra
seguir preguntndote: ests comiendo una galletita mientras les? ests tomando mate? Si es as, ests
digiriendo ese alimento y esa bebida, transformndolos en molculas orgnicas ms pequeas que al mismo tiempo ests usando para otros procesos metablicos. Mientras todo esto ocurre, tu ADN se est replicando en millones de clulas de tu cuerpo, todas tus protenas y lpidos se estn reciclando a diferentes
velocidades, y otras clulas de tu cuerpo aqullas que no se necesitan ms estn siendo conducidas a un
proceso de muerte celular programada y en su reemplazo estn reproducindose nuevas clulas con un
balance tal que tu cuerpo no aumenta ni disminuye de tamao en todo este proceso.
Ahora imaginemos que podemos mirar lo que pasa en una sola clula, pongamos por caso una clula
muscular de tu espalda. La glucosa que est all adentro est siendo usada para suministrar la energa necesaria para que no te caigas, pero tambin se necesita para producir la ribosa que va a formar parte de los
cidos nucleicos (ARN y ADN), los aminocidos que van a formar parte de las protenas y el glicerol que va
a formar parte de los triglicridos que esa clula est sintetizando sin parar. Pero la glucosa tambin podra
oxidarse a cido glucrico y sin embargo, y pese a que en el msculo hay una gran cantidad de oxidantes,
esa reaccin no est teniendo lugar. Quiere decir que pese a que todas estas reacciones son espontneas
termodinmicamente (tienen un G' < 0) no todas ellas tienen lugar a una velocidad apreciable. Por qu
entonces se cataliza la oxidacin de la glucosa a piruvato y no la oxidacin de la glucosa a cido glucrico?
Por qu el piruvato puede ser usado al mismo tiempo para producir energa y para producir alanina siendo
que ambos procesos tienen demandas diferentes? Esto es as porque las enzimas no solo son catalizadores, sino que fundamentalmente son catalizadores altamente especficos. En el ejemplo que acabamos
de mencionar, la descarboxilacin del piruvato para transformarse en acetil-coenzima A (paso fundamental
para la obtencin de energa en la fosforilacin oxidativa) es catalizada por una enzima llamada piruvato
deshidrogenasa, mientras que la transaminacin del piruvato para convertirse en alanina es catalizada por
otra enzima, completamente diferente, llamada alanina aminotrasferasa. Por otra parte, la oxidacin de la
glucosa a piruvato se inicia con la fosforilacin de la glucosa a glucosa-6-fosfato en una reaccin catalizada
por una enzima llamada hexoquinasa, la cual es absolutamente incapaz de catalizar la oxidacin de la glucosa a cido glucrico. En el Cap. 2 veremos cmo es que las enzimas pueden discriminar tan eficientemente entre los reactivos cuyas reacciones van a catalizar (a esos reactivos los llamaremos sustratos) y en
los Cap. 3 y 5 veremos cmo esa especificidad se manifiesta en una cintica de reaccin muy particular,
que nos ayudar a entender el rol de las enzimas en el metabolismo. Luego, en el Cap. 6 veremos cmo
ciertas condiciones, en particular el pH del medio y la temperatura, afectan la cintica de las reacciones
catalizadas por enzimas, y cmo los efectos de la temperatura pueden ser usados para calcular la energa
de activacin de la reaccin catalizada.
Ahora supongamos lo siguiente: ests leyendo este libro en un parque, levants la vista y ves que se
est nublando mal... al rato, comienzan a sonar los truenos y poco despus empieza a diluviar. A correr
para ponerse a resguardo!... esto tambin requiere la produccin de energa en los msculos, pero ahora a
una tasa mucho mayor que cuando estabas en reposo. Las reacciones de oxidacin de la glucosa para
proveer esta energa son las mismas, pero su velocidad se va a ver incrementada conforme aumenta la
demanda energtica. Esto significa que las enzimas (por ejemplo, la hexoquinasa) van a estar reguladas
para modificar su actividad cataltica rpidamente en respuesta a la demanda metablica. La regulacin de
la actividad enzimtica tiene varios niveles y no solo explica por qu la velocidad de las reacciones catalizadas puede cambiar en respuesta a estmulos, sino tambin por qu cada rgano de nuestro cuerpo cumple
una funcin especfica pese a que todos los rganos estn hechos de clulas genticamente idnticas, y
an por qu cada rgano tiene una forma especial, adaptada a esa funcin especfica. En los Cap. 4 y 7
veremos algunos principios de cmo puede regularse la actividad de las enzimas, y tambin cmo podemos
aprovechar este conocimiento para producir medicamentos o caracterizar procesos metablicos.
Pese a que la clula contiene una intrincada red de reacciones qumicas, que las mismas estn catalizadas especficamente por las enzimas y que las propias enzimas estn altamente reguladas, el metabolismo an sera un caos si no hubiera un control global del mismo. El control metablico no es ejercido por
alguna especie de programa que est de alguna manera por encima de la red metablica, sino que es una
caracterstica de la red metablica. Esto es difcil de entender si uno mira la red metablica como un mecanismo que pueda explicarse solamente conociendo las propiedades de los componentes individuales. En
vez de ello, la red metablica es un sistema, es decir un conjunto de componentes y sus interacciones. De
esas interacciones surgen a menudo propiedades emergentes, es decir, comportamientos o performances,
para usar la terminologa de J. Monod, que no son explicables a partir de los comportamientos o performan-

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ces de los componentes aislados, sino que son la consecuencia directa de la forma particular en la cual se
establecen las interacciones entre los componentes. Por lo tanto, la interacciones solo pueden conocerse y
analizarse cuando se mira el sistema en su conjunto. Por ms caracterizada que tengamos una enzima
purificada y estudiada en el tubo de ensayo, no podremos saber cmo participa del control del metabolismo
a menos que la estudiamos inmersa en la red metablica de la que forma parte. Estas redes, como as tambin las clulas y nosotros mismos, son sistemas abiertos fuera del equilibrio. Por lo tanto, para entender
cmo es el control metablico debemos primero entender cmo es el sistema, en este caso el sistema abierto fuera del equilibrio. Estas cuestiones se encararn a modo introductorios en el Cap. 8.
Siendo claves en la estructura de la vida, las enzimas deben ser cuidadosa y tenazmente estudiadas, y
para ello existen una variedad de mtodos tanto bioqumicos como genticos. La manera de usar estos
mtodos se expone en los Cap. 9-11, con lo cual concluye el libro.
En sntesis, lo que caracteriza a las enzimas es que no modifican el G de la reaccin pero s aceleran su velocidad, en forma altamente especfica y regulable. El estudio de sus propiedades estructurales, cinticas y metablicas es clave para entender la vida y para ello debemos ser capaces de purificarlas,
caracterizarlas y manipularlas genticamente. Hay preguntas fundamentales que luego podremos responder, como por ejemplo cmo evolucionaron las enzimas? cul es su origen? Si esto nos ayuda a entender
la vida en el planeta Tierra, nos permitir tambin entender la vida extraterrestre, el da (seguramente no
muy lejano) en que se descubra? Sobre la base de nuestra comprensin de las redes metablicas podremos estar seguros de que una suerte de moco o de gelatina descubierta en un planeta lejano sea efectivamente un ser viviente? Podremos proyectar la evolucin, es decir, predecir hacia dnde se encaminar en
el futuro lejano?
Obviamente, con estas preguntas nos estamos asomando a un abismo ms all de la frontera del conocimiento. Un abismo que no sabemos dnde termina, y que probablemente nunca sabremos dnde termina,
ya que a cada poquito que avanzamos en nuestra tarea de entender la Naturaleza el abismo se hace ms
grande. Y eso, abrir las puertas a cada vez mayores ignorancias, es lo excitante del camino que llamamos
ciencia.

Bibliografa
Monod, J. (1970) El Azar y la Necesidad. Ensayo Sobre la Filosofa Natural de la Biologa Moderna. Barcelona: Tusquets.

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Captulo 1
Conceptos Generales de Cintica Qumica
Alberto Capparelli y Antonio Lagares

Qu es, pues, el tiempo? Si nadie me lo

pregunta, lo s; pero si quiero explicrselo al
que me lo pregunta, no lo s. Lo que s digo sin
vacilacin es que s que si nada pasase no
habra tiempo pasado; y si nada sucediese, no
habra tiempo futuro; y si nada existiese, no
habra tiempo presente.
SAN AGUSTN DE HIPONA. CFR. CONFESIONES XI,14,17.

Procesos de cambio, composicin e identidad celular. Problemas antiguos, ciencias nuevas

Entender el devenir de las cosas ha sido desde hace mucho tiempo para el hombre motivo de anlisis
profundo ante la necesidad natural que ha sentido de explicar las observaciones cotidianas del mundo que
lo rodeaba. Aun desconociendo la estructura ntima de la materia, los cambios en las cosas (entes) materiales han sido foco de estudio en la antigua Grecia del siglo VI a.C. con el propsito de describir e identificar
primariamente aquello que perdura de aquellos que fenece. La ntima relacin de los procesos de cambio, y
su relacin con el tiempo, contina siendo hoy centro del pensamiento de fsicos (Hawking, 1989), qumicos
(Prigogine, 2005) y filsofos contemporneos (Mahner y Bunge, 2000).
La revolucin que ha operado en el siglo XVIII en las ciencias qumicas a partir de la identificacin de los
primeros elementos y las mediciones que sustentaron el principio de conservacin de la masa (A. Lavoisier,
1743-1794), sentaron las primeras bases elementales para -por primera vez- pensar en un anlisis numrico
formal de la dinmica de los procesos de cambio qumico (cintica qumica). Los avances extraordinarios en
la qumica orgnica del siglo XIX dieron marco general y acompaaron a los experimentos pioneros de medidas del progreso temporal de la hidrlisis cida de la sacarosa que realizara L. Wilhelmy (1812-1864), y
poco ms tarde a las primeras bases formales de la cintica qumica en manos de J. H. Vant Hoff (18521911)(Estudios de dinmica qumica, 1884) y S. Arrhenius (1859-1927). Tales hallazgos fueron adems
contemporneos del primer planteo formal del equilibrio qumico hacia 1864 por parte de Waage (18331900) y C. Guldberg (1836-1902) como un fenmeno resultante de reacciones opuestas a travs de la ley
de accin de masas. La aparicin de la mecnica cuntica a comienzos del siglo XX y el uso de la termodinmica estadstica, sentaron finalmente las bases para el desarrollo de las teoras centrales de la cintica
qumica moderna, hoy acompaadas por tcnicas experimentales que permiten resoluciones temporales del
-15
orden de los femtosegundos (10 s).
En el contexto de la visin actual aun en desarrollo de la historia y evolucin de la vida en la superficie
terrestre, la variable temporal es un componente decisivo a la hora de interpretar la dinmica tanto de los
procesos qumicos ms elementales (entre molculas celulares), como la de los procesos ms complejos de
la bisfera (ambientales atmosfricos y terrestres, y entre organismos y ecosistemas). Entender las prioridades temporales que el diseo de la vida asigna a cada evento, y cmo los mismos son modulados por el
ambiente en relacin al transcurso del tiempo, est entre los objetivos centrales de todo estudio de un sistema biolgico (J. A. Wheeler ha expresado que el tiempo es el modo que tiene la naturaleza de evitar que

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todo ocurra a la vez). Afirmar en trminos bioqumicos que un proceso determinado no tiene lugar en una
instancia particular (lugar y tiempo), equivale en trminos formales a decir que dicho proceso es lento, sin
significancia para la vida celular en esas circunstancias. Por el contrario, cuando referimos a procesos de
cambio apreciables necesitamos expresar la intensidad relativa de cada uno de los cambios, que sern
adems los que en cada condicin a lo largo de la vida definirn lo que la clula es en acto (lo que se
observa) y tambin en potencia (lo que puede ser a partir de nuevos estmulos a su condicin actual). En
otros trminos, la condicin qumica de no equilibrio que caracteriza a cualquier clula viva es consecuencia
directa de una historia inmediata que la ha conformado (reacciones), y tambin sustento fsico para aquellas
nuevas posibilidades de cambio a las que podr acceder. Resulta de suyo entonces que la condicin qumica que alcanza una clula en un instante determinado (de todos sus componentes) define su identidad,
incluyendo sus posibilidades de cambio. La biologa de sistemas, cuyo nombre formaliza con modernismo
una rama histrica de la bioqumica, no hace ms que buscar la descripcin ms acabada del mapa composicional de los diferentes estados celulares, y el modo en que la clula transita entre unos y otros a travs
de cinticas coordinadas (flujos) que han sido moldeadas a lo largo de la evolucin (regulacin).

Qumica para qumicos?qumica para bilogos?, o simplemente: qumica

Las ideas presentadas en la seccin precedente muestran a la comprensin temporal de los diferentes
procesos que tienen lugar en la clula como eslabones esenciales para la construccin de una imagen integrada de su composicin y de sus dinmicas de cambio (esto es, de su metabolismo). La inclusin del
presente captulo en un libro de enzimas tiene como principal objetivo disuadir al lector de cualquier
idea que pretenda diferenciar las bases cinticas de los procesos celulares de aquellas que rigen la
generalidad de los procesos qumicos que siempre ha estudiado.
En segundo lugar, las pginas que siguen estn orientadas a revisar conceptos que seguramente ha visto, con el propsito de consolidar algunas ideas y trminos (velocidad de reaccin, ley de velocidad, orden
de reaccin, molecularidad, mecanismo de reaccin, energa de activacin) que son importantes a la hora
de caracterizar y describir, sobre base formal, el cambio temporal de procesos qumicos. Cada uno de estos
conceptos podr ser revisado y complementado en la literatura corriente de cintica qumica [Atkins (2008),
Castellan (1987), Dickerson & cols. (1999), Levine (2004)].
Finalmente, haremos breve mencin a la catlisis qumica como expresin real de vas alternativas de
reaccin, para la consecucin de productos en tiempos menores respecto a la reaccin no catalizada; teniendo especialmente en cuenta que la estrategia celular a lo largo de toda la escala evolutiva es la de contar con reacciones lentas que pueden ser aceleradas por la presencia de catalizadores especficos (-> las
reacciones celulares directrices son lentas, pudiendo ser acelerarlas en momentos precisos por via cataltica). Dejaremos para los captulos siguientes de este libro la descripcin y tratamiento de la estructura, funcin, y caractersticas cinticas asociadas a los catalizadores celulares centrales: las enzimas.

Cintica qumica
El estudio de las reacciones qumicas puede encararse desde el punto de vista termodinmico con el fin
de establecer las condiciones en las cules estas pueden ocurrir en forma espontnea. Con este enfoque,
no interesa conocer la evolucin temporal de los mismos, ni tampoco saber cmo es el o la suma de procesos que acompaan a la transformacin cuando esta tiene lugar.
La cintica qumica, por el contrario, estudia la velocidad de las transformaciones y se preocupa por conocer sus mecanismos; es decir, como son las etapas que llevan a los reactivos desde la condicin de reactivos a la de productos, incluyendo un conocimiento tan detallado como sea posible sobre los posibles intermediarios que pueden formarse durante la reaccin, as como tambin conocer los factores que son relevantes y controlan la velocidad del proceso (el medio, por ejemplo). A modo de ejemplo, la reaccin de Friedel-Crafts, que normalmente requiere 8 horas a 80C, con un rendimiento de 80% y con formacin de ismeros diferentes, cuando se realiza en lquidos inicos requiere 30 segundos a 0 C, con un rendimiento de
98 % de un nico ismero. El impacto positivo sobre el ambiente es evidente.
Para el estudio detallado de los distintos aspectos de la cintica qumica y de los principios fundamentales sobre la que se sustenta la interpretacin terica de este campo de la fisicoqumica, se requieren conocimientos de estructura molecular y termodinmica estadstica. Esto no implica que puedan desarrollarse las
nociones fundamentales en diferentes niveles, y a medida que se progresa en el estudio del tema incorporar
conceptos ms avanzados.

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Los estudios cinticos y los termodinmicos atienden a diferentes aspectos de los

procesos de cambio
En los procesos termodinmicos para el clculo de funciones de estado no es necesario conocer cmo el
sistema evoluciona desde un estado a otro, pero s es relevante para estudios de cintica qumica. En la
Tabla 1.1 se compararn algunas de las diferencias ms importantes entre ambos enfoques. La informacin
termodinmica es fundamental para el anlisis cintico de numerosos procesos.
Tabla 1.1. Comparacin entre objetivos generales de la termodinmica y la cintica qumica.

Termodinmica
Los resultados termodinmicos son independientes
del camino, y no se requiere del conocimiento del
mecanismo de reaccin ni de la velocidad a la cul
ocurre el proceso
La determinacin de la constante de equilibrio constituye un aspecto importante de la aplicacin de la termodinmica a reacciones qumicas. Es posible predecir constantes de equilibrio a partir del conocimiento de la estructura molecular, fundamentalmente la
que proviene de las medidas e interpretacin de espectros moleculares (microondas, infrarrojo, visibleultravioleta).

Cintica qumica
La determinacin de la velocidad de reaccin y el
conocimiento del camino o de los canales de reaccin son objetivos centrales en cintica qumica.
En cintica qumica, la medida de la velocidad de
reaccin conduce al conocimiento de la constante
de velocidad. Sin embargo, existen dificultades
tericas en la prediccin de las constantes de velocidad a partir de la estructura molecular. Esta
situacin es compleja cuando la reaccin es tambin compleja.

Conceptos bsicos y aspectos formales de la cintica qumica

En cintica qumica es necesario definir los conceptos de velocidad de una reaccin, ley de velocidad, y
orden de reaccin cuando corresponda. Asimismo, para reacciones particulares es necesario establecer su
mecanismo, identificando las etapas (y su molecularidad) a travs de las cuales evoluciona temporalmente
el sistema durante el proceso. Las tres primeras definiciones son magnitudes experimentales que se determinan sobre la base de cambios macroscpicos, mientras que el mecanismo es normalmente una hiptesis
que debe ser objeto de verificacin experimental.

Velocidad de reaccin
La velocidad de una reaccin qumica est relacionada con la medida del cambio de la concentracin de
las especies (reactivos o productos) por unidad de tiempo.
La medida de la velocidad requiere de la determinacin de la concentracin instantnea de las distintas
especies. Se habla que es necesario determinar el perfil de concentraciones de reactivos o productos a
medida que la reaccin progresa en el tiempo. La concentracin de las especies participantes puede evaluarse por mtodos qumicos o fsicos. En el primer caso, se hace necesaria la medida de la concentracin
deteniendo el proceso para su posterior tratamiento con tcnicas analticas convencionales (titulacin, gravimetra, etc). En el segundo tipo de anlisis, se requiere que la concentracin de alguna o todas las especies presentes en el sistema sean proporcionales a alguna propiedad fsica, bsicamente que sea fcil de
medir, una funcin lineal y sencilla de la concentracin. En el conjunto tcnicas que renen estas caractersticas pueden mencionarse:
# Espectrofotometra IR, UV-visible, UV
# Espectrometra de resonancia magntica nuclear, resonancia paramagntica electrnica, espectrometra
de masa, etc.
# Polarimetra, conductimetra, potenciometra, etc
# HPLC, cromatografas de gases o combinadas, etc

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Extensin o grado de avance de reaccin ()

Dada una reaccin:

aA + bB cC

(1.1)

se entiende por grado de avance a la medida del nmero de moles de reaccin que tienen lugar cada vez
que los reactivos reaccionan estequiomtricamente para dar productos. La velocidad de la reaccin qumica
indicada por la ecuacin (1.1) puede evaluarse a partir de la medida con que A o B desparecen o por la
formacin de C. Si la concentracin de A se expresa como [A] y esta se mide en funcin del tiempo, puede
llegar a obtenerse un perfil de su evolucin temporal como la que se indica en la Figura 1.1. La velocidad
con que A desaparece puede evaluarse directamente midiendo la pendiente en cualquier punto de la curva
que describe la evolucin temporal de la concentracin de A. La pendiente de la recta tangente a la curva,
d[A]/dt al tiempo t da cuenta del cambio temporal por unidad de tiempo de la concentracin de la especie A.
[A]
[A]0

tiempo
Fig.1.1. Perfil de concentracin de uno de los reactivos en funcin del tiempo, y definicin de lavelocidad instantnea como la
medida de la pendiente de la curva en un tiempo dado.

Por ejemplo, para una cintica A + 2B C, la velocidad a la que desaparece A es igual a la que aparece
el producto C. A su vez cada vez que un mol de A reacciona, se consumen dos moles de B. Esto determina
que debe cumplirse que:
-d[A]/dt = - d[B]/dt = d[C]/dt
En consecuencia, en la medida de los cambios de concentracin debe prestarse atencin a la estequiometra de la reaccin. Si en lugar de evaluar la evolucin temporal de A, como en la Figura 1.1, se
mide la de B o C, se observar que los valores de las pendientes sern diferentes si tambin lo son los coeficientes estequiomtricos.
La definicin de velocidad de una reaccin qumica se realiza en forma general sobre la base del grado
de avance . As, la ecuacin (1.1) puede representarse algebraicamente como:
cC - (aA + bB) = 0, es decir, k vk . Ak = 0
siendo vk el coeficiente estequiomtrico de la especie Ak que interviene en la reaccin. En esta ecuacin, vk
es positivo si Ak es producto, mientras que toma valores negativos si Ak es reactivo.
Para hallar la expresin de la velocidad en trminos de , debe considerarse que el nmero de moles de
la especie k-sima en un instante de tiempo se expresa

nk nk0 k

(1.2)

dnk
d
k
dt
dt

(1.3)

Luego,

La velocidad de la reaccin se define como el nmero de moles de reaccin que ocurren en la unidad de
tiempo. Luego,

d
1 dnk

dt k dt
18

(1.4)

Por ejemplo, para la reaccin A + 2B C

nA = nA0 - (t)

nB = nB0 - 2.(t)

nC = nC0 + (t)

La expresin de la velocidad de esta reaccin queda definida (independientemente de la especie cuya concentracin se monitorea en el experimento)

d
dn
1 dnB dnC
A

dt
dt
2 dt
dt

(1.5)

y para una reaccin genrica, aA + bB cC + dD

d
1 dnA
1 dnB 1 dnC 1 dnD

dt
a dt
b dt c dt
d dt

(1.6)

Medida de la velocidad de una reaccin

La velocidad de las reacciones qumicas abarca un amplio intervalo de rdenes de tiempo. Existen reacciones muy lentas que pueden estudiarse siguiendo el cambio de concentraciones en el tiempo con un
cronmetro estndar como mtodo convencional para monitorear la evolucin temporal del proceso. Estas
son reacciones que ocurren en tiempos superiores a las decenas de minutos hasta horas, das o en escalas
de tiempo superiores. Por otro lado, existen otras reacciones que son suficientemente rpidas y para las
cuales los mtodos convencionales no son aplicables y debe recurrirse al registro digital de los cambios de
concentracin como funcin del tiempo. En estos casos, las reacciones pueden iniciarse y completarse en
tiempos muy breves, por ejemplo en segundos, milisegundos, microsegundos, o an en escala de tiempos
inferiores. Los desarrollos que se introdujeron en los ltimos aos permiten acceder a estudios en el campo
-15
de la fotoqumicas a escalas de tiempo del orden del femtosegundo (10 ). Los tipos de procesos que pueden estudiarse en los distintos intervalos de tiempo menores a los pocos milisegundos se resumen en la
Tabla 1.2.
Tabla 1.2. Tipos de procesos en distintas escalas de tiempo menores a los 10 milisegundos y hasta el atosegundo (10 -18 s). La
divisin temporal es cualitativa (adaptada de A. Zewail, en Femtochemistry, F.C.De Schryver et al. (Ed.), Wiley (2001).

En relacin a los sistemas biolgicos en particular, los cambios que experimentan a diferente nivel
abarcan intervalos de tiempo que exceden a los presentados en el diagrama anterior, con una correlacin cualitativa entre las dimensiones de la porcin de sistema analizada y la escala de tiempo en
que tienen lugar los cambios asociados a la misma. Puede decirse en trminos genricos que los cambios a nivel de rganos ocurren en general en escalas de tiempo de los segundos o mayores, con los cam-3
bios celulares en escala de los milisegundos (10 s), y los macromoleculares y de molculas pequeas en
-9
-15
escala de los nanosegundos (10 s) y femtosegundos (10 s), respectivamente. Tal correlacin de los
tiempos de cambio respecto de los tamaos de las entidades participantes, es consecuencia de vnculos

19

subyacentes entre las energas puestas en juego en cada una de las escalas y las masas de los sistemas
considerados.

Ley de velocidad
La velocidad de una reaccin qumica es afectada por cambios en las concentraciones de reactivos y
productos, por la temperatura, la presin, la fuerza inica del medio si en la misma participan especies polares o inicas en fase lquida, y a esto debe sumarse la posibilidad del efecto de superficies.
Los procesos cinticos pueden ocurrir en sistemas homogneos o heterogneos, aunque pueden existir
contribuciones de procesos homogneos y heterogneos.
La ley de velocidad debe describir en forma precisa como estos factores influyen la velocidad del proceso. En general esta ley es una funcin del tipo F(c, T, P, I, V, A), donde c representa todas las concentraciones que realmente afectan el proceso, T y P corresponden a la temperatura y presin, I a la fuerza inica en
caso de corresponder, V y A indican como el volumen del reactor y la superficie intervienen en esta ley. En
general,
v = F((c, T, P, I, V, A) = vhomogneo + vheterogneo

(1.7)

La influencia del volumen del sistema y de la superficie siempre resultan ser aditivas, de manera que:
v = V . f1(T,P,c,I) + A . f2(T,P,C)

(1.8)

Con f1 y f2 se describen las contribuciones de procesos en fase homognea y heterognea. En el caso de

no existir ninguna influencia de la superficie del reactor, la ecuacin de velocidad puede llevarse a formas
ms familiares para los qumicos:

1 d
1 dnA
1 dnB 1 dnC 1 dnD

f1 (T , P, c, I )
V dt
a V dt
b V dt c V dt d V dt

(1.9)

Si el volumen de reaccin no se modifica en el tiempo, entonces la ecuacin 1.9 toma la forma:

1 d
1 d (nk V ) 1 dck

f1 (T , P, c, I )
V dt k
dt
k dt

(1.10)

donde ahora ck es la concentracin en moles por unidad de volumen (normalmente molaridad, M = moles.L
1
). El problema consiste en conocer la funcin f1 que en definitiva expresar la ley de velocidad.

No existe una manera a priori que permita, a partir de la estequiometra de la reaccin, conocer la
ley de velocidad en reacciones complejas (ver ms adelante la descripcin de este tipo de reacciones). Slo es posible describir la ley de velocidad a partir de la estequiometria de la reaccin en caso
de reacciones que transcurren en una sola etapa (reacciones simples) como se discutir en el siguiente punto. Esta consideracin implica que para cualquier proceso general, la ley de velocidad
debe obtenerse de un estudio sistemtico y experimental de la cintica en estudio. En la ley de velocidad pueden intervenir las concentraciones o presiones de reactivos, y a veces las de reactivos y productos. En los casos en que en la ley de velocidad intervengan en el denominador de la misma la concentracin
de un reactivo y/o producto, se dir que estas especies inhiben la reaccin.

Orden de reaccin
Considere una reaccin genrica aA + bB cC por ejemplo. Si la ley de velocidad puede escribirse en la
forma:
(1.11)
donde los exponentes (alfa), (beta), y (gama), pueden ser mayores, menores que cero y an fraccionarios. A los exponentes a los cules estn elevadas las concentraciones cuando la ley de velocidad

20

adopta la forma indicada por la ecuacin (1.11), se denominan rdenes parciales de la reaccin y a
su suma se la define como el orden global de la reaccin qumica. Es importante sealar que el orden
de reaccin no siempre est definido y no puede conocerse de la estequiometra de una reaccin compleja.
Mecanismo de reaccin y molecularidad.
Las reacciones qumicas evolucionan a travs de una serie de etapas o canales de reaccin desde la
condicin de reactivos a la de producto o productos. Se define como mecanismo a la sucesin de procesos
asociados a esta transformacin. Si la reaccin ocurre en una nica etapa, si dir que el mecanismo es
simple. Esto implica que los reactivos pueden convertirse en productos en un nico encuentro entre las
molculas de (los) reactivo(s).
Se define como molecularidad al nmero de molculas y/o tomos que participa en una reaccin
elemental. As, para una reaccin simple o elemental, A + B C, la ley de velocidad puede hallarse directamente a partir del conocimiento de los coeficientes estequiomtricos. En este caso:
v = k.[A][B]
Si la reaccin tiene lugar en varios pasos, la misma no es ya elemental, aunque cada uno de estos pasos
as lo sean. El mecanismo en complejo. En estos sistemas, la ley de velocidad no puede evaluarse a partir
de la lectura de los coeficientes estequiomtricos asociados con la reaccin en estudio. Supongamos por
otra parte una situacin en la que una reaccin de la forma A2 + B2 2AB sigue una ley de velocidad con la
siguiente forma:
v = k [A2][B2]
donde los rdenes parciales coinciden con los coeficientes estequiomtricos. Debe sealarse que esto no
garantiza que el proceso en cuestin corresponda a una reaccin elemental.
Puede resumirse que:
En una reaccin elemental el orden de reaccin u rdenes de reaccin parciales coincide con la suma
de sus coeficientes estequiomtricos o con los coeficientes estequiomtricos individuales respectiva
mente.
Si el orden de reaccin global coinciden con la suma de los coeficientes estequiomtricos y simult
neamente los rdenes parciales con los coeficientes estequiomtricos individuales, no puede asegu
rarse que la reaccin sea elemental.
Si los rdenes parciales y los coeficientes estequiomtricos difieren, entonces la cintica tiene un me
canismo complejo.
Cuando el mecanismo es complejo, y en la reaccin se generan intermediarios o se proponen intermediarios
que no estn ni al principio ni al final de la reaccin (aunque en algunos casos estos puedan aislarse), el
estudio cintico requiere que:
Se caractericen todas las etapas de la reaccin.
Se identifiquen y caractericen todos los intermediarios.
Debe tenerse en cuenta, que mientras la ley de velocidad es una formulacin experimental, el mecanismo es siempre slo la mejor interpretacin que se dispone con las herramientas accesibles de anlisis. En
otras palabras, la ley de velocidad es un hecho fctico, que surge de la experiencia. El mecanismo es
la mejor hiptesis para explicar el comportamiento experimental. Puede existir ms de un mecanismo que puedan conducir a la misma ley experimental. La eleccin de la hiptesis del mecanismo debe
apoyarse en la identificacin y caracterizacin de todos los intermediarios posibles que se generan o producen en una reaccin compleja. La hiptesis sobre un mecanismo puede ser rebatida o abandonada, si mejora la calidad de la informacin experimental y/o terica.

Unidades de la constante de velocidad

Considere que la velocidad de una reaccin puede escribirse en la siguiente forma:

dc A
k c
dt
21

(1.12)
Las unidades de la constante de velocidad dependen del orden de reaccin, tal como se indica a continuacin, donde la concentracin se expresa, por ejemplo, en unidades de molaridad M y el tiempo en segundos. La unidad de velocidad siempre queda expresada en M/s.
orden

[k]

1/s

n
(n-1)

1/M .1/s

1/M

. 1/s

Determinacin experimental del orden de una reaccin qumica

Varios son los mtodos para determinar el orden de reaccin. Pueden citarse los siguientes:
# Determinacin del orden de reaccin por prueba y error. En este mtodo, se supone a priori un orden
de reaccin, se integra luego la ecuacin de velocidad y se compara el resultado de la prediccin con el
comportamiento experimental.
Cintica de primer orden.
Considere que el orden =1. La ecuacin de velocidad (1.12) en trminos de evolucin temporal del reactivo (A) se reordena y se integra entre t=0 y el tiempo t, dando lugar a:

dc A
k cA
dt

dc A
d ln c A k dt ln c A C kt
cA

(1.13)

Si la hiptesis es vlida, entonces debera observarse una dependencia lineal de los valores del logaritmo
de las concentraciones del reactivo como funcin del tiempo. La constante de integracin es el valor de la
0
funcin cuando t = 0, es decir, C = ln c A
Luego:

ln cA ln cA0 kt c A cA0 .e k .t

(1.14)

La pendiente de la recta en la ecuacin (1.13) o (1.14) (Figura 1.2) es la constante de velocidad k con signo
negativo:
ln cA

tiempo
Fig. 1.2. Comportamiento esperable del lnCA vs t bajo la hiptesis de una cintica de primer orden.

Se define tiempo medio de reaccin t1/2 al tiempo requerido para que la concentracin inicial del reactivo se
reduzca a la mitad de la inicial. Luego:

ln

cA
c A0
1

kt

ln kt1/ 2
A
0
cA
2
2

22

t1/ 2

ln 2
k

(1.15)

En una cintica de primer orden, el tiempo medio es independiente de la concentracin inicial. Si se dispone de una traza del perfil de concentracin de un reactivo en funcin del tiempo (Figura 1.3), es posible inducir en una primera aproximacin si la cintica es de orden 1.

Fig.

1.3.

Estimacin
del
orden
de
reaccin
partir de la traza de la evolucin tempo
ral de la concentracin.

Si de la traza se evala el tiempo necesario para que la concentracin se reduzca a , , , etc. de la

concentracin inicial, los tiempos requeridos para alcanzar estos valores son t 1/2, 2.t1/2, 3.t1/2 etc. Si el anlisis no coincide con el comportamiento experimental, deben ensayarse otros rdenes de reaccin. Este
comportamiento es tpico de procesos de primer orden. En general, para garantizar el orden de una reaccin
dada es conveniente estudiarla en una escala de tiempo superior al menos tres tiempos medios.
Cintica de segundo orden.
Si el anlisis previo no se ajusta a una cintica de orden 1, puede proponerse otro orden, por ejemplo = 2.
En este caso, si A es el reactivo:

dc A
k c A2
dt

dc A
k dt
c A2

1
C kt
cA

La constante de integracin se evala a t=0, donde cA=c A, la concentracin inicial.

Fig. 1.4. Comportamiento de la concentracin que se ajusta a la

ecuacin siguiente:

1
1
0 kt
cA cA

(1.16)

Al tiempo medio de reaccin, t1/2, la concentracin del reactivo debe ser la mitad de la inicial. Luego:

t1/ 2

1
k c A0

A diferencia de los procesos de primer orden, en estos casos, el tiempo medio depende de la concentracin inicial. Si el sistema cumple con esta consideracin, entonces, la representacin de 1/cA versus el tiempo debe dar una recta de pendiente positiva e igual a la constante de velocidad k, tal como se esquematiza
en la Figura 1.4.
Al igual que lo indicado para las cinticas de primer orden, las medidas de cambios de concentracin en
funcin del tiempo deben realizarse durante ms all de tres o cuatro tiempos medios.
En general, el anlisis por prueba y error tiene inconvenientes en casos de mayor complejidad. Se pueden proponer otros mtodos ms adecuados para evaluar el orden de reaccin. Si bien el manejo en forma
de grficos de la informacin experimental suele ser conveniente, la aplicacin de herramientas del anlisis
de regresin es aconsejable.

23

Determinacin del orden de reaccin a partir del tiempo medio de reaccin

Considere una cintica con > 1 cuya ley de velocidad sea la indicada en la ecuacin (1.12.)

dc A
k c
dt

. Su integracin entre t=0 (con cA=c A) y el tiempo t permite obtener:

1
1

cA

0 1
A

1 k t

(1.17)

Cuando el orden de reaccin no es conocido, este puede evaluarse a partir de medidas del tiempo medio
de reaccin. Luego, a partir de la ecuacin (1.17) se obtiene:

2 1 1

1 c A0 1

k t1/ 2

(1.18)

Tomando logaritmo en ambos miembros de la igualdad en la ecuacin (1.18):

2 1 1
0
ln t1/ 2 ln
ln k 1 ln c A
0 1
1 c A

(1.19)

Midiendo tiempos medios de reaccin para distintas concentraciones iniciales y representando ln t1/2 versus
0
ln c A, debera obtenerse una dependencia lineal como la que se muestra en la Figura 1.5:

Fig.

1.5.

Determinacin del
orden
partir
del
anlisis
de
en funcin de la concentracin.

de
reaccin
a
tiempos
medios

El valor de la pendiente m coincide con m = - 1. As se obtiene = m + 1

Para una cintica de primer orden se verifica que el tiempo medio es independiente de la concentracin
inicial.

Determinacin del orden de reaccin a partir de medidas de la velocidad inicial

Considere la reaccin aA + bB Productos. Si la velocidad de esta reaccin puede escribirse como:
(1.20)
la determinacin del orden de reaccin puede realizarse midiendo las velocidades iniciales v 0.
Este mtodo es adecuado si no existe un perodo de induccin en la reaccin. Se entiende por perodo de
induccin al tiempo que transcurre desde el momento de la mezcla de reactivos hasta el tiempo en que se
inicia la reaccin. Este perodo depende de varios factores y puede variar de sistema a sistema.
Si se conocen las concentraciones iniciales de reactivos (y/o productos, hecho que es de particular importancia cuando la ley experimental depende de sus concentraciones), la velocidad inicial para el caso indicado previamente ser:

24

(1.21)
Es importante evaluar con precisin la tangente al origen para determinar v 0. Este mtodo permite determi0
nar los rdenes parciales. Si se fija la concentracin inicial de uno de los componentes (por ejemplo, c B=
0
constante) y se mide la velocidad inicial para distintas concentraciones iniciales del otro componente (c A
variable), la ley de velocidad puede reescribirse como:
(1.22)
0

donde kap es una constante de velocidad aparente, definida en este caso como k.( c B). La representacin
doble logartmica siguiente:
debera ajustarse a una dependencia lineal de cuya pendiente se obtiene el orden parcial . La inversin del
0
0
procedimiento, variando la concentracin c B a c A constante, permite obtener . El anlisis de la ordenada
al origen permite obtener la constante de velocidad.
Las ventajas y desventajas de este mtodo de medida del orden de reaccin pueden resumirse de la siguiente manera:
Es conveniente en cinticas complejas debido a la presencia de reacciones laterales o varias etapas.
Al no ser necesario la integracin de la ley de velocidad se evita trabajar con expresiones de compleji
dad variable
Puede estudiarse el efecto de productos o potenciales intermediarios en la velocidad del proceso, in
corporndolos en el sistema al comienzo de la reaccin.
El mayor inconveniente es el nmero de experimentos que deben llevarse a cabo para hallar la ley de
velocidad, y a la vez se requiere un experimento muy controlado para obtener perfiles de concentra
cin para un nivel bajo de conversin de reactivos en productos.
Aunque con un objetivo diferente al de determinar el orden de reaccin, la medida de velocidades iniciales
es la forma ms frecuente de estimar velocidades en reacciones catalizadas por enzimas (ver Captulos 3 y
5 de este libro).

Reduccin del orden de reaccin global. Cinticas de pseudoprimer orden

De manera similar a situaciones previas, considere una cintica cuya ley de velocidad tenga la forma:
v = k. cA.cB
Si se trabaja en exceso de uno de los reactivos de manera tal que su consumo no implique cambios significativos en su concentracin, entonces esta puede tomarse constante y el orden global se reduce al de la
0
0
otra especie en defecto. Si el sistema se prepara de manera tal que c A << c B, y para la concentracin del
t
0
compuesto B al tiempo t se observa que c B c B, entonces, la ley experimental adopta la forma
con
El anlisis del cambio en el tiempo de la concentracin de la especie en defecto permitir obtener el orden
parcial de reaccin respecto de la misma. Cuando =1, en las condiciones anteriores la cintica es de
pseudoprimer orden.
Un ejemplo clsico en cintica qumica de una cintica de pseudoprimer orden es la inversin de la sacarosa catalizada por cidos. La reaccin en soluciones acuosas es la siguiente:

La ley experimental es v = kap.[S]. Ahora, kap depende tanto de la concentracin de protones (catalizador,
que no se consume en la reaccin) como de la de agua. El tiempo medio se modificar con la concentracin

25

del catalizar y con la concentracin de agua, efecto que se podr observar en el caso que la reaccin se
lleve a cabo en mezclas de agua y etanol o agua y acetona, donde se pueda regular la [H2O].
El estudio detallado de kap con la concentracin de protones muestra que a concentraciones no muy
elevadas de sacarosa en soluciones acuosas, la cintica es de orden 1 en protones en soluciones diluidas
de cido. La determinacin del orden de reaccin parcial en agua requiere trabajar con medios no acuosos
donde, sin cambio en el mecanismo de la reaccin, la concentracin de agua pueda ser regulada externa+
n
mente. La constante de velocidad experimental resulta kap = k.[H ].[H2O] , con n 4. La constante k no es la
constante de velocidad de un proceso nico, sino que es combinacin de varias constantes de velocidad por
tratarse de una cintica compleja.
Otro ejemplo clsico se presenta en el estudio de varias reacciones catalizadas por enzimas. En estos
sistemas, se realizan medidas de velocidades iniciales. En estas condiciones, la concentracin de sustrato S
es su concentracin inicial [S]0. El sustrato se pone en contacto con un enzima cuya concentracin total es
[E]0, y se mide la evolucin de [S] en el tiempo, evalundose la pendiente a la curva en el origen. As, se
observa que la ley de velocidad obedece a la expresin conocida como ecuacin de Michaelis-Menten:

v0

k [ S0 ] [ E0 ]
K M [S0 ]

La que en concentraciones de sustrato [S] <<< KM se reduce a:

v0

k [ S0 ] [ E0 ]
KM

que indica un orden parcial 1 en el sustrato y 1 en el enzima. Por otro lado, cuando [S 0] > KM, se verifica
que:

v0 k [ E0 ] vmx
siendo entonces la cintica de orden cero en el sustrato y de orden 1 en el enzima.
El detalle de la deduccin de la ley de Michaelis-Menten y las diferentes caractersticas de la misma en relacin a su uso prctico en estudios de enzimas que obedecen a la misma, ser abordado en el Captulo 3 del
presente libro. Es importante sealar, que reacciones consecutivas del tipo:
k1

k2

k1

k1

k12

k1

kn
S E ES ES I ES II
P E v0

k2
[S ]0 [ E ]
K [S ]0

conducen a la misma ley de velocidad que la planteada previamente, por lo que dicha ley no aporta informacin sobre el mecanismo real de una cintica enzimtica. La constante KM* involucra una combinacin de
las distintas constantes de velocidades especficas asociadas con los distintos intermediarios.

Integracin de ecuaciones de velocidad de segundo orden

Considere nuevamente la reaccin aA + bB Productos, que obedece a una ley cintica de segundo orden:

dc A
k c AcB
dt

Segn lo que hemos discutido en las secciones precedentes, debe considerarse que si a y b fuesen unitarios y coincidentes con el orden parcial en cada especie en esta ley no es una condicin suficiente para
afirmar que la reaccin es elemental. Por el contrario, si la reaccin es elemental, puede afirmarse que los
rdenes parciales deben coincidir con los coeficientes estequiomtricos.
La integracin de este tipo de ley puede realizarse siempre. Sin embargo, desde el punto de vista prctico
puede diagramarse el experimento para que el manejo de la informacin medida sea siempre la ms sencilla. Dependiendo del mecanismo de la reaccin, pueden presentarse las siguientes situaciones:
CASO 1. Para la reaccin indicada, correspondiente a una situacin menos frecuente, la ley puede tomar la
forma:

dc A
k c A2
dt
26

Si este es el comportamiento observado, independientemente del diseo del experimento, puede afirmarse
que la cintica no es elemental. Como se discuti previamente, la integracin conduce a las formas vistas
en la ecuacin (1.16), esto es:

1
1
0 kt
c A dcc A

CASO 2. Para la reaccin indicada:

k c AcB

dt

si alguno de los coeficientes estequiomtricos es distinto de la unidad, ya puede

afirmarse que la cintica es compleja. Si ambos fuesen unitarios, no puede afirmarse que la reaccin sea
elemental.
En general, si x es el grado de avance de la reaccin, las concentraciones de A y B al tiempo t sern:
cA = c

0
A

a.x

cB = c

0
B

b.x

Luego, -dcA/dt = a dx/dt

La integracin de esta ecuacin puede realizarse considerando las siguientes situaciones relacionadas con el diseo de la experiencia:
a.- A partir de la mezcla de cantidades estequiomtricas de A y B
Analicemos la estequiometra A+2BProductos. Por cada mol de A que reaccione deben reaccionar 2 mo0
les de B. Si la concentracin inicial de la especie A es cA , la cantidad estequiomtrica de B debe ser
0
0
0
0
c B=2c A. Si la estequiometra es A+bBP, la relacin ser c B=bc A. Para la estequiometra general
0
0
0
0
aA+bBProductos, se debe verificar que c A=(a/b).c B o c B= (b/a)c A.
En este caso, por integracin la ley es la que sigue:

1 dc A dx
b

k c A0 a x cB0 b x k c A0 a x c A0 b x
a dt
dt
a

(1.23)

Reordenando:

2
dx
b
b
k c A0 a x c A0 a x k c A0 a x k ' c A0 a x
dt
a
a

(1.24)

En la ecuacin (1.24), k'= k.(b/a). Luego, integrando esta ecuacin se obtiene:

1
1
0 kt
(c a x ) c A
0
A

que es idntica a la ecuacin (1.16) discutida previamente al analizar cinticas de segundo orden sencillas y
coincide con el CASO 1 ya estudiado para este tipo de reacciones.
0
B

b.- trabajando en exceso de un reactivo, por ejemplo c

>> c A. Luego:

1 dc A dx

k c A0 a x cB0 b x k " c A0 a x
a dt
dt

con k" k cB0

(1.25)

Esta ley se ha llevado a condiciones de pseudoprimer orden y la solucin es del tipo que se muestra en la
ecuacin (1.15), con la diferencia que ahora el tiempo medio depender de la concentracin inicial de la
0
especie en exceso (c B en este caso).
c.- trabajando en condiciones tales que c
La ecuacin:

0
A

(a/b).c B.
0

1 dc A dx

k c A0 a x cB0 b x
a dt
dt

se reordena separando variables:

dx
k dt
c a x cB0 b x

0
A

Luego debe integrarse por el mtodo de fracciones simples, tal como se indica a continuacin:

1
0
A

a x c b x
0
B

M
N
M cB0 b x N c A0 a x McB0 Nc A0 ( M .b B.a) x

c A0 a x
cB0 b x
c A0 a x cB0 b x
c A0 a x cB0 b x

27

Los coeficientes M y N se obtienen a partir de la condicin del numerador en la ecuacin previa:

McB0 Nc A0 (M .b B.a) x 1
Por lo tanto, como en el miembro de la izquierda no hay trmino en el grado de avance (x), se debe cumplir:

b
McB0 Nc A0 1 y M .b N .a 0 N M
a

yM

La integral a resolver tiene la forma:

1
a
0
0
b
cB0 c A0 a cB b c A
a

y N

b
a c b c A0
0
B

dx
dx
dx
M
c A0 a x N
cB0 b x

ln

ln
kt
cA0 a x
cB0 b x
c A0 a x cB0 b x
a
c A0
b
cB0

Reemplazando M y N por sus expresiones, se obtiene:

dx
1
c A0 a x
1
cB0 b x

ln

ln
kt
c A0 a x cB0 b x bc A0 acB0
c A0
bc A0 acB0
cB0

Finalmente:

ln

c
c

0
A
0
B

ax
c
c0
ln A ln 0A (bc A0 acB0 )k t
b x
cB
cB

(1.26)

Representado ln(cA/cB) en funcin del tiempo debe obtenerse una dependencia lineal, cuya pendiente contiene la constante de velocidad k.

Reacciones de orden cero y fraccionarios

Las reacciones de orden cero deben ser independientes de la concentracin. En el caso de reacciones enzimticas, a concentraciones iniciales del sustrato muy superiores a la constante de Michaelis-Menten, la
cintica se vuelve de orden cero en esa especie, aunque tiene orden 1 respecto de la concentracin total
del enzima que es constante durante el proceso.

Tipos de reacciones: Reacciones simples y complejas. Mecanismo de

reaccin
a. Reacciones simples (o elementales).
Las reacciones elementales ocurren en un nico paso. Las etapas de una reaccin qumica, que definirn el
mecanismo de la misma, se plantearn sobre la base de reacciones simples.
Ejemplos de reacciones consideradas simples son:
HO2
H + O2
H + O2 HO2

(unimolecular), y
(bimolecular)

b. Reacciones complejas.
Son aquellas que ocurren en ms de una etapa elemental. En general, las reacciones complejas pueden
agruparse en:
Reversibles.

k1
A

B
k-1

Estas pueden ser de primer orden, segundo, etc.

28

 Consecutivas.
En estas reacciones, se genera al menos un intermediario que no est presente ni al comienzo ni al final del
proceso.
k1
k2
ABC
En este caso, la sustancia B es el intermediario de reaccin, cuya naturaleza (caracterizacin e identificacin) debe ser determinada con el fin de establecer que efectivamente existen reacciones consecutivas. Las
reacciones enzimticas Michaelianas son un ejemplo de este tipo de reacciones (pueden verse en ms detalle en el Captulo 3 de este libro).
Paralelas.
En este grupo de reacciones, un reactivo puede reaccionar por dos vas independientes para generar distintos productos. Ejemplos genricos de este tipo de reacciones se detallan a continuacin
ABC

A+BC

AD

A+DE

Concurrentes o competitivas.
A+B C

AP

C+DE

A + B P

C+BF

A + A P

C+AG

Integracin de reacciones complejas

No todos los sistemas admiten la integracin de las ecuaciones diferenciales que surgen de un mecanismo
de reaccin. Cuando esto no es posible existen procedimientos numricos que permiten resolver este problema.
En esta seccin se tratarn algunos ejemplos de integracin para los sistemas cinticos presentados anteriormente.
Reversibles.
Atento a lo discutido previamente, considere el siguiente ejemplo
A B (k1, v1)

B A (k-1, v2)

El perfil de concentracin de una reaccin reversible como la indicada, comparada con una reaccin irreversible se presenta en la Figura 1.6 siguiente:
cA

reversible

Fig.

A
irreversible

tiempo

29

1.6.

Comparacin
irreversible.

de

una

reaccin

reversible

con

otra

En el equilibrio, dcA/dt = 0. Luego, A/B = k1/k-1 = Ke, donde B es la concentracin de equilibrio de B. La

integracin de la ecuacin de velocidad es posible, introduciendo en ella el balance de materia:
d(/V)/dt = -d[A]/dt = d[B]/dt = k1.[A] - k-1.[B] = k1.[A] - k-1.([A]0 - [A])
Luego, en trminos de las concentraciones de equilibrio, se obtiene
ln(B/( B - cB) = (k1 + k-1).t = k1.(1 + Ke).t
Obsrvese que la evaluacin de los parmetros cinticos de esta reaccin se requiere de informacin termodinmica completa, incluyendo las medidas de los cambios de entalpa correspondientes como se discutir ms adelante al estudiar el efecto de la temperatura en la velocidad de los procesos.
Consecutivas.
k1
k2
ABC
Las ecuaciones de velocidad para cada especie involucrada en cada etapa pueden deducirse directamente,
pues se trata de reacciones elementales:
d[A]/dt = - k1.[A]
d[B]/dt = k1.[A] k2.[B]
d[C]/dt = k2.[B]
0

Vale la siguiente condicin sobre la concentracin analtica de la especie A: c A = cA + cB + cC

Esta relacin muestra que la tercera ecuacin diferencial es suma algebraica de las dos primeras:
d[C]/dt = - d[A]/dt - d[B]/dt.
Esto implica que evaluando la evolucin temporal de A y de B, permite el conocimiento de la evolucin temporal de la tercera especie. La integracin de la primera ecuacin es directa:

c A c A0 e k1t
Si esta expresin se introduce en la segunda ecuacin:

dcB
k1c A0 e k1t k2cB
dt
Siempre debe trabajarse con una o varias condiciones de contorno. En este caso a t=0, c B = 0 y a t ,
cB = 0. La solucin de esta ecuacin diferencial conduce a la siguiente expresin para la evolucin temporal
de B:
0

cB
de C, se tendr:

k1
c A0 (e k1t e k2t )
k 2 k1

y para la concentracin

k e k1t k1e k2t

cC c A0 1 2

k1 k2

En la Figura 1.7 se muestra la evolucin temporal de las concentraciones de las especies A, B y C en una
cintica de reacciones consecutivas. Puede apreciarse que la concentracin de A disminuye exponencialmente, el intermediario B, aumenta su concentracin, pasa por un mximo para luego decaer, mientras que
C se incrementa de manera regular hasta que su concentracin final coincide con la inicial del reactivo A.
Existe para el intermediario un tiempo para el cual su concentracin es mxima. Dicho tiempo puede obtenerse derivando la concentracin de la especie B (cB) respecto del tiempo, lo que conduce a la siguiente
ecuacin:

tmx

1
k
ln 2
k2 k1 k1
30

Observese que la evolucin temporal del intermediario depende de los valores de las constantes de velocidad k1 y k2.

Hiptesis del estado estacionario. Hiptesis del preequilibrio

Un mecanismo es una hiptesis de trabajo. De esta hiptesis debe surgir la expresin de una ley de velocidad. La sola coincidencia entre el resultado de estas consideraciones con la ley experimental puede ser una
buena coincidencia. Ms an, distintos mecanismos pueden conducir al mismo tipo de expresin que la ley
experimental y esto no significa que todos son vlidos.
La confirmacin del mecanismo depende de la calidad de la informacin, pero sobre todo de la caracterizacin e identificacin del o de los intermediarios de reaccin.
k1=0,03 s-1 ; k2=0,06 s-1
1.2

1.0

1.0

0.8

0.8

C/[A]0

C/[A]0

k1=0,06 s-1 ; k2=0,03 s-1

1.2

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

0.0

0.0
0

20

40

60

80

100

20

40

t/s
k1=0,12 s-1 ; k2=0,03 s-1

1.0

1.0

0.8

0.8

0.6

100

Fig.

0.2

0.2

intermediario
producto

0.0
20

40

60

80

100

20

40

t/s

60

80

100

t/s

k1=0,03 s-1 ; k2=0,30 s-1

k1=0,30 s-1; k2=0,03 s-1

1.2

Perfiles
de
concentracin
de
reactivo
(A),
intermediario
(B) y producto (C) para una
reaccin consecutiva.

reactivo
0.4

1.7.

0.6

0.4

0.0

1.2

1.0

1.0

0.8

0.8

C/[A]0

C/[A]0

80

k1=0,03 s-1 ; k2=0,12 s-1

1.2

C/[A]0

C/[A]0

1.2

60

t/s

0.6

0.4

0.6

0.4

0.2

0.2

0.0
0

20

40

60

80

100

0.0
0

t/s

20

40

60

80

100

t/s

Considere el mecanismo A B C. Puede ocurrir que el intermediario B sea muy reactivo, de manera que
el mismo no se acumula en concentraciones considerables comparadas con A o con C. Si la velocidad a la
que se forma B debe ser comparable a la que desparece, entonces su concentracin neta puede ser los
suficientemente pequea y relativamente constante. Esta consideracin es base para enunciar la hiptesis
del estado estacionario.
Esta hiptesis establece que la velocidad de neta del o de los intermediarios de reaccin es aproximadamente cero y por lo tanto la concentracin estacionaria o en estado estacionario de B es prcticamente
constante. Es importante tener presente que esta hiptesis no puede aplicarse a reactivos y productos de la
reaccin, pero puede aplicarse a todos los intermediarios reactivos que se postulen en el mecanismo.
Si se considera el mecanismo propuesto, entonces dcB/dt 0. La concentracin estacionaria de este intermediario se indicar como [B]ss (steady state aproximation). Luego:

dcB
0 v1 v2 k1c A k2 [ B]ss
dt
31

[ B]ss

k1
cA
k2

Introduciendo esta expresin en la velocidad del proceso:

dc A dcC ]

k2 [ B]ss k1c A k1c A0 e k1t

dt
dt

De la solucin exacta, puede obtenerse la concentracin estacionaria de B si se supone que k 2>>k1 (en
general, esta condicin se cumple si k 2/k1 10, como puede inducirse de la Figura 1.7 para el ejemplo don-1
-1
de k1=0,03 s y k2=0.03 s .
Si el mecanismo involucra una etapa reversible, como es el caso de las reacciones y el equilibrio se alcanza en condiciones que B se descompone para formar A con mayor velocidad que la que conduce a C
(por ser este ejemplo una cintica de primer orden en cada etapa entonces debe esperarse que k -1 > k2, si
no fuese as, conviene hablar de velocidades, luego v-1 > v2).
En estas condiciones, la velocidad de formacin de C, que servir de base para expresar la velocidad del
proceso depende de la concentracin de equilibrio de B durante la reaccin. Esta consideracin es base
para la hiptesis del preequilibrio (a veces llamada del equilibrio rpido, en el sentido que este se establece en una escala de tiempo menor que la requerida para que B se descomponga en productos). Luego,
se puede deducir la ley de velocidad.
En estas condiciones, la constante de equilibrio Ke se expresa como

Ke
y la ley de velocidad:

cB
cA

cB K e c A

dcC
k2cB k2 K e c A k 'c A
dt

con k= k2.Ke

La hiptesis del estado estacionario puede aplicarse a este sistema. Ahora, la concentracin estacionaria de
B se expresa como:

[ B]ss

k1
k1
cA
c A0 e k1t
k1 k2
k1 k2

y la velocidad:

dcC
kk
1 2 c A0 e k1t k" c A
dt
k1 k2

con k"

k1k2
k1 k2

Si k-1 >> k2, la concentracin estacionaria y la ley se reducen a la discutida en la hiptesis de preequilibrio.
Por el contrario si k 2 >> k-1, entonces d[C]/dt = -d[A]/dt = k1.[A]. Esta consideracin permite plantear que la
velocidad de formacin B es la etapa determinante del proceso. El orden de la reaccin est gobernado por
esta etapa nicamente. En este caso el orden es 1. Sin embargo, en casos ms generales, dependiendo de
las condiciones experimentales, puede modificarse cul es la etapa determinante o lenta de la reaccin y
con ello modificar el orden de la reaccin.

Efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones qumicas.

Ecuacin de Arrhenius
La temperatura afecta de manera significativa a la mayora de las reacciones qumicas. En general es posible observar comportamientos que dependen del tipo de sistema particular que se estudie. En la Figura 1,8
se esquematizan distintos casos.
k

(a)

(b)

(c)

(d)

Fig. 1.8. Diferentes dependencias de la constante especfica de velocidad con la temperatura.

32

En general, estos ejemplos se clasifican segn el tipo de ley emprica que describe el comportamiento de la
constante de velocidad (k) con la temperatura o con el tipo de cintica a la que estas constantes estn asociadas. A continuacin se describen los diferentes casos de la Figura 1.8:
CASO a. En este tipo de comportamiento, el crecimiento de la constante es de carcter exponencial. La ley
emprica que lo describe en conocida como ecuacin de Arrhenius

E
ln k
a2
T
RT

(1.27)
En esta ecuacin, Ea es la energa de activacin. Esta es la energa mnima promedio
que deben alcanzar los reactivos para convertirse en productos. Si E a es independiente de la temperatura,
su integracin conduce a:
E
a
E
(1.28)
ln k C a k A e RT

RT

La ecuacin anterior se aplica a intervalos no muy amplios de temperatura dado que en general Ea depende
de la temperatura. En muchos sistemas la dependencia de la constante de velocidad con la temperatura
puede expresarse como:

k BT n e

Ea
RT

con n entero o fraccionario

(1.29)

En general existe una energa E0 caracterstica de la naturaleza de las molculas por encima de la cual
habr molculas con chances para descomponerse. En esta situacin:

E
ln k
02
T
RT

(1.30)

Si la ecuacin (1.28) describe la constante de velocidad de un proceso global, es posible hallar una relacin
entre E0 y Ea en dicha ecuacin. Si se deriva la forma logartmica de la ecuacin (1.29) respecto de T, se
obtiene:

ln k ln B n ln T

Ea
E nRT
ln k n Ea

a 2
2
RT
T
T RT
RT

(1.31)

Las ecuaciones (1.30) y (1.31) pueden compararse en la forma de una ecuacin diferencial, y esta comparacin conduce a la relacin buscada entre energa crtica y la energa de activacin. Esta comparacin
conduce a E0 Ea = n.RT. La importancia de esta relacin radica en que pone en evidencia que la energa
de activacin experimental debe tener una suave dependencia con la temperatura.
Si en el intervalo de trabajo se observa que es aplicable la ecuacin (1.28), representado el ln k versus 1/T
debe obtenerse una dependencia lineal de cuya pendiente puede evaluarse la energa de activacin. Sin
embargo existen situaciones donde esto no se verifica. En la Figura 1.9a se presenta una dependencia tpica de Arrhenius. La Figura 1.9b muestra un comportamiento que aparentemente no cumple aparentemente
con una dependencia del tipo Arrhenius. Estas desviaciones son caractersticas de procesos en los que
estn presentes reacciones competitivas con energas de activacin diferentes (al menos dos en esta representacin), o transiciones de reacciones homogneas a heterogneas.
a

ln k

ln k

1/T

1/T

Fig. 1.9. Diferentes dependencias del ln k en funcin de la inverta de la temperatura.

CASO b. Son tpicas en explosiones.

33

CASO c. Se presentan en reacciones enzimticas, hidrogenaciones catalticas, etc.

CASO d. Se presentan en reacciones termoleculares, por ejemplo 2NO + O 2, y en estos casos las energas
de activacin son pequeas o negativas.

Energa de activacin de reacciones reversibles y complejas. Concepto de coordenada de reaccin

Para cualquier reaccin, es posible analizar qu se entiende por energa de activacin sobre un diagrama
cualitativo de energa versus la coordenada de reaccin. A medida que la reaccin progresa, se producen
cambios energticos como consecuencia de modificaciones en las coordenadas de los ncleos dentro de
una molcula de reactivo, y en los ncleos de la molcula con la que esta entra en reaccin. Estos cambios
energticos implican variaciones en la energa potencial de las partculas durante el curso de la reaccin.
Las variaciones en la configuracin geomtrica de las partculas implican modificaciones tanto en distancias
internucleares como en los ngulos de enlace.
Para representar las variaciones en la energa que experimentan las partculas que reaccionan en funcin
de los cambios de estas coordenadas, se requiere trabajar en un espacio de varias dimensiones.
Sin embargo, conviene muchas veces introducir un diagrama simplificado en el los cambios energticos o
de energa potencial se representan en funcin de lo que se designa coordenada de reaccin. En la mayora
de los sistemas, esta coordenada es en realidad una coordenada muy compleja, y contiene tanto cambios
de distancias como ngulos de enlace en el proceso que lleva desde la configuracin de reactivos a la de
productos.
En la Figura 1.10 se esquematiza de modo somero un cambio que tiene lugar en un proceso elemental
(reaccin simple, en un nico paso).
Energa
E-1
E1

Producto
Reactivo

U
>0

Coordenada de reaccin
Fig. 1.10. Variaciones de energa de las molculas a lo largo de la coordenada de reaccin.

El mximo que se esquematiza en la Figura 1.10 corresponde a una situacin donde los reactivos adquieren
una configuracin (no es un intermediario) que tiene la energa mnima requerida para que se produzca la
a
reaccin. Esta energa es la que se asocia con la energa de activacin para la reaccin directa (E1 ), mientras que E-1 corresponde a la energa de activacin de la reaccin opuesta. La diferencia de energa entre
estas energas es el cambio de energa interna que tiene lugar en el proceso (U):
Reactivo(s) Producto(s)
Para una reaccin reversible de primer orden, Ke = k1/k-1. Si se toma el logaritmo y se deriva respecto de la
temperatura, se obtiene

ln K e ln k1 ln k1

ln K e ln k1 ln k1

T
T
RT 2

(1.32)

Recurriendo a las ecuaciones de vant Hoff por un lado (ln Ke/T = U/RT ) y de Arrhenius (ln
a
2
ki/T=Ei /RT ) por el otro, se obtiene:
2

34

U = E1 E2
a

(1.33)

La diferencia de energas de activacin mide el cambio de energa interna de productos y reactivos tal como
se esquematiza en la Figura 1.10.
En la Figura 1.11 se muestran sobre una ley general de velocidad de reaccin los diferentes trminos de la
misma y el significado fsico de los mismos.

Ley de velocidad

Siglo XIX

a
b
VELOCIDAD DE REACCIN:
Masa (i.e. moles) de
El producto de las concentraciones es
reactivos/productos
a+b
proporcional, para una dada temperatura, al
ORDEN DE REACCIN: consumida/generada por unidad
nmero de choques que tienen lugar por
de tiempo (i.e. segundos)
En reacciones
unidad de tiempo
elementales coincide
CONSTANTE ESPECFICA DE VELOCIDAD:
con la molecularidad,
Expresa el nmero de choques eficaces (aquellos
esto es el nmero de
Variable subyacente:
que dan productos por tener orientacin y energa
especies de reactivos
Densidad de partculas
adecuadas) por unidad de tiempo, cuando las
que participan en la
concentraciones son unitarias
reaccin

v = k [A] [B]

Siglo XX

Teora de las colisiones (Trautz y Lewis, 1916-1918)

vant Hoff, 1884

Arrhenius, 1889

k = A . e-Ea/RT

(1852-1911)

(1880-1960)

FRECUENCIA DE COLISIN:
Nmero de choques por
unidad de tiempo, cuando
las concentraciones son
unitarias
Variables subyacentes:
Velocidades (temperatura)
y tamaos de las partculas
(seccin efectiva)

FACTOR
EXPONENCIAL

Variables subyacentes:
Estructura/geometra de
los reactivos
Z = (rA+rB) . [(8.kBolztmann T) /) ]1/2
= (mA . mB)/ (mA+ mB)

(1859-1927)

Bolzmann, 1871

Variables subyacentes:
Temperatura -> energa
cintica

FACTOR ESTRICO:
Fraccin de molculas que
chocan con la orientacin
adecuada. Es la relacin
entre el A observado y el
calculado (Z)

(1844-1906)

Energa

A=Z.

FACTOR PREEXPONENCIAL

Ea

Coordenada de reaccin

Molculas

El factor A expresa el nmero de choques con

orientacin adecuada por unidad de tiempo,
cuando las concentraciones son unitarias

Fraccin de molculas
que alcanzan la energa
de activacin (Ea) para
reaccionar (Bolzmann)

Ea
Energa

Fig 1.11. Ley de velocidad, sus trminos y significado.

Catlisis qumica. Conceptos generales. Catalizadores biolgicos

Los procesos catalticos, mediados por catalizadores, proveen vas alternativas en una reaccin
qumica y aumentan su velocidad. Dicho efecto tiene lugar porque en el nuevo camino de reaccin la energa de activacin (de la etapa limitante) es ms baja que la del proceso no catalizado (Fig. 1.12).
El catalizador estabiliza el estado de transicin ms que a los propios reactivos. La denominacin de
procesos catalizados fue acuada por primera vez J. J. Berzelius (1779-1848) en el siglo XIX. El catalizador,
no se consume ni afecta las caractersticas termodinmicas del proceso global (calor puesto en juego, trabajo asociado al mismo, funciones de estado, rendimiento-equilibrio qumico). Cuando una sustancia incrementa la actividad del catalizador se denomina promotor; a diferencia de otras sustancias que la inhiben,
en cuyo caso, si la interaccin es irreversible, se denominan venenos.

35

Un ejemplo arbitrario:
Reaccin sin catalizar:

Eg

A + B (AB)1 P
Eg-catalizada

Reaccin catalizada:

A+B
+ Cat

A + B + Cat (AB-Cat)1 (AB-Cat)2 (AB-Cat)3 P + Cat

(AB-Cat)1
(AB-Cat)2
(AB)1

P + Cat

Coordenada de reaccin
Fig 1.12. Perfiles de energa a lo largo de la coordenada de reaccin para una reaccin genrica arbitraria no catalizada (curva y notas
en negro) y para la misma reaccin catalizada.(curva y notas en rojo). En el ejemplo las reacciones transcurren con uno y tres intermediario de reaccin, respectivamente. Se observa que el proceso catalizado tiene lugar por un camino diferente y con menor energa
de activacin.

En los sistemas biolgicos los procesos catalticos centrales tienen lugar tanto en fase homognea (reactivos y catalizador en la misma fase) como heterogena (con participacin, por ejemplo, de componentes de
membrana); y son mediados por enzimas, componentes de naturaleza proteica que se analizan desde diferentes ngulos en el presente libro; y tambin por ribozimas en las que el elemento cataltico es un ARN.
Para cualquier catalizador se denomina sitio activo a la disposicin de tomos, o grupos de tomos, en el
catalizador donde se llevar a cabo la transformacin cataltica.
En los sistemas biolgicos cuando existen compuestos que disminuyen la actividad cataltica de las
enzimas, se los suele denominar inhibidores (en general cuando el complejo con el catalizador es completamente inactivo, y donde la unin puede ser reversible o irreversible), o moduladores negativos (cuando
el complejo con el catalizador disminuye pero no anula la actividad cataltica). Existen asimismo compuestos
que son promotores de la actividad cataltica, y en ese caso se los denomina moduladores positivos.
Vnse los Captulos 4 y 7 de este libro. Esta caracterstica de las enzimas como catalizadores biolgicos las
hace particularmente interesantes dado que la capacidad cataltica del sistema puede ser modificada no
slo aumentando la cantidad de catalizador, sino modificando su actividad cataltica especfica (en ms o en
menos). Tal caracterstica es importante dado que: a) la clula requiere en muchos casos responder de
modo inmediato a necesidades metablicas que no pueden condicionarse a la sntesis de novo de molculas del catalizador, o a la destruccin de las mismas; y b) los catalizadores funcionan como sensores que al
percibir la composicin del medio celular acomodan su actividad especfica (concertadamente con el resto
de los catalizadores) de modo de conducir a la clula hacia respuestas que han sido moldeadas a lo largo
de todo el proceso evolutivo. Cabe destacar, de todos modos, que no todos los catalizadores biolgicos
responden al efecto de compuestos moduladores. En los captulos 3, 4, 5, 6 y 7 de este libro pueden consultarse las caractersticas cinticas ms representativas de las reacciones catalizadas por diferentes clases de
enzimas, incluyendo las denominadas enzimas Michaelianas (cuya capacidad cataltica no es afectada por
moduladores) y las que presentan efectos cooperativos y alostricos (cuya actividad cataltica es modulada).

Problemas
Problema 1.
a) En Escherichia coli muchas protenas estn presentes en relacin de dos molculas por clula. Cual es la
concentracin Molar de estas protenas? (Asuma que una clula de E. coli es un cilindro de 2 m de longitud
por un 1 m de dimetro). Por otro lado cuantas molculas de glucosa contiene esta clula si la concentracin interna es 1 mM?
b). Bajo condiciones ptimas para el crecimiento, una clula de E. coli se divide cada 20 minutos, aproximadamente. Si ninguna clula se muriera en estas condiciones cunto tiempo le tomara a una clula de E. coli
10
en un frasco de cultivo de 10 litros llegar a una densidad de clulas mxima de 10 clulas por ml (cultivo
saturado)?

36

c). El ADN del cromosoma de E. coli mide 1.6 mm de longitud cuando est extendido y 20 de dimetro.
Qu fraccin de una clula de E. coli ocupa este DNA?
Una clula humana tiene unas 600 veces ms de ADN que una clula de E. coli. Si asume una clula de tripo
esfrica como algunas de la sangre, con un dimetro de 20 m Qu fraccin de la clula humana ocupa su
ADN?
Problema 2.
Una protena represora interacta con ADN de doble hebra a travs de dos sitios idnticos.
a) qu tipos de interacciones predominan en las interacciones ADN-protena?
b) Si la protena se corta de modo de separar los dos dominios de unin sin afectar la interaccin de cada uno
de ellos con el ADN, discuta en trminos de entropa, entalpa y energa libre como se ver afectada la unin
entre las macromolculas.
c) Discuta en los mismos trminos cmo se afectar la unin ADN-protena en el caso que uno de los sitios del
DNA sea eliminado por un cambio de secuencia?
Problema 3.
Considere el equilibrio entre una protena dimrica y sus dos subunidades hidrofbicas
(considerar H <<: T. S)
2 monmeros

dmero

El cambio de entropa S para la reaccin de asociacin vara con la temperatura de la siguiente forma:
Temperatura (C) S (kJ/mol C)
0
0,041
25
0,043
37
0,045

Cul ser el efecto de la temperatura sobre el estado de asociacin de esta protena? Por qu existe aumento de entropa a pesar de que existe una dimerizacin?
Problema 4.
La N-metil acetamida (NMA) se dimeriza en solucin formando dos puentes de hidrgeno como se muestra
en la figura:

H
CH3
H
O
H

H N
H
H

CH3

O
H
O

H
H

H N
H

O
H

H
H
H

CH3
H

H N
H

O
H

H
O

N H
CH3

37

O
H

O
H

O
H

H
O

Klotz y Franzen estudiaron la capacidad de formacin del dmero en dos solventes distintos: agua y tetracloruro de carbono. Ellos obtuvieron los siguientes datos para la reaccin de dimerizacin:
H(kJ/mol)
-17
0.0

Solvente
Cl4C
H2O

S(J/mol K)
-45
-41

G(kJ/mol)
-3.8
12.8

a. Es favorable la formacin del dmero en ambos solventes?

b. Comente la diferencia de H en ambos solventes.
Problema 5
En el metabolismo celular el oxalacetato se forma por la oxidacin del malato en la reaccin
+

L-malato + NAD oxalacetato + NADH + H

G = + 7,0 kcal/mol.

Cmo puede explicar el hecho de que, en la clula, la reaccin proceda en la direccin de la produccin de
oxalacetato?
Problema 6
El estudio in vivo en condiciones definidas de una reaccin celular termodinmicamente reversible mostr
que la concentracin de los reactivos y productos es constante. Ud esperara que la concentracin de los
metabolitos implicados sea la concentracin de equilibrio? Qu importancia tiene su respuesta anterior
para la ruta metablica desde un punto de vista cintico?

Bibliografia
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En resumen, sin cosas distintas ni cambiantes no hay espaciotiempo. p. 39. En Fundamentos de biofilosofa. Mxico: Siglo XXI Editores.
Castellan, G. W. (1987) Fisicoqumica (segunda edicin en espaol de la tercera edicin en ingls). Mxico:
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Waage, P. y Gulberg, C. M. (1864) Forhondiinger: Vidmskobs.SeIsknbet i Chrlslionia (Studies concerning
affinity). Pag 35.

38

CAPTULO 2
Relacin estructura-funcin en la unin de ligandos a
enzimas
The secret of life is molecular recognition; the
ability of one molecule to "recognize" another through
weak bonding interactions
LINUS PAULING, AT THE 25TH ANNIVERSARY OF THE INSTITUTE OF
MOLECULAR BIOLOGY AT THE UNIVERSITY OF OREGON

La relacin estructura-funcin es un tema central en biologa. Dentro del contexto evolutivo, la estructura o forma de un organismo, de alguno de sus rganos o de alguna estructura particular del mismo es en
general aquella que mejor llevar a cabo una o varias funciones. Si pensamos en la forma hidrodinmica de
un delfn, diremos que es la mejor para vivir en el agua. De la misma forma, sus ojos presentan globos oculares ligeramente achatados con pupilas grandes que son adaptaciones para corregir la visin en el agua y
para captar una mayor cantidad de luz en las profundidades del ocano. Al igual que en otros mamferos,
cuando observamos la estructura del corazn podemos comprender la funcin de las aurculas y ventrculos
y su accin coordinada para impulsar la sangre y generar la circulacin perifrica. Siempre dentro del paradigma evolutivo (no cabra otra posibilidad para comprender a los sistemas biolgicos como dej claramente
asentado T Dobzhansky: Nada tiene sentido en biologa si no es a la luz de la teora de la evolucin)
la relacin estructura-funcin (tambin muchas veces aparece como la relacin forma-funcin) acta como una poderosa herramienta para estudiar o predecir la funcin de estructuras en distintos organismos. En
general podemos decir que en organismos evolutivamente relacionados (que comparten un ancestro en
comn) estructuras u rganos con forma similar podran tener funcin similar. De la misma forma podramos
inferir que la observacin de estructuras similares en organismos distintos podra evidenciar un parentesco
evolutivo entre los mismos. Sin embargo, esto ltimo no siempre funciona de esta forma, pensemos en la
forma que tienen las alas de los pjaros y las alas de los murcilagos. Sus formas son similares (ya que son
adaptaciones para volar), pero los pjaros y los murcilagos son animales que no comparten un ancestro
comn cercano y de ah que la similitud en la forma de sus alas se deba a que estructuras distintas terminaron parecindose ya que cumplen funciones similares.
Esta relacin entre estructura y funcin se cumple para todos los niveles de organizacin que encontramos en los seres vivos, desde un organismo completo hasta el nivel molecular, y este ltimo es el
nivel que nos ocupa en este captulo. Si bien destacamos la importancia de la relacin estructura-funcin, es
importante tener presente que a nivel molecular la relacin estructura-funcin puede ser una propiedad
degenerada: estructuras completamente distintas puedan sustentar la misma funcin e incluso, la misma
estructura puede sustentar distintas funciones. Pensemos que un martillo puede servir (funcin) para martillar un clavo o aplastar una cucaracha. O a la inversa podemos usar un zapato tanto para clavar un clavo o
aplastar a la famosa cucaracha. Si bien esto parece relajar excesivamente la relacin estructura-funcin en
una macromolcula no quiere decir que para cada caso particular no existan adaptaciones estructurales a
cada funcin en particular. Todo depende del detalle con el que se mire, como veremos ms adelante en
el captulo.
El estudio de la relacin entre la estructura y la funcin de las macromolculas en general, es un tema
central en la bioqumica estructural. En este nivel tenemos ejemplos conocidos como es el caso de la
estructura bicatenaria de un DNA y su relacin funcional en la replicacin o ejemplos ms crpticos como la
adaptacin de la estructura del glucgeno a la rpida liberacin de glucosa en una situacin de estrs. Sin
bien distintas macromolculas pueden presentar una determinada relacin entre su estructura y funcin,
fundamentalmente en este captulo nos ocuparemos del estudio de protenas.

Hiptesis sobre la relacin estructura-funcin en protenas

Una de las primeras hiptesis sobre la relacin estructura-funcin en protenas fue desarrollada por Emil
Fischer en 1894. Fischer estudiaba enzimas que actuaban sobre distintos glucsidos. Al notar la alta especi-

39

ficidad de las enzimas sugiri que la enzima debera contener una regin complementaria al sustrato de
la forma en la que una llave es complementaria con una cerradura, de ah el nombre de su modelo:
llave-cerradura (Figura 2.1).

P
Hermann Emil Fischer
(1852-1919)
Estado nativo

Fig. 2.1. El modelo llave-cerradura de Emil Fischer postulaba que el estado

nativo de la protena es nico y que posee un sitio de unin al sustrato que es
complementario al mismo. En la figura representamos a la protena (P) con un
cuadrado azul que no cambia su conformacin al unir el sustrato (esfera roja).
El circulo blanco alrededor de la esfera roja representara el sitio activo.

Los aspectos ms importantes de esta hiptesis es que se plantea la existencia de un solo estado o estructura para representar la estructura nativa de la protena y el sustrato es perfectamente complementario al sitio de unin en la protena que producir la transformacin qumica. En principio este modelo parecera explicar la alta afinidad que tienen las enzimas por sus sustratos, justamente ofreciendo una regin
perfectamente complementaria a la forma o geometra del sustrato. Como veremos ms adelante, el modelo
de Fischer no puede ser utilizado para explicar el funcionamiento de las enzimas, ya que resultara en una
enzima altamente ineficiente desde el punto de vista cataltico.

+
P

Daniel Koshland,
1920-2007

Estado nativo

Fig. 2.2. El modelo de Koshland propone que la protena existe en un estado nico, pero que en presencia de un ligando este le induce un cambio conformacional (la protena pasa del estado P a P)

40

Un modelo posterior de relacin estructura-funcin lo propuso Daniel Koshland en 1958. Para esta poca
era conocido que gran parte de las enzimas eran promiscuas, esto es pueden procesar ms de un sustrato
(aunque con distintas capacidades de unin y/o catalticas). Detengmonos un momento en esta definicin
de promiscuidad. Esto significa que los sustratos que puede utilizar una enzima promiscua pueden ser artificiales o no tener importancia biolgica para el organismo que tenga dicha enzima. Esto es la enzima no evolucion para procesar esos otros sustratos, simplemente los puede procesar por similitud qumica,
conformacional, etc. Otra cosa muy distinta es una enzima multi-sustrato. La gran diferencia es que estas
enzimas evolucionaron para procesar varios sustratos y esto encaja en la lgica metablica del organismo.
Si las enzimas pueden entonces procesar sustratos ms grandes o ms chicos que el sustrato natural
(o el que mayormente procesa en condiciones biolgicas) segn Koshland las enzimas no funcionaran como el modelo de llave-cerradura de Fischer, ya que deberan adaptar su estructura para acomodar a distintos sustratos (Fig 2.2).
Al igual que Fischer, el modelo de Koshland propone nuevamente que la estructura nativa de la protena era nica. Este concepto estaba fuertemente arraigado ya que Linus Pauling en 1936 haba caracterizado al estado nativo de una protena como la estructura que confera las propiedades funcionales. Cualquier estado que no fuera el nativo, por definicin, se converta en desnaturalizado. Sin embargo, el estado
nativo en el modelo de Koshland poda sufrir cambios conformacionales para adaptarse a la presencia de
un sustrato u otros ligandos. Como vemos en la Fig 2.2, la presencia del sustrato induce un cambio conformacional. Si nos ubicamos en la poca cuando Koshland realiz su experimento veremos que fue en el
mismo ao que se obtuvo la primera estructura de una protena (mioglobina de cachalote en 1958). De esta
forma Koshland no contaba con mtodos como difraccin de rayos X para detectar los cambios que propona. Por el contrario, Koshland utiliz ensayos bioqumicos. Detect que en ausencia y en presencia de sustrato, la enzima en estudio mostraba una diferencia significativa en el nmero de tioles titulables (provenientes de cistenas libres) evidenciando de esta forma los cambios conformacionales. Como el estado nativo
era nico y la presencia de sustrato induca el cambio conformacional, el modelo de Koshland se denomin modelo de ajuste-inducido.
Hacia 1965, Monod y colaboradores ofrecieron un nuevo modelo basado en nuevas evidencias experimentales. En 1965 propusieron que el estado nativo de una protena no era nico, sino que estaba formado por distintos confrmeros en equilibrio (Fig 2.3).

+
P

Estado nativo

Jacques Monod
1910-1976

Fig. 2.3. El modelo de Monod propone la existencia de un pre-equilibrio en

donde 2 o ms confrmeros (en la figura los confrmeros P y P) coexisten en
equilibrio previo al agregado de un ligando (en rojo). El rol del sustrato es simplemente seleccionar el confrmero con mayor afinidad y desplazar el equilirbio
favoreciendo la ocurrencia de ese confrmero. El estado nativo que propone
Monod es complejo como se ve en los mltiples pozos en el grfico de energa
libre.

Monod bas su hiptesis tanto en evidencias bioqumicas como en estructurales (concretamente la cristalizacin de la hemoglobina llevada a cabo por Perutz en 1963). Perutz haba cristalizado a la hemoglobina
en dos conformaciones distintas, la conformacin desoxigenada o T (del ingls tense o tensa, debido a
su alto nmero de contactos intermoleculares) y la forma oxigenada o R (del ingls relaxed o relajada por
su bajo contenido de contactos intermoleculares comparadas con la forma T). Segn el modelo de Monod,
el estado nativo de las protenas estaba formado por al menos dos confrmeros T y R en ausencia de ligando (al igual que en la hemoglobina). De ah que su modelo se denomine de pre-equilibrio ya que las
distintas formas (confrmeros) de la protena los tenemos en forma previa (pre-equilibrio) al agregado de

41

sustrato u otros ligandos. Al agregar sustrato a una enzima que se encuentra en solucin, el rol del sustrato
es seleccionar la forma de la protena que muestra mayor afinidad, es por esto que esta hiptesis se conoce en la actualidad como modelo de seleccin conformacional (conformational selection). Una vez que el
sustrato se une a la forma con mayor afinidad, desplaza el equilibrio conformacional hacia esa forma. Es
muy importante destacar que las formas T y R pre-existen al agregado de ligandos y que el rol del ligando
no es inducir un cambio conformacional como propona el modelo de Koshland.

Conceptos bsicos de la unin de un ligando a una protena

La unin de un ligando a una protena se puede describir como un proceso bimolecular:
kon
P+L

PL
koff

Lo que representa un paso elemental de reaccin, sin la formacin de intermediarios de reaccin entre P,
L y PL. Kon y koff son las constantes cinticas que caracterizan cada paso. La afinidad de P por L se puede
describir por la constante de equilibrio Kd (de disociacin) expresada como:

[][]
[]

Esta constante est relacionada con la variacin de energa libre de formacin del complejo PL (Gd).
Esta constante de equilibrio, a temperatura constante, depende fundamentalmente de las interacciones de
P y L con el solvente y de P y L entre s para formar el complejo PL. Por el contrario, kon y koff dependen de la trayectoria que siga L en su unin o des-unin de P. De todas las trayectorias posibles, la de
mnima energa caracterizar a la energa del estado de transicin, como la mxima energa para esa trayectoria.
La relacin entre estas constantes, Kd, kon y koff es fcil de apreciar en un grfico de G como el que presentamos en la figura 2.4.
TS (estado de transicin)

Gon
Goff

P+L
Gd
PL
Fig. 2.4. Representacin grfica de la variacin de energa libre cuando
una protena P une un ligando L. Se destacan las distintas energas libres involucradas en el proceso

En principio cualquiera de las tres energas libres (P, PL y de los estados de transicin) pueden ser modificadas en forma independiente del resto. Sin embargo, esto es bastante difcil de realizar a nivel experimental, en particular si queremos disear determinados ligandos para una dada protena. Segn la fig 2.4 vemos que estabilizar o desestabilizar P y PL afectarn la constante de afinidad Kd, pero no afectar ni a k on ni
a koff. Por el contrario, modificar la energa del estado de transicin tanto para k on como para koff modificar
la cintica de entrada y/o salida de L pero no modificar la constante de afinidad. A pesar de no afectar la

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afinidad, kon y koff definen la cintica de entrada y salida de L de la protena, as como el tiempo de residencia del sustrato o ligando en la protena. El tiempo de residencia de L en la protena se calcula como:

Esta descripcin general para P y L se cumple exactamente de la misma forma cuando estudiamos cintica de enzimas, segn la ecuacin:
k1

E+S

ES
k -1

Donde k1 y k-1 seran kon y koff. Si bien por simplicidad modelamos la entrada/salida de L en solo 1 paso
elemental, este podra tener varios pasos elementales haciendo ms complejo el grfico de la figura 2.4.
Recordemos que para la reaccin catalizada por una enzima
k1

E+S

kp

ES

E+P

k -1

El grafico para la variacin de energa libre en funcin de la coordenada de reaccin posee dos estados
de transicin ya que la reaccin est compuesta por dos pasos fundamentales
TS2

TS1

E+S
E+P
ES
Fig. 2.5. Variacin de la energa libre en el proceso bimolecular de reaccin
de una enzima segn E+S<ES->E+P

Consecuencias de los modelos estructura-funcin

Hasta este punto tenemos tres hiptesis para explicar la relacin estructura-funcin en protenas: el modelo o hiptesis de Fischer, de Koshland y finalmente el de Monod. Son modelos muy tiles que en ciencia
llamamos modelos de grano-grueso ya que por lo que se desprende de los mismos lo nico que sabemos
es que los confrmeros que unen al ligando pueden ser estructuralmente distintos (Koshland y Monod) o
iguales (Fischer) sin mucho ms detalle. Sin embargo, el hecho que existan distintos confrmeros para unir
el sustrato implicara que existen distintas constantes de afinidad y/o distintos tipos de cinticas de
unin del ligando, lo cual tendra consecuencias importantes en cuanto a cmo funcionan las enzimas y
cul sera la relacin estructura-funcin en las mismas.
Segn el modelo de Fischer existe una sola constante de afinidad por el ligando ya que el estado nativo
de la protena es nico y el sitio activo o lugar de unin es perfectamente complementario a dicho ligando.
Pensemos que, si una enzima evolucionara para cumplir con este modelo, optimizara ms y ms su interaccin con el sustrato para lograr una complementariedad ptima. Al hacer esto lograra estabilizar ms y
ms el complejo ES (ver figura 2.5) y de esta forma podra aumentar cada vez ms la energa de activacin
del paso lento de la reaccin hacindola an ms lenta. Esta interpretacin del modelo de Fischer nos sirve
para comprender que las enzimas no evolucionaron para unir exactamente el sustrato, sino que

43

evolucionaron para unir fuertemente al estado de transicin que participa en la reaccin qumica que
catalizan. Vimos que la estabilizacin del estado de transicin del segundo paso es el que proporciona el
poder cataltico a la enzima. Sabemos tambin que los inhibidores competitivos que se parecen al estado de
transicin tienen constantes de unin mucho ms grandes (mayor afinidad) que los sustratos naturales de la
enzima, de alguna forma mostrando que cuando una enzima alcanza un cierto nivel de afinidad sobre su
sustrato deja entonces de ser un parmetro a optimizar. Por otra parte, el modelo de Fischer no podra explicar la promiscuidad que muestran la mayora de las enzimas ni tampoco explicar las enzimas multisustratos, ya que sus sitios activos son altamente complementarios a un determinado sustrato.
Por otra parte, segn el modelo de Koshland podramos decir que el cambio conformacional que induce
el ligando servira para mejorar su constante de afinidad, observaramos que una protena que funcione
segn el modelo de Koshland podra unir a un ligando con al menos dos constantes de afinidad (una antes
al cambio conformacional y la otra despus del cambio conformacional). Adems, este modelo permite unir
distintos ligandos ya que la misma protena podra sufrir cambios conformacionales ms o menos pronunciados dependiendo del tipo de ligando que procese. Finalmente, el modelo de Monod tambin permite unir
un ligando con al menos dos constantes de afinidad distintas correspondientes a los confrmeros T y R y
tambin permite que la protena una distintos ligandos (podramos suponer la existencia de un confrmero T
y varios R: R, R, R para unir distintos ligandos).
A partir de este punto trataremos de dilucidar dos cosas: por una parte, exploraremos la importancia de
que una protena una a un determinado ligando con ms de una constante de afinidad. Y por otro lado
comenzaremos a explorar en ms detalle la relacin estructura-funcin, ya que hasta ahora slo sabemos
que las protenas pueden tener una o dos constantes de unin, pero no sabemos estructuralmente el significado de dicha afirmacin.

Anlisis estructural de la unin de ligandos

El anlisis estructural que veremos en adelante se aplica tanto a protenas en general (por ej. la hemoglobina) como a enzimas. Mayormente usaremos la hemoglobina ya que ha sido ampliamente estudiada
desde el punto de vista estructural y dinmico. Como sabemos, la hemoglobina une cuatro molculas de
oxgeno, una por cada subunidad (2 alfa y 2 beta globinas). Cada una de estas globinas contiene un grupo
hemo, que a su vez contiene un tomo de hierro al que se une el oxgeno. Querramos en esta seccin
comprender el tema central del captulo, la relacin entre la estructura y la funcin en una protena. En la
figura 2.6 mostramos un grfico de la distancia entre una molcula de oxgeno y el hierro del grupo hemo

Fig. 2.6. Distancia entre una molcula de oxgeno y el hierro perteneciente

al hemo extrada de una dinmica molecular. Se observa que en determinados
momentos el oxgeno se encuentra a una distancia muy corta del hemo (entre 5
y 10 angstroms) distancia compatible con la existencia de interacciones dbiles
entre el hierro y el oxgeno (fuente Leonardo Boechi, UBA).

Lo que vemos en el grafico es el resultado de una simulacin computacional que se denomina dinmica
molecular. En una dinmica molecular se entrega energa a una molcula (en este caso un tipo especial de
hemoglobina que se denominan hemoglobinas truncadas, y al oxgeno). El sistema as formado se mueve
para disipar esa energa entregada, haciendo de esta forma posible observar cmo se mueven los distintos
tomos del sistema en estudio. Si prestamos atencin en el grfico, la distancia entre el oxgeno y el hierro

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del grupo hemo (representada en el eje y en angstroms) nos da una idea de cmo se mueve la molcula de
oxgeno en torno a la hemoglobina. Por otra parte, en el eje x graficamos el tiempo (en nanosegundos). Se
puede observar que el oxgeno por momentos est lejos del hemo y por otros momentos est a una distancia muy corta (del orden de las distancias de interacciones dbiles o sea podramos decir interaccionando con el hierro). Podramos decir entonces que el oxgeno entra en la hemoglobina, permanece un
tiempo interaccionando con el hemo y luego sale repitiendo el ciclo. Este tiempo de permanencia y las
energas derivadas de dichas interacciones (no se muestran en el grfico 2.6) ayudan a conceptualizar las
constantes de afinidad (Kd) y las constantes cinticas (kon y koff) mencionadas anteriormente.
Como explicaramos este grfico de la figura 2.6 en trminos estructurales? Como entra el oxgeno en la
hemoglobina? Cmo sale? Comencemos con la figura 2.7que representa la estructura de la alfa globina,
una de las cadenas que forma la hemoglobina. Como podemos observar en la figura, el hemo se puede ver
fcilmente con lo cual el oxgeno no tendra problemas en unirse a l!

Fig. 2.7. Representacin esquemtica de la alfa globina de la hemoglobina

humana. En rojo se destacan las alfa hlices. La molcula orgnica representada como sticks corresponde con al grupo hemo.

Si esta representacin de la globina fuera acertada, nos podramos preguntar sobre el rol del resto de la
protena. Solo se une el hemo? Por qu no simplemente tenemos hemos en la sangre, si en definitiva el
oxgeno se une a l y no a la protena? Para qu est el resto de la estructura terciaria? Estas preguntas se
pueden contestar con una representacin de la globina ms realista. En la figura 2.8 representamos la misma molcula, pero ahora utilizando una representacin que incluye la superficie de Van de Waals de todos
los tomos de la molcula, con lo cual vemos que la protena contiene una superficie.

Fig. 2.8. La misma molcula de la figura 2.7 pero ahora con el agregado de
los volmenes de Van de Waals para cada tomo. Se observa que la molcula
posee una superficie dada por estos volmenes de Van de Waals. Los colores
corresponden a las cargas parciales de los distintos tomos (azul para los positivos y rojo para los negativos)

Utilizando esta representacin de la globina se complica ahora saber cmo hace el oxgeno para entrar
en la molcula y unirse al hemo. De hecho, en las primeras cristalografas de la dcada del 60 llevadas a
cabo por Max Perutz utilizando la hemoglobina, no se pudo dilucidar como ocurra la entrada y salida del
oxgeno de la molcula. La respuesta a esta pregunta necesit al menos una dcada ms para contestarlo.

45

La figura 2.8 no slo nos da una visin ms realista de lo que es una protena, sino que tambin nos
obliga a pensar que los ligandos en general (sustratos de una enzima en particular) entran por algn lado
(canal? tnel? conducto?) a la protena y que por algn otro lado salen (quizs utilizando el mismo camino).
Esta visin nos fuerza a re-pensar lo que sabemos sobre la estructura de las protenas.

Estructuras funcionales en protenas

Si bien en todos los cursos de bioqumica bsica se ensea estructura de protenas, necesitamos obtener una idea ms realista de la estructura de una protena. Como vimos en la figura 2.7 la simple representacin de la estructura terciaria de una protena por s sola no nos ayuda a comprender su relacin con la
funcin. Sin embargo, como muestra la figura 2.8, las protenas tienen una determinada superficie. Esta
superficie obviamente est en contacto con su entorno inmediato, y de ser una protena soluble por ejemplo
citoplasmtica, acertaramos en decir que mayormente los aminocidos en la superficie seran hidroflicos lo
cual no impide que encontremos aminocidos no-polares en contacto con el agua. Esta relacin entre aminocidos hidroflicos e hidrofbicos en la superficie de una protena resulta de la estabilizacin relativa
que tenga cada protena. Sin embargo, el tipo y nmero de aminocidos superficiales no est solamente
determinado por cuestiones energticas durante el plegado de la protena. En la superficie de la protena es
usual encontrar aminocidos que funcionan como seales para distintas interacciones que la protena
pueda mantener, por ejemplo, la interaccin con un ligando, o con otra protena, o con una enzima que
introducir una modificacin postraduccional, etc. As, la superficie de una protena contiene informacin funcional. De hecho, varios mtodos utilizan dicha informacin superficial para anotar funcionalmente
a una protena. En la figura 2.9 representamos la estructura de una porina, una protena transmembrana
que transporta ligandos. En la figura 2.9 (panel izquierdo y medio) representamos la estructura terciaria
formada por un barril de hlices beta que forman un canal. En la figura 2.9 (panel derecho) estimamos la
superficie de la protena la cual se coloreo utilizando la carga de los aminocidos. As, vemos que la superficie de entrada del canal es azul (carga positiva, ver la escala debajo de la estructura) lo que se corresponde
con el hecho que este tipo de protenas transporta sustancias cargadas negativamente.

Fig. 2.9. Distintas representaciones de la protena porina proveniente del

organismo Comamonas acidovorans. En el panel izquierdo se muestra la parte
lateral de la molcula mientras que en el panel central se muestra una visin
desde el eje mayor. La porina es una protena transmembrana que posee un
gran canal para el transporte de distintas sustancias. En el panel en el extremo
derecho representamos la misma visin del panel central pero ahora representando la superficie de la molcula. Se observa claramente que la superficie del
canal de entrada es positiva.

As es pues que la superficie de una protena es la primera componente con la que un ligando se
encuentra con una protena. Este primer reconocimiento puede facilitar la interaccin e internalizacin de
un ligando en la protena correspondiente y como vimos anteriormente podra influir en las constantes kon
y koff. Si mutramos alguno de estos aminocidos superficiales, la protena podra perder su capacidad de
reconocer a un ligando, o ser incapaz de interaccionar con otra protena, una membrana, etc y de esta forma perder su funcin biolgica. De esta forma, las superficies de las protenas se pueden considerar como
un ejemplo de una estructura funcional. Como veremos inmediatamente, la informacin funcional sobre la
superficie de la protena se encuentra en forma dispersa en otras estructuras funcionales o regiones que
por su importancia funcional se denominan hotspots o puntos o regiones calientes de una protena. Lo de
calientes no est relacionada para nada con la energtica sino con el hecho que al mutar aminocidos

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dentro de esos hotspots se pierde o altera la funcin biolgica. Debido a su importancia biolgica estos
hotspots en general estn muy conservados evolutivamente.
Dentro de la superficie podemos encontrar un segundo tipo de estructura funcional que se denominan
pockets (bolsillos). Los pockets son como hendiduras que posee la superficie de una protena y en
general estn asociadas con la entrada del ligando a la protena (ver figura 2.10 y 2.11). En los pockets
es frecuente encontrar aminocidos conservados (hot-spots) que sirven para reconocer y favorecer la
internalizacin de los ligandos en la protena. Otro tipo de estructuras funcionales son los tneles y los
canales. Los primeros son segmentos que conectan la superficie con cavidades y los ltimos conectan dos regiones superficiales (ver figura 2.10 y 2.12). En la figura 2.11 podemos ver en rojo una gran
pocket (parte diferencial de la superficie de la protena que aparece representada como una maya en azul)
en donde emergen 2 tneles. Estos tneles conectan la superficie con la cavidad que posiblemente contiene
al sitio activo. Los tneles pueden unir una o ms cavidades. En enzimas que contienen ms de un sitio
activo o varias cavidades donde se alojan por ejemplo el sustrato y cofactores, los tneles sirven para que
los sustratos o productos intermediarios migren entre las distintas cavidades y/o alcancen la superficie (figura 2.13). En general los tneles contienen determinados aminocidos que abren o cierran los tneles regulando de esta forma la entrada o salida de productos y sustratos. Estos aminocidos que regulan la migracin de ligandos desde la superficie hasta las cavidades se denominan gatekeepers (figura 2.13).
Finalmente, las cavidades son huecos en el interior de la protena que se pueden conectar con la
superficie por tneles o que pueden no tener ninguna conexin con la superficie de la protena. Estas ltimas cavidades se llaman cavidades void.

2
3
1

Fig. 2.10. Corte esquemtico de una protena. Se observan los cinco tipos
de estructuras funcionales a saber: 1 cavidad, 2 pocket, 3 tnel, 4 canal y 5 superficie de la protena.

47

Fig. 2.11. En esta figura observamos la superficie de la protena representada como una maya en color azul transparente. La parte de la superficie que
aparece en color rojo corresponde con un pocket. Las esferas rosa y amarilla
corresponden a la entrada de tneles que conducen los ligandos que interaccionan con el pocket hacia la cavidad principal de la protena.

Fig. 2.12. Ejemplo de estructuras funcionales en distintas protenas. Panel

izquierdo red de tneles (en rojo), panel central pocket principal (rojo) con sustrato unido (en representacin stick), panel derecho cavidad (en celeste claro) y
tneles asociados a la misma.

Las cavidades void son cavidades que en general contienen molculas de agua oclusas. Estas
molculas quedan atrapadas durante el plegamiento de la protena y/o podran migrar desde tneles o pockets cercanos.

C1
C2

Fig. 2.11. Representacin esquemtica de una protena que en su interior

posee dos cavidades (C1 y C2) conectadas por tneles entre s y con la superficie. Las barras rojas simbolizan residuos gatekeepers.

48

Se sabe que la cantidad de molculas de agua ocluidas podra condicionar los movimientos de la protena (ver prxima seccin).
En resumen, hasta ahora tenemos que la estructura de las protenas contiene lo que podemos llamar estructuras funcionales a saber la superficie, pockets, tneles y cavidades que de alguna forma
participan en el trnsito del ligando hasta la cavidad donde se unir (para ser transportado en el caso de
una protena transportadora como la hemoglobina con el oxgeno) o se procesar qumicamente (en el caso
de una enzima). En el caso de las enzimas, tenemos que tener presente que tanto la entrada del sustrato
(como la de posibles cofactores) es tan importante como la salida de los productos. Este pasaje desde la
superficie hasta el sitio activo describe la trayectoria del ligando y como vimos antes define la energa del
estado de transicin de las constantes k on y koff.
Debe quedar claro entonces que cualquier alteracin (mutacin, por ejemplo) de algn aminocido en alguna de estas estructuras funcionales podra modificar la entrada o salida de los ligandos con los que interacciona una protena. En general en bioqumica prestamos demasiada atencin al sitio activo (ver ms adelante). Pero el sitio activo es una mnima porcin de una enzima comparada con el resto de las estructuras funcionales que posee!

El sitio activo
El sitio activo de una enzima es el lugar fsico donde se lleva a cabo la transformacin qumica. En general el sitio activo de la mayora de las enzimas se encuentra en el interior de las mismas. Esto est
relacionado con el hecho que el agua podra competir con los reactivos de varias reacciones qumicas catalizadas por las enzimas de ah que se haya favorecido el proceso cataltico lejos del solvente acuoso. El
sitio activo en general est ubicado en una cavidad a la que como vimos se accede por tneles, canales
o pockets. El tamao de la cavidad depende del tamao del sustrato, pero en general dicha cavidad es
pequea considerando el volumen total de la protena. Dentro de esta cavidad vamos a encontrar aminocidos que sirven para llevar a cabo la reaccin qumica (aminocidos catalticos) y por otro lado aminocidos que participan en la unin del sustrato (aminocidos de unin o de binding). Los aminocidos catalticos son aquellos que pueden llevar a cabo reacciones qumicas, por ejemplo participando de reacciones
redox o interviniendo en procesos catalizados por cidos o bases. En general estos aminocidos interaccionan con otros aminocidos de la cavidad para activarse, por ejemplo aquellos aminocidos cidos pueden
ser ms cidos o ms bsicos al interaccionar con determinados aminocidos de la cavidad. Es comn, por
citar un ejemplo, encontrar dadas de interaccin entre aminocidos. Una de las dadas ms comunes es
encontrar pares de aminocidos dicarboxilicos interaccionando uno con el otro. Estos pares de aminocidos
dicarboxilicos al estar muy prximos aumentan considerablemente sus pka pudiendo ser protonados (por el
sustrato y por el agua por ejemplo como ocurre en las asprtico proteasas). De ah que las propiedades
fisicoqumicas de los aminocidos catalticos no son corrientes, en el sentido que un asprtico que forme
parte del sitio activo en una enzima no tendr la misma reactividad, pk, etc que otro asprtico ubicado fuera
de la cavidad del sitio activo.
Los aminocidos de la cavidad no slo sirven para activar aminocidos catalticos, sino tambin que participan de la unin del sustrato formando numerosas interacciones dbiles. Como vimos anteriormente, el
nmero de interacciones dbiles define la energa libre del complejo ES y as la afinidad de la enzima por su
sustrato. Adicionalmente, existen aminocidos que regulan el trnsito del sustrato en la cavidad favoreciendo la especificidad por un determinando sustrato contra otro. Por ejemplo, una determinada
familia de almejas contiene un tipo de hemoglobina que no une oxgeno sino SH 2. La estructura de la hemoglobina humana y de la hemoglobina de la almeja son muy similares, pero los mayores cambios se dan en
la cavidad que contiene el hemo para desfavorecer la unin de oxgeno y favorecer la unin del SH 2 en la
hemoglobina de las almejas.
De esta forma, el sitio activo est constituido por un conjunto de aminocidos mayormente ubicados en
una cavidad de la enzima. Si bien los aminocidos catalticos son frecuentemente pocos (dos o tres
aminocidos) el conjunto de estos aminocidos ms los de la cavidad son los que definen la especificidad y propiedades catalticas de la enzima.

Importancia de los cambios conformacionales y la funcin de las protenas

Cuando hablamos de la relacin estructura-funcin, en realidad para ser estrictos deberamos hablar de
la relacin entre la dinmica-funcin en una protena. Ya vimos que una protena rgida como la que
postula el modelo de Fischer, no podra funcionar. Vimos tambin que el modelo de Koshland y el modelo
de Monod plantean cambios estructurales para unir en forma ms adecuada al sustrato. Para poner de manifiesto la importancia de la dinmica (o cambios conformacionales que debe sufrir una protena en orden de
ser funcional) pongamos como ejemplo el caso de una protena perteneciente a un organismo hipertemfilo.

49

Estos organismos en general viven a ms de 80 grados centgrados y han desarrollado adaptaciones para
que las estructuras de sus protenas sean estables a esas temperaturas y no se desnaturalicen. Una de las
adaptaciones ms comunes es el incremento de interacciones entre los residuos, particularmente las interacciones de carcter coulombico, o sea carga-carga. De esta forma estas protenas tienen gran cantidad de
interacciones para compensar la gran energa cintica a tales temperaturas. Que pasara si le midiramos la
actividad a una enzima de un organismo hipertermfilo a 30-40 C? Lo que se observa es que la enzima a
esa temperatura no funciona. Siguiendo con la clsica definicin de Linus Pauling de 1937 de lo que es el
estado desnaturalizado de una protena (el estado nativo es la estructura funcional de una protena y por
contraposicin los estados desnaturalizados seran cualquier otra estructura distinta a la del estado nativo)
diramos que, si la enzima no funciona esta desnaturalizada, o sea cambi su estructura. Pero en realidad, la estructura de la enzima a 30 C es exactamente la misma que a ms de 80 C ya que si es estable
a altas temperaturas probablemente lo sea a bajas! Entonces porque no funciona la enzima a bajas temperaturas? Simplemente es debido a que la protena no se mueve. Es tal la cantidad de interacciones dbiles
que contiene para compensar la alta energa trmica a ms de 80 C, que la energa a 30 C no le alcanza
para que la enzima pueda moverse. Sin embargo, la estructura es la misma! Con este simple ejemplo
comprendemos la importancia de los cambios conformacionales para el mantenimiento de la funcin biolgica. Si bien mayormente hablamos de la relacin estructura-funcin, lo correcto sera hablar de dinmica-funcin o al menos de una terna estructura-dinmica-funcin.
Actualmente el estado nativo de una protena se define como un conjunto de confrmeros, concretamente estructuras alternativas de la misma protena que se pueden obtener por rotacin de enlaces simples.
Las estructuras que describen el modelo de Koshland y el modelo de Monod son justamente confrmeros.
En que pueden diferir estructuralmente los confrmeros? En general en bastantes cosas, por ejemplo, un
dominio puede rotar en torno a otro dominio (ver figura 2.12 panel izquierdo), o puede haber una reacomodacin de la estructura terciaria (figura 2.12 panel derecho), o puede moverse un loop o incluso puede existir una prdida parcial de la estructura de una regin de la protena. Evidentemente todos estos cambios
conllevan a cambios conformacionales en las estructuras funcionales que vimos ms arriba, la superficie de
la protena, pockets, tneles y cavidades. De esta forma, los confrmeros que define Monod como T y R
(inactivo y activo respectivamente) quizs puedan ser interpretados en trminos superficiales: el confrmero
T no muestra en su superficie los aminocidos necesarios para que el ligando reconozca a la protena y de
ah que no pueda internalizarse. O quizs la explicacin este a nivel de los tneles, el confrmero T tiene un
tnel cerrado que impide el pasaje del sustrato al sitio activo. Evidentemente estas explicaciones pueden ser
muy variadas e involucrar una serie de estructuras funcionales y cambios conformacionales.

Fig. 2.11. Pares de confrmeros para dos protenas (panel derecho e izquierdo). Los confrmeros se colorearon en rosa y celeste. Las flechas indican
los movimientos relativos entre cada par de confrmeros, por ej. en el panel izquierdo la flecha indica el movimiento relativo de todo un domino, mientras que
en el panel derecho existe un desplazamiento de todo un confrmero con respecto al otro.

Pensemos ahora porque son importantes los cambios conformacionales. Conocemos sus bases
estructurales, mencionamos los cambios en loops, dominios, superficies, tamaos de cavidades etc. Qu
relacin tiene esto con la funcin de una protena en general y en particular con una enzima?

50

Evidentemente estos cambios conformacionales estn adaptados para ocurrir en determinadas condiciones.
Tomemos como ejemplo una protena transportadora de oxgeno que funcione como el modelo de Fischer.
Quizs esta protena se adapt tan bien a la unin complementaria del oxgeno, que lo estabiliza
enormemente. Pero si la protena es transportadora de oxgeno, lo deseable sera que en algn momento
esta protena tomara el oxgeno y en otro (dependiendo de la fisiologa, metabolismo u otras condiciones) lo
devolviera para ser utilizado por los tejidos. Esto se ve claramente en el grfico de la figura 2.6 donde
vemos que el oxgeno entra y sale de la hemoglobina a determinados tiempos. Quizs la estabilizacin es
tan fuerte en nuestro ejemplo, que la protena que sigue a rajatablas el modelo de Fischer no devolvera tan
fcilmente el oxgeno, de ah que no cumplira su funcin de transportar el mismo de una regin a otra. Por
el contrario, el tener varios confrmeros con distintas afinidades por un ligando o sustrato, permite que este
equilibrio conformacional se desplace favoreciendo uno u otro confrmero dependiendo de la
necesidad funcional (otra vez, fisiolgica, metablica, etc) que tenga el organismo. Obviamente, para
un dado organismo y un determinado ambiente celular, una determinada enzima posee un determinado
equilibrio entre sus confrmeros (mayormente se observa que el confrmero que predomina en ausencia de
sustrato es el confrmero sin actividad o con baja afinidad). Es importante destacar que este equilibrio
conformacional y su adaptacin a los requerimientos funcionales del organismo, se debe al proceso
evolutivo que ha quedado codificado en la estructura primaria de la protena. Mnimos cambios
secuenciales (mutaciones) puede desplazar este equilibrio produciendo nuevas adaptaciones funcionales
o incluso enfermedades. En este ltimo caso, existen enzimas que al sufrir determinadas mutaciones
(mutaciones que por su efecto se llaman activantes) permanecen mayormente en su conformacin activa,
de ah que funcionen en forma desregulada del resto del metabolismo. Estas mutaciones estabilizan
preferencialmente al confrmero activo sobre el inactivo, de ah que cambia la constante de equilibrio
conformacional favoreciendo enormemente al confrmero activo. Varias enzimas kinasas (por ejemplo, el
EGFR de epidermal growth factor receptor) con este tipo de mutaciones se encuentra frecuentemente
asociadas con enfermedades como el cncer pulmn, pncreas, rion, etc.

Bibliografia.
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell.
Dixon, M., Webb, E.C. (1980) Enzymes New York: Academic Press.
James, L. C., Tawfik, D. S. (2003) Conformational diversity and protein evolution- a 60-year-old hypothesis
revisited. Tibs. Vol28, 7
Gutteridge, A, Thornton, J. (2005). Understanding natures catalytic toolkit. Tibs. Vol20, 11.
Gora, A, Brezovsky, J, Damborsky, J. (2013). Gates of enzymes. Chemical reviews. Vol113.

51

52

CAPTULO 3
Fundamentos de Cintica Enzimtica
Anbal R. Lodeiro

El ser es; el no-ser no es

PARMNIDES. SOBRE LA NATURALEZA. (SIGLO V A.C.)

Uno de los pilares del paradigma de la Biologa actual sostiene que es posible describir todo lo que
ocurre en los seres vivos usando solamente principios fisicoqumicos. S, tambin el amor, la alegra,
el entusiasmo y el gol del Diego a los ingleses. Lo que pasa es que describir los detalles fisicoqumicos de
esos fenmenos sera un poco largo, pero eso no significa que no se pueda. Hace no tanto tiempo 150
aos, ms o menos los bilogos pensaban que no se poda. Que exista una fuerza vital propia de los
seres vivos, ausente en la materia inanimada, que era responsable por los fenmenos biolgicos. Esa hiptesis fue descartada por varias evidencias, entre las cuales la ms importante fue la constatacin de que
ciertos procesos biolgicos que se consideraba que dependan de la fuerza vital, como por ejemplo la fermentacin, podan ser observados fuera de las clulas. Esto condujo al descubrimiento y posterior aislamiento de los fermentos responsables de llevar a cabo estos procesos, los cuales luego se reconoci que
1
eran protenas a las que se llam enzimas .
El estudio de las enzimas prcticamente inaugur la ciencia que hoy conocemos como Bioqumica: la
qumica de los seres vivos. Pero una cosa es pensar la qumica de los seres vivos como una caracterizacin
de los compuestos orgnicos llevados por los seres vivos y las reacciones entre dichos compuestos, y otra
muy distinta es pensar a los seres vivos como una organizacin compleja de reacciones qumicas muy bien
articuladas y reguladas. La Bioqumica actual, como as tambin la Biologa Molecular y la ms reciente
disciplina llamada Biologa de Sistemas asumen esta posicin y tratan de entender cmo un conjunto de
reacciones qumicas puede reproducirse a s misma usando componentes simples del entorno, y hasta tener sentimientos, memoria y razonamiento, e incluso terminar preguntndose cmo es posible que un conjunto de reacciones qumicas pueda reproducirse, etc...
Las herramientas experimentales que se desarrollaron para entender estas cuestiones abarcan muchos
campos del conocimiento, incluyendo la Biologa, la Fsica, la Qumica, la Matemtica y la Informtica. Estas
herramientas dieron origen a la Biotecnologa y son tan poderosas, que si no las usamos criteriosamente
podemos provocar un desastre de dimensiones planetarias. Por lo tanto, es imprescindible la comprensin
de los fenmenos biolgicos desde el punto de vista molecular, y en ese sentido, la cintica enzimtica juega un rol fundamental. A continuacin iniciaremos la exploracin de este campo del conocimiento.

El Complejo Enzima-Sustrato
Muy poco tiempo despus de que se conocieron las enzimas, muchos qumicos comenzaron a preguntarse cmo sera su interaccin con los reactivos. En una serie de estudios de la reaccin de hidrlisis de la
sacarosa para dar glucosa y fructosa, catalizada por una enzima a la que en esa poca llamaron invertasa
(hoy tambin conocida como -fructofuranosidasa), ciertos autores encontraron que la velocidad de reaccin, adems de depender linealmente de la concentracin de invertasa, tambin dependa de la concentracin de sacarosa. En cambio, otros autores sostenan que la velocidad de reaccin era independiente de la

1
Uno de los primeros qumicos que estudi las enzimas fue Richard Willsttter. El sostena que no podan ser protenas porque en
sus procedimientos para purificarlas poda observar actividad enzimtica en muestras donde no detectaba ni trazas de protenas.
Como era un qumico muy prestigioso premio Nobel en 1915 la comunidad cientfica de su poca acompa esta creencia por casi
20 aos. El problema era que en esa poca los mtodos de cuantificacin de protenas eran muy poco sensibles, mucho menos que
los que se usaban para determinar la actividad. Deberan haberle hecho caso a Konstantin Tsiolkovski, autor de la Filosofa Csmica,
quien para esa misma poca acu la frase la ausencia de evidencia no es evidencia de ausencia.

53

concentracin de sacarosa. Adems, se haba observado que la estabilidad trmica de la invertasa cambiaba en presencia de sacarosa, lo cual llev a sospechar que haba una asociacin fsica entre la invertasa y
la sacarosa. Estas observaciones condujeron a A.J. Brown a plantear en 1902 la idea de que se formara un
complejo entre la invertasa y la sacarosa, de tal manera que a bajas concentraciones de sacarosa el complejo se formara rpidamente, rompindose luego para dar lugar a la aparicin de los productos glucosa y
fructosa, pero que a altas concentraciones de sacarosa la existencia del complejo pondra un lmite a la
velocidad de reaccin alcanzable con el aumento la concentracin de sacarosa. Extendiendo la idea a cualquier enzima (E) y sustrato (S) que se transforma en producto (P), la formacin y descomposicin del complejo enzima-sustrato puede esquematizarse como sigue:
k1

E+S

k2

ES

E+P
k -2

k -1

donde las ki representan las constantes cinticas de velocidad para las reacciones 1 y 2, con signo positivo
en direccin a la formacin de producto y con signo negativo en direccin a la formacin de sustrato. Como
puede verse, si la concentracin de E es constante, el aumento en la concentracin de S puede hacer aumentar la velocidad de formacin de P siempre que dicha concentracin de S no sea tan alta como para que
toda la E se encuentre formando el complejo ES. Llegado ese punto, ulteriores aumentos de la concentracin de S no podrn provocar aumentos en la velocidad de formacin de P ya que no habr ms E libre
para formar ms complejo ES. Estas ideas fueron recogidas por L. Michaelis y M. Menten, quienes en 1913
llevaron a cabo una serie de experimentos que les permiti desarrollar la primera expresin matemtica de
la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas.

La Aproximacin del Equilibrio Rpido

Hace unos aos, los lidios y los medos se estaban matando en una batalla campal a pleno sol en lo que
hoy es Turqua. Ya haca seis aos que se venan dando porque los medos queran avanzar sobre el territorio de los lidios y parece que aquel da la batalla era feroz. De repente, el Sol se puso negro, el da se hizo
noche y solo se vea un tenue resplandor. Presas del pnico, los ejrcitos dejaron de pelear y pronto se
sell la paz entre ambas naciones. Gracias a los relatos de la poca y los clculos astronmicos, hoy sabemos que lo que sucedi aqul da fue un eclipse total de Sol, que el da en cuestin fue el 28 de Mayo del
ao 585 a.C. y que el suceso tuvo lugar a las cuatro y cuarto de la tarde, extendindose durante 6 minutos y
cinco segundos. Impresionante. Casi como viajar en el tiempo (aunque no habra sido lindo estar all con
una lanza en la mano).
Este grado de precisin en la caracterizacin de un suceso puntual ocurrido hace 2.600 aos es posible
gracias a la existencia de leyes astronmicas que permiten predecir la posicin exacta de un cuerpo celeste
de nuestro Sistema Solar en cualquier momento del pasado o del futuro. En Biologa, en cambio, no existen
leyes de este tipo. La Biologa es una ciencia experimental y emprica en la cual el conocimiento se basa
en la realizacin e interpretacin de experimentos, que no son ms que preguntas que le hacemos a la Naturaleza. Si las preguntas estn bien hechas, ella tiene la amabilidad de responderlas, permitindonos empujar un cachito ms la frontera de nuestra ignorancia. Ello no quita que en un momento dado una pregunta
tenga una respuesta inesperada, que nos obligue a replantear y reconsiderar nuestro conocimiento, siendo
precisamente en esos momentos cuando se producen los avances ms significativos y a veces, hasta revolucionarios. Como sea, tenemos que asumir la conducta de que la Naturaleza siempre tiene razn y jams
intentar forzar la interpretacin de un fenmeno para que encaje en nuestras creencias y preconceptos. Esa
conducta es la que mantuvieron L. Michaelis y M. Menten en 1913 y por ello debe tenerse mucho cuidado al
leer lo que sigue, evitando creer que impusieron condiciones a la interpretacin de los hechos. Simplemente, l y ella buscaron el camino ms simple para desarrollar un modelo que permitiera el estudio de la cintica enzimtica pero siempre ajustndose estrictamente a interpretar lo que los resultados experimentales decan.
La evidencia clave que recogieron de sus cuidadosos experimentos con la invertasa era que, a bajas
concentraciones de sacarosa y controlando el pH y la temperatura de la mezcla de reaccin, la velocidad de
produccin de glucosa y fructosa (productos) era directamente proporcional a la concentracin inicial de
sacarosa. Adems, si bajo estas condiciones medan la aparicin de productos a lo largo del tiempo, observaban que a tiempos cortos la relacin era lineal: si al tiempo t = x la concentracin de productos era y, al
tiempo t = 2x la concentracin de productos era 2y, al tiempo t = 3x la concentracin de productos era 3y,
etc. (Fig. 3.1). Sin embargo, saban que si dejaban transcurrir la reaccin hasta un tiempo lo suficientemente
largo, al cual podramos llamar t, en ese momento la velocidad de reaccin sera cero ya que se habra
alcanzado el equilibrio, y en todo el transcurso entre el inicio y la llegada al equilibrio la velocidad de reaccin ira decreciendo. Por qu, entonces, la velocidad de reaccin al inicio de los experimentos era cons-

54

tante? Ellos razonaron que, si se forma el complejo ES y ste es el intermediario que da origen a los productos, la velocidad de la reaccin estara determinada por la concentracin de ES:
=

3.1

donde kp representa una constante cintica de la velocidad de formacin de productos. Ahora bien, en cualquier mezcla de reaccin la concentracin de sustrato es mucho mayor que la de enzima:
[]

3.2

Esta suposicin es vlida ya que la enzima se encuentra en concentraciones catalticas y no se destruye en el curso de la reaccin (tericamente, una sola molcula de enzima bastara para catalizar muchos
ciclos de transformacin de sustrato en producto, ya que se recicla cada vez). Siendo as, y suponiendo que
el paso limitante es la velocidad con la que ES se descompone en E y P, el equilibrio
k1

E+S

ES
k -1

se debera establecer muy rpidamente. Con estos elementos, podra explicarse por qu durante el inicio
de la reaccin la velocidad de aparicin de productos es constante.
Durante ese tiempo inicial la concentracin de productos [P] es cercana a cero, con lo cual la reaccin de
formacin de sustrato a partir de productos puede considerarse insignificante. Ello reduce la reaccin total a
lo siguiente:
k1

E+S

kp

ES

E+P

k -1

donde la constante k-2 ha desaparecido y la constante k2 se ha transformado en la kp. Como estamos al

inicio de la reaccin (t 0) nos vamos a referir a esta velocidad de reaccin como velocidad inicial, v0 y por
lo tanto, la ecuacin de la velocidad (3.1) quedar expresada como:
0 = []

3.3

Concentracin (M)

4,5

S = 0,04 mM

4
3,5
3
2,5

S = 0,02 mM

2
1,5
1
0,5
0

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

Tiempo (min)
Fig. 3.1. Representacin esquemtica de la produccin de P (lneas
llenas) y la formacin de complejo ES (lneas discontinuas). Entre las
lneas de puntos la tasa de produccin de P es constante debido a
que se mantiene constante la [ES]. Las velocidades iniciales (v0) se
calcularon como las pendientes en el tramo lineal con las concentraciones de sustrato 0,04 mM (rojo) o 0,02 mM (azul) considerando una
KM = 1 mM y una Vmax = 15 moles min1.

55

Es muy importante notar que esta situacin representa el inicio de la reaccin y que si se ha despreciado k-2 es solamente porque [P] en este momento es casi cero; no importa cul es el valor de k-2.
Ahora podemos explicarnos por qu la v0 es constante. Para que v0 sea constante tiene que cumplirse
que [S] tambin lo sea. En efecto, esto parece ser una condicin necesaria y suficiente, ya que mientras
no varen el pH y la temperatura durante el ensayo, kp se mantendr constante.
Uniendo la condicin de estado inicial de la reaccin con la idea de que la enzima y el sustrato se equilibran rpidamente podemos llegar a darnos cuenta de que a medida que S se va consumiendo la concentracin de complejo ES se va a mantener casi constante durante los primeros tiempos luego del inicio de la
reaccin. Sin embargo, las magnitudes involucradas en la ecuacin planteada arriba (kp, [ES]) son muy difciles de medir y por lo tanto, sera necesario poder expresar v0 en trminos de otros valores.
Una primera cuestin es tratar de expresar [ES] en trminos de la concentracin de sustrato inicial [S],
2
que nosotros conocemos porque es lo que agregamos en la mezcla de reaccin , y de la concentracin
total de enzima, [ET], que podramos llegar a medir, aunque no sepamos cunta de ella est libre (E) y cunta complejada con sustrato (ES). Para eso, podemos partir de la idea de que [ET] = [E] + [ES] y dividir la
ecuacin 3.3 por estos valores:
[]
0
=
3.4
[ ]
+ []
Dado que supusimos que la enzima libre y el sustrato se equilibran rpidamente con el complejo enzimasustrato, podemos plantear la existencia de una constante de equilibrio, a la que llamaremos KS:
=

[] [] 1
=
[]
1

3.5

Por lo tanto, podemos expresar [ES] en trminos de [E] y KS:

=

3.6

En la ecuacin 3.4 podemos reemplazar [ES] por la expresin que acabamos de encontrar:
0
=
[ ]

[]

[]
+
[]

3.7

Ahora la concentracin de enzima libre puede ser simplificada y la ecuacin de la velocidad (3.3) queda
en funcin de variables ms fciles de determinar experimentalmente: la concentracin total de sustrato, la
concentracin total de enzima y la constante de equilibrio KS. De todos modos, podemos dar un paso ms,
pasando la concentracin total de enzima al otro miembro:

0 =

1+

3.8

y reordenando, podemos expresar la ecuacin 3.8 como:

0 =

3.9

Ahora bien: recordemos que la primera ecuacin de la velocidad que escribimos (3.3) era v0 = kp [ES],
pero tambin habamos dicho que si la concentracin de sustrato [S] supera cierto lmite, el equilibrio se va
a desplazar hacia la formacin de complejo ES de modo tal que prcticamente toda la enzima va a estar
complejada con sustrato. En esas condiciones, [ES] [ET] y la velocidad inicial v0 no podr aumentar cuan-

2
La concentracin total de sustrato [ST] es en realidad la suma de la concentracin de sustrato libre [S] ms la concentracin de
sustrato unido a la enzima en el complejo enzima-sustrato, [ES]. Sin embargo, al ser [ST] >> [ET] puede considerarse que la proporcin
de ST que se encuentra en ES es despreciable y por lo tanto, puede hacerse la aproximacin [S T] [S].

56

do se aumente la concentracin de sustrato por sobre el valor lmite ya que no habr ms enzima disponible
para formar ms complejo ES. En otras palabras, la enzima estar saturada de sustrato, y por encima de la
concentracin de sustrato saturante no habr ms incrementos de la v0. A esa v0, que se alcanza con la
concentracin de sustrato saturante, se le llama velocidad mxima (Vmax), y como se acaba de ver, es una
velocidad inicial. En sntesis, es la mxima velocidad inicial alcanzable con aumentos de la concentracin de sustrato. De este modo:
=

3.10

Reemplazando Vmax en la ecuacin 3.9, nos queda:

0 =

[]
+ []

3.11

la cual expresa la velocidad inicial en trminos de la concentracin total de sustrato, la velocidad inicial
mxima y la constante de equilibrio KS. Al ser esta ltima la relacin de las constantes cinticas de formacin y ruptura del complejo ES (ver arriba), tambin representa la afinidad de la enzima por el sustrato. Puede observarse que cuanto mayor sea la tendencia a la formacin del complejo ES en relacin con la tendencia a su ruptura, menor ser el valor de KS (= k-1/k1) y a menor KS mayor ser la v0 si todos los otros
componentes de la ecuacin de la velocidad no cambian. Visto desde el otro punto de vista, cuanto menor
sea KS, menor ser la concentracin de sustrato [S] necesaria para alcanzar la misma v0, es decir, la enzima
ser ms afn por el sustrato.

La Aproximacin del Estado Estacionario

Retomando el esquema bsico del estado inicial de la reaccin catalizada enzimticamente:
k1

E+S

kp

ES

E+P

k -1

podemos preguntarnos si es necesario que haya un equilibrio rpido entre la enzima libre, el sustrato y el
complejo enzima-sustrato para que la velocidad inicial sea constante. En realidad, existe otra condicin
donde la [ES] puede mantenerse constante, la cual fue descripta por Briggs y Haldane en 1925. A esta condicin la conocemos como estado estacionario.
Un estado estacionario con respecto a alguna variable del sistema se alcanza cuando, para esa variable,
la velocidad de entrada al sistema es igual a la velocidad de salida del sistema, de modo tal que dentro del
sistema el valor de la variable permanece constante, aun cuando el sistema no est en equilibrio. En nuestro caso, el sistema se halla claramente fuera del equilibrio porque estamos considerando la velocidad inicial. El sistema es pues el complejo ES y la variable que tomaremos en cuenta es la materia, medida como
concentracin. La velocidad de entrada de materia sera la velocidad con la cual se forma el complejo ES a
partir de E y S. Por su parte, la velocidad de salida sera aquella con la cual se descompone el complejo ES.
El complejo ES puede descomponerse de dos maneras: disociarse a E + S o reaccionar para dar E + P. Por
lo tanto, la suma de las dos velocidades de reaccin ES E + S y ES E + P debera ser igual a la velocidad de la reaccin E + S ES para que se alcance el estado estacionario y la concentracin de ES se
mantenga constante:
[]
= 1 1 = 0

3.12

Si recordamos que [E] = [ET] [ES] y reordenamos:

1 [ )[] (1 + ) = 0

(3.13)

Agrupando los trminos en [ES]:

1 [ ] = (1 + + 1 [])

57

1 [ ]
(1 + + 1 [])

3.14

De este modo, podemos calcular la v0, reemplazando en 3.3 el valor de [ES]:

0 = =

1 [ ]
(1 + + 1 [])

3.15

Dividiendo numerador y denominador por k1 y simplificando:

0 =

[ ]
(1 + )
+ []
1

(3.16)

Observemos que en el denominador ha quedado una relacin de constantes cinticas muy similar a KS,
excepto que esta vez tambin se agrega la constante kp. Esto es razonable ya que no hicimos ninguna suposicin acerca del valor de kp. Por lo tanto, Briggs y Haldane llamaron a esa relacin de constantes constante de Michaelis-Menten o KM, en honor a quienes fueron los primeros en proponer la ecuacin para la
cintica de la reaccin catalizada por una enzima. Reemplazando y recordando que kp [ET] = Vmax, queda:
0 =

+ []

3.17

la cual es muy similar a la que habamos deducido anteriormente (con KM en vez de KS) y se la conoce como la ecuacin de Michaelis-Menten. Esta ecuacin es la ecuacin fundamental de la cintica enzimtica,
y ms all de que haya sido deducida a partir de un mecanismo particular y simplificado, puede aplicarse a
muchos mecanismos incluso ms complejos.

Significado de los Parmetros de la Ecuacin de Michaelis-Menten

Si observamos de nuevo la ecuacin de Michaelis-Menten (3.17), veremos que tiene dos variables: v0 y
[S], de las cuales [S] es la variable independiente (o sea, aquella cuyo valor es arbitrariamente elegido por el
experimentador) y v0 es la variable dependiente (cuyo valor depende del valor que asuma [S]). Pero adems
hay otras dos cantidades, a veces mal llamadas constantes, pero que en realidad son parmetros: Vmax y
KM. Ninguna de ellas depende de [S] pero s son quienes definen la forma que adopta la funcin. Para entender su significado tenemos que pensar en trminos matemticos pero tambin bioqumicos y fisiolgicos.
Es por ello que aqu hay uno de los puntos centrales donde se manifiesta la multidisciplinariedad de este
enfoque: en la confluencia de distintas ciencias para obtener un resultado que emerge como algo superador
de todas ellas y no como mero agregado de aportes diversos.
Como primer paso, veamos qu aspecto tiene la representacin grfica de la ecuacin de MichaelisMenten. En la Fig. 3.2 mostramos cmo vara v0 en funcin de [S], representando, como es usual, a la variable independiente en el eje de las abscisas y a la variable dependiente en el eje de las ordenadas. El
resultado es una grfica que sigue una funcin hiperblica que pasa por el punto (0; 0) donde las asntotas
son Vmax y KM. Aqu vemos una de las razones por las cuales Vmax y KM deben llamarse parmetros: al ser
las asntotas son los parmetros que definen los lmites y la curvatura de la hiprbola.
Ahora intentemos ver qu significado tienen estos parmetros desde el punto de vista bioqumico. Por un
lado, es fcil ver por qu Vmax es una asntota: si aumentamos la [S], KM se vuelve despreciable y el cociente
[S]/(KM + [S]) de la ecuacin 3.17 se aproxima a 1, con lo cual v0 se aproxima a Vmax, pero nunca dicho cociente se iguala a 1, con lo cual nunca la v0 alcanza a la Vmax, por ms alta que sea la [S]. En realidad,
cuando anteriormente dijimos que a la [S] saturante toda la enzima est complejada con S, cometimos un
exceso de lenguaje, ya que si se mira bien la Fig. 3.2 veremos que la v0 aumenta siempre, aunque la tasa
de aumento de v0 a [S] muy grandes se vuelve imperceptible. Cul es, entonces, la explicacin bioqumica
de que la Vmax no pueda alcanzarse nunca, por ms alta que sea la [S]? Recordemos que la combinacin de
la enzima libre (E) y el sustrato (S) conduce a la formacin del complejo enzima-sustrato (ES), que es donde
se produce la reaccin. Por ley de accin de masas, al aumentar la [S] el equilibrio se desplaza hacia la
formacin de ES, pero al ser una reaccin reversible, nunca se llega a la situacin donde la [E] sea 0. Por lo
tanto, decir que a [S] saturante toda la enzima est presente como complejo ES es, como dijimos, un exceso de lenguaje.

58

v0 (moles min1)

Vmax

15

10

0
-1
KM
-5

[S] (mM)

-10

Fig. 3.2. Representacin grfica de la relacin entre la v0 y la [S] para una enzima que sigue la cintica de Michaelis-Menten. Los parmetros cinticos son
los mismos que en la Fig. 3.1. La lnea de puntos trazada en el valor v0 = 15
moles min1 indica la Vmax. Las lneas que marcan el punto de coordenadas (1;
7,5) indican los valores de [S] = KM y 0,5Vmax respectivamente. El recuadro gris
indica una zona que no tiene sentido fsico, pero permite visualizar que KM es
la otra asntota de esta hiprbola.

Vale la pena aqu recalcar que, como estamos viendo, la Vmax es una v0, es decir, se trata de la mxima
velocidad inicial. No nos cansamos de repetir esto ya que la forma de las grficas de las Fig. 3.1 y 3.2 (en
el cuadrante positivo) es similar y puede conducir fcilmente a una interpretacin errnea. La costumbre
indica que una velocidad mxima se alcanza un cierto tiempo despus de iniciado el proceso, y la idea
misma de velocidad mxima entraa una idea de aceleracin, es decir, de un proceso que se inicia a
velocidad igual a cero, procede a lo largo del tiempo con una aceleracin que va decreciendo, y finalmente
alcanza la velocidad mxima cuando la aceleracin se hace igual a cero. Por lo tanto, muchos estudiantes
tienden a confundir estas grficas y a creer que la velocidad mxima se alcanza luego de transcurrido un
tiempo de reaccin. Es por ello que debe tenerse mucho cuidado al mirar las Fig. 3.1 y 3.2: en ninguno de
los ejes de la Fig. 3.1 est explcitamente indicada la velocidad, sino que sta resulta ser la pendiente de la
curva [P] vs tiempo. Como puede verse, la mayor pendiente de cada curva se encuentra al tiempo cero,
mientras que a tiempos largos dicha pendiente tiende a cero (es decir, se alcanza el equilibrio qumico).
En los ejes de la Fig. 3.2 est representada la v0 en funcin de la [S], no del tiempo. Por lo tanto, cada punto del eje v0 de la Fig. 3.2 es la pendiente a tiempo cero de cada una de las curvas de la Fig. 3.1.
Finalmente, podemos considerar a la Vmax desde el punto de vista fisiolgico. Con las salvedades mencionadas arriba, este parmetro puede representar a la cantidad de enzima presente, ya que a los fines
prcticos Vmax = kp [ET]. Por lo tanto, en condiciones de saturacin de sustrato, y manteniendo todos los
otros parmetros sin cambios, la velocidad de catlisis no depende de la concentracin de sustrato sino slo
de la concentracin de enzima. Por lo tanto, si en un tejido una enzima que cataliza cierta reaccin de una
va metablica se encuentra operando cerca de su Vmax, la velocidad de catlisis de esta reaccin podr
modificarse solo modificando la cantidad de enzima, independientemente de la concentracin de sustrato
presente. Esto realmente ocurre con muchas enzimas que se regulan al nivel de la expresin de los genes
que las codifican. Volveremos sobre este punto en captulos posteriores cuando analicemos el rol de la regulacin de la actividad enzimtica sobre el control de las rutas metablicas.
Con respecto al KM, si bien desde el punto de vista matemtico se encuentra en el cuadrante negativo
(Fig. 3.2), no tiene sentido bioqumico hablar de [S] negativas, y aunque una velocidad de reaccin negativa
podra estar indicando que prevalece la formacin de sustrato a partir del producto, tampoco tiene sentido
considerar una velocidad inicial negativa ya que al tiempo cero no hay producto a partir del cual pueda formarse sustrato. Es decir, el valor de KM solo tiene sentido para indicar que es uno de los parmetros de la
hiprbola.
Si buscamos el valor positivo del KM sobre el eje de [S] nos encontramos con que coincide con la [S] a la
cual se alcanza la mitad de la Vmax. En efecto, si en la ecuacin 3.17 reemplazamos el valor de KM por [S]
cuando numricamente KM = [S] nos queda que:
0 =

1
=
=
[] + []
2[]
2

59

3.18

Ahora bien: debemos recordar que, por la ecuacin 3.16:

=

(1 + )
1

3.19

y por lo tanto, KM no es una concentracin de sustrato, sino una relacin de constantes cinticas.
Por qu entonces KM se encuentra sobre el eje de [S] y tiene unidades de concentracin? Se encuentra en
el eje de [S] precisamente por ser uno de los parmetros de la hiprbola el que corresponde al eje de las
abscisas y tiene unidades de concentracin porque las constantes cinticas que estn en el numerador de
3.19 son de primer orden y por tanto tienen unidades de (tiempo 1) mientras que la constante cintica k1 del
denominador es de segundo orden y entonces tiene unidades de (concentracin 1 tiempo1). Simplificando,
se puede ver que la unidad de KM queda expresada en unidades de concentracin. En resumen, KM es una
relacin de constantes cinticas que coincide con la [S] a la cual v0 es la mitad de la Vmax, pero no es una
concentracin de sustrato (yo que vos, le pasara un resaltador a la ltima oracin).
Por otro lado, es obvio que, al estar en el mismo eje, KM no depende de [S] ya que equivale a un nico
valor de [S]. Tampoco KM depende de la concentracin de enzima, ya que es un parmetro independiente
de v0 y por lo tanto, independiente de Vmax. Esto significa que KM es equivalente a la [S] a la cual se alcanza
la mitad de la Vmax siendo esa [S] siempre la misma, independientemente de la concentracin de enzima.
Al ser una relacin de constantes cinticas, KM depende del pH y de la temperatura. Sin embargo, es imposible predecir la tendencia del KM con el incremento del pH o de la temperatura, ya que KM depende de
tres constantes cinticas y por lo tanto, su valor cambiar de acuerdo a cmo el pH y la temperatura afecten
a cada una de esas tres constantes.
Como ya dijimos, KM (y ms propiamente, Ks) representa la afinidad de la enzima por el sustrato. Cuanto
mayor sea la suma (k1 + kp) con relacin a k1 ms tendencia tendr el complejo ES a disociarse que a asociarse y por lo tanto, un valor alto de KM representa una menor afinidad. Asimismo, cuanto ms alto sea el
KM mayor ser la [S] necesaria para alcanzar la mitad de la Vmax, lo cual puede extenderse a cualquier fraccin de la velocidad. As, el KM es una propiedad del par enzima-sustrato considerado: dos enzimas que
catalizan reacciones distintas con el mismo sustrato tendrn KM distintos, y una enzima que cataliza una
dada reaccin con dos sustratos alternativos tendr un valor de KM para cada uno de ellos.
Dado que el valor de KM no depende de la concentracin de enzima, una mayor produccin de enzima
en un tejido dado no modificar el valor de KM de esa enzima por su sustrato en ese tejido. Si embargo, el
valor de KM depende de la estructura de la enzima, y en particular, de la estructura de su sitio activo, ya que
ste es el que determina los valores de k1, kp y k1. Por lo tanto, cualquier molcula que sea capaz de unirse
a la enzima y provocarle un cambio conformacional tal que modifique la estructura o el estado de ionizacin
del sitio activo provocar un cambio en el KM. Este tipo de molculas se conocen como efectores y tambin
tienen un papel de gran importancia en la regulacin de las vas metablicas. Regresaremos a ellos cuando
+
analicemos el fenmeno del alosterismo, pero por el momento podemos ver que incluso los H podran ser
considerados como efectores si es que el cambio de pH produce cambios en el estado de ionizacin del
sitio activo tales que afecten alguna de las constantes cinticas k1, kp o k1.
Entre estas constantes cinticas hay una a la que debemos prestar especial atencin. Se trata de kp, ya
que es la constante de primer orden de la reaccin de produccin de P a partir del complejo ES. Por lo tanto, esta constante, que como dijimos tiene unidades de tiempo 1, representa el nmero de ciclos catalticos
por unidad de tiempo que la enzima es capaz de producir. Por ello, esta constante tambin es conocida
como constante cataltica (kcat) o como nmero de recambio. Esta constante puede determinarse experimentalmente si se conocen la concentracin de enzima y la Vmax, ya que de acuerdo con la ecuacin 3.10,
kp = Vmax/[ET].
Debe hacerse notar que si bien kp y KM son independientes entre s, cada una de ellas hace referencia
en cierto modo a la eficiencia cataltica de la enzima. Por ejemplo, consideremos la fumarasa, que cataliza
la hidratacin del fumarato para dar malato en una va metablica de suma importancia para la generacin
de energa, poder reductor y esqueletos carbonados para la biosntesis de aminocidos, nucletidos, etc. El
sustrato natural de esta enzima es el fumarato, pero tambin puede catalizar la hidratacin del fluorofumarato. La kp (o kcat) es considerablemente mayor para el fluorofumarato (2.700 s 1) que para el fumarato (800
s1), lo que significa que puede catalizar ms del triple de ciclos por segundo con fluorofumarato que con
fumarato. Sin embargo, su afinidad por el fumarato parece ser mucho mayor, dado que el KM por el fluorofumarato es 27 M mientras que por el fumarato es 5 M. Por lo tanto, podra decirse que esta enzima funciona mejor con fluorofumarato a altas concentraciones de sustrato, donde [S]/(KM + [S]) 1 y por lo tanto la
ecuacin de Michaelis-Menten puede considerarse como una cintica de orden cero en la cual v0 Vmax, es
decir que v0 no depende de [S] y s depende de kp. Por otro lado, a [S] << KM el denominador de la ecuacin

60

3.17 resulta KM + [S] KM y la ecuacin de Michaelis-Menten se aproxima a una cintica de primer orden,
donde v0 [S](Vmax/KM). En esta situacin la v0 depende directamente de la [S], con lo cual la afinidad de la
enzima por el sustrato debera jugar un papel. Si observamos la constante que ha quedado en la ecuacin
de primer orden y apartamos de ella la concentracin de enzima, observamos que dicha ecuacin podra
tambin escribirse como:
0 =

3.20

La relacin kp/KM se conoce como constante de especificidad, o kA. Por lo tanto, la ecuacin anterior
puede escribirse como:
0 =

3.21

Para el caso de la fumarasa, la kA por el fumarato es 800 s1/5 M = 160 s1 M1 mientras que para el
fluorofumarato es 2.700 s1/27 M = 100 s1 M1, es decir que la kA es un 60% mayor para el fumarato.
Esto indica que a bajas concentraciones de sustrato, la fumarasa debera funcionar mejor con fumarato que
con fluorofumarato. Sin embargo, esto se aplica solo a la situacin de bajas [S]? La kA no tiene validez
fuera de este rango? Es ms fundamental la KM que la kA? Esta situacin es una rareza de la fumarasa o
se repite con otras enzimas?
La realidad es que esta situacin es general y el parmetro kA es igualmente fundamental que KM. De
hecho, se ha propuesto que la ecuacin de Michaelis-Menten puede escribirse igualmente bien empleando
kA y KM en vez de kp y KM:
0 =

[ ]
[]
1+

3.22

o bien empleando kA y kp sin usar KM:

0 =

[ ]
+

(3.23)

Por lo tanto, vemos que cualquiera de los tres parmetros: kA, kp y KM son igualmente fundamentales y la
misma ecuacin puede expresarse en trminos de dos cualquiera de ellos. De todos modos, la costumbre
hace que la expresin 3.17, en trminos de kp y KM, sea ms familiar y es por ello que continuaremos utilizndola en el resto de este libro.

Clculo de los Parmetros Cinticos

La ecuacin de Michaelis-Menten nos permite expresar la v0 en relacin con la [S] y dos parmetros
cinticos que, en principio, parecen fciles de determinar experimentalmente. Por ejemplo, si podemos utilizar en nuestros experimentos una [S] lo suficientemente alta como para acercarnos a la saturacin, podemos entonces determinar experimentalmente la Vmax. Luego, utilizando una serie de [S] menores (no de
saturacin) podramos reordenar la ecuacin de Michaelis-Menten para determinar el KM. Para este tipo de
experimentos es cmodo expresar [S] en trminos de KM: 0,1KM; 0,5KM; 2KM; 10KM; etc. Puede verse que
cada una de estas expresiones es una concentracin; si por ejemplo el valor de KM es 4 mM, las concentraciones referidas anteriormente sern 0,4 mM, 2,0 mM, 8,0 mM y 40,0 mM respectivamente. Al expresar [S]
en trminos de KM podemos ver en la ecuacin de Michaelis-Menten cunto nos acercamos a la Vmax. Por
ejemplo, si la [S] = 2KM, reemplazando [S] en 3.17 vemos que v0 ser 2/3 de la Vmax; si [S] = 10KM, v0 ser
10/11 de la Vmax, y as sucesivamente. Podramos decir que 2/3 no es lo suficientemente cerca de la Vmax,
pero 10/11 s lo es. Siguiendo con el razonamiento, una [S] de 100KM llevara la v0 a 100/101 Vmax, y bueno... ah s podramos decir que estamos razonablemente cerca, o no?
En muchos aspectos de las ciencias experimentales se tienen usos y costumbres que definen umbrales
de hasta qu punto es aceptable cierto acercamiento. Por ejemplo, en el anlisis estadstico de datos
siempre nos manejamos con muestras que esperamos que representen a la poblacin. Si por ejemplo estamos haciendo nuestro experimento para determinar el valor del KM, vamos a tener una serie de medidas
de v0 en un rango de [S]. Por ejemplo, supongamos que a una [S] = 1 mM obtenemos una v0 = 0,21 moles

61

de P producidos por minuto. Repetimos el experimento, y a la misma [S] obtenemos una v0 = 0,24 moles
de P producidos por minuto. Cul es la verdadera v0? 0,21 o 0,24 moles de P producidos por minuto?
Podramos hacer una tercera determinacin para desempatar, pero lo ms probable es que obtengamos
un tercer valor, que no va a ser ni 0,21 ni 0,24 moles de P producidos por minuto. Y as sucesivamente, si
siguiramos repitiendo el experimento, obtendramos una serie de valores todos distintos entre s, pero en
cierto modo, parecidos: difcilmente obtendramos valores tales como 5.478 moles de P producidos por
minuto o 3.1014 moles de P producidos por minuto... y si los obtuviramos, tendramos buenas razones
para sospechar de que son la consecuencia de haber hecho algo mal durante la determinacin. Cada uno
de los valores que vamos obteniendo es una muestra de la poblacin de todas las determinaciones que
podramos hacer con la misma enzima, el mismo sustrato y las mismas condiciones experimentales. El
hecho es que no todas las determinaciones son exactamente iguales: un pequeo error en algn volumen
tomado con nuestras pipetas, una leve diferencia en la temperatura de incubacin de distintos tubos, una
insignificante inhomogeneidad en la distribucin de las molculas de enzima en el seno de la solucin, pueden dar origen a valores levemente diferentes de la v0, no importa cuntas veces lo hagamos. Es decir, no
existe un valor verdadero de la v0 en esas condiciones, sino una distribucin de valores de v0. Si sumamos
todos estos valores y los dividimos por el nmero total de determinaciones, obtenemos la media. De nuevo,
si hiciramos todas las determinaciones posibles con la misma enzima, el mismo sustrato y las mismas
condiciones experimentales, obtendramos la media poblacional, pero como esto es evidentemente imposible, lo que hacemos es un conjunto de determinaciones, que constituyen una muestra, y su promedio es la
media muestral. Haciendo el mismo razonamiento que antes, es fcil ver que cada muestra tendr su media
muestral, y que casi ninguna de ellas coincidir con la media poblacional, cuyo valor seguramente ignoraremos. Por lo tanto, podemos repetirnos la pregunta hasta qu punto el valor obtenido para la media muestral se parece al de la media poblacional? La estadstica ha desarrollado una gran cantidad de herramientas
para responder esta pregunta, basadas en el estudio de las distribuciones de datos alrededor de un promedio. El punto es que, como desconocemos el valor de la media poblacional (porque no podemos hacer la
infinita cantidad de determinaciones experimentales que necesitaramos para calcularla) todo lo que podemos decir es cul es la probabilidad de que nuestra media muestral sea parecida a la media poblacional.
Usando estas herramientas estadsticas se acepta, en general, que una probabilidad igual o mayor al 95%
nos da un grado de confianza aceptable de que el valor obtenido en nuestra serie de determinaciones refleje el verdadero valor de la media poblacional. Sin embargo, no hay una justificacin lgica de por qu 95%
es aceptable y 94% no.
Haciendo algo similar, podramos intentar un uso y costumbre (o generar una comisin de expertos...)
que ponga un umbral aceptable de hasta qu punto la v0 obtenida experimentalmente con [S] muy alta refleje la verdadera Vmax. Por ejemplo, sabiendo que no podemos obtener la verdadera Vmax experimentalmente, podramos convenir que una v0 = 10/11Vmax sera una buena aproximacin. Frente a esto, podemos
decir que hay dos noticias: una mala y una buena. Empecemos por la mala: a menudo es imposible disolver
una sustancia a una concentracin del orden de 10KM. Por ejemplo: recordemos que muchos aminocidos
tienen cadenas laterales (grupos R) hidrofbicas. Ejemplos de ellos seran la valina, la leucina, la isoleucina o la fenilalanina. Si por ejemplo estuviramos interesados en determinar la Vmax de una enzima que cataliza cierta reaccin con fenilalanina como sustrato, sera seguramente muy difcil preparar una solucin
acuosa altamente concentrada de fenilalanina dado que su solubilidad en agua a 25C es de solo 180 mM.
Para otras enzimas, puede haber una limitacin tcnica adicional: muchas de ellas catalizan pasos intermedios (por ejemplo en la sntesis de fenilalanina) cuyos sustratos son molculas inestables, difciles de obtener en forma pura a partir de muestras naturales y que solo estn disponibles en pequeas cantidades gracias a complicados procesos de sntesis qumica, lo que hace difcil preparar con ellas soluciones altamente
concentradas. Es decir, en la mayora de los casos, preparar soluciones con [S] = 10KM es tcnica o fsicamente imposible.
Ahora podemos dar la buena noticia: es posible calcular exactamente los valores de KM y Vmax con cualquier [S]. En 1934, H. Lineweaver y D. Burk, simplemente invirtiendo la ecuacin de Michaelis-Menten, propusieron lo que hoy conocemos como la doble recproca: una funcin lineal de donde se pueden extrapolar los valores de KM y Vmax:
1
+ []
1
1
=
=
+
0

(3.24)

Es decir, obtenemos la ecuacin de una recta de la forma y = ax + b donde la pendiente es KM/Vmax y la

ordenada al origen es 1/Vmax. Adems, si hacemos que 1/v0 = 0, nos queda la igualdad
1
1
=

62

A
0,35
0,4

0,3

1/v0

0,25

0,3

0,2

0,2

0,15

1/KM

0,1

0,1

1/Vmax

0,05

-1

1/[S]

1/[S]

Fig. 3.3. Representacin doble recproca de Lineweaver-Burk de los datos de la Fig. 3.2. En A se muestra
la lnea que une los puntos experimentales (rojo) y su prolongacin sobre los ejes. El corte del eje 1/v0 se
produce en el valor 1/Vmax y el corte del eje 1/[S] se produce en el valor equivalente a 1/KM. En B se
muestra la misma grfica (sin proyectar) donde se han incluido barras de error correspondientes a 10% de
error en las medidas de las v0. El valo azul seala los puntos que provienen de valores bajos de v0.

1
1
=
=

(3.25)

es decir, que la proyeccin de la recta sobre el eje de las abscisas da 1/KM. En otras palabras, la proyeccin de la recta sobre los ejes 1/v0 y 1/[S] da por resultado las inversas de los dos parmetros de la hiprbola: 1/Vmax y 1/KM (Fig. 3.3).
La representacin de la doble recproca, tambin conocida como representacin de Lineweaver-Burk, si
bien ha sido muy utilizada, tiene algunas limitaciones. La ms importante es que, dado que en general se
usan [S] relativamente bajas, los valores de las inversas 1/[S] y 1/v0 son grandes y por lo tanto, tambin lo
son los desvos ocasionados por los valores experimentales. Observando la recta de la Fig. 3.3 vemos que
los errores cometidos a valores bajos de 1/[S] y 1/v0 van a propagarse a la pendiente de la recta con lo cual
la extrapolacin a los ejes de abscisas y ordenadas puede arrojar estimaciones muy errneas. Para solucionar este problema se han propuesto modificaciones a la doble recproca, siempre procurando transformar la
ecuacin de Michaelis-Menten en una ecuacin de una recta. Algunas de las ms importantes son la representacin de [S]/v0 vs [S], la de v0 vs v0/[S] y la lineal directa.

0,8

0,8

0,6

[S]/v0

0,6
0,4
0,4
0,2

0,2

KM
0

-1

11

[S]

10

[S]

Fig. 3.4. Representacin de Hanes-Wolfe de los datos de la Fig. 3.2. En A se muestra la lnea que une los
puntos experimentales (rojo) y su prolongacin sobre los ejes. El corte del eje [S] se produce en el valor
equivalente a KM. En B se muestra la misma grfica (sin proyectar) donde se han incluido barras de error
correspondientes a 10% de error en las medidas de las v0. El valo azul seala los puntos que provienen
de valores bajos de v0.

63

15

Vmax

12

v0

Vmax/KM

12

15

v0/[S]
Fig. 3.5. Representacin de Eadie-Hofstee de los datos de
la Fig. 3.2. En este caso no se pueden trazar barras de
error verticales ya que v0 se encuentra en ambos ejes.

La primera de ellas es tambin conocida como la representacin de Hanes-Woolf y se obtiene multiplicando ambos miembros de la doble recproca (3.24) por [S]:
[]

1
=
+

(3.26)

En un grfico donde el eje de las ordenadas representa [S]/v0 y el de las abscisas representa [S], la ordenada al origen es KM/Vmax, la pendiente es 1/Vmax y el corte en el eje de las abscisas se produce en el
valor KM (Fig. 3.4).
Calculando Vmax a partir de esta pendiente, tambin puede obtenerse KM despejando del valor de la ordenada al origen.
Similarmente, si multiplicamos ambos miembros de la ecuacin de la doble recproca (3.24) por (v0 Vmax)
y rearreglamos se obtiene la representacin de Eadie-Hofstee:
0
0 0
=
+
0

0
+ 0
[]

(3.28)

[]

(3.29)

0 =

(3.27)

En una representacin grfica de 3.29 donde las abscisas representan v0/[S] y las ordenadas v0, se obtiene una recta cuya ordenada al origen es Vmax y su pendiente es KM (Fig. 3.5)
En ambos casos, se evita que o bien [S] o bien v0 estn expresados como inversas, con lo cual se disminuyen las desviaciones de la pendiente que se originaban por el alto valor de la inversa del error en la doble
recproca. En la representacin de Hanes-Woolf (3.26) la magnitud del error en la v0 queda relativizada por
la [S], de modo que las barras de error son menores para valores bajos de v0. (Fig. 3.4). Por lo tanto, si el
diseo del experimento demanda medir v0 bajas, es preferible utilizar esta representacin antes que la doble
recproca. Por su parte, la representacin de Eadie-Hofstee (3.29) permite representar las v0 en forma directa a lo largo de todo el rango desde 0 hasta Vmax (Fig. 3.5). Adems, en esta representacin los datos que
ms se desvan de la lnea de ajuste son fcilmente observables, de modo tal que es preferible utilizar esta
representacin cuando hay dudas acerca de si la cintica de la enzima en estudio sigue o no el modelo de
Michaelis-Menten (ms adelante vamos a ver comportamientos que se desvan de esta cintica).
Finalmente, en 1974 Eisenthal y Cornish-Bowden propusieron la representacin lineal directa, que tiene
la ventaja de que no requiere clculos y por lo tanto puede ser utilizada en el laboratorio mientras el experimento est en curso. Ello permite ajustar concentraciones y tiempos de incubacin en tiempo real para optimizar reactivos y esfuerzo. Esta representacin parte de un rearreglo de la ecuacin de Michaelis-Menten
(3.17), donde ahora la Vmax y el KM son tratados como variables:

64

16

Vmax

14
12

v0

10
8
6
4
2
0

-10

-8

-6

-4

-2

[S]

KM

Fig. 3.6. Representacin lineal directa de los datos de la

Fig. 3.2. Cada recta es un par de datos de [S] y v0, y las
coordenadas del punto donde todas las rectas se cortan
son KM y Vmax.

0 =

0 ( + )
=
(3.30)
+ []
[]
=

0
+ 0
[]

(3.31)

La ecuacin 3.31 define una lnea recta donde la ordenada al origen es v0 y la pendiente es v0/[S], que
cortar al eje de las abscisas en valores de [S] y al eje de las ordenadas en valores de v0:
= 0

0
= 0
[]

0
=
[]
0

(3.33)

(3.34)

= 0 = 0

0
+ 0
[]

= 0

(3.32)

(3.36)

(3.37)

Por ms que parezca raro usar v0 y [S] como constantes, en realidad una vez que uno las mide en un
experimento puede considerar que lo son, ya que las mismas no deberan modificarse para esa medicin en
particular. De este modo, puede trazarse una recta para un par de valores de v0 (en el eje de las ordenadas)
y [S] (en el eje de las abscisas). Dado que para esa enzima y en ese experimento en particular va a haber
un nico par de valores de Vmax y KM que no dependern de las [S], una segunda recta trazada para un segundo par de valores de v0 y [S] se deber intersectar con la primera en un punto cuyas coordenadas en
los ejes v0 y [S] debern ser Vmax y KM (Fig. 3.6). Lo mismo puede decirse de cualquier par de puntos de v0 y
[S], de modo tal que se terminar obteniendo una serie de rectas, todas las cuales se deberan cortar en el
mismo punto de coordenadas (KM; Vmax) y cuya desviacin nos dar una medida del error experimental. Por
lo tanto, lo nico que hay que hacer es medir v0 a diferentes [S] y graficar las rectas resultantes a ver si todas se cortan en un mismo punto. Si es as, de ese punto pueden extraerse directamente los valores de
Vmax y KM (Fig. 3.6).

65

La Forma Reversible de la Ecuacin de Michaelis-Menten

Todo lo que vinimos viendo hasta aqu se basa en la idea de que trabajamos en condiciones iniciales,
esto es, antes de que se haya acumulado una cantidad significativa de producto. Esto sin dudas sirve de
mucho para calcular los parmetros cinticos Vmax, kp, kA y KM mediante ensayos in vitro, pero no refleja la
realidad de la clula. Si consideramos una enzima actuando en el metabolismo celular y no en el tubo de
ensayo, inmediatamente veremos que cataliza su reaccin especfica en presencia tanto del sustrato como del producto. Sin embargo, como veremos ms adelante, la reaccin no llega al equilibrio, sino que se
encuentra en un estado estacionario, tal que an cuando no se den las condiciones iniciales, la velocidad
de reaccin sigue siendo constante. Esto puede entenderse si miramos el siguiente esquema:

A
entrada

B
E1

C
E2

D
E3

salida

que representa parte de una va metablica donde hay una entrada de sustancia A, que se transforma en B,
luego B se transforma en C, que a su vez se transforma en D, y D sale del sistema. Si este sistema est en
estado estacionario, significa que el flujo de materia a lo largo de la serie de reacciones es constante. En
otras palabras, la velocidad con la que entra materia bajo la forma de A es igual a la velocidad con que sale
materia bajo la forma de D. No importa si la molcula A es ms grande o ms chica que la molcula D, o si
es ms compleja o est ms reducida, etc. Lo que importa es si la cantidad de materia por unidad de
tiempo que entra al sistema es igual a la que sale. Para que se cumpla la condicin de estado estacionario
por la cual la cantidad de materia que entra por unidad de tiempo es igual a la que sale, debe cumplirse
3
adems que todas las reacciones dentro del sistema estn ocurriendo a la misma velocidad . O sea,
el flujo de materia dentro del sistema tambin debe ser constante. Por ende, la reaccin catalizada por la
enzima E2 (en el recuadro) debe estar ocurriendo a una velocidad constante e igual a la de las catalizadas
por E1 y E3 para que la condicin de estado estacionario se mantenga. Esto significa que no importa que B
(sustrato) y C (producto) estn presentes; la reaccin va a ocurrir de todos modos con velocidad constante.
Por lo tanto, necesitamos una expresin de la ecuacin de Michaelis-Menten que d cuenta de la presencia
del producto para poder aplicarla al anlisis de vas metablicas.
De acuerdo con el esquema que planteamos al principio, la serie de reacciones a considerar en presencia del producto seran:
k1

E+S

k2

ES

E+P
k -2

k -1

con lo cual ahora no solo debemos considerar como constante cataltica a k2, sino tambin a k1, ya que hay
que tomar en cuenta la reaccin de formacin de S a partir de P. Adems, la velocidad neta (vneta) va a resultar de la diferencia entre la velocidad de formacin de P a partir de S (a la que denominaremos velocidad
directa, o vd) y la de formacin de S a partir de P (a la que denominaremos velocidad reversa, o vr):
=

3.38

Por lo tanto, si hacemos la simplificacin de tomar en cuenta al complejo ES como el nico capaz de
producir P a partir de S o bien S a partir de P, el estado estacionario puede ser expresado como la situacin
en la cual la [ES] no cambia con el tiempo. Es decir que en este estado la diferencia entre las velocidades
de formacin de ES a partir de S o de P y las velocidades de descomposicin del complejo ES para dar S o
P es nula:
[]
= 1

+ 2

1 + 2 = 0

3.39

Agrupando los trminos que contienen [ES] y reordenando, obtenemos la siguiente igualdad para [ES]:

Esto se refiere al ejemplo de una va lineal muy simple. Normalmente, las vas metablicas incluyen ramificaciones y ciclos en las
cuales no se puede decir que todas las reacciones ocurren a la misma velocidad, sino que el balance neto de las velocidades de entrada y salida se compensa exactamente para dar por resultado el estado estacionario.

66

1 [ ] + 2 [ ]
(1 + 2 + 1 + 2 [])

(3.40)

Esta ecuacin es muy similar a 3.14, la que obtuvimos anteriormente en el tratamiento de la aproximacin del estado estacionario para deducir la ecuacin de Michaelis-Menten y de hecho, si se considera [P] =
0 se llega a la misma ecuacin.
Ahora podramos expresar la vneta de produccin de P como la diferencia entre la velocidad a la cual P es
producido en la reaccin ES E + P y la velocidad a la cual P es consumido en la reaccin E + P ES:
= 2 2 [ )

(3.41)

Reemplazando [ES] en 3.41 por lo obtenido en la igualdad 3.40:

= 2

1 [ ] + 2 [ ]
1 [ ] + 2 [ ]
2 + 2

(1 + 2 + 1 + 2 [])
(1 + 2 + 1 + 2 [])

(3.42)

Esta ecuacin da un poquito de miedo, y peor va a ser ahora, que te voy a pedir que saquemos denominador comn y distribuyamos el numerador. Pero enseguida vas a ver que para nuestra tranquilidad, la mayora de los trminos del numerador se van a cancelar mutuamente:
=

1 2 [ ] 1 2 [ ] + 2 2 [ ] 2 2 [ ]
+
(1 + 2 + 1 + 2 [])

1 2 [ ] 1 2 [ ] + 2 2 [ ][]2 2 2 [ ][]2
(1 + 2 + 1 + 2 [])

(3.43)

la cual, luego de simplificar los trminos que se cancelan mutuamente, queda:

=

1 2 [ ] 1 2 [ ]
(1 + 2 + 1 + 2 [])

(3.44)

De nuevo, si comparamos con la ecuacin 3.15 veremos que se trata de la misma ecuacin, con [P] = 0.
Similarmente, si consideramos [S] = 0 obtendremos la ecuacin simtrica para la v0 de produccin de S a
partir de P. Con estas consideraciones, podemos encontrar los parmetros cinticos para S y P que quedan
definidos por la relacin entre las constantes k1, k1, k2 y k2:
, = 2 ; , = 1

(3.45)

, =

1 + 2
1 + 2
; , =
1
2

(3.46)

, =

1 2
1 2
; , =
1 + 2
1 + 2

(3.47)

Con estas definiciones, y recordando que Vmax,d = k2 [ET] por lo que anlogamente Vmax,r = k1 [ET], podemos ahora dividir el numerador y el denominador de la ecuacin de la vneta por (k1 + k2) y expresarla as
en trminos de los parmetros cinticos de la ecuacin de Michaelis-Menten:

1 2 [ ]
[ ]
1 2
1 + 2
1 + 2
=
[]
1 + 2
1
+
+ 2
1 + 2 1 + 2 1 + 2

67

(3.48)

[]
[]
,
,
,
[]
[]
1+
+
, ,

(3.49)

La ecuacin 3.49 se conoce como la ecuacin de Michaelis-Menten reversible y puede verse que, como
siempre, si hacemos [P] = 0 se reduce a la ecuacin directa 3.17. Esta ecuacin puede aplicarse a vas
metablicas y utilizarse para el modelado matemtico del metabolismo, donde los flujos internos van a estar
determinados por las vneta de las enzimas participantes.
Sin embargo, esta deduccin tiene un problema, originado en una simplificacin que se utiliz en el punto de partida. Recordemos que comenzamos diciendo que partiramos de la simplificacin de tomar en
cuenta al complejo ES como el nico capaz de producir P a partir de S, lo cual no es estrictamente as. En
realidad, el esquema de reacciones debera representarse de la manera siguiente:
k1

E+S

k2

ES
k 1

k3

EP
k 2

E+P
k 3

Es decir, en la simplificacin que hicimos no tomamos en cuenta (deliberadamente) que una vez que se
forma el complejo ES ocurre la reaccin dentro del mismo, con lo cual dicho complejo se transforma en un
complejo EP y solo despus el P se disocia de la E. La transformacin del complejo ES en EP tambin tiene
su cintica, y en particular, es ah donde se produce la reaccin. Por lo tanto, puede considerarse que la
etapa cuyas constantes cinticas son k2 y k2 es la etapa limitante de la reaccin, ya que las otras dos etapas son simplemente unin y disociacin. Por supuesto que si quisiramos deducir la ecuacin de la vneta a
partir del sistema de reacciones completo nos las veramos negras, pero al final llegaramos a la misma
ecuacin de Michaelis-Menten reversible, salvo que ahora los parmetros cinticos van a resultar de relaciones de constantes diferentes ya que debemos incluir las constantes cinticas de la transformacin reversible de ES en EP. No vamos a deducir todos estos parmetros pero s es importante considerar los dos KM:
, =

1 2 + 1 3 + 2 3
1 2 + 1 3 + 2 3
; , =
1 (2 + 2 + 3 )
3 (1 + 2 + 2 )

(3.50)

Si, como dijimos, la transformacin reversible de ES en EP es la etapa limitante de la reaccin, significa

que tanto la reaccin ES EP como la reaccin EP ES deben ser ambas limitantes. Esto quiere decir
que la constante k2 para la transformacin ES EP debe ser mucho menor que la suma de las constantes
(k2 + k3), que determinan la reaccin reversa EP ES y la disociacin EP E + P, y simultneamente, la
constante k2 para la reaccin EP ES debe ser mucho menor que la suma de las constantes (k1 + k2),
que determinan la disociacin ES E + S y la reaccin ES EP:
2 2 + 3

(3.51)

2 1 + 2

(3.52)

Por lo tanto, si aproximamos a cero los valores de esas constantes y las reemplazamos en las ecuaciones 3.50:
, =

1 (2 + 3 ) + 03 1
=
= ,
1 (2 + 0 + 3 )
1

(3.53)

, =

01 + 3 (1 + 2 )
3
=
= ,
3 (1 + 0 + 2 )
3

(3.55)

las constantes de Michaelis-Menten KM se reducen a las constantes de disociacin KS. Por lo tanto, la ecuacin 3.49 queda expresada como:

[]
[]
,
,
,
[]
[]
1+
+
, ,

68

(3.56)

donde ahora las constantes de disociacin s representan la verdadera afinidad de la enzima por S o P.

Relacin de Haldane
Al principio del captulo aclaramos que las enzimas son catalizadores, es decir, aceleran la velocidad de
las reacciones pero no modifican sus constantes de equilibrio. Ahora podramos preguntarnos si a partir de
los parmetros cinticos podemos obtener una expresin para la constante de equilibrio. Suponiendo una
reaccin no catalizada:
k1

P
k 1

en el equilibrio la vneta = vd vr es cero, con lo cual:

1 [] = 1 []

(3.57)

donde [S]eq y [P]eq representan las concentraciones de S y P una vez que la reaccin alcanz el equilibrio.
Por lo tanto, la constante de equilibrio (Keq) ser:
=

[]
1
=
1 []

(3.58)

Como dijimos, estas [S]eq y [P]eq sern las mismas si se aade la enzima que cataliza esta reaccin; la nica
diferencia ser que se alcanzarn ms rpido en presencia de la enzima que en su ausencia. Por lo tanto, si
utilizamos [S]eq y [P]eq en la ecuacin 3.49, sta forzosamente tendr que igualarse a 0:
[]
[]
,
,
,
= 0 (3.59)
[] []
1+
+
,
,

Para que esto sea as, es necesario que el numerador de 3.59 valga 0, con lo cual:
,

[]
[]
= ,
,
,

,
[]
,
=
=
,
[]
,

(3.60)

La ecuacin 3.60 se llama relacin de Haldane entre los parmetros cinticos y la constante de equilibrio. Como la [ET] es la misma en ambas Vmax, la relacin de Haldane tambin puede expresarse usando los
otros parmetros cinticos, lo cual es ilustrativo:
,
,
=
,
,

(3.61)

,
=
,

(3.62)

es decir que la constante de equilibrio tambin es la relacin entre las constantes de especificidad para S y
P. La reaccin va a ser termodinmicamente favorable en el sentido S P si la constante de especificidad

69

para S es mayor que para P. No obstante, debe recordarse siempre que estos tratamientos se refieren a
tendencias termodinmicas; la reaccin puede proceder en el sentido P S si se la inicia en presencia de
P y con [S] = 0.
La relacin de Haldane tambin puede reemplazarse en la ecuacin 3.49, lo cual brinda otro resultado interesante. Comencemos por sacar divisor comn en el denominador:

[]
[]
[]
[]
,
,
,
,
,
,
,
=
[]
[]
, , + , [] + , []
1+
+
, ,
, ,

(3.63)

Ahora llevemos KM,S al numerador:

,
,
,
[] , []
+ ,
+
,
,

, ,
, ,
,

(3.64)

Simplificando y reordenando en el denominador:

,
, ,
,
,
,
,
,
=
[]

, 1 +
+ []
, + [] + ,
,
,

, ,

(3.65)

Distribuyamos KM,S en el numerador y simplifiquemos:

, ,
,

,
,

1+
+ []
,

(3.66)

Seguidamente, multipliquemos y dividamos por Vmax,d en el numerador y luego simplifiquemos:

,
,

, ,
, , ,
,
, ,
, ,
=

, 1 +
+ []
, 1 +
+ []
,
,

(3.67)

Si comparamos el segundo miembro del numerador con la relacin de Haldane (3.60) vamos a notar que
,
, ,
1
,
=
=
, , ,

(3.68)

De este modo, si reemplazamos 3.68 en 3.67, la ecuacin que finalmente nos queda es:

,
, 1 +

+ []
,

(3.69)

Esta ecuacin es una forma muy til de escribir la ecuacin de Michaelis-Menten reversible ya que destaca, por un lado, el parecido con la ecuacin de Michaelis-Menten para la v0 (3.17) y por otro lado, evidencia dos cosas fundamentales. En el numerador, evidencia que la vneta depende de cun desplazada del equilibrio est la reaccin. Llamemos a lo que tenemos dentro del parntesis del numerador de 3.69 como grado
de desplazamiento del equilibrio y simbolicmoslo como . Si all reemplazamos Keq por la relacin de concentraciones de S y P en el equilibrio (ecuacin 3.58), obtenemos lo siguiente:

70

(3.70)

Asumiendo que iniciamos la reaccin con S y en ausencia de P, la misma se producir necesariamente

en el sentido S P, independientemente de su valor de Keq. A medida que transcurra la reaccin [S] se
aproximar a [S]eq, y por lo tanto ir disminuyendo desde su valor inicial. Recprocamente, a medida que se
vaya produciendo P, [P] se ir incrementando y se ir aproximando a [P] eq. Es importante notar que ni [S]
podr disminuir ms que el valor de [S]eq ni [P] podr aumentar ms all de [P]eq, ya que estos son los lmites termodinmicos del sistema. Por lo tanto, a medida que [S] disminuya y [P] aumente, tender a cero.
Vale la pena recordar aqu que la condicin termodinmica para que una reaccin se produzca es que su
G sea menor que cero. El valor de G surge de:
G =

[]
[]

(3.71)

Como puede verse, cuanto ms desplazada del equilibrio est una reaccin, ms negativo ser su G y
por lo tanto, ms favorable ser termodinmicamente. Pero esto nada nos dice de su velocidad, ya que,
como venimos insistiendo, la relacin 3.71 se cumple independientemente de la presencia de la enzima, y
adems no incluye explcitamente al tiempo. Sin embargo, si reemplazamos 3.70 en 3.69 veremos que el
grado de desplazamiento del equilibrio tambin determina en forma directa la vneta:
= ,

, 1 +

+ []
,

(3.72)

Por otra parte, si miramos en el denominador de 3.69 y 3.72, notaremos que se parece mucho al denominador de la ecuacin de Michaelis-Menten directa (3.17) excepto que KM,S aparece multiplicado por un
factor mayor que 1. El valor de este factor depende de [P] y de la afinidad de la enzima por P. Dado que P
puede acceder tambin al sitio activo de la enzima, bloquea en parte los sitios accesibles para S. Por lo
tanto, el efecto que se produce por la presencia de P es disminuir el valor de KM ya que ahora se necesita
mayor [S] para alcanzar la misma v0 que si P no estuviera. Sin embargo, la presencia de P no afecta el valor
de Vmax, ya que al ser la unin de P al sitio activo reversible, P puede ser desplazado del sitio activo aumentando suficientemente la [S]. Ya que estrictamente el KM,S no se modifica por la presencia de P, hablamos
de KM,S aparente y lo podemos simbolizar KM(ap),S. Reemplazando, 3.72 queda expresada entonces como
= ,

( ), + []

(3.73)

donde ahora vemos claramente cmo la vneta depende del grado de desplazamiento del equilibrio y de la
afinidad de P por el sitio activo de la enzima.

Preguntas
1) Cules son los aspectos caractersticos de las reacciones enzimticas?
2) Es cierto que todas las enzimas conocidas son de naturaleza proteica?
3) Qu propiedades presentan las enzimas que las diferencian de otros catalizadores?
4) Qu tipo de interacciones se ejercen entre la enzima y el sustrato para formar el complejo ES?
5) A qu es igual la constante de Michaelis, de qu depende?
6) Defina KS y kcat.
7) Cul es la diferencia entre el complejo activado y el complejo enzima-sustrato?
8) Para una reaccin A B defina las condiciones en que KM = KS. Describa condiciones bajo las cuales
esto no es cierto.
9) Cul es la aproximacin del estado estacionario y bajo qu condiciones es vlida?

71

10) Cul es el orden de reaccin, con respecto al sustrato, de una reaccin enzimtica monosustrato?
11) Bajo qu condiciones podemos asegurar que medimos velocidades iniciales?
12) En cunto tiempo se alcanza la Vmax?
13) Cmo vara la velocidad inicial para [S]<<KM y para [S]>>KM? Qu utilidad tiene trabajar en cada una
de estas condiciones?
14) Cul estimara que fuese la concentracin del sustrato fisiolgica de las enzimas?
15) Qu es el nmero de recambio?

Problemas
Problema 1
Para una reaccin catalizada por una enzima michaeliana:
a- Dibuje un grfico de velocidad de reaccin en funcin del tiempo.
b- Haga lo mismo para la velocidad inicial en funcin de la concentracin del sustrato.
c- Idem para velocidad incial vs. concentracin de enzima.
Problema 2
La creatina quinasa cataliza la siguiente reaccin:
creatina + ATP Creatina-P + ADP
a- De acuerdo al valor de Keq, en una mezcla de creatina, ATP, creatina-P y ADP en equilibrio a pH 8,0 un
87% de la creatina se encuentra como creatina-P. Si a esta mezcla se le agrega la creatina quinasa (sin
cambiar las otras condiciones), podra predecir qu porcentaje de creatina-P habr luego de una hora de
reaccin?.
32
32
b- Si luego de alcanzado el equilibrio se agrega creatina-P marcada con P, Se introducir P en el ATP?.
-2
c- El KM de esta enzima por la creatina es 1,6 x 10 M Qu significado fsico tiene este valor? Como
podra aumentar el KM (creatina)?.
Problema 3
En diez mezclas de reaccin conteniendo la misma concentracin de enzima y distintas concentraciones de
sustrato, se determinaron las velocidades iniciales:
-1

Sustrato (M)
1,0.10-3
5,0.10-4
1,0.10-4
5,0.10-5
3,0.10-5
2,0.10-5
1,0.10-5
5,0.10-6
1,0.10-6
5,0.10-7

vo (moles min )
65
63
51
42
33
27
17
9,5
2,2
1,1

Utilizando la ecuacin de Lineweaver-Burk, determine grficamente KM y Vmx. Tenga en cuenta que uno de
los factores crticos en la seguridad de esta determinacin es la escala elegida para ordenada y abscisa.
Qu rango de concentracin de sustrato es ms til para estas determinaciones?
Problema 4
En un experimento similar al anterior, se obtuvieron los datos de la tabla que se muestra en la pgina siguiente.
Grafique vo en funcin de vo/[S]. Determine KM y Vmx. Cul es la ventaja de este tipo de grfica con respecto al grfico de la doble recproca?

72

-1

Sustrato (M)
4,0.10-4
2,0.10-4
1,0.10-4
5,0.10-5
4,0.10-5
2,5.10-5
2,0.10-5

vo (moles min )
130
110
89
62
53
38
32

Problema 5
Se estudi la dependencia de la velocidad de una reaccin enzimtica con la concentracin de sustrato. Se
midieron en un volumen de reaccin de 10 ml, las velocidades iniciales a distintas concentraciones de sustrato y concentracin constante de enzima:
-1

Sustrato (M)
5,0.10-2
5,0.10-3
5,0.10-4
5,0.10-5
5,0.10-6
5,0.10-7

vo (moles min )
0,25
0,25
0,25
0,20
0,071
0,0096

a) Cmo determina los valores de vo?

Utilizando clculos numricos (no grficos) conteste lo siguiente:
b) Cules son los valores de Vmx y KM?.
-6
-1
c) Cules son las velocidades iniciales a [S] = 1,0.10 M y 1,0.10 M?.
-3
d) Calcule la cantidad total de producto producido durante los primeros 5 minutos a [S] 2,0.10 M. Puede
-6
hacer el mismo clculo a [S] 2,0.10 M?.
e) Suponga que la concentracin de enzima en cada mezcla de reaccin se incrementa en un factor de 4.
-6
Cul ser el valor de KM? y de Vmx? Cul ser el valor de v0 a [S] 5,0.10 M?.
Problema 6
Se desea medir parmetros cinticos de la invertasa en un extracto de levadura comercial. Esta enzima
cataliza la siguiente reaccin:
sacarosa + H2O glucosa + fructosa
Para ello se realiza el experimento diagramado a continuacin:
Mezcla de
reaccin 1
2 ml
2 ml
0,4 ml
5,6 ml

Buffer Ac. actico-acetato Na 0,02 M pH 4,77

Sacarosa 0,5 M
Sacarosa 0,05 M
Extracto enzimtico
Agua

Mezcla de
reaccin 2
2 ml
4 ml
0,4 ml
3,6 ml

Mezcla de
reaccin 3
2 ml
2 ml
0,4 ml
5,6 ml

Las tres mezclas de reaccin se incubaron a 20 C tomndose muestras de 1 ml a tiempos 2', 5' 7' y 10' de
incubacin. Sobre las muestras se midi la actividad de la enzima. Los resultados se expresan como moles de sacarosa transformada en 10 ml de mezcla de reaccin:

Tiempo
2'
5'
7'
10'

M.R. 1

moles sacarosa transformada/10 ml mezcla reaccin

M.R. 2
M.R. 3
1,6
2,0
3,9
3,7
4,5
9,0
5,5
6,3
12,6
5,5
9,0
18,2

73

a- Calcule, con estos datos, Vmx y KM a partir de un grfico 1/vo en funcin de 1/[S].
b- Calcule las unidades de invertasa contenidas en los 0,4 ml de extracto enzimtico, de acuerdo a una
unidad de actividad enzimtica que Ud. debe definir previamente.
c- Puede calcular la actividad especfica de la invertasa en el extracto enzimtico? Explique.

Problema 7
Los siguientes datos se registraron para la reaccin S P catalizada enzimticamente:
-1

[S] (M)
6,25 x 10-6
7,50 x 10-5
1,00 x 10-4
1,00 x 10-3
1,00 x 10-2

-1

vo (nmoles l min )
15,00
56,25
60,00
74,90
75,00

a- Determinar Vmx y KM
-5
b-Cul sera vo si [S] = 2,5.10 M
-5
Cul sera vo si [S] = 5,0,10 M
-5
Cul sera vo si [S] = 2,5.10 M y la concentracin de enzima es el doble de la original.
-2
c-Cul es la concentracin de enzima libre cuando [S] es 1,00.10 M ?.
-6
d- Cul es la concentracin de enzima libre cuando [S] es 6,25.10 M ?.
e- La vo dada en la tabla anterior se determin midiendo la concentracin de producto acumulado en un
perodo de 10 min. Es vlida la suposicin de que estos valores de v o representan las velocidades iniciales
en todo el rango de [S]?.
f- Defina una unidad enzimtica para este sistema y calcule la actividad en la mezcla de incubacin.

Bibliografa
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell.
Dixon, M., Webb, E.C. (1980) Enzymes New York: Academic Press.
Fell D. (1996) Understanding the Control of Metabolism. Londres: Portland Press.
Segel, I. H. (1975). Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons.
Segel I.W. (1982) Clculos de Bioqumica, 2da. edicin. Zaragoza: Editorial Acribia.
Voet D., Voet J (2006) Bioqumica, 3ra. edicin. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana.

74

CAPTULO 4
Inhibicin y Activacin Reversibles
Anbal R. Lodeiro

...Y debers crear

si quieres ver tu tierra en paz
LUIS ALBERTO SPINETTA, QUEDNDOTE O YNDOTE

La enorme mayora de las enzimas son protenas, si bien se conocen algunos (e importantes) ejemplos
de ARN catalticos. Como sabemos, las protenas son muy complejas y sus estructuras tridimensionales
presentan una enorme diversidad tanto en sus formas, como en sus tamaos, sus grados de agregacin y
su asociacin con cofactores o grupos prostticos. Adems, estas estructuras no son rgidas, sino que en
solucin tienen cierta flexibilidad gracias a la cual pueden modificar su conformacin sin desnaturalizarse.
Dado que el sitio activo es parte integral de esta estructura compleja y flexible, l tambin puede modificar
su conformacin, lo cual puede traducirse en la aceptacin de otras molculas (que pueden ser ms o menos parecidas al sustrato) por dicho sitio activo.
Uno de los bilogos evolutivos ms importantes del siglo pasado fue Theodosius Dobzhansky, quien
acu una famosa frase: nada en la Biologa tiene sentido excepto a la luz de la Evolucin. Esta frase
tiene un profundo sentido no slo cientfico sino tambin poltico. Aunque a muchos les pueda parecer raro,
en EEUU existen crculos acadmicos muy atrasados que an al da de hoy siguen sin aceptar la Teora de
la Evolucin y en su lugar reivindican el creacionismo, que es ms o menos una interpretacin literal de la
Biblia segn la cual Dios cre a todos los seres vivos tal como los conocemos, si bien algunas especies se
fueron extinguiendo a lo largo de los milenios. Estos grupos no son para nada marginales, sino que permanecen activos en varias universidades, sobre todo del sur del pas, donde incluso han llegado a lograr que
se prohba hablar de evolucin. Es por eso que la frase de Dobzhansky apunt sobre todo al corazn del
creacionismo dicindoles, diplomticamente, que sus creencias no pertenecen al mbito de la Biologa.
Nosotros podemos retomar la frase de Dobzhansky en su sentido cientfico para hacernos algunas preguntas. Claramente, el resultado de la evolucin por seleccin natural es la adaptacin. Algunos dicen que
no es muy de cientficos andar por la vida diciendo que lo que existe es as porque se adapt, ya que es
obvio que lo que no existe no est porque no se adapt. Es decir, no podemos proponer un experimento
que sea capaz de contradecir que lo que existe es as porque se adapt, pero de todos modos esa idea nos
puede iluminar la interpretacin y el anlisis de todos los fenmenos biolgicos mucho mejor que la igualmente anticientfica idea de que lo que existe es as porque as lo dispuso Dios. Por lo tanto, podramos
hacernos la siguiente pregunta: cul es el valor adaptativo de un sitio activo flexible en vez de uno rgido?
Uno podra pensar que sera mejor (ms adaptativo) que los sitios activos sean rgidos o al menos ms
4
rgidos que el resto de la estructura de las protenas, porque eso les permitira una mayor robustez en la
catlisis. Sin embargo, la observacin indica que los sitios activos son flexibles. Por qu? cul es la ventaja adaptativa de que sean flexibles? Para responder a esta pregunta, retornemos al ejemplo de tener que
salir corriendo porque se larga la tormenta. Salimos corriendo, lo cual es posible gracias a que se acelera en
nuestros msculos la velocidad de oxidacin de la glucosa a CO2, lo que requiere que cierto grupo de enzimas que estaba catalizando reacciones a una dada vneta cuando estbamos sentados se acelere y ahora
catalice esas mismas reacciones a una vneta mucho mayor. Al cabo de correr algunos metros, o cuadras,
encontramos refugio bajo techo y nos sentamos a descansar. Qu pasa entonces con esas enzimas? Siguen catalizando la oxidacin de la glucosa a CO 2 a la misma vneta que cuando corramos? Si lo hicieran,
seguiramos transpirando, generaramos calor y eventualmente, nuestros msculos empezaran a temblar.
Quiere decir que es una buena adaptacin que nuestras enzimas puedan modificar repentinamente su
velocidad de catlisis. Sin que nos demos cuenta, la velocidad de catlisis tambin se va controlando sutil-

El concepto de robustez tambin es importante en Biologa. Se refiere a la capacidad de un sistema biolgico de ejecutar una actividad en forma consistente frente a perturbaciones en el entorno.

75

mente en todas nuestras vas metablicas de acuerdo a las necesidades existentes en tiempo real. Por
ejemplo, no hacemos lo mismo con la glucosa y los aminocidos antes o despus de comer, despiertos o
dormidos, alertas o relajados. Adems, las situaciones que atravesamos no son tan binarias: por ejemplo,
podemos estar alertas antes o despus de comer. De modo tal que es necesario modular la actividad de
las enzimas. La flexibilidad del sitio activo sin dudas juega un papel en este control de la actividad enzimtica, pero algo tiene que aprovechar y conducir esa flexibilidad para dar por resultado distintos niveles de
actividad acordes a las necesidades del momento. Ese algo son pequeas molculas, que pueden o no
estar estructuralmente relacionadas con los sustratos, y que en general se conocen como efectores.
Adems de estos efectores producidos por nosotros mismos, hay otro conjunto de sustancias que no son
producidas por nuestro cuerpo y por lo tanto no participan del control de la actividad de nuestras enzimas,
pero que si son administradas desde afuera pueden tambin perturbar la actividad enzimtica, en muchos
casos inhibindola. En general, las sustancias que tienen esta caracterstica son txicas y pueden producir
perturbaciones graves e incluso la muerte, como es el caso del cianuro, que inhibe uno de los ltimos pasos
de la oxidacin completa de la glucosa. Otras sustancias no actan en contra nuestra pero s en contra de
bacterias patgenas, como por ejemplo los antibiticos, que inhiben enzimas claves para la biosntesis de la
pared celular en las bacterias, o para sus procesos de transcripcin y traduccin. Asimismo, muchos medicamentos son efectores ms o menos artificiales de la actividad de determinadas enzimas, tanto humanas
como de patgenos.
Por lo tanto, los efectores, ya sean endgenos o exgenos, pueden inhibir o activar enzimas modificando
su actividad cataltica, y por lo tanto los distinguimos entre inhibidores o activadores respectivamente, sin
importar si son producidos en forma endgena o no. Comenzaremos estudiando los inhibidores.

Inhibidores
En trminos generales, un inhibidor ser una sustancia capaz de disminuir la vneta. Sin embargo, existen
muchas variantes. Para empezar, un inhibidor puede ser reversible o irreversible, dependiendo de cmo se
una a la enzima. Dentro de los inhibidores reversibles, a su vez, hay distintos tipos de acuerdo a qu lugar
de la estructura de la enzima constituya su sitio de unin. Si se unen al sitio activo, competirn por l con el
sustrato y por lo tanto, sern inhibidores competitivos. Hay otros que adems se pueden unir al sitio activo
cuando ste ya uni al sustrato, produciendo distintos efectos sobre los parmetros cinticos, segn los
cuales se los conoce como inhibidores acompetitivos, de tipo mixto y no-competitivos. Finalmente, los inhibidores tambin pueden distinguirse por el grado en el que bloquean la actividad enzimtica. Algunos,
cuando se unen a la enzima, forman un complejo que es incapaz de producir P y por lo tanto, se los conoce
como inhibidores lineales. Otros forman complejos que poseen una actividad reducida pero no nula de produccin de P y por ello se los llama inhibidores parciales o hiperblicos. Estas clases estn superpuestas a
las que mencionamos anteriormente (p. ej. un inhibidor puede ser reversible, competitivo y lineal) con lo cual
la variedad de efectos es muy grande. A continuacin analizaremos los inhibidores lineales reversibles y
luego haremos mencin de los irreversibles. Los conceptos que vamos a exponer a continuacin pueden
asimismo aplicarse a los inhibidores hiperblicos.

Inhibidores Competitivos
Estos inhibidores son molculas que se unen de tal manera a la enzima que bloquean el acceso del sustrato al sitio activo. Muchos de ellos tienen una estructura similar a la del sustrato y por lo tanto son reconocidos y unidos por la enzima con una afinidad similar, pero otros pueden unirse en la vecindad del sitio activo y taponarlo de tal manera que se impida la unin del sustrato. Como la unin de este tipo de inhibidores
es reversible y alternativa a la unin del sustrato, una alta [S] puede desplazar el equilibrio hacia la formacin de complejo ES y por lo tanto la Vmax no vara en presencia o ausencia del inhibidor. Simbolizando al
inhibidor como I, el esquema de la reaccin para la condicin inicial en presencia de I es el siguiente:
k1

E+S
k 1
+
I
k ic

kp

ES

k ic

EI

76

E+P

Aqu, kic y kic simbolizan las constantes cinticas de asociacin y disociacin, respectivamente, del inhibidor competitivo a la enzima para formar el complejo enzima-inhibidor, que como puede verse, es inactivo, es decir, no puede reaccionar para producir P.
Por lo tanto, ahora vamos a tener tres combinaciones diferentes para la enzima: la enzima libre (E), el
complejo enzima-sustrato (ES) y el complejo enzima-inhibidor (EI), que se agrega a los considerados anteriormente para sumarse a la cantidad total de enzima. Dado que EI es inactivo catalticamente, lo nico que
puede hacer es disociarse nuevamente a E + I. Por lo tanto, en este caso indudablemente se establecer un
equilibrio entre E, I y EI y se podr definir la constante del inhibidor competitivo KIc como la inversa de la Keq:
1
[] []
= =
=

[]

4.1

Asimismo, la v0 dividida la [ET] (cf. ecuacin 3.4) puede ahora expresarse como:
[]
0
=
[ ]
+ + []

4.2

la cual, reemplazando [ES] y [EI], nos queda:

0
=
[ ]

[]

[]
[]
+
+
[]

4.3

Ahora podemos hacer lo mismo que antes (cf. ecuaciones 3.8-3.9) simplificando [E] y multiplicando numerador y denominador por KM:
0
=
[ ]
0
=
[ ]

[] []
1+
+

4.4

[] + 1 +

[]

4.5

Finalmente, pasando [ET] al otro miembro y reemplazando kp [ET] por Vmax, queda:
0 =

[] + 1 +

[]

4.6

Analicemos ahora un poco la ecuacin 4.6: es prcticamente igual que la ecuacin de Michaelis-Menten
(3.17) salvo que KM est multiplicado por un factor mayor que 1, que depende de la [I] y de la constante del
inhibidor competitivo, KIc, la cual representa la afinidad del inhibidor por la enzima libre. Esto ya lo vimos, en
la ecuacin de Michaelis-Menten reversible (3.69), donde KM estaba multiplicado por el mismo factor, con [P]
y KM,P en vez de [I] y KIc. O sea que la competicin por el sitio activo, ya sea ejercida por P o por I sobre S,
nos lleva a la misma expresin para la disminucin de la afinidad, con lo cual aqu tambin podemos hablar
de un KM aparente (KM(ap)) y reescribir 4.6 as:
0 =

[] + ( )

4.7

Esto, por un lado, resalta el parecido con la ecuacin de Michaelis-Menten (3.17) y por otro lado, nos seala claramente que la Vmax no cambia en presencia del inhibidor. Es lgico que esto sea as? Si miramos
de vuelta el esquema de reacciones, vamos a ver que la enzima libre E tiene dos caminos alternativos: o
bien se une a S o bien se une a I. En ambos casos, la formacin de los complejos ES o EI son reacciones
reversibles, de modo que si aumentamos [S] que a una [I] fija, podremos desplazar el equilibrio hacia la
formacin de ES. Si llevamos [S] a una concentracin infinitamente alta, en teora podramos desplazar el

77

equilibrio totalmente (asintticamente) hacia la formacin de ES, con lo cual, siempre en teora, podramos
llegar a la situacin en la que toda la enzima est como complejo ES, en cuyo caso alcanzaramos la Vmax.
Es por eso tambin que este tipo de inhibicin se conoce como inhibicin competitiva.
En la Fig. 4.1a se muestran las curvas de v0 vs [S] en presencia o ausencia de un inhibidor competitivo,
donde puede apreciarse cmo el KM(ap) es mayor que el KM mientras que la Vmax tiende a la misma asntota.
Debe recalcarse, sin embargo, que cuando hablamos de KM(ap) no estamos diciendo que el KM cambi. El KM
no cambia porque la unin de S al sitio activo sigue siendo igual; lo que ocurre es que algunos sitios activos
estn bloqueados reversiblemente, es decir, es como si hubiera menos sitios activos, con lo cual la [S]
necesaria para alcanzar una dada fraccin de la Vmax es mayor que si no hubiera inhibidor.
Teniendo en cuenta estas consideraciones, podemos ver que si nos manejamos con el KM(ap) es fcil calcular el valor de KIc, ya que
[]

( ) = 1 +

(4.8)

Recordemos que al hablar de v0 en general nos estamos refiriendo a condiciones iniciales que ocurren
in vitro, es decir, en un tubo de ensayo. Bajo esas condiciones, tanto [S] como [I] son conocidas, ya que
nosotros decidimos qu concentraciones utilizar en el ensayo. Por lo tanto, usando cualquiera de los mtodos de linealizacin podemos encontrar el valor de KM(ap) y a partir de l, y conociendo [I], despejar KIc. As,
1/KM(ap) ser el punto donde la recta de la doble recproca corta al eje de las abscisas, KM(ap) ser el punto
donde la recta de la representacin de Hanes-Wolfe corta al eje de las abscisas, KM(ap) ser la pendiente
de la recta en la representacin de Eadie-Hofstee, y KM(ap) podr encontrarse como la coordenada sobre el
eje de las abscisas del punto de interseccin de todas las rectas de la representacin lineal directa (Fig. 3.33.6). A ttulo de ejemplo, se muestra en la Fig. 4.1b el grfico de la doble recproca con y sin inhibidor.

Inhibidores Acompetitivos
Este tipo de inhibidores podran considerarse como el otro extremo de los inhibidores competitivos. Aqu,
en vez de unirse a la enzima libre, el inhibidor se une reversiblemente al complejo ES, dando como resultado nuevamente un complejo ESI inactivo. Es decir, existe un orden secuencial en la unin de cada ligando:
primero debe unirse el sustrato para que luego pueda unirse el inhibidor, ya que ste es incapaz de unirse a
la enzima libre. En otras palabras, solo el complejo ES posee el sitio adecuado para la unin del inhibidor. El
esquema de reacciones ser, esta vez:
k1

kp

E+S

E+P

ES
+
I

k 1

k ia

k ia

ESI

16

b
0,4

12

0,3

10

1/v0

v0 (moles min1 )

14

0,2

6
4

0,1

2
0

10

-1

[S] (mM)

1/[S]

Fig. 4.1. Representacin grfica de v0 vs [S] (a) y doble recproca (b) de la enzima de la Fig. 3.1 en presencia de un
inhibidor competitivo a las siguientes concentraciones: 0 mM (rojo), 0,5 mM (verde), 1,5 mM (azul) o 3,0 mM (violeta). KIc: 1,0 mM. Las lneas punteadas muestran la extrapolacin a los valores de KM(ap) (a) o 1/Vmax(ap) y 1/KM(ap) (b).

78

Como antes, podemos considerar que la unin del inhibidor al complejo ES para dar el complejo inactivo
ESI constituye un equilibrio, ya que dicho complejo no produce P. As, la inversa de la constante de equilibrio representa la correspondiente constante del inhibidor acompetitivo, KIa:
1
[] []
= =
=

[]

4.9

Por lo tanto, si reemplazamos [ES] por [E][S]/KM:

[] =

[] =
[]

4.10

Ahora podemos escribir la ecuacin de la v0 considerando que la [ET] se compone de la suma de las
concentraciones [E], [ES] y [ESI], y simplificando [E] como antes:
0
=
[ ]

[] []
1+
+

4.11

Multiplicando numerador y denominador por KM y simplificando:

0
=
[ ]

+ [] 1 +

4.12

Finalmente, si reemplazamos kp [ET] por Vmax, y dividimos numerador y denominador por (1 + [I]/KIa) de
modo de dejar [S] sin afectar por ningn coeficiente,

1+

0 =

+ []

1+

4.13

Es decir que ahora el factor (1 + [I]/KIa) afecta tanto a Vmax como a KM, y por lo tanto, podramos considerar que hay una Vmax aparente (Vmax(ap)) y una KM aparente (KM(ap)):
0 = max ( )

( ) + []

4.14

Otra vez, la ecuacin se parece a la de Michaelis-Menten sin inhibidor, pero ahora hay que observar que
la KM(ap) no est aumentada respecto a la KM sin inhibidor, sino que est disminuida. Esto significara que la
presencia del inhibidor aument la afinidad de la enzima por S. Esto obviamente no es as; en primer lugar,
lo que ocurre es que la unin de S a la enzima sigue siendo la misma, razn por la cual la KM no vara, pero
en segundo lugar, la unin del inhibidor a ES secuestra complejo ES previamente formado, disminuyendo
as la [ES] efectiva, lo que da origen a una menor Vmax pero tambin a una menor [S] necesaria para alcanzar una dada fraccin de la Vmax. Como I se une al ES preformado, por ms que aumentemos [S] nunca
vamos a alcanzar la Vmax. Es por estas razones que se ha propuesto cambiar el rtulo de acompetitivo
que en realidad, es bastante raro y no dice mucho acerca del mecanismo de inhibicin y denominar a
este tipo de inhibidores como inhibidores catalticos, para hacer notar que se unen al complejo cataltico ES.
De la misma manera que explicamos para los inhibidores competitivos, conociendo la [I] podemos calcular la KIa usando cualquiera de los mtodos de linealizacin a partir de las extrapolaciones a los valores de
KM(ap) y Vmax(ap). Como ejemplos, en la Fig. 4.2 se presentan las grficas de v0 vs [S] y la doble recproca
para este tipo de inhibidores.

79

16

b
0,4

12
0,3

10

1/v0

v0 (moles min1 )

14

0,2

6
4

0,1

2
0

10

-4

-3

-2

[S] (mM)

-1

1/[S]

Fig. 4.2. Representacin grfica de v0 vs [S] (a) y doble recproca (b) de la enzima de la Fig. 3.1 en presencia de un
inhibidor acompetitivo a las siguientes concentraciones: 0 mM (rojo), 0,5 mM (verde), 1,5 mM (azul) o 3,0 mM (violeta). KIc: 1,0 mM. Las lneas punteadas muestran la extrapolacin a los valores de KM(ap) (a) o 1/Vmax(ap) y 1/KM(ap) (b).

Inhibidores de Tipo Mixto

Los inhibidores de tipo mixto reciben este nombre porque combinan las propiedades de los inhibidores
competitivos y los acompetitivos, ya que pueden unirse tanto a la enzima libre como al complejo ES. De este
modo, producen dos complejos inactivos en vez de uno: EI y ESI. Dado que se unen a dos formas diferentes de la enzima, es esperable que los equilibrios entre E, I y EI por un lado, y ES, I y ESI por el otro, no
tengan necesariamente la misma constante de equilibrio, ya que las especies intervinientes (salvo I) son
diferentes. As, podramos escribir el siguiente esquema de reacciones:
k1

kp

E+S
k 1
+
I
k ic

k ia

k ic

E+P

ES
+
I
k ia

ESI
EI
Sin embargo, ya que la unin del inhibidor no sigue un orden obligatorio puesto que puede unirse tanto a
E como a ES, lo mismo debera ocurrir con S: no hay razn para suponer que solo podr unirse a E y no a
EI. Por lo tanto, el esquema debera ser as:
k1

kp

E+S
k 1
+
I
k ic

k ia

k ic

E+P

ES
+
I
k ia

kx

EI + S

ESI
k x

Qu valores deberan tener entonces las constantes cinticas marcadas como kx y kx? Una clave es
que si entendemos toda la reaccin de unin del inhibidor a la enzima como un solo equilibrio, el mismo
ocurrira entre las formas libres E, S e I y el complejo ESI, yendo por dos caminos: EI y ES. Esquemticamente, lo podramos representar as:
kd

E+S+ I

ESI
kr

Es decir que la constante cintica de la reaccin de formacin del complejo ESI (kd) debera cualquiera
de las dos siguientes:

80

 = 1

4.15

4.16

segn se tome el camino que pasa por ES (ecuacin 4.15) o el que pasa por EI (ecuacin 4.16).
Anlogamente, para la reaccin reversa:
= 1

4.17

4.18

Por lo tanto, si proponemos un coeficiente tal que KIa = KIc, las ecuaciones para el equilibrio entre E, S
e I y ESI podran expresarse como sigue:
=

4.19

4.20

Es decir, el coeficiente debe afectar ambos caminos por igual, ya que el equilibrio entre E, S, I y ESI
es el mismo, independientemente de por dnde se alcance. Recordando que la constante de afinidad de S
es KS = k1/k1 = [E][S]/[ES], y as sucesivamente para las otras, de las ecuaciones 4.19-4.20 se deduce que:
=

[]
[]

4.21

[]
[]

4.22

[]
[]

4.23

[]
[]

4.24

Por lo tanto, si elegimos 4.24 y reemplazamos [ES] por 4.21,

[] =

[]

4.25

Luego, si hacemos los mismos reemplazos que siempre para obtener la ecuacin de la v0:
0
=
[ ]

[] []
[]
1+
+
+

4.26

Utilizando la aproximacin del estado estacionario, obtenemos la misma ecuacin, con KM en vez de KS,
si bien el camino es ms largo porque nos encontramos con trminos cuadrticos que tenemos que eliminar
0
=
[ ]

[] []
[]
1+
+
+

4.27

Si multiplicamos numerador y denominador por KM nos queda:

0
=
[ ]

+ +

[] []
+

81

4.28

16

b
0,4

12

0,3

10

1/v0

v0 (moles min1 )

14

0,2

6
4

0,1

2
0

10

-1,5

-0,5

0,5

[S] (mM)

1,5

2,5

3,5

1/[S]

Fig. 4.1. Representacin grfica de v0 vs [S] (a) y doble recproca (b) de la enzima de la Fig. 3.1 en presencia de un
inhibidor de tipo mixto a las siguientes concentraciones: 0 mM (rojo), 0,5 mM (verde), 1,5 mM (azul) o 3,0 mM (violeta). KIc: 1,5 mM; KIa: 1,0 mM. Las lneas punteadas muestran la extrapolacin a los valores de KM(ap) (a) o 1/Vmax(ap)
y 1/KM(ap) (b).

Ahora podemos pasar [ET] al otro miembro, reemplazar [ET] kp por Vmax y reordenar el denominador:
0 =

[]

1+
+ 1+

4.29

Para que nos quede [S] sin multiplicar por ningn factor, podemos dividir el numerador y el denominador
por (1 + [I]/KIc) de manera anloga a como lo hicimos para obtener 4.13:

0 =

1+

[]
1+

1+

4.30

o lo que es lo mismo,

0 =

1+

[]
1+

1+

4.31

Es decir que ahora Vmax(ap) y KM(ap) van a ser, respectivamente,

max ( ) =
(4.32)

1+

( ) =

[]

1+

1+

(4.33)

En este caso, vemos que la Vmax(ap) ha disminuido respecto de Vmax sin inhibidor, pero la KM(ap) se ha modificado respecto de la KM sin inhibidor en una forma que depende de dos constantes de equilibrio: KIc y KIa.
De esta manera, no podemos predecir en qu sentido se va a modificar KM(ap): si KIc > Kia o bien < 1 (es

82

decir, la afinidad del inhibidor es mayor por el complejo ES que por la enzima libre) KM(ap) ser menor que KM
sin inhibidor. Por el contrario, si KIc < Kia o bien > 1 (el inhibidor tiene ms afinidad por la enzima libre que
por el complejo ES), entonces KM(ap) ser mayor que KM sin inhibidor. En la seccin siguiente trataremos el
caso donde = 1. Como antes, podemos expresar 4.35 as:
0 = max ( )

[]
( ) +

4.34

y encontrar los valores de KIc, KIa y despejando de los Vmax(ap) y KM(ap) encontrados en las grficas de linealizacin (Fig. 4.3).

Inhibidores No-Competitivos
Este es el caso donde = 1, es decir que el inhibidor tiene la misma afinidad por la enzima libre que por
el complejo ES. Por lo tanto, para el inhibidor no-competitivo, KIc = KIa, y las ecuaciones 4.33 y 4.36 quedan
expresadas de la siguiente manera:
0 =

1+

0 = max ( )

4.35

[]
+

4.36

En este caso solo se modifica la Vmax(ap) respecto de la Vmax sin inhibidor, pero no hay efectos sobre el
KM. Por esta razn, en un principio este esquema fue tomado como el opuesto a la inhibicin competitiva, y
de ah su nombre. Sin embargo, son muy raros los ejemplos de inhibicin no-competitiva en la naturaleza.

Comparacin de los Distintos Tipos de Inhibidores Reversibles

Para visualizar los efectos de los distintos tipos de inhibidor es til no solo mirar las Vmax(ap) y KM(ap) sino
tambin el cociente Vmax(ap)/KM(ap), ya que el mismo refleja la variacin de la constante de especificidad, kA
(ecuacin 3.21). En la Tabla 4.1 se dan las equivalencias de para los distintos tipos de inhibidores.
Puede observarse all fcilmente que los dos casos extremos son la inhibicin competitiva y la acompetitiva, mientras que la inhibicin no-competitiva es un caso especial de la inhibicin de tipo mixto, con KIc = KIa
(o bien = 1). Adems, puede verse que siempre que hay un efecto sobre Vmax o sobre el cociente Vmax/KM
se trata de una reduccin de su valor. Cuando Vmax(ap) < Vmax el valor de esta ltima siempre est dividido
por (1 + [I]/KIa) y nunca interviene KIc. Por el contrario, cuando el cociente Vmax(ap)/KM(ap) < Vmax/KM, el divisor
es siempre (1 + [I]/KIc) y en ningn caso interviene KIa.
Tabla 4.1: Comparacin de los distintos tipos de inhibidores
Tipo de inhibidor

Vmax(ap)

Vmax(ap)/KM(ap)

KM(ap)

Competitivo

max

max /
1 + /

(1 + / )

Tipo Mixto

max
1 + /

max /
1 + /

(1 + / )
1 + /

max
1 + /

max /
1 + /

max
1 + /

max /

1 + /

No-Competitivo

Acompetitivo
1

En la inhibicin no-competitiva KIa = KIc; la expresin de la tabla permite apreciar la regularidad de las ecuaciones.

83

En otras palabras, siempre que la Vmax es reducida, el factor que la afecta contiene la constante de afinidad
entre el complejo ES y el inhibidor, mientras que el cociente Vmax/KM, que indirectamente involucra a la constante especfica kA, siempre que es reducido, lo es por un factor que contiene la constante de afinidad entre
la enzima libre y el inhibidor. Por ltimo, no se puede apreciar una tendencia clara con el KM, pero s se
puede deducir cmo se afecta a partir de la comparacin de Vmax(ap) y Vmax(ap)/KM(ap).

Inhibidores Irreversibles
Un inhibidor irreversible lleva a la enzima a un estado permanentemente inactivo. As, el mecanismo de
este tipo de inhibicin es muy similar al de la inhibicin competitiva, salvo que la etapa de unin del inhibidor
a la enzima es irreversible:
k1

E+S
k 1
+
I

kp

ES

E+P

ki

EI

donde ki es la constante cintica de unin del inhibidor irreversible. A diferencia de la inhibicin competitiva,
el efecto neto de este tipo de inhibicin es disminuir la cantidad de enzima total. Por lo tanto, la Vmax se ver
realmente disminuida, pero el KM no se ver afectado.

Activadores
La activacin de enzimas es un proceso esencial en la regulacin del metabolismo celular, y ocurre por
una diversidad de mecanismos, parte de los cuales sern tratados a continuacin y otra parte, en el Cap. 7.
De todos modos, haremos aqu un resumen de los aspectos esenciales de la activacin de enzimas.
Obviamente no todas las enzimas estn activas al mismo tiempo, porque de lo contrario se generara un
caos en la clula. Adems, de las enzimas que estn activas no todas lo estn al 100% de su actividad, ni
todas estn presentes a la misma concentracin, ni todas estn presentes en todos los compartimentos
celulares, ni todas estn presentes en todos los tejidos. Esto que parece una obviedad no lo es tanto si pensamos que todas las clulas de todos nuestros tejidos tienen exactamente el mismo genoma, es decir que
todas nuestras clulas codifican todas (y las mismas) enzimas. Cmo hace entonces una clula en particular para elegir qu enzimas van a estar presentes, de ellas cules van a estar activas, de ellas dnde van a
estar activas, y de ellas qu nivel de actividad van a tener? La respuesta se cae de maduro: hay una yuxtaposicin de mecanismos de activacin que van desde la expresin del gen que codifica la enzima hasta el
nivel de actividad que la misma va a presentar en determinado momento y lugar.
El control gentico del nivel de enzima se realiza a dos niveles: la transcripcin/degradacin del ARN
mensajero y la traduccin del ARN mensajero a polipptido y su degradacin por proteasas especficas.
Estos procesos no solo deciden qu enzimas se producen y cules no, sino que tambin controlan la cantidad de enzima presente. En un segundo nivel est la ubicacin subcelular de la enzima. A menudo las enzimas (y las protenas en general) se sintetizan como precursores inactivos que poseen secuencias de aminocidos especficas que las dirigen a cierto compartimento subcelular, por ejemplo el retculo endoplasmtico. Una vez ubicadas all, las mencionadas secuencias de aminocidos se remueven por la accin de endopeptidasas especficas y los precursores se activan. En un tercer nivel est el requerimiento de cofactores: molculas de naturaleza no proteica que son necesarias para la actividad de ciertas enzimas y deben
acoplarse a la estructura polipeptdica para activarla. Estos cofactores o grupos prostticos van desde simples iones metlicos hasta molculas orgnicas de diversa complejidad como ser vitaminas, grupos hemo,
etc. Aun en otro nivel, existen mecanismos de activacin/inactivacin reversibles. En general, podemos
mencionar a tres: la modificacin covalente, el alosterismo y la accin de activadores. Los dos primeros
sern analizados en el Cap. 7 y aqu nos ocuparemos de los activadores.
Estas sustancias, al igual que los inhibidores, son efectores, es decir, pequeas molculas que deben
unirse a la enzima para que sta tenga actividad cataltica. De acuerdo con sus mecanismos de accin los
podemos clasificar en activadores esenciales y mixtos.

84

Activadores Esenciales
Estos activadores deben unirse primero a la enzima libre para formar un complejo enzima-activador, el
cual es el nico capaz de unir sustrato para formar el complejo enzima-activador-sustrato catalticamente
activo. Simbolizando al activador como A, el mecanismo de reaccin sera el siguiente:
k1

EA + S

kp

E+P+ A

EAS
k 1

k a

ka

E+A

Como puede verse, el mecanismo es bastante parecido al de la inhibicin competitiva, con lo cual la
ecuacin de la v0 que se deduce del mismo tambin es muy parecida, salvo que KM se afecta por un factor
igual a (1 + KAe/[A]), donde KAe representa la constante de afinidad del activador esencial por la enzima libre:
0 =

[] + 1 +

[]

4.37

Fijate que en este caso el modificador del KM es un cociente inverso al que afectaba al KM con inhibidor
competitivo: en vez de ser [I]/Kic ahora es KAe/[A]. Es decir que, al contrario de lo que ocurra con el inhibidor
competitivo, la ausencia de activador da por resultado un KM(ap) infinitamente grande, con lo cual en esta
situacin la v0 se reduce a 0. Esta similitud ha llevado a algunos, obsesionados con el lgebra, a llamar a
este tipo de activadores activadores competitivos, lo cual es evidentemente una ridiculez, ya que de ninguna manera el activador compite con el sustrato.

Activadores de Tipo Mixto

En este caso, la unin del activador a la enzima puede ocurrir tanto a la enzima libre como al complejo
ES, tal como vimos para los inhibidores de tipo mixto:
KS

EA + S

kp

E+P+ A

EAS
KAe

KAe

E+S
+
A

ES
KS

Como antes, el coeficiente afecta las constantes de afinidad KS y KAe cuando S se une al complejo EA
o cuando A se une al complejo ES, respectivamente. El esquema de reaccin se parece al del inhibidor de
tipo mixto, y por lo tanto, el lgebra para obtener la expresin de v0 nos lleva a algo muy parecido (con KM
en lugar de KS):
0 =

1 +

+
[]

1+

(4.38)

Los clculos de KAe y pueden hacerse de la misma forma que antes, a partir de las extrapolaciones a
los valores de Vmax(ap) y KM(ap) que se obtienen de cualquier mtodo de linealizacin.

Activacin e Inhibicin Parcial

Como dijimos al principio, el efecto de los inhibidores no tiene por qu ser la anulacin total de la actividad cuando el inhibidor se encuentra unido a la enzima. Del mismo modo, la actividad de la enzima sin acti-

85

vador no tiene por qu ser nula. Esto nos lleva a la situacin donde ya sea un complejo de enzima con inhibidor o bien una enzima sin activador pueda tener algo de actividad. El esquema general, considerando un
efector en forma genrica, al que llamaremos X, sera:
KS

EX + S

kp

E+P+ X

EXS
KX

KX

ES

E+S
+
X

KS

E+P
kp

De esta manera, la v0 va a ser la resultante de kp[ES] + kp[ESX] pero el efecto de X como inhibidor o activador puede deberse no solo a su naturaleza, sino tambin a su concentracin. Por ejemplo, si kp > kp, a
alta [S] X se comportar como inhibidor, ya que en esta situacin la [EXS] va a ser considerable, y por lo
tanto, la v0 en presencia de X va a ser menor que en su ausencia. Sin embargo, a baja [S] el efecto de la
relacin entre [ES] y [EXS] puede verse compensado por la relacin kp/kp, y por lo tanto, la v0 puede no
verse afectada por la presencia de X. Por otro lado, si kp < kp, la manifestacin del efecto activador de X
puede requerir asimismo que la [S] est en un rango bajo como para que haya una prevalencia de EXS por
sobre ES. Otras combinaciones de constantes cinticas ms complicadas pueden asimismo determinar si X
acta como inhibidor o activador de acuerdo a la [S].

Regulacin de la Actividad Enzimtica por Feedback y Feedforward

Hasta aqu hemos considerado a los efectores en esquemas de estado inicial, es decir in vitro. Deberamos echar un vistazo a lo que ocurre con los inhibidores naturalmente, es decir, en las vas metablicas.
Un aspecto muy usual en las vas metablicas es la necesidad de control de acuerdo cmo se van acumulando sus intermediarios. Otra necesidad del metabolismo es la de adaptarse rpidamente a cambios en el
entorno. Entre los varios mecanismos que permiten satisfacer estas necesidades estn la retroinhibicin o
feedback y su opuesto, el feedforward, que utilizan a los propios intermediarios metablicos como efectores
de la actividad de alguna de las enzimas de la va.
El mecanismo de feedback consiste simplemente en que algn intermediario, o incluso el producto final,
acta como inhibidor de alguna de las enzimas que catalizan los primeros pasos de la va, de acuerdo al
siguiente esquema:
A

B
E1

C
E2

D
E3

La lnea roja indica que el metabolito D es un inhibidor de la enzima E1. De esta manera, si la demanda
de D es baja debido a las condiciones metablicas del momento, la inhibicin de la primera enzima de la va
evita que D se acumule. Ms importante an, se evita un gasto de energa intil en sintetizar B, C y D pero
tambin se evita la acumulacin de B y C, que inevitablemente ocurrira si se acumula D. Tales intermediarios de las vas metablicas pueden resultar txicos a altas concentraciones, y por lo tanto, evitar su acumulacin puede servir tambin para preservar la viabilidad de la clula. Estos mecanismos pueden tambin
servir para controlar qu vas se favorecen. Por ejemplo, en una va ramificada como la que se esquematiza
a continuacin:
E5

F
E3

B
E1

C
E2

E4

E
E6

86

En este esquema, los metabolitos D y E actan de forma concertada como inhibidores parciales de la
enzima E1 de forma tal de modular la produccin de F y G segn su demanda. La constante de afinidad
entre cada uno de estos inhibidores y la enzima E1 puede ser diferente, tal como lo representan la lnea
discontinua y la continua. Asimismo, F podra actuar como retroinhibidor de E 3 y G como retroinhibidor de E4
como para favorecer diferencialmente una u otra rama de la va, y estas regulaciones a su vez superponerse sobre las retroinhibiciones de E1. Dado que los distintos metabolitos seguramente tienen diferencias estructurales entre s, en general este tipo de retroinhibiciones no siguen el modelo de inhibicin competitiva.
Si en vez de inhibicin hay activacin, el esquema se transforma en un feedforward:
A

B
E1

C
E2

E3

En este caso, D acta como activador de E1, y por lo tanto, estimular su propia sntesis. Esto puede
permitir que D se acumule rpidamente en respuesta a una necesidad repentina, pero tambin puede conducir a un fenmeno curioso, llamado biestabilidad. Este fenmeno se ha visto sobre todo en bacterias.
Cultivos puros de bacterias clonales (es decir, todas las clulas presentan el mismo genotipo) pueden comportarse de dos maneras diferentes a pesar de que las condiciones de cultivo son idnticas para todas las
clulas. Si los mecanismos de feedforward son suficientemente sensibles, el disparo del mecanismo en un
conjunto de clulas puede llevarlas a producir (en este ejemplo) D mientras que el resto de las clulas permanecern sin producir D. Si a su vez D es un regulador de un comportamiento celular macroscpico, por
ejemplo, la movilidad, se obtendr una poblacin donde una parte de las clulas son mviles y la otra no.
Este tipo de comportamientos tiene importancia evolutiva, ya que permiten que una poblacin de clulas
est preparada para ofrecer respuestas alternativas frente a un entorno cambiante.

Relacin de los Efectores con el Sitio Activo

Al principio del captulo hicimos referencia a la importancia de la flexibilidad del sitio activo para las respuestas de la actividad enzimtica a las demandas metablicas. Ahora podemos volver a ese concepto,
observando que si el sitio activo y el sustrato fueran estructuras rgidas, cada una encajando perfectamente
en la otra como una llave y una cerradura, no habra posibilidad de regulacin alguna. Por ms que consideremos a los inhibidores competitivos, nunca la estructura del inhibidor va a ser idntica a la del sustrato. En
los casos donde los inhibidores/activadores se unen indistintamente a la enzima libre o al complejo ES, es
obvio que debe haber un ajuste estructural como para que la misma molcula pueda unirse a dos formas
diferentes del sitio activo.
Como vimos anteriormente, la relacin del sustrato con el sitio activo es la de un ajuste inducido, donde
la entrada del sustrato al sitio activo modifica a ste de modo tal que la unin se va produciendo durante el
contacto. En vez de pensar en una llave y una cerradura, deberamos pensar por ejemplo en un pie y una
media: si bien la media no tiene preformada la estructura complementaria del pie, la misma se va formando
a medida que el pie (el sustrato) va ingresando a la media (el sitio activo) y la va moldeando. Dada esa
flexibilidad, la media puede admitir otras estructuras aparte de la del pie. Por ejemplo, puede admitir una
berenjena (inhibidor competitivo) o puede tener lugar para que antes o despus del pie ingresen un conjunto
de tachuelas (inhibidor de tipo mixto). En ninguno de estos casos podramos caminar, si bien podra haber
cierta semejanza entre el pie y la berenjena pero no as entre el pie y una tachuela. Podramos seguir buscando analogas para un inhibidor acompetitivo o un activador, pero la idea es que precisamente gracias a
la flexibilidad del sitio activo y al fenmeno del ajuste inducido es que pueden existir todos estos tipos de
inhibicin o activacin lineal o parcial. Esto es de fundamental importancia para la regulacin del metabolismo... y salgamos corriendo, que se viene la tormenta!

Problemas
Problema 1:
Se estudi la cintica de una enzima a diferentes concentraciones de sustrato, en presencia y ausencia de
-3
un inhibidor (I) a concentracin 2.10 M.

87

-1

vo (moles min )
sin inhibidor
con inhibidor
10,4
4,1
14,5
6,4
22,5
11,3
33,8
22,6
40,5
33,8

Sustrato (M)
-5
0,3 x 10
-5
0,5 x 10
-5
1,0 x 10
-5
3,0 x 10
-5
9,0 x 10

a) Cules son los valores de Vmx y KM en ausencia y en presencia de inhibidor?.

b) Qu tipo de inhibidor es?.
-5
-3
c) Cuando [S] = 1,0.10 M e [I] = 2,0.10 M qu fraccin de las molculas de enzima estn unidas al sustrato?
-5
d) Cuando [S] = 3,0.10 M qu fraccin de las molculas de enzima estn unidas a sustrato en presencia y
ausencia de inhibidor?. Compare esta relacin con la relacin de velocidades iniciales en las mismas condiciones.
Problema 2:
Se realiz un estudio exhaustivo de una cepa de Saccharomyces cereviceae y result de inters analizar el
comportamiento cintico de la enzima directamente comprometida en una mutacin, la porfobilinogenasa
(PBGasa), la cual presenta una cintica michaeliana.
Para todos los estudios cinticos se utilizaron las mismas cantidades de clulas (absorbancia medida a 540
nm). La mezcla de reaccin se llev a cabo en condiciones ptimas de temperatura y pH. En cada caso la
enzima se inactiv tomando 1 ml de mezcla de reaccin (que contena una dilucin 1:1000 del extracto enzimtico) y agregando 4 ml de reactivo B4C (inactivador coloreado), posteriormente, se ley la absorbancia
a 500 nm.
El primer experimento se refleja en la tabla que se muestra a continuacin, donde se entregan resultados de
concentracin de producto expresados en el tubo de colorimetra, para diferentes concentraciones de sustrato.

Se realiz un segundo experimento: un estudio cintico en diferentes fases de crecimiento celular, encontrndose los resultados expresados a continuacin:
Fase de crecimiento
1

Vmax (moles min )

180

300

350

KM (mM)

15,1

15,3

15,2

-1

En un tercer y ltimo experimento se seleccionaron las clulas que se encontraban en la fase 2 de crecimiento y se realiz una cintica en la cual se agreg a la mezcla de reaccin cido 5-aminolevlico obte-1
nindose valores de Vmax=300 moles min y KM=5,1 mM.
a) Determine los parmetros cinticos utilizando los datos del primer experimento.
b) Interprete los resultados del segundo experimento y si es posible, hgalo numricamente.
c) Qu conclusiones puede obtener del tercer experimento?
Problema 3. Se estudi la cintica de una enzima a diferentes concentraciones de sustrato, en presencia y
-3
ausencia de 2.10 M de un inhibidor (I).

88

vo (moles/min)
Sustrato (M)
-5
0,3 x 10
-5
0,5 x 10
-5
1,0 x 10
-5
3,0 x 10
-5
9,0 x 10

sin inhibidor
10,4
14,5
22,5
33,8
40,5

con inhibidor
4,1
6,4
11,3
22,6
33,8

a) Cules son los valores de Vmx y KM en ausencia y en presencia de inhibidor?

b) Qu tipo de inhibidor es?
c) Cul es la constante de asociacin del inhibidor?
d) Cuando [S] = 1,0.105 M y [I] = 2,0.103 M qu fraccin de las molculas de enzima estn unidas al sustrato?
e) Cuando [S] = 3,0.105 M qu fraccin de las molculas de enzima estn unidas a sustrato en presencia
y ausencia de inhibidor? Compare esta relacin con la relacin de velocidades iniciales en las mismas condiciones.
Problema 4. Se estudi la cintica de la enzima del problema anterior en presencia de un inhibidor diferente. La concentracin del inhibidor fue 1.104 M.
vo (moles/min)
Sustrato (M)
-5
0,3 x 10
-5
0,5 x 10
-5
1,0 x 10
-5
3,0 x 10
-5
9,0 x 10

sin inhibidor
10,4
14,5
22,5
33,8
40,5

con inhibidor
2,1
2,9
4,5
6,8
8,1

a) Cules son los valores de KM y Vmx en presencia de este inhibidor?. Compare con los valores obtenidos
en el problema anterior.
b) Qu tipo de inhibidor es?
c) Cul es la constante de asociacin de este inhibidor?
d) Cuando [S] = 3,0.105 M qu fraccin de molculas de enzima tienen unido sustrato en presencia y ausencia de inhibidor? (1,0.104 M).

Bibliografa
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell.
Dixon, M., Webb, E.C. (1980) Enzymes New York: Academic Press.
Fell D. (1996) Understanding the Control of Metabolism. Londres: Portland Press.
Segel, I. H. (1975). Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons.
Segel I.W. (1982) Clculos de Bioqumica, 2da. edicin. Zaragoza: Editorial Acribia.
Voet D., Voet J (2006) Bioqumica, 3ra. edicin. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana.

89

90

CAPTULO 5
Reacciones con Ms de un Sustrato
Anbal R. Lodeiro

Los dos captulos anteriores proveyeron una visin general de la cintica enzimtica para enzimas monosustrato, es decir aquellas que catalizan la reaccin de un nico sustrato para convertirse en productos.
Aunque esta visin es de gran importancia ya que sienta las bases de todos los anlisis de cintica enzimtica, la realidad es que son pocas las enzimas que catalizan reacciones de un nico sustrato. Las isomerasas, que con frecuencia catalizan cambios de posicin de un grupo en una molcula (p. ej. la fosfoglucosa
isomerasa, que cataliza la interconversin entre glucosa-1-fosfato y glucosa-6-fosfato), son las nicas que
pueden considerarse verdaderamente monosustrato. Otras enzimas, como las hidrolasas (la invertasa que
usaron Michaelis y Menten es un ejemplo de ellas), catalizan reacciones de hidrlisis de un sustrato, pero en
realidad hay otro sustrato que interviene en la reaccin: el agua. Sin embargo, el agua se encuentra a una
concentracin tan alta que normalmente pueden despreciarse sus efectos cinticos. Esto nos lleva a una
primera reflexin: quizs podra analizarse el comportamiento cintico de una enzima multisustrato manteniendo todos sus sustratos a saturacin menos uno, calcular los parmetros cinticos de ese, luego hacer lo
mismo con otro, y as sucesivamente. Es posible, pero enseguida veremos que no es tan sencillo como
parece.
La gran mayora de las enzimas cataliza reacciones de dos o ms sustratos. En este punto, es importante destacar que todas las molculas que son modificadas en la reaccin son sustratos. Esta aclaracin parece innecesaria, pero en muchos textos aparece la palabra coenzima para referirse a molculas que en
realidad son sustratos y ello complica el anlisis. Por ejemplo, las reacciones de xido-reduccin involucran
pares redox: un dador reducido reacciona transfiriendo electrones a un aceptor oxidado para dar como productos el dador oxidado y el aceptor reducido, y por lo tanto en estas reacciones no puede haber un solo
sustrato, sino al menos dos. Las deshidrogenasas son un grupo de enzimas que catalizan reacciones de
+
xido-reduccin donde uno de los miembros del par redox es el nicotinamida-adenina-dinucletido (NAD en
+
su forma oxidada y NADH en su forma reducida) o su anlogo fosforilado, el NADP /NADPH. Sin embargo,
+
+
tanto al NAD /NADH como al NADP /NADPH se los suele denominar coenzimas, quizs porque intervienen en toda la diversidad de reacciones catalizadas por deshidrogenasas, y otro poco porque son molculas
sintetizadas por la clula. Evidentemente, esta terminologa puede llevar a confusin y oscurecer el hecho
+
+
de que el NAD /NADH y el NADP /NADPH son tan sustratos como el otro miembro del par redox, y deben
ser integrados en las ecuaciones cinticas como tales.
Los principios que vimos anteriormente con los efectores (Cap. 4) tambin rigen en parte la formacin de
complejos de la enzima con ms de un sustrato. Entre estos principios podemos destacar:

La unin de ms de una molcula al mismo sitio activo requiere un ajuste inducido.

Dos o ms molculas pueden unirse al sitio activo en forma secuencial o al azar.
La liberacin de ms de una molcula del sitio activo puede ocurrir en forma secuencial o al azar.
La presencia de una molcula en el sitio activo puede producirle modificaciones.

As, la cintica de enzimas multisustrato se complica a medida que aumenta el nmero de sustratos, ya
que hay una cierta diversidad de maneras en las que pueden unirse al sitio activo, reaccionar y liberarse los
productos.

91

Mecanismos Generales de Reaccin

Vamos a enfocar a continuacin algunos mecanismos de reaccin con dos sustratos, que podrn ilustrar
los principios generales necesarios para entender al resto de los mecanismos, incluyendo aquellos con ms
de dos sustratos. Esencialmente, la reaccin que vamos a considerar puede esquematizarse como:
A+B

P+Q

Sin embargo, hay varias maneras en las cuales los sustratos A y B pueden combinarse con el sitio activo
de la enzima para dar como productos P y Q. Consideremos primero la reaccin en condiciones iniciales,
as luego podemos entrar en las cinticas en presencia de productos. A grandes rasgos, vamos a dividir los
esquemas en los de formacin de complejos ternarios, donde los dos sustratos ocupan en algn momento
el sitio activo, y los de enzima sustituida, donde uno de los sustratos transfiere un grupo a la enzima, el cual
es luego transferido desde ella al otro sustrato.

Formacin de Complejos Ternarios

En el anlisis de estos mecanismos utilizaremos la aproximacin del equilibrio rpido, por lo cual emplearemos como parmetros cinticos la Vmax y la constante de disociacin del complejo enzima-sustrato. Llamaremos, KA, KB, KP y KQ a las constantes de disociacin de los sustratos A y B, y de los productos P y Q respectivamente. Adems, debemos notar que cuando en el sitio activo ya se encuentre unido uno de los sustratos (o productos), la constante de disociacin del segundo sustrato (o producto) se ver afectada ya que
la afinidad no ser la correspondiente a la enzima libre. Por lo tanto, en esos casos multiplicaremos las
constantes de disociacin por unos coeficientes, para los sustratos y para los productos.
Los complejos ternarios EAB pueden formarse por una entrada al azar de los sustratos al sitio activo, o
bien por una entrada ordenada de los mismos. En el caso de la unin al azar hay una similitud con los mecanismos de tipo mixto que ya vimos para los efectores:
KB

KA

B+E
+
A

KQ

kp

EAB

B + EA

KP

KA
KB

EP + Q

EPQ

EQ
+
P

EB
+
A

KP
KQ

E+Q
+
P

Este mecanismo de complejo ternario al azar tambin se conoce como equilibrio rpido al azar bi-bi. Su
caracterstica es que el orden en que ingresan los sustratos A y B al complejo ternario es al azar, como as
tambin lo es el orden en que se liberan los productos P y Q. Dado que en la aproximacin del equilibrio
rpido la etapa limitante de la reaccin es la conversin lenta de EAB en EPQ, se puede suponer que todas
las dems reacciones estn en equilibrio. La ecuacin de v0 para la condicin inicial (ausencia de P y Q) se
deduce de forma semejante a la de v0 en presencia de un efector de tipo mixto (ecuacin 4.26) y puede
escribirse de la siguiente manera:
0
=
[ ]

[]

[] [] []
1+
+
+

5.1

Multiplicando numerador y denominador por KAKB y recordando que Vmax = kp [ET] obtenemos:
0 =

[]
+ [] + [] + []

5.2

Si consideramos [A] variable y [B] fija, podemos reordenar la ecuacin 5.1 para obtener una muy semejante a la de v0 con un activador de tipo mixto (4.38):

92


0
=

[ ]
1 + +
[]

1+

(5.3)

Dividiendo numerador y denominador por (1 + KB/[B]) y recordando que kp [ET] = Vmax:

1+

0 =

1+
[]

+
1+

(5.4)

la cual podemos expresar como:

0 =

max ( )
( ) +

(5.5)

donde:
max ( ) =

1+

[]
=

1+

(5.6)

1+

( )

(5.7)

La ecuacin 5.4 resalta el hecho de que por ms que nos encontremos frente a un mecanismo complicado, con dos sustratos, la cintica sigue siendo fundamentalmente la de Michaelis-Menten. Es decir, la ecuacin 3.17 sigue siendo la ecuacin fundamental de la cintica enzimtica an cuando nos hayamos apartado del mecanismo monosustrato.
Otro esquema til para visualizar lo que ocurre en el complejo ternario al azar es el que se presenta en la
Fig. 5.1, donde se muestra un sustrato intercambiando un grupo con el otro sustrato.

A B

P Q

Q
P

Fig. 5.1. Representacin esquemtica de un complejo ternario al azar. Ambos sustratos, A y B pueden unirse en cualquier orden al sitio
activo, cuya forma se ajusta en el complejo ternario. El grupo llevado por A es transferido a B, con lo cual A se transforma en P y B se
transforma en Q. La salida de los productos tambin se produce en cualquier orden.

93

En realidad, muchas de las reacciones bisustrato involucran la transferencia de un grupo desde un sustrato hasta el otro, si bien el rtulo de transferasas ha sido reservado para una clase particular de estas enzimas. En la Fig. 5.1 puede apreciarse con mayor claridad que si bien cada sustrato puede unirse por s solo
al sitio activo, el complejo ternario es el nico complejo activo. Es ms: puede darse la unin de las dos
molculas desprovistas del grupo a ser transferido (complejo EBP) y en ese caso, se tendr un complejo
ternario inactivo.
A pesar de las apariencias de la Fig. 5.1, el sitio activo y los sustratos no son tan rgidos como parecen.
Como ya comentamos en el Cap. anterior, existe un ajuste inducido por el cual el sitio activo va adquiriendo
su forma en la medida en que el sustrato va interactuando con l. Esto se puede ver ms claramente en otra
manera de formar el complejo ternario, conocida como complejo ternario de orden obligatorio, o tambin
llamada bi-bi ordenado, en la cual tanto el ingreso de los sustratos al sitio activo como la liberacin de los
productos desde el mismo siguen una secuencia estricta. A continuacin mostramos la secuencia de reacciones para este mecanismo, y en la Fig. 5.2 lo ilustramos con un diagrama.
kp

EAB

EPQ
KP

KB

A+E
KA

EQ
+
P

EA
+
B

E+Q
KQ

En este caso las constantes de disociacin de A y Q difieren conceptualmente de las constantes de B y

P, ya que B no puede unirse a la enzima si antes no se uni A y Q no puede liberarse si antes no se liber
P. Por lo tanto, solo las constantes de A y Q pueden considerarse constantes de disociacin entre sustrato o
producto y la enzima. Este hecho ha sido destacado con los coeficientes y , que multiplican a KB y KP
respectivamente, pero debe tenerse en cuenta que esos coeficientes afectan a las constantes de disociacin de de los complejos EB y EP, que no forman parte de la secuencia de reacciones. Razonablemente,
esos coeficientes y deberan tener valores muy bajos ya que los complejos EB y EP se presume que
seran altamente inestables.
Como puede apreciarse, este esquema es mucho ms parecido al de un inhibidor acompetitivo (ecuacin 4.11) que a uno de tipo mixto, con lo cual la ecuacin de la v0 que se obtiene con la aproximacin del
equilibrio rpido es parecida tambin:
0
=
[ ]

[] []
1+
+

5.7

B
A

E
A

E
P

A B

P Q

Fig. 5.2. Representacin esquemtica de un complejo ternario de orden obligatorio. El sustrato A ingresa primero al sitio activo, cuya
estructura tiene muy baja afinidad por B. Una vez que A se asoci a la enzima, la estructura del sitio activo se modifica y B puede
unirse. Al formarse el complejo ternario, el grupo llevado por A es transferido a B, con lo cual A se transforma en P y B se transforma
en Q. La salida de los productos tambin se produce en orden, en este caso primero se disocia Q y luego lo hace P.

94

Multiplicando numerador y denominador por KAKB y recordando que Vmax = kp [ET] obtenemos:
0 =

[]
+ + []

5.8

Estas ecuaciones son muy similares a 5.1 y 5.2, excepto que los trminos [B]/KB y KA [B] no aparecen,
justamente debido a que la reaccin entre B y la enzima libre no est contemplada en la secuencia de reaccin.

Formacin de Enzimas Sustituidas

En este mecanismo, conocido tambin como ping-pong bi-bi, el grupo que se transfiere sustituye primero
a un grupo reactivo del sitio activo, el sustrato dador del grupo se libera, ingresa el sustrato aceptor y finalmente el grupo se libera del sitio activo transfirindose al sustrato aceptor (Fig. 5.3). De esta manera, no se
forma un complejo ternario ya que nunca los dos sustratos estn en el sitio activo al mismo tiempo. La secuencia de reacciones es la siguiente:
E*B
KB

EA

E*P

KQ

E* + P

kp

KA

E+Q

EQ
kq

KP

A+E

Aqu hay dos cosas importantes para observar: por un lado, KA, KB, KP y KQ no estn multiplicadas por
ningn coeficiente, ya que cada vez que cualquiera de estas molculas se une a la enzima, sta no contiene
otro sustrato o producto en el sitio activo; por otro lado, la enzima libre oscila entre dos estados (de ah el
nombre de ping-pong): E y E*, esta ltima simbolizando la enzima con el grupo transferido. De esta manera, hay dos complejos activos: EA y E*B, lo cual da origen a dos constantes catalticas: kp y kq para la produccin de P y Q respectivamente. De esta manera, la Vmax depender en principio de una u otra constante
cataltica segn qu producto usemos para expresar la v0:
[]
= [ ]

(5.9)

[]
= [ ]

(5.10)

Fig. 5.3. Representacin esquemtica de un mecanismo de enzima sustituida. El sustrato A ingresa primero al sitio activo, cuya estructura tiene muy baja afinidad por B. Una vez que A se asoci transfiere un grupo a la enzima, con lo cual se transforma a su vez en P.
Seguidamente, P se libera y recin despus B se une a la enzima modificada, cuyo sitio activo adquiri afinidad por B. El grupo transferido inicialmente desde A a la enzima pasa ahora desde la enzima a B, el cual se transforma en Q, y finalmente se libera.

95

Sin embargo, kp y kq no pueden ser muy distintas entre s, ya que si lo fueran, eso significara que la enzima tendra diferente nmero de ciclos catalticos por unidad de tiempo con A P que con B Q, lo cual
llevara inevitablemente a un atascamiento de la enzima con uno u otro sustrato.
El tratamiento de equilibrio rpido para esta secuencia de reacciones permite obtener la ecuacin de la
v0 que se expresa a continuacin:
0 =

[]
[] + + []

5.11

En esta ecuacin no aparece el producto de KAKB en el denominador, ya que no hay interaccin simultnea de ambos sustratos en el sitio activo.
Las observaciones precedentes se pueden comparar en la Tabla 5.1, donde se expresan las v0 para los
tres mecanismos.

Tabla 5.1: Comparacin de los distintos mecanismos de catlisis con dos sustratos
Tipo de
mecanismo

v0

Observaciones

Ternario al azar

[]
+ [] + [] + []

Los dos sustratos A y B se unen

independientemente al mismo sitio
activo y la reaccin se produce all.

Ternario con
orden obligatorio

[]
+ + []

Un sustrato (A) se une al sitio activo, despus se une el otro (B) y la

reaccin se produce all.

Enzima sustituida

[]
[] + + []

Un sustrato (A) se une al sitio activo, le transfiere el grupo a intercambiar, sale y recin despus se une el
otro (B), que recibe el grupo.

Representaciones Grficas
Es posible aqu tambin encontrar los parmetros cinticos realizando linealizaciones de las ecuaciones
cinticas, solo que todo resulta ms engorroso que para el caso de un solo sustrato (Cap. 3). En primer
lugar, debemos considerar un solo sustrato variable y el otro fijo como para poder hacer grficas bidimensionales entre la v0 y el sustrato variable. El problema es que an as las intersecciones a los ejes de abscisas y ordenadas no dan directamente los parmetros cinticos. Por lo tanto, a partir de los resultados de los
grficos primarios deben realizarse grficos secundarios para encontrarlos. Para ejemplificar el procedimiento, realizaremos la representacin grfica de la doble recproca para un esquema de complejo ternario al
azar, donde A ser el sustrato variable y B el sustrato cuya concentracin se mantendr fija. La doble recproca de la ecuacin 5.2 da por resultado:
1

1
1

=
1+
+
1+
0

[] []
[]
De esta manera, el valor de la abscisa cuando 1/v0 = 0 es:

1
1 1 + []
=
[]
1 +
[]
Y el valor de la ordenada cuando 1/[A] = 0 es:

96

5.13

5.12

0,08

0,12

0,4

0,1

1/[A]

1/v0

0,3

0,2

0,06

0,04
0,02

-1

0,04

0,08

0,02

0,1

-3

1/Vmax(ap)

0,06

1/[A]

-1

-0,5

0,5

1,5

1/[B]

-3,5

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

1,5

1/[B]

Fig. 5.4. Representacin doble recproca para una enzima que cataliza una reaccin de dos sustratos mediante el mecanismo de
complejo ternario al azar. En a se muestra el grfico primario de la doble recproca 1/v0 vs 1/[A] con tres concentraciones de B: 0,5 mM
(verde) 1,5 mM (azul) y 3 mM (rojo). El punto de interseccin de las tres rectas tiene como coordenadas 1/KA en las abscisas y
1/Vmax(1 ) en las ordenadas. Los puntos de corte del eje 1/[A] son los valores de 1/KA(ap) (ecuacin 5.13) y los puntos de corte del
eje 1/v0 son los de 1/Vmax(ap) (ecuacin 5.14). En b y c se muestran los grficos secundarios en funcin de las concentraciones de B.
Panel b: doble recproca 1/[A] vs 1/[B] donde el punto de corte en el eje de abscisas es 1/KB y en el eje de las ordenadas es KA/Vmax.
Panel c: doble recproca 1/Vmax(ap) vs 1/[B], donde el punto de corte del eje de las abscisas es 1/KB y en el de las ordenadas es 1/Vmax.
Los parmetros cinticos utilizados en estas grficas fueron: KA = 1 mM; KB = 1 mM, = 0,3; Vmax = 15 moles de producto min1.

1
1

=
1+
0

[]

(5.14)

De este modo, en las dos intersecciones est [B] y por lo tanto, hay que hacer los grficos secundarios
de 1/[A] vs 1/[B] y 1/Vmax(ap) vs 1/[B] para obtener los parmetros cinticos. En la Fig. 5.4 se ilustra el procedimiento para este tipo de esquema de reaccin. La misma estrategia se utiliza con los otros mecanismos.

Cinticas Reversibles
En el anlisis anterior nos basamos en reacciones in vitro que nos permitieron obtener expresiones para
la velocidad inicial, v0. Sin embargo, en el anlisis metablico vamos a estar interesados en contemplar la
presencia de los productos, ya que ellos tienen concentraciones distintas de cero en la clula. Por lo tanto,
debemos encontrar las expresiones para la cintica reversible de todos los mecanismos de reaccin que
vimos anteriormente. Estas expresiones van a resultar altamente complejas ya que renen varios parmetros cinticos (Vmax, constante de afinidad, constante de Michaelis-Menten) para dos sustratos y dos productos, y no son fciles de deducir con la misma metodologa del Cap. 3. Para ello, es mejor utilizar una metodologa desarrollada por E. King y C. Altman en 1956, basada en un mtodo algebraico simple y sistemtico. Gracias a su sistematicidad, el mtodo ha podido ser compilado en softwares, algunos de los cuales
estn disponibles con acceso gratuito en Internet (p. ej. KAPattern, http://virtualrat.org/software/ka-pattern).

El mtodo de King-Altman
Para ejemplificar el mtodo de King-Altman vamos a tomar una reaccin catalizada por un complejo ternario de orden obligatorio. El mtodo se basa en las siguientes etapas:
1) Representar la secuencia de reacciones en un esquema cerrado, que contenga todas las formas de la
enzima (p.ej. enzima libre, enzima complejada con un sustrato, con dos, etc.) y todas las reacciones entre ellas.
2) Anotar todas las constantes cinticas. Todas las reacciones deben tratarse como reacciones de primer
orden, por lo tanto, si en una reaccin hay dos reactivos (p.ej. E + A EA) la constante cintica debe incorporar la concentracin de A: k1 [A], resultando en una constante de pseudoprimer orden.
3) Dibujar un patrn maestro que represente el esqueleto del esquema.

97

4) A partir de ese patrn maestro, dibujar todos los patrones que, conteniendo solo lneas del patrn maestro, no formen estructuras cerradas y conecten todas las enzimas.
5) Dibujar todos los patrones que conducen a una forma dada de la enzima. Anotar las constantes cinticas
y repetir la operacin para todas las formas de la enzima.
6) Multiplicar todas las constantes cinticas dentro de cada patrn y luego sumarlas extendiendo la suma a
todos los patrones encontrados. Realizar esta operacin separadamente para los conjuntos de patrones
que conducen a cada forma de la enzima.
En el ejemplo del complejo ternario de orden obligatorio, cuya secuencia de reacciones fue esquematizada en la pg. 94 se puede elaborar la secuencia de reacciones mostrada a continuacin:
k 2[B]

EAB
EPQ

EA
k 2
k 1

k 1[A]

k3

k 3[P]

k 4[Q]

EQ
k4

En esta secuencia se consideran como una sola cosa los complejos donde se produce la catlisis, que
en este caso estn encerrados entre llaves. A continuacin, dibujemos el patrn maestro:

y ahora los patrones que, sin tener estructura cerrada, conectan todas las formas enzimticas terminando
en una de ellas. En este caso, dibujamos todas las que terminan en la enzima libre, E. En total vemos que
son cuatro (igual al nmero de enzimas) y cada uno tiene tres lados (uno menos que el nmero de enzimas). No se pueden hacer ms patrones que, conectando todas las enzimas, terminen en E y solo tengan
lados que estn presentes en el patrn maestro (p.ej. no vale hacer un patrn con forma de Z porque, aunque conecte todas las enzimas, la diagonal no est en el patrn maestro). En cada uno de los diagramas
est indicada la constante cintica correspondiente.
k 2
k 1

k 2[B]
2

k 3[P]

k 2
k3

k 1

k4

k3

k 1

k4

4
k4

Luego, multiplicamos las constantes cinticas que aparecen dentro de cada patrn: p.ej. para el patrn
Nro. 1, el producto es k1 k2 k3[P]. Luego hacemos la suma extendida a los cuatro patrones del 1 al 4 para
encontrar todos los caminos que conducen a E: (k1 k2 k3[P] + k2[B] k3 k4 + k1 k3 k4 + k1 k2 k4). Si luego
hacemos lo mismo pero extendido a todas las formas enzimticas, tendremos una suma de 16 trminos
(cuatro por cada una de las cuatro formas enzimticas). Esta suma, que llamaremos D, contiene todos los
caminos que llevan a todas las formas enzimticas, es decir, todos los caminos que conducen a E T. De esta
manera, si dividimos la suma que encontramos en los caminos 1 al 4 por D, obtenemos la proporcin de
enzima libre respecto del total de enzima:
[]
1 2 3 + 2 3 4 + 1 3 4 + 1 2 4
=
[ ]

98

5.15

Ahora deberamos hacer lo mismo para cada una de las formas en que se encuentra la enzima, y encontrar [EA]/[ET], {[EAB] + [EPQ]}/[ET] y [EQ]/[ET]. Los resultados de hacer esas operaciones son los siguientes:
[]
1 2 3 [] + 1 2 4 [] + 1 3 4 [] + 2 3 4 [][]
=
[ ]

5.16

{ + []}
1 2 3 ] [ + 1 2 4 ][ + 1 3 4 ][ + 2 3 4 ] [
=
[ ]

[]
1 2 3 ][ + 1 2 4 + 1 3 4 + 2 3 4 ][
=
[ ]

5.17

5.18

La velocidad de la reaccin deber medirse respecto de la produccin de alguno de los productos (o el

consumo de alguno de los sustratos) de modo tal que podra expresarse respecto de P o respecto de Q. Si
la expresamos respecto de P, lo que vamos a mirar es cul es el complejo que produce P y en qu reaccin
se consume P. As podemos ver que P se produce a partir del complejo {EAB + EPQ} para dar EQ + P, y se
consume en la reaccin de produccin del complejo: EQ + P {EAB + EPQ}. De esta manera, la vneta ser:
[]
= = 3 +

3 [] (5.19)

Reemplazando las concentraciones de complejo por la chorrera de constantes que averiguamos hace un
rato, nos queda una tremenda ecuacin:
(1 2 3 3 ] [ + 1 2 3 4 ][ + 1 3 3 4 ][ + 2 3 3 4 ] [

1 2 3 3 ][ 1 2 3 4 1 3 3 4 2 3 3 4 ][ )
(5.20)

Sin embargo, en esta ecuacin hay varios trminos que se cancelan (1 y 5; 3 y 7; 4 y 8) de modo
que lo que nos queda ahora es:
=

1 2 3 4 ][ 1 2 3 4

(5.21)

Esta notacin sigue teniendo poco sentido prctico, ya que contiene un gran nmero de constantes cinticas que son muy difciles de medir experimentalmente. Sin embargo, puede expresarse empleando coeficientes que nos permitan acercarnos al un significado ms enzimolgico:
=

][
0 + 1 [] + 2 [] + 3 [] + 4 [] + 5 [][] + 6 [][] + 7 [][] + 8 [][] + 9 [][][] + 10 [][][]

(5.22)

donde Nd es el coeficiente del numerador para la reaccin directa:

= 1 2 3 4

(5.23)

Nr es el coeficiente del numerador para la reaccin reversa:

= 1 2 3 4

(5.24)

y en el denominador nos quedaron 11 coeficientes. Recordemos que estos coeficientes provienen de la

sumatoria de los numeradores de las ecuaciones 5.15-5.18, que representa todas las formas en que se
encuentra la enzima. Los coeficientes se agruparon sacando factor comn con las concentraciones de reactivos que las multiplican, y son:
0 = 1 2 + 3 4 (5.25)
1 = 1 2 + 3 4 (5.26)
2 = 2 3 4 (5.27)

99

3 = 1 2 3 (5.28)
4 = 1 2 + 3 4 (5.29)
5 = 1 2 (3 + 4 ) (5.30)
6 = 1 2 3 (5.31)
7 = 2 3 4 (5.32)
8 = (1 + 2 )3 4 (5.33)
9 = 1 2 3 (5.34)
10 = 2 3 4 (5.35)
Si bien aqu hay en total 13 coeficientes (dos N y once D), todos ellos provienen de ocho constantes
cinticas (k1-k4 y k1-k4) de manera que seguramente estn relacionados entre s. Estas relaciones nos
pueden ayudar a encontrar las expresiones de las Vmax directa y reversa (Vmax,d, Vmax,r, respectivamente), las
constantes de disociacin y las constantes de Michaelis-Menten (Ki y KM,i respectivamente, siendo i el sustrato o producto en cuestin) en funcin de las constantes cinticas para este tipo de esquema de reaccin.
As, la ecuacin de la vneta para el esquema del complejo ternario de orden obligatorio nos queda:

, [] , []

,
,
=
,
, []
,

[] []
[]
[]
[]

1+
+
+
+
+
+
+ ,
+
+
+
+

,
, ,
,
,
, , ,

donde:
, =
, =

3 4
3 +4

(5.37)

1 2
1 +2

(5.38)

, =

3 4
1 (3 +4 )

(5.39)

, =

4 (2 +3 )
2 (3 +4 )

(5.40)

, =

1 (2 +3 )
3 (1 +2 )

(5.41)

, =

1 2
4 (1 +2 )

(5.42)

1
1

(5.43)

1 + 2
2

(5.44)

1 + 4
1

(5.45)

100

5.36

4
4

(5.46)

...Y as podemos seguir con los otros esquemas de reaccin: complejo ternario al azar y complejo de enzima sustituida. Por esto es importante que alguien se haya tomado el trabajo de compilar estos mtodos en
un software, pero tambin es importante que antes de usarlo, entiendas de dnde salen las ecuaciones que
resuelve.

Modelos Alternativos: la Cintica de Conveniencia

Si bien las descripciones detalladas de la vneta como la que se realiz en la ecuacin 5.36 permiten entender muy bien los mecanismos de reaccin de enzimas individuales, la obtencin de las mismas es muy
laboriosa, an con la ayuda de softwares, ya que cada enzima tiene sus particularidades y la cosa no se
agota en encontrar las ecuaciones detalladas de los tres mecanismos que vimos. Por ejemplo, hay enzimas
que tienen tres, cuatro y hasta cinco sustratos. Adems, muchas enzimas actan en presencia de efectores
que modifican su actividad, o bien estn sujetas a regulacin por otros medios, como por ejemplo, modificacin covalente. Un ejemplo podra ser la glutamino sintetasa, una enzima clave en el metabolismo del nitrgeno en prcticamente todas las formas de vida. En bacterias, esta enzima tiene tres sustratos, al menos
nueve efectores conocidos y adems se regula por modificacin covalente. No te quiero explicar lo que es la
ecuacin de la vneta de esta enzima tomando en cuenta todos esos factores.
Adems hay otro problemita: las constantes cinticas sobre las que se basan estas ecuaciones en realidad no son constantes en el sentido fsico ya que dependen del pH, de la temperatura y de la secuencia
de aminocidos de la enzima en cuestin. Por ejemplo, el KM de determinada enzima por un sustrato medido en el ratn puede no tener el mismo valor para la misma enzima en humanos. An cuando fuera as, ese
KM va a depender de la temperatura y el pH al cual fue medido, que pueden diferir de los de su entorno fisiolgico en el ratn o en el humano. Entonces, por ms que encontremos la ecuacin correcta y podamos
obtener experimentalmente los valores de todos los parmetros cinticos, esa informacin se restringir a
esa enzima de esa especie en esas condiciones.
Cuando estos mtodos fueron desarrollados, hace unos 60 aos, no exista la posibilidad de analizar
grandes masas de informacin a nivel del conjunto de genes, protenas y metabolitos que contiene una
clula. Esto fue posible recin en el siglo XXI debido fundamentalmente a tres avances: la secuenciacin
masiva de ADN, las nuevas metodologas de especrometra de masas y el avance de la informtica, con su
pata biolgica: la bioinformtica. Estas metodologas nos permiten el acceso a lo que denominamos enfoques micos: la genmica (estructural y funcional), la protemica y la metabolmica. Estas son las que nos
interesan aqu, pero por supuesto hay otras micas referidas a las totalidades de alguna cosa: p.ej. la
glicmica, referida a todos los carbohidratos de la clula, la plasmidmica, referida a todos los plsmidos
compartidos por una comunidad de bacterias, y an la biblimica, referida a todas las publicaciones de un
determinado tema.
La combinacin de genmica funcional, protemica y metabolmica permite la construccin de modelos
metablicos a escala celular. Estos modelos no son simples mapas, sino modelos dinmicos. Haciendo una
analoga, el mapa de La Plata es el mismo un domingo a la medianoche que un lunes a las 9 de la maana,
pero el flujo de trnsito evidentemente, no. Si uno quisiera hacer un plan para mejorar la circulacin en la
ciudad, debera contar con informacin dinmica de los flujos de trnsito bajo distintas circunstancias (horarios, meses del ao, clima, etc.). De la misma manera, el anlisis metablico requiere informacin dinmica.
Tenemos casi todo para hacerlo: sabemos qu protenas se expresan en la clula bajo distintas circunstancias (tipo de clula, presencia de una enfermedad, nivel nutricional, etc.), sabemos tambin qu metabolitos
hay y cunto de cada uno... en resumen, tenemos todos los datos para conocer cada [E T] y cada [S] (o [P]),
pero nos faltan las constantes cinticas de cada metabolito y los mecanismos cinticos de cada enzima para
poder transformar esos datos en un modelo matemtico dinmico que permita hacer un anlisis metablico
a nivel global. Es decir, faltara la cinetmica. No obstante, se han realizado algunos intentos, el ms
conspicuo de todos es el as llamado silicon cell, algo as como una clula virtual, que puede encontrarse en
http://www.siliconcell.net/sica/. Sin embargo, muchas de estas iniciativas intentan suplir la falta de informacin cintica detallada con reducciones ms o menos fundamentadas de las expresiones de la vneta. La ms
simple, y ms equivocada, es la que utilizan muchos modelos de balance de masas y balance de flujos metablicos, que consideran a la velocidad de reaccin como el producto simple de una constante cintica por
la concentracin de sustrato: v = k [S]. Al no tomar en cuenta el complejo enzima-sustrato, no toman en
cuenta un rasgo fundamental de las reacciones catalizadas por enzimas, que es el grado de saturacin de
la enzima. Como venimos viendo, el aumento de vneta entre dos [S] puede ser lineal si el rango de [S] es
bajo respecto del KM, pero puede ser prcticamente nulo si la [S] se aproxima a la saturacin. Asimismo,

101

cambios de concentraciones de [S] en rangos algo por encima o algo por debajo del KM van a producir respuestas diferentes en el cambio de la vneta.
En resumen, el problema consiste en lograr expresiones de menor complejidad, que puedan resolverse
para un gran nmero de enzimas diferentes pero que al mismo tiempo capten la variabilidad de las constantes cinticas en respuesta al ambiente y el grado de saturacin de las reacciones catalizadas por enzimas
con suficiente fidelidad. En otras palabras, muchas veces no hace falta conocer todos los detalles de algo
para implementarlo en un modelo matemtico al cual le pedimos cierta informacin concreta, pero la eliminacin de detalles es riesgosa porque muchas podemos cambiar el sentido de las cosas.
En un intento de ofrecer una propuesta de anlisis cintico que abarque a todas las formas posibles de
catlisis que obedezcan la cintica de Michaelis-Menten sin perder informacin esencial, W. Liebermeister y
E. Klipp propusieron en 2006 la cintica de conveniencia. Como su nombre lo indica, no pretende ser una
herramienta exhaustiva, sino simplemente una aproximacin conveniente que permite a los modelos matemticos del metabolismo realizar mejores ajustes y predicciones que la simple cintica de primer orden
que no toma en cuenta la existencia de la enzima. Para esta propuesta se basaron en un esquema de complejo ternario al azar con dos sustratos y dos productos y luego lo extendieron a diferentes combinaciones,
con o sin efector.
En el esquema del complejo ternario al azar podemos suponer que la vneta depende de la interconversin
entre los complejos EAB y EPQ, que en la aproximacin del equilibrio rpido sera la etapa limitante de la
reaccin, estando todas las otras en equilibrio. Por lo tanto, y como vimos anteriormente, las concentraciones de cada una de las formas de enzima pueden escribirse as:
[] =

[] (5.47)

[] =

[] (5.48)

[] =

[]
[] (5.49)

[] =

[] (5.50)

[] =

[] (5.51)

[] =

[]
[] (5.52)

Para mayor simplicidad, podemos escribir los trminos [A]/KA, [B]/KB..., etc. de las ecuaciones 5.47-5.52
como a, b..., etc. puesto que ya vimos que es vlido expresar las concentraciones relativizadas a sus constantes de disociacin. Por lo tanto, si sumamos todas las formas de la enzima para obtener [ET], con esta
nueva notacin obtenemos:
= 1 + + + + + +

(5.53)

La vneta, como dijimos, es:

= , ,

(5.54)

donde kp,d y kp,r son las constantes catalticas para las reacciones EAB EPQ y EPQ EAB, respectivamente. Reemplazando y, como siempre, dividiendo ambos miembros por la [E T]:
=

, ,
1 + + + + + +

(5.55)

Operando en el denominador para reunir los trminos correspondientes a sustratos por un lado y a productos por el otro, obtenemos:

102

, ,
1+ 1+ + 1+ 1+ 1

(5.56)

Ahora podemos imaginar a una enzima que cataliza una reaccin con n sustratos s1, s2, s3,... sn y m productos p1, p2, p3,... pm, y lo nico que tenemos que hacer es la multiplicatoria de los mismos (simbolizada
por ):
=

,
=
=1

=
=1

1 + +

=
=1

=
=1

1 + 1

(5.57)

Otra cosa que hasta ahora no mencionamos es la estequiometra. En muchas reacciones interviene ms
de un mol de uno de los sustratos por cada mol del otro, p.ej.: 2A + B P + Q. En general, podramos decir
que cada sustrato si puede tener su coeficiente estequiomtrico i y cada producto pi su coeficiente i de tal
modo que la ecuacin para la reaccin en general podra ser:

1 1 + 2 2 + 3 3 + 1 1 + 2 2 + 3 3 + +
Para contemplar esto, en la ecuacin 5.57 agregamos los coeficientes estequiomtricos:
=

,
=
=1

=
=1
=
=0

=
=1

=1
=

=0

(5.58)

La presencia de efectores puede ser tambin incluida a travs de los factores que modifican Vmax y KS,
tal como vimos en el Cap. 4 (ecuaciones 4.8 y 4.37).
Estas aproximaciones estn siendo utilizadas para desarrollar modelos metablicos a gran escala y en
pocos aos seguramente podremos apreciar sus resultados. Cuando se logre tener modelos confiables, que
reproduzcan con un grado aceptable de fidelidad lo que ocurre en una clula y sean capaces de predecir el
efecto metablico causado por la modificacin de la actividad de una o varias enzimas, habremos dado un
paso gigantesco en la comprensin de de la fisiologa celular y su tratamiento.

Bibliografa
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell.
Dixon, M., Webb, E.C. (1980) Enzymes New York: Academic Press.
Fell D. (1996) Understanding the Control of Metabolism. Londres: Portland Press.
Liebermeister, W., Klipp, E. (2006) Bringing Metabolic Networks to Life: Convenience Rate Law and Thermodynamic Constraints. Theor Biol Med Model. 3:41.
Qi F., Dash, R.K., Han, Y., Beard, D.A. (2009) Generating Rate Equations for Complex Enzyme Systems by
a Computer-Assisted Systematic Method. BMC Bioinformatics. 10:238.
Segel, I. H. (1975). Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons.
Segel I.W. (1982) Clculos de Bioqumica, 2da. edicin. Zaragoza: Editorial Acribia.
Voet D., Voet J (2006) Bioqumica, 3ra. edicin. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana.

103

104

CAPTULO 6
Efectos del pH y la Temperatura
Daniela Hozbor y Anbal R. Lodeiro

Durante los primeros estudios de la catlisis enzimtica referidos en el Cap. 3 la situacin era bastante
catica y los investigadores no se ponan de acuerdo sobre lo que estaban caracterizando. Si bien la mayora de ellos trabajaban con la invertasa, los resultados eran muy poco reproducibles de un laboratorio a otro.
Justamente fueron Michaelis y Menten quienes se decidieron a sistematizar los experimentos y en ese esfuerzo se dieron cuenta de que el control del pH era fundamental. El hecho de que los otros no hayan notado este hecho se debi a que estaban acostumbrados a los experimentos de qumica general, donde el
control del pH muchas veces involucra valores muy cidos o muy alcalinos, pero difcilmente se controla el
pH en el rango de la neutralidad. De hecho, es una particularidad de la bioqumica actual que las constantes
de equilibrio y las energas libres de Gibbs se midan a pH = 7,0 y es por ello que las nombramos con un
tilde, para diferenciarlas de las ms tradicionales de la qumica. Por otro lado, los primeros investigadores
razonaban que si las enzimas actan en el entorno celular en un medio acuoso, todo lo que haba que hacer
era extraerlas en agua para no alterar las condiciones fisiolgicas. Es por esto que desconfiaban de la adicin de buffers artificiales, pero todava no tenan una nocin acabada de los efectos de diluir los buffers
naturales que existen en la clula ni tampoco valoraban la cuestin de la compartimentalizacin celular, que
se rompe al hacer la extraccin. Asimismo, haba pocas posibilidades de controlar la temperatura: los incubadores termostatizados no existan en esa poca ni tampoco haba un conocimiento acabado sobre los
fenmenos de desnaturalizacin de las protenas por calor, si bien se saba que haba cierta desestabilizacin y que la misma era revertida en parte por la presencia del sustrato.
Hoy sabemos que estas dos variables: pH y temperatura, juegan un rol fundamental en la catlisis enzimtica. Esto es as a tal punto que no puede expresarse una unidad de actividad si no se informa a qu
pH y temperatura se refiere. Estas dos variables afectan tanto a la enzima como al sustrato y tambin al
curso de la reaccin. Tienen influencia tanto en la estabilidad estructural de la enzima como en las constantes cinticas, con lo cual no solo afectan la velocidad de la reaccin sino tambin la proporcin de enzima
activa que hay en la muestra. El efecto del pH sobre el sustrato tambin determina la proporcin de sustrato
en la forma inica adecuada para unirse a la enzima. De modo que el estudio de estos factores puede ser
muy abarcativo, por lo cual encararemos aqu los conceptos fundamentales acerca de cmo estas dos variables afectan la catlisis enzimtica.

Efecto del pH Sobre la Catlisis Enzimtica

Las enzimas estn llenas de grupos ionizables: como recordars hay muchos aminocidos que pueden
ganar o perder protones en sus cadenas laterales (grupos R) y los extremos carboxilo y amino terminales
tambin se protonan y desprotonan. El estado protonado/desprotonado de la enzima, adems de afectar a
su carga neta, puede afectar las interacciones con el sustrato en el sitio activo en dos sentidos: en la unin
del sustrato o en la catlisis. Por lo tanto, el estado de ionizacin de la enzima puede tener efectos tanto en
la Vmax como en el KM. Los estados de ionizacin dependen del pKa de cada grupo, el cual es el pH al cual
el 50% de las molculas estn protonadas y el otro 50% desprotonadas para el grupo en consideracin. En
la Tabla 6.1 se muestran los valores de pKa para los grupos ionizables de las protenas. Adems, debs
recordar que las enzimas pueden contener tambin grupos prostticos que pueden tener sus propios valores de pKa. Cualquiera de estos grupos, cuando se encuentran a un pH por encima de su pKa, liberan un
protn, mientras que lo ganan cuando el pH se encuentra por debajo de su pKa. As, el pKa indica el grado
de afinidad de cada grupo por los protones, o dicho de otra manera, la tendencia de cada grupo a tomar o
+
ceder protones. Esto tambin lo podemos mirar como un equilibrio, que tender a la liberacin de H desde

105

el grupo ionizable cuando la [H ] de la solucin sea baja y por el contrario, tender a la unin de H al grupo
+
+
ionizable cuando la [H ] sea alta. Pero qu significa aqu alta o baja? Record que el pH = log10[H ] y
+
+
por lo tanto un pH = 3 significa que la [H ] es 103 M, mientras que un pH = 7 significa que la [H ] es 107 M.
+
Si un grupo ionizable dado tiene un pKa = 3, significa que a cualquier concentracin de [H ] por debajo de
3
10 M (o sea, pH > 3) se encontrar desprotonado, mientras que un grupo ionizable que tenga un pKa = 10
+
no soltar su protn a menos que la [H ] sea tan baja como 1010 M. Es decir, el primer grupo ionizable tiene
baja afinidad por los protones (los libera enseguida cuando empieza a aumentar el pH) mientras que el segundo tiene alta afinidad por los protones (no es proclive a liberarlos a menos que la concentracin en la
solucin sea muy baja). Estas tendencias han sido resaltadas con distintos colores en la Tabla 6.1.
Las curvas del estado de ionizacin de las enzimas suelen tener una forma de campana, ya que son varios los grupos con diferentes pKa presentes en su estructura. Si solo parte de esos estados de ionizacin
son catalticamente activos, ya sea porque son los nicos capaces de unir al sustrato o porque se requiere
de dicho estado para que ocurra la reaccin en el complejo [ES], la v0 a distintos pH puede asumir tambin
la forma de campana. Sin embargo, dado que el cambio en la v0 se puede deber tanto a cambios en la Vmax
como en el KM, no es correcto mirar solo la v0, sino que hace falta mirar la Vmax. Esto es as porque una dada v0 puede ser un porcentaje de la Vmax a cierto pH y otro porcentaje distinto a otro pH, de manera que no
estaremos comparando la misma cosa. Para que la comparacin del efecto del pH sobre la actividad enzimtica sea vlida es necesario comparar las Vmax que se obtienen a los distintos pH. Si no se puede disolver el sustrato a concentraciones suficientemente altas, ser necesario hacer la linealizacin para un conjunto de v0 y [S] a cada valor de pH a ser considerado.
Dado que el sustrato tambin puede asumir distintos estados de ionizacin, no todos los cuales sean aptos para la unin al sitio activo o para la reaccin, es posible que la curva de campana de la enzima se superponga con una curva de estado de ionizacin del sustrato. De la interseccin de ambas curvas surgirn
los pH a los cuales la reaccin es posible, y el porcentaje de actividad vendr dado por el porcentaje de
formas activas en el estado de ionizacin correcto de la enzima. Estas curvas se muestran en la Fig. 6.1
para una enzima con dos grupos ionizables a distintos pKa.
Estos valores son los que se obtienen en solucin, pero los mismos pueden variar en ms/menos dos
unidades segn el entorno en que se encuentren dentro de la estructura de la protena. Por ejemplo, grupos
con el mismo pKa pueden interferirse entre s para tener el mismo estado de ionizacin.
+
En algunos libros la protonacin/desprotonacin de las enzimas suele ser tratada como si el H fuera un
+
efector. De hecho, las caractersticas estructurales del H lo hacen adecuado para un tratamiento del tipo de
los inhibidores no-competitivos. Sin embargo, la situacin es diametralmente distinta, ya que los protones se
unen a varios sitios en la enzima y por lo tanto no es adecuado el tratamiento como si fueran efectores con
un nico sitio de unin. Por otra parte, prcticamente todas las enzimas van a ser afectadas por los protones, y el efecto mismo puede no ser una inhibicin o activacin total.

Tabla 6.1: Valores de pKa de los grupos ionizables de las protenas

Aminocido

Grupo Ionizable

pKa

C-terminal

Carboxilato

3,4

Aspartato

Carboxilato

4,1

Glutamato

Carboxilato

4,5

Histidina

Imidazol

6,3

N-terminal

Amonio

7,5

Cistena

Tiol

8,3

Tirosina

Fenol

9,6

Lisina

Amonio

10,4

Argninia

Guanidinio

>12

106

Proporcin de forma ionizada

0,8

0,6

0,4

0,2

10

12

pH
Fig. 6.1. Proporcin de las formas ionizadas de un sustrato
cuyo pKa = 7,0 (lnea roja) y una enzima con dos grupos ionizables, uno con pKa = 6,0 y el otro con pKa = 8,0 (lnea azul).
Suponiendo que los estados ptimos para la catlisis son el
desprotonado para el sustrato y con una carga negativa para
la enzima, la actividad enzimtica tendr lugar en el espacio
marcado por las lneas horizontales.

Efecto de la Temperatura Sobre la Catlisis Enzimtica

Al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas se incrementa con la temperatura. La variacin de la actividad enzimtica con la temperatura
es diferente de unas enzimas a otras en funcin de la barrera de energa de activacin de la reaccin catalizada. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras reacciones qumicas, en las reacciones catalizadas por enzimas el efecto de la temperatura es ms complejo porque casi todas las enzimas se desnaturalizan al ser calentadas por encima de las temperaturas fisiolgicas. Esto es, la conformacin de las enzimas
se altera usualmente de manera irreversible perdiendo la actividad cataltica. Como resultado de ambas
acciones, la dependencia de la actividad cataltica (v0) de las enzimas con la temperatura puede representarse como se muestra en la Fig 6.2

Fig 6.2. Dependencia de la actividad cataltica con la temperatura. Con la

flecha se indica la temperatura a la cual se registra el valor ms alto de
actividad enzimtica (v0)

107

La desnaturalizacin no involucra la ruptura de enlaces covalentes sino la desestabilizacin de puentes

de hidrgeno y de otras interacciones dbiles que estn involucradas en el mantenimiento de las conformaciones activas de la enzima. El proceso qumico de la desnaturalizacin es parcialmente comprendido, aqu
por cuestiones de simplicidad trabajaremos la desnaturalizacin reversible pero teniendo en cuenta que es
importante la irreversible aunque sea ms compleja probablemente catalogada as porque el conocimiento
sobre la misma es escaso.
El efecto de la desnaturalizacin sobre las constantes de velocidad puede analizarse considerando que
solo una parte de la enzima va a estar activa mientras que otra parte va a estar inactivada por el efecto de la
temperatura. As, se va a generar un equilibrio entre la activa (Eact) y la inactiva (Eina):
k1

Eact

Eina
k 1

de modo que podr considerarse una constante de equilibrio para la reaccin de desnaturali-zacin:
=

[ ]
[ ]

(6.1)

La constante de equilibrio para la desnaturalizacin vara con la temperatura de acuerdo con la ecuacin
de vant Hoff
= G = H TS

(6.2)

reordenando:
=

S H

(6.3)

Por su parte la constante especfica de velocidad (k) estara gobernada por la ecuacin de Arrhenius:

(6.4)

siendo A una constante y Ea la energa de activacin de Arrhenius.

La velocidad de la reaccin en condiciones de sustrato saturante, como hemos visto, podemos expresarla como:
=

(6.5)

pero como solo una parte de la cantidad total de enzima va a estar activa, la [E T] = [Eact] + [Eina], por lo
tanto, la ecuacin 6.5 debera expresarse como
=

(6.6)

Para poder expresar esta ecuacin en trminos de [ET], multiplicaremos y dividiremos por [ET] y reemplazaremos usando la ecuacin 6.3 para la Keq:
=

(6.7)

sacando factor comn y reordenando:

=

[ ]
[ ]
1 +

Reemplazando por el valor de Keq:

108

(6.8)

[ ]
1 +

(6.9)

La constante de velocidad observada, kobs, puede definirse como:

=

1 +

(6.10)

Reemplazando k y Keq por las expresiones de las ecuaciones 6.3 y 6.4, podemos ver que esta constante
vara con la temperatura de acuerdo con la siguiente relacin:

=
S H
1 +

(6.11)

A bajas temperaturas, cuando S`/R sea bajo comparado con H`/RT, la exponencial del denominador
se hace pequeo. En tales circunstancias, la kobs variar con la temperatura segn la ecuacin de Arrhenius:
=

1
+
2,3

(6.12)

As, la representacin de logk versus 1/T da una recta de cuya pendiente puede determinarse el valor de
Ea. En un esquema de equilibrio rpido Vmax= kp [ET] y de aqu tambin se puede calcular el valor de Ea.
Pero es importante recordar aqu que una concentracin de sustrato saturante no ser tal para todas las
temperaturas ya que KM depende de la temperatura. Para la mayora de las reacciones enzimticas Vmax
depende de varias contantes de velocidad las cuales varan de manera diferencial con la temperatura. Por
lo tanto, la Ea estimada a partir de Vmax/[ET] vs 1/T ser un valor aparente. La representacin de Arrhenius
incluso puede no ser lineal, presentando un cambio agudo en la pendiente a alguna temperatura (temperatura de transicin) y esto parece deberse al hecho de que la Vmax cambia de un proceso limitante de velocidad a otro (diferente dependencia con la temperatura de las constantes involucradas). Una cada brusca en
la representacin de Arrhenius indica desnaturalizacin de la protena.
Esto podemos analizarlo fcilmente tambin de la ecuacin 6.11. A temperaturas altas, el denominador
se incrementa y la constante especfica de velocidad decrece rpidamente a cero.
Otro parmetro que se utiliza para cuantificar el efecto de la temperatura es el coeficiente de temperatura
(Q10), que se define, para una temperatura dada, como el factor de incremento de la velocidad de reaccin
cuando la temperatura se incrementa 10 C.
=

2,31 2 10
10

(6.13)

De aqu un Q10=2 es equivalente a una Ea de 12.600 cal/mol en la regin de 25C a 35C. Ms all de
esta complejidad, los valores de Ea que llegan a determinarse con estas aproximaciones y cuidados aportan
informacin valiosa respecto de mecanismos de reaccin. As por ejemplo los autores Bender, Kzdy y Gunter (1964) realizaron estudios sobre la enzima quimotripsina en los que pudieron detectar un comportamiento especial respecto de la temperatura pudiendo evidenciar los mecanismos que se vean afectados por la
temperatura. Estos autores realizaron comparaciones con enzimas con mecanismos conocidos y eso les
llev a una clara comprensin de la qumica del proceso dependiente con la temperatura.
Ahora bien, el efecto de la temperatura depende tambin del tiempo de incubacin de la enzima a las
distintas temperaturas. Resulta fcil de comprender que la progresin de la desnaturalizacin ser ms
rpido cuanto mayor sea la temperatura. As se podr identificar una temperatura ptima para una reaccin catalizada enzimticamente que depende del tiempo del ensayo escogido. La temperatura ptima
ser entonces aquella en la que se observa el valor mximo de actividad enzimtica que se mantiene constante a lo largo de un perodo de tiempo por lo menos tan largo como el que dura el ensayo. La temperatura ptima puede establecerse realizando el ensayo de estabilidad que implica la incubacin de la enzima
sin sustrato a diferentes temperaturas durante una o dos veces el tiempo de ensayo deseado y midiendo
luego de agregar el sustrato la actividad de la enzima a la temperatura donde se haba observado el valor
ms alto de actividad (indicada con una flecha en la Fig 6.2).

109

Ensayo de Estabilidad Frente a la Temperatura

% de actividad enzimtica respecto del

valor obtenido a 25C

A modo de ejemplo en la Fig. 6.3 se presenta la grfica de la dependencia de la actividad enzimtica de

la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, una enzima que interviene de en el metabolismo de hidratos de
carbono. Dicha grfica fue obtenida preparando mezclas de reaccin (en este caso 11 mezclas de reaccin)
de igual composicin que son incubadas cada una de ellas a las temperaturas indicadas en la figura. Cada
punto de la grfica se obtiene de la evaluacin a cada temperatura de la variacin de la concentracin de
producto en funcin de tiempo (velocidad inicial y en este caso la Vmax). En este caso particular se grafic la
actividad enzimtica porcentual calculada respecto del valor de actividad enzimtica hallada a 25C.
Es importante remarcar aqu que de esta grfica no se define la temperatura ptima. De esta grfica se
puede definir la o las temperaturas a las que se detecta el valor ms alto de Vmax. Para establecer la temperatura ptima se realiz un ensayo de estabilidad que implica, como hemos mencionado, incubar las mezclas de reaccin sin sustrato a distintas temperaturas por un tiempo igual o el doble del empleado en el ensayo de actividad. Una vez finalizada la incubacin de la enzima sin sustrato a cada temperatura, a la mezcla de reaccin se le adiciona el sustrato y se incuba a la temperatura en que se detect el valor ms alto de
Vmax que en este caso podra ser cualquier temperatura entre 25C y 32C. Los resultados obtenidos al
hacer un experimento de estabilidad trmica como el descripto se muestran en la Fig 6.4. En esta figura se
puede observar que cualquiera de las temperaturas entre 25C y 32C puede tomarse como temperaturas
ptimas. Tambin se observa en la grfica que por encima de 35C la enzima se desnaturaliza y deja de ser
funcional.

Temperatura (C)

% de actividad enzimtica respecto del

valor obtenido a 25C

Fig 6.3. Dependencia de la actividad enzimtica de la gliceraldheido 3 fosfato deshidrogenasa con la temperatura

Temperatura (C)

Fig 6.4. Actividad remanente respecto de la actividad detectada a 25C luego de incubar el extracto enzimtico durante 10 minutos a cada una de las temperaturas ensayadas.

110

Problemas
Problema 1.
La fumarasa cataliza la deshidratacin reversible del malato a fumarato:
malato fumarato + H2O
La energa de activacin de la reaccin es:
Ea: 15.600 cal/mol.
o
a- Cul es el cambio de la constante de velocidad cuando se aumenta la temperatura de 25 a 35 C?
o
-4 -1
b- Sabiendo que el valor de la constante de velocidad a 25 C es k25 = 5.10 s , calcule el valor de la misma
o
a 35 C.
c- Dibuje el perfil de energas a lo largo de la coordenada de reaccin indicando a qu corresponde cada
regin de la curva.
Problema 2.
a) Se encontr que la velocidad de la reaccin de hidrlisis de las uniones -14 de almidn, catalizada por
o
la enzima alfa-amilasa, experimentaba un aumento de tres veces al pasar de 20 a 30 C. En base a estos
datos calcule la energa de activacin (Ea) de la reaccin.
b) En presencia de cido, la energa de activacin para la reaccin de hidrlisis es de 25.000 cal/mol. Con
cul de los dos catalizadores ser mayor el aumento de la velocidad inicial de reaccin para un determinado
aumento de temperatura? Por qu?
Problema 3.
Se midi la actividad de una enzima a diversos pH y se obtuvo la siguiente curva:

vo

1 2

7 pH

a) Cules seran los aminocidos involucrados en el centro activo y cul el estado de ionizacin requerido
para obtener la mxima actividad?
b) Por exposicin durante 5 minutos a pH 5,0, la enzima se inactiva en un 50%. Dibuje el grfico comparativo de las curvas [P] en funcin del tiempo, para el pH ptimo y para pH 5,0.
c) Dibuje la curva que obtendra al exponer la enzima 5 minutos a cada uno de los pH correspondientes a la
curva I y luego medir su actividad a pH 4,0.
Problema 4.
Se midi la actividad de la enzima monoaminooxidasa a diferentes pH y se obtuvieron los siguientes valores
(en unidades relativas a la actividad a pH 7,0):
pH
actividad

7,0
100

8,0
150

9,0
200

10,0
215

11,0
30

a- Grafique actividad vs pH. Cul es el pH ptimo de esta enzima?

b- Luego de preincubar la enzima durante 5 minutos a cada uno de los pH indicados, se midi su actividad a
pH 7,3 y se obtuvieron los siguientes valores:
pH de preincubacin
actividad a pH 7,3

8
120

111

9
120

10
100

11
20

b- Grafique y explique estos resultados.

Problema 6. La enzima lactato deshidrogenasa cataliza la siguiente reaccin:
COOC=O
CH3

COO+NADH + H+

HC-OH + NAD+
CH3
+

El mecanismo de reaccin implica la transferencia coordinada de un H (proveniente del residuo His 195) y
+
un H (proveniente de la coenzima NADH) al piruvato. El sustrato se une luego de la unin enzimacoenzima.
A partir de diferentes lneas experimentales se lleg a los siguientes resultados:
a- En el caso en que la protena se modific, reemplazando el residuo Arg 109 por Gln, la reactividad qumi+
ca del piruvato unido se reduce drsticamente; la velocidad de transferencia del H se reduce a menos del
0,07% con respecto a la enzima nativa. En cambio, la afinidad de unin del piruvato se reduce mucho menos (5%) y la del NADH no sufre alteracin.
b- Un residuo Asp 168 se encuentra cercano a la His 195. Su reemplazo por Ala o Asn causa una fuerte
reduccin de la velocidad de reaccin.
c- El reemplazo de un residuo Arg 171 por Lys reduce la afinidad de la enzima por el sustrato al 0,05% con
respecto a la unin con la enzima nativa. Asimismo, se modifica la especificidad de la unin E-S. Mientras la
enzima nativa tiene KM = 0,05 mM y 2,00 mM para sustratos con cadenas de uno y dos carbonos, respectivamente, el mutante Lys tiene KM de 120 y 60 mM.
d- El reemplazo de un residuo Ile 250 por Asn reduce la unin del NADH.
En base a estos resultados, prediga:
a- La localizacin posible de los residuos mencionados en la enzima nativa, en relacin con el sustrato y el
NADH.
b- Cul sera su funcin en la catlisis.

Bibliografa
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell.
Dixon, M., Webb, E.C. (1980) Enzymes New York: Academic Press.
Fell D. (1996) Understanding the Control of Metabolism. Londres: Portland Press.
Segel, I. H. (1975). Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons.
Segel I.W. (1982) Clculos de Bioqumica, 2da. edicin. Zaragoza: Editorial Acribia.
Voet D., Voet J (2006) Bioqumica, 3ra. edicin. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana.

112

CAPTULO 7
Alosterismo y cooperativismo
Gustavo Parisi

Without an adequate technological advance the pathway of

progress is blocked, and without an adequate guiding vision there
is no pathway, there is no way ahead.
CARL W OESE, IN A NEW BIOLOGY FOR A NEW CENTURY, 2004

Introduccin
Comencemos por el final: el cooperativismo y el alosterismo son propiedades generales de las protenas. No todas las protenas son cooperativas pero la gran mayora son alostricas. Clsicamente en Bioqumica es un tema que se lo asocia a enzimas, pero por un lado histricamente el cooperativismo se descubri en una protena que no es una enzima: la hemoglobina y por otro en los ltimos aos se ha encontrado que la gran mayora de las protenas seran alostricas. De esta forma un protena transportadora, un
receptor hormonal o una protena estructural pueden o no presentar cooperativismo y/o alosterismo.
Adems, una protena puede ser slo cooperativa, slo alostrica o tener ambas propiedades juntas. De
aqu en ms hablaremos indistintamente de protena o enzima.
Definimos cooperativismo como la capacidad que tiene una protena de cambiar sus constantes de
unin para un determinado ligando, en funcin de la concentracin de ese ligando. Definimos alosterismo como la capacidad que tiene una protena de cambiar sus constantes de unin para un determinado
ligando, en funcin de la concentracin de otro ligando. La evidencia experimental ms comn de la existencia de cooperativismo es el alejamiento del comportamiento micaeliano cuando graficamos v0 vs. [s] o
v0/Vmax como en la Figura 7.1

1,2

vo/Vmax

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

[s]
Michaelis-Menten

No-micaelinana

Fig. 7.1. Comparacin de cintica micaelina y no micaeliana. Notese que en el

eje Y se representa v0/Vmax.

113

El comportamiento sigmoidal, en contraposicin a la hiprbola cuadrtica tpica de enzimas y protenas

micaelinas, constituye una fuerte evidencia de la presencia de cooperativismo. El hecho de graficar
v0/Vmax es muy conveniente para darnos cuenta que este tipo de grficos se pueden hacer tanto para enzimas como para protenas que unan un determinado tipo de ligando. Utilizando la ecuacin de MichaelisMenten podemos ver que

0
[]
=
+ []
reemplazando v0 y Vmax tenemos:

0
[]
[] []
=
=
=
=
+ [] [] []
Donde representa el porcentaje de la enzima asociado a una determinada concentracin de sustrato.
Cuando la enzima est saturada =1 como ocurre cuando vemos en la figura 7.1 el grfico a altas concentraciones de sustrato. Si la protena no es una enzima, como la hemoglobina, la podremos estudiar de la
misma forma que estudiamos a las enzimas pero ahora viendo cmo vara vs. PO2.
Cual es la evidencia experimental ms comn para el alosterismo? La protena con el comportamiento
no-micaeliano de la figura 7.1 (lnea roja) podra ser alostrica, pero por las variables que estoy graficando
vs [s] no lo estoy poniendo de manifiesto. Repasemos las definiciones dadas ms arriba, cooperativismo, capacidad que tiene una enzima de modificar sus constantes de unin para un ligando en funcin de la
concentracin de ese ligando, mientras que el alosterismo es la capacidad que tiene una protena de cambiar sus constantes de unin para un ligando en funcin de la concentracin de otro ligando, distinto al primero. Ahora en la figura 7.1 no se menciona explcitamente ningn otro ligando que no fuera s, el sustrato.
As que para comprobar si la protena tiene comportamiento alostrico debera repetir el ensayo sumando
otra variable, la concentracin de otro ligando.

1,2

v0/Vmax

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

0,5

1,5

[s]
Con agregado de otro ligando

control

Fig. 7.2. Al agregar un modulador en la mezcla control (curva roja) vemos que
esta se desplaza hacia arriba. Este modulador veremos ms adelante que es
un modulador alostrico positivo. El cambio de la curva roja a la azul cuando se
lo compara a una determinada concentracin de sustrato indica la presencia de
alosterismo.

114

Segn la figura 7.2, la lnea azul es distinta a la lnea control (que corresponde al agregado solamente de
sustrato), la diferencia entonces resulta del agregado de otro ligando al sistema. La diferencia entre ambas
curvas (a una determinada concentracin de sustrato) pone de manifiesto la presencia de alosterismo.
Las curvas sigmoidales implican que la unin de ligando se hace cada vez ms fcil al aumentar la concentracin de ese ligando. De ah que una condicin necesaria para que exista cooperativismo es que la protena tenga al menos dos sitios de unin al ligando. Sin embargo, esta condicin no es suficiente, ya que para
que exista cooperativismo los sitios tienen que influenciarse uno con otro para facilitar la unin del ligando.
Obviamente existen protenas con la propiedad inversa, en vez de favorecer la unin de ligando, la desfavorecen. De ah que el cooperativismo puede dividirse en positivo (favorecen la unin de ligando) y negativo
(desfavorecen la unin de ligando).
Ahora que ya tenemos algunos conceptos iniciales, veamos brevemente la historia de estas propiedades. Una de las primeras evidencias del cooperativismo fue obtenida estudiando la hemoglobina y su curva
de saturacin en oxgeno. La misma fue estudiada en 1904 por Christian Harald Lauritz Peter Emil Bohr
(padre de Niels Bohr, fsico atmico a quien debemos uno de los primeros modelos atmicos). Bohr estudi
tanto el comportamiento de la hemoglobina en funcin de la concentracin de oxgeno, as como tambin
cmo variaba este comportamiento en funcin de otros ligandos como la concentracin de protones (pH) y
CO2. Cuando en 1913 Michaelis-Menten formularon las bases matemticas del comportamiento cintico de
las enzimas, las enzimas que posteriormente se estudiaron y se apartaban de este comportamiento micaeliano, dando curvas no-micaelianas o sigmoidales, eran tomadas como errores o artefactos. Para comprender esta actitud, debemos recordar que a principios de siglo XX era bastante difcil trabajar con protenas y enzimas en el laboratorio. El xito de Michaelis-Menten en obtener un formalismo para explicar la
cintica enzimtica, no slo se debi a su pericia matemtica sino tambin experimental. MichaelisMenten se encuentran entre los primeros investigadores que pudieron mantener constante el pH para mantener la estabilidad de la enzima durante el ensayo cintico y obtener datos coherentes sin artefactos producidos por desnaturalizaciones de la enzima. Es importante destacar que la obtencin de curvas sigmoidales bien se podra deber a la desestabilizacin de la enzima (por distintos efectos, pH, temperatura, etc) o
efectos relacionados con el sustrato. Por ejemplo, como usualmente la unin de sustrato implica un factor
de estabilizacin adicional, en el transcurso de un experimento cintico al variar la [s], la enzima inicialmente
desestabilizada podra ir ganando estabilidad con el aumento de la [s] con lo que dara una cintica posiblemente no-micaeliana o sigmoidal. Adems, como al comienzo del siglo XX todava no estaban caracterizadas las rutas metablicas y en varios casos no se conocan los sustratos naturales de las enzimas, varias
veces ocurran desviaciones de la cintica micaeliana por no tener bien caracterizado al sustrato. Por ejemplo, en el caso de enzimas que utilizan ATP, el verdadero sustrato de la enzima es el ATP complejado con
magnesio, de ah que la falta de control de la presencia del in podra introducir desviaciones en la cintica.
Fueron necesarios varios aos, concretamente hasta casi comienzos de la dcada del 60, para que se alcanzara una maduracin conceptual del comportamiento sigmoidal en protenas, pero esta maduracin fue
necesariamente acompaada de una notable mejora en las tcnicas analticas para la caracterizacin qumica (pensemos que para estimar velocidades iniciales es necesario detectar pequeas variaciones de producto o sustrato o como mencionamos anteriormente lograr la estabilidad del sustrato y de la enzima). Fue
as, que ms de 40 aos despus de su descubrimiento se desarrollaron modelos matemticos para explicar el cooperativismo y el alosterismo.

Modelos matemticos para explicar el cooperativismo

Modelo de Hill y Adair
La primera descripcin matemtica para explicar una curva sigmoidea fue descrita por Archibal Hill en
1910. Hill quera expresar matemticamente las distintas curvas de saturacin que presentaba la
hemoglobina en soluciones con distintas concentraciones salinas. En esa poca, no se conoca bien el
peso molecular de la hemoglobina, as que se tenan curvas para lo que hoy sabemos eran las formas monomricas, dimricas, etc. Considerando que la hemoglobina poda unir, una, dos, tres o cuatro molculas
de oxgeno en un solo paso Hill llego a la siguiente ecuacin:

=
=
+

115

Donde otra vez encontramos a como el porcentaje de saturacin de la enzima y Ks es la constante aparente de disociacin (es aparente ya que la enzima tiene varios sitios de unin). En esta ecuacin n representa el coeficiente de Hill. La ecuacin de Hill tiene una suposicin muy fuerte, casi irreal en considerar
que los ligandos de una enzima o protena (suponiendo la hemoglobina con cuatro sitios de unin) se
unen al mismo tiempo a la molcula (sera algo muy poco probable que 5 molculas interaccionaran todas al mismo tiempo). Si bien el n en la ecuacin de Hill representa el nmero de molculas que se unen a
la enzima, en la prctica este n nunca alcanza ese valor terico. De ah que en la ecuacin de Hill el n se lo
denomine coeficiente de Hill y no nmero de sitios de unin de la enzima. Por ejemplo, la estimacin
del n para la hemoglobina oscila entre 2.7 y 3.2, lo que tendra que dar un valor de 4 si el modelo fuera correcto.
A pesar de esta fuerte consideracin poco realista, la ecuacin de Hill es enormemente simple y muy
utilizada para realizar una primera caracterizacin de una protena posiblemente cooperativa.
Una forma til de utilizar la ecuacin es en su forma lineal

log = log
()
De donde podemos estimar fcilmente n. Este coeficiente adems de darnos informacin sobre el nmero
aproximado de sitios, tambin nos da informacin sobre el tipo de cooperatividad. Si n>1 tenemos cooperatividad positiva en cambio si n<1 tenemos cooperatividad negativa y finalmente si n=1, la ecuacin de Hill se
reduce a un comportamiento micaeliano, o sea no hay cooperatividad.
Hacia 1925 Gilbert Adair estim correctamente el peso molecular de la hemoglobina y confirm
que posea 4 sitios de unin poniendo de manifiesto las desviaciones derivadas de la ecuacin de
Hill. Adair comprendi entonces que la hemoglobina completamente saturada se formaba en etapas uniendo secuencialmente las cuatro molculas de oxgeno y no en un solo paso como sugera Hill. Estim as las
cuatro constantes de unin (una para cada paso) encontrando una ecuacin que ajustaba correctamente la
curva de saturacin de la hemoglobina. Sin embargo, no propuso un mecanismo para explicar la cooperatividad.
Linus Pauling hacia 1935 fue quien propuso el primer modelo mecanstico para explicar la cooperatividad. Este reinterpret la ecuacin de Adair suponiendo que las distintas constantes de unin de la hemoglobina se podan interpretar en trminos de interacciones entre las subunidades de la hemoglobina. Sin
embargo, las ecuaciones derivadas por l se basaron en presunciones falsas sobre la organizacin estructural de la hemoglobina. Deberamos esperar hasta la dcada del 60 para que dos nuevas teoras pudieran
explicar en trminos mecansticos (bioqumicos podramos decir) no slo la cooperatividad, sino una nueva
propiedad de las protenas: el alosterismo.

Contexto histrico de los nuevos modelos

Numerosos estudios en la dcada del 50 pareceran confirmar que dos enzimas, la aspartato transcarbamilasa y la treonina deaminasa, se apartaban de la cintica micaeliana. Los estudios en estas enzimas
formaban parte de numerosos esfuerzos para comprender el control metablico en microorganismos. En
1956, Umbarger estaba estudiando la posible existencia de lo que se llama en ingls negative-feedback o
control negativo por retroalimentacin. En una publicacin clave publicada en la prestigiosa revista Science,
mostr el efecto inhibitorio de la isoleucina sobre la enzima treonina deaminasa, primer paso en la sntesis
de isoleucina a partir de la treonina. Pero adems demostr que la cintica de la enzima no era micaeliana
aunque tomando los recaudos necesarios para suavizar la posibilidad que sus resultados fueran errneos
ya que contrariaban la bien establecida cintica micaeliana (Further experiments are in progress in an
effort to decide whether this peculiar kinetic hehavior is apparent or real, o algo as como Se estn llevando
a cabo experimentos adicionales para decidir si esta cintica tan particular es aparente o real). Posteriormente Jean-Pierre Changeux se top con los mismos problemas al encontrar que la enzima tena una cintica compleja y que no sigue la simple cintica de Michaelis-Menten. Pero la contribucin ms importante
de Changeux fue demostrar que el sitio de unin del sustrato (treonina) permaneca funcional despus del agregado de ciertas sustancias desnaturalizantes, pero significativamente, la enzima no se
inactivaba en presencia de isoleucina. Resultados similares se encontraron por esos aos para la enzima
aspartato transcarbamilasa, donde el CTP inhibe a la enzima, otra vez unindose a un sito distinto al del
sustrato. Estos experimentos condujeron a Jaques Monod y a Francoise Jacob en 1961 a postular la idea

116

del alosterismo, la capacidad que tiene una enzima de modular la unin de un determinado ligando en
funcin de otro ligando (de ahora en ms lo llamaremos modulador alostrico) que se une en un sitio
distinto al sitio activo de la enzima (sitio alostrico).
La importancia del descubrimiento del alosterismo produjo un cambio conceptual sobre el comportamiento sigmoidal que presentaban estas enzimas forzando de alguna forma al re-descubrimiento del cooperativismo (ya que el fenmeno se conoca desde los tempranos estudios de la hemoglobina hacia 1904 por C.
Bohr). Fue as, que la necesidad de comprender el control del flujo metablico en la dcada del 50
deriv en la conceptualizacin de dos propiedades fundamentales de las protenas para regular el
metabolismo: el cooperativismo y el alosterismo.

Modelo de Monod
Como vimos en el captulo 2, hacia fines de la dcada del 50 Daniel Koshland desafi el clsico modelo
de llave-cerradura propuesto por Emile Fischer en 1894. Un nuevo paradigma surga para explicar cmo
funcionan las protenas: la flexibilidad o dinmica de la protena. Koshland propuso que una protena
exista en una forma nica, sin embargo, esta forma o conformacin sufra un cambio conformacional en
presencia del ligando para lograr una mejor especificidad sobre el mismo. Como era el ligando el que produca el cambio conformacional, Koshland denomin a su modelo ajuste-inducido (ajuste de la conformacin de la enzima inducido por el sustrato). La existencia de cambios conformacionales en presencia o
ausencia de ligando, comenz a visualizarse con la cristalizacin de la hemoglobina en sus dos conformaciones, desoxigenada y oxigenada, respectivamente T y R segn Max Perutz. La idea del alosterismo y
cooperativismo recientemente emergidas hacia 1961 como comentamos arriba, sumada a la cristalografa
de la hemoglobina llevaron a Monod, Wyman y Changeux en 1965 a formular el modelo de pre-equilibrio
para explicar ambas propiedades.
El modelo de Monod entonces se basa bsicamente en que la protena se encuentra en solucin representada por distintos confrmeros, bsicamente dos, T y R. Indicaremos T0 y R0 usando el subndice para
indicar el nmero de ligandos unidos a cada forma. Estos confrmeros T0 y R0 se encuentran en equilibrio
representado por la constante L=T0/R0 >1, de esta forma en el equilibrio prevalece el confrmero T. Vimos
que este equilibrio pre-existe al agregado del ligando de ah que al modelo se lo conozca tambin como de
pre-equilibrio.
R
T
Los confrmeros T y R poseen distintas constantes de afinidad al sustrato (K d y Kd ) cuya relacin define la constante c:

Si c=1 las dos constantes de afinidad (expresada como constantes de disociacin) sern iguales.
Usualmente en el modelo c<1 indicando que el confrmero R tiene mayor afinidad que el confrmero T.
Dicha constante tambin nos dice el sentido del desplazamiento del equilibrio T y R al agregar sustrato. Si c
es pequea y menor que 1, el equilibrio se desplazar hacia la forma R ya que el sustrato se unir preferentemente a la forma R. Es importante destacar que el modelo original de Monod se propona slo para protenas oligomricas, ya que en ese momento eran las nicas protenas con ms de un sitio de unin a sustrato que se conocan. Segn el modelo original una protena oligomrica (pensemos en la hemoglobina con
R
T
cuatro subunidades) tendra la misma constante de afinidad (Kd o Kd ) para cada uno de sus sitios en el
respectivo confrmero R o T. Expresado de otra forma, todos los sitios de unin al sustrato en la forma R
tienen idntica constante de afinidad, y lo mismo ocurre en el confrmero T. La consideracin que las protenas cooperativas o alostricas fueran oligomricas en la actualidad se ha relajado ya que se conocen
muchas protenas cooperativas y/o alostricas que son monomricas. Slo recordemos que la condicin
necesaria para que exista cooperativisimo es que la protena tenga al menos dos sitios de unin al sustrato
y que ambos sean modificables entre s. Como vimos, junto con la definicin de alosterismo, la condicin
necesaria para que exista tal propiedad es que exista en la protena al menos un sitio alostrico (aquel que
unir como definimos ms arriba un modulador alostrico).
Como en otros modelos vistos anteriormente, el modelo de Monod nos da una expresin para (el porcentaje de saturacin) que es una funcin de la concentracin de sustrato, del nmero de sitios de unin de
ligandos, de la constante c y la constante L. Esta funcin ajusta las curvas sigmoideas observadas en las
protenas cooperativas.
Cual es el fundamento del cooperativismo en el modelo de Monod? Supongamos como ejemplo una protena con dos sitios de unin. Sabemos que la constante c<1 o sea el confrmero R tiene mayor afinidad por
el sustrato que T y sabemos adems que los dos sitios de unin al sustrato tienen la misma constante de

117

afinidad en el confrmero T (Kd ) y en el confrmero R (Kd ). El sistema inicialmente se encuentra en equilibrio, definido por la constante L=R0/T0. Al agregar sustrato, este seleccionar (se unir preferencialmente)
al confrmero con mayor afinidad (R ) comenzando a saturar sus sitios de unin en funcin de la concentracin de sustrato. Pero lo mismo ocurrir con el confrmero T, aunque en menor escala ya que su constante
de afinidad es mucho menor. Vemos entonces que, en funcin de la concentracin de sustrato, la poblaT
cin de sitios con constante de afinidad Kd (mayoritarios en ausencia de sustrato ya que vimos que L <<1)
va a ir disminuyendo al ir aumentando la concentracin de sustrato, enriquecindose en sitios con constante
R
de afinidad Kd . A medida que aumentamos la concentracin de sustrato, la poblacin de confrmeros R se
R
va enriqueciendo y con estos aumenta la proporcin de sitios Kd (figura 7.3).

R/T=0.85

R/T=0.6
R/T=0.3

Fig. 7.3. Segn el modelo de Monod podemos explicar el cooperativismo de

una enzima como el desplazamiento del equilibrio conformacional hacia el
confrmero con mayor actividad (R ) en este caso en funcin de la concentracin de sustrato. Para distintas concentraciones de sustrato, mostramos como
vara la relacin R/T llegando a invertirse a concentraciones saturantes de sustrato cuando se la compara con concentraciones bajas de sustrato.

Responde esta propuesta a nuestra definicin de cooperatividad mencionada al comienzo del captulo?
Repasemos: cooperatividad es la capacidad que tiene una protena de cambiar sus constantes de unin
para un determinado ligando, en funcin de la concentracin de ese ligando. El punto clave en el modelo
de Monod es comprender que las constantes no cambian (en el sentido que un confrmero (R o T) no
cambia estructuralmente su constante) sino que lo que cambia es la distribucin de los confrmeros
que tienen asociadas determinadas constantes de afinidad.
Por qu una enzima con un solo sitio no es cooperativa segn el modelo de Monod? En realidad,
podramos pensar que, si tengo dos constantes de unin, una para el confrmero T y otra para el confrmero R, pensara entonces que el sistema podra ser cooperativo. El punto clave es que el cambio de afinidad (en el caso de cooperatividad positiva) debera mejorar en funcin de la concentracin de sustrato.
Al agregar sustrato a una determinada concentracin, podramos decir que el mismo se une preferencialR
mente a la forma R (ya que tiene una menor Kd ). La unin del primer ligando podramos decir que paga
un costo energtico al convertir T0 a R0 y de ah pasar de R0 a R1 y desplazar el equilibrio conformacional.
Ahora si agrego ms sustrato y si la protena tiene un solo sitio de unin, se tendr que pagar el mismo
costo energtico para repetir el ciclo. En cambio, si la protena tuviera dos sitios de unin, el pago de convertir T0 a R0 lo realiza de alguna forma la unin de la primera molcula para formar R1. Pero a este
confrmero le queda libre un sitio en R1 de ah que la segunda molcula de sustrato se une a R1 en forma
ms fcil (sin volver a pagar el costo del cambio conformacional) para obtener R2. Si la unin de una segunda molcula de sustrato se une con mayor facilidad que la primera se corresponde entonces con
la definicin de cooperatividad positiva.
Finalmente, el modelo de Monod se llama tambin de simetra, ya que por las consideraciones del moT
delo todos los sitios del confrmero T tienen la misma constante de afinidad K d y todos los sitios del
R
confrmero R tienen la misma constante de afinidad Kd . Estas constantes son estado (confrmero) especficas y no se alteran si pasamos por ejemplo de R0 a R1 a R2. Esta propiedad de simetra es una de las
principales diferencias que veremos con el prximo modelo de cooperatividad, el modelo de Koshland.

118

Cmo explica el modelo de Monod el alosterismo? Vimos anteriormente que los moduladores alostricos
se unan a otros sitios, distintos de los sitios de unin al sustrato. Estos moduladores podra favorecer la
actividad de la enzima o disminuirla, de ah que se llamen moduladores positivos o negativos. La forma que
tiene un modulador alostrico positivo de activar a la enzima es simplemente unirse a la forma R y desplazar
el equilibrio conformacional activando a la enzima. Esto es, si este experimento se llev a cabo a una determinada concentracin de sustrato (ver figura 7.2) y luego en la misma forma, pero con el agregado del
modulador, esperamos que, para la misma concentracin de sustrato, el modulador desplace an ms el
equilibrio obteniendo de esta forma una mayor proporcin del confrmero R. De ah que, para esa dada
concentracin de sustrato, la protena muestre mayor actividad. De la misma forma, un modulador alostrico
negativo tendr mayor afinidad de unin por la forma T de la enzima, ya que al unirse desplazar el equilibrio hacia la forma inactiva de la enzima.
En forma general, podemos decir que los moduladores alostricos son molculas orgnicas que simplemente estabilizan diferencialmente a un confrmero en detrimento de otro. Muchos remedios actan como
moduladores alostricos negativos. Varios de ellos podrn parecerse a sustancias naturales que actan
modulando la actividad natural de la enzima. Sin embargo, muchos pueden ser artificiales, incluso unirse
a sitios alostricos nuevos, ya que la enzima no evolucion para unir ese tipo de moduladores. La bsqueda de sitios alostricos nuevos, o sitios por los cuales al unirse una sustancia a la enzima se desplaza el
equilibrio en algn sentido, es uno de los objetivos centrales del diseo de nuevos frmacos y reguladores
metablicos.

Modelo de Koshland
Daniel Koshland propuso un modelo en 1966 para explicar el cooperativismo y alosterismo basado en su
modelo de ajuste-inducido de 1958. Recordemos que dicho modelo propona la existencia de una sola estructura como representacin de la estructura nativa de la protena, pero que en presencia de ligando se
podra modificar conformacionalmente para aumentar su especificidad por el sustrato. Suponiendo nuevamente una protena oligomrica donde cada subunidad contiene un sitio de unin al ligando, esta unin
induce un cambio conformacional en esa subunidad que altera la afinidad de las subunidades vacas
restantes. Este cambio conformacional se propaga a las otras subunidades por la modificacin de las interfaces entre las subunidades. De esta forma la cooperatividad en el modelo de Koshland est dada principalmente por la intensidad del cambio conformacional y cmo este se propague al resto de las subunidades vacas. El modelo de Koshland se denomina secuencial, ya que cada subunidad puede sufrir el
cambio conformacional en forma independiente del resto, dando lugar a estructuras intermediarias donde
algunas subunidades cambiaron conformacionalmente y otras no. Esta es una de las principales diferencias
con el modelo de Monod.

Evidencias experimentales en favor de los modelos

Tanto el modelo de Koshland como el de Monod ajustan correctamente las curvas sigmoidales de la
gran mayora de las enzimas y protenas cooperativas y/o alostricas. Desde este punto de vista, tratar
de interpretar los datos experimentales de saturacin y/o velocidades en funcin de la concentracin de
sustrato no nos permite en general favorecer a un modelo sobre otro. La validacin experimental de cada
modelo se demor por dcadas hasta que el avance tecnolgico comenz a aportar pruebas experimentales sobre cul de los modelos representaba mejor el mecanismo cooperativo o alostrico de las protenas.
Numerosas evidencias experimentales obtenidas en los ltimos aos dan amplio soporte al modelo de
Monod sobre el modelo de Koshland, aunque en los ltimos aos se han publicado modelos que funcionaran como una mezcla de los dos modelos arquetpicos.
La evidencia experimental crucial para determinar si una dada protena funciona siguiendo el modelo de
Monod o el de Koshland consistira en determinar la presencia del pre-equilibrio de los confrmeros T y
R (resultado que dara soporte al modelo de Monod) o determinar la presencia de los intermediarios
conformacionales a medida que se va induciendo los cambios con la unin del sustrato (resultado
que dara soporte al modelo de Koshland). Entre todos los experimentos realizados, mayormente tcnicas
de difraccin de rayos X, NMR y otras tcnicas para detectar la presencia de distintos confrmeros, hemos
seleccionado uno de los experimentos concluyentes que dan soporte al modelo de Monod sobre el modelo
de Koshland utilizando la enzima aspartato transcarbomilasa (AT). La AT es una enzima hexamrica. Contiene 6 unidades catalticas y 6 unidades regulatorias que contienen al sitio alostrico. En un experimento
llevado a cabo por el grupo del Dr. Kantrowitz en 2001, se obtuvo una AT quimrica. El grupo de investigacin obtuvo una mutante de AT incapaz de unir el sustrato (la mutacin bajaba la afinidad de la enzima por
su sustrato unas 1005 veces). Los investigadores estudiaron que dicha mutacin no afectara la dinmica ni

119

la estructura de tal forma que la AT mutante fuera lo ms parecida posible a la AT salvaje, salvo en su capacidad de unir el sustrato. Para eso usaron tcnicas bioqumicas (estimacin de kcat, Km e incluso la estructura cristalogrfica de la AT mutante). Con esta AT mutante, construyeron entonces una enzima quimrica compuesta de 5 subunidades AT mutante y 1 AT salvaje (figura 7.4).

AT salvaje
quimera
(slo se muestran subunidades catalticas)
Fig. 7.3. Representacin esquemtica de las 6 subunidades catalticas de la AT
salvaje (crculos vacios) y subunidades mutadas (crculos rayados). La quimera
que utilizaron en el ensayo consiste de 5 subunidades catalticas mutadas y
una salvaje. Esta ltima es la nica que une sustrato en la quimera. Las subunidades regulatorias, si bien presentes en los ensayos bioqumicos, se han
removido de los grficos por comodidad.

Los investigadores entonces agregaron sustrato a dicha AT quimrica y cristalizaron la protena para ver
los posibles cambios conformacionales. Por un lado, si la AT salvaje funcionara segn el modelo de Koshland, los investigadores esperaran obtener 5 subunidades sin cambio conformacional y una sola subunidad
(la salvaje, la nica que podra unir el sustrato) con los cambios conformacionales productos del efecto inducido por la unin del sustrato. Ya vimos en el captulo 2 que los confrmeros son estructuras alternativas
de una misma protena, as que dichos cambios conformacionales (en este caso inducidos por el sustrato)
seran detectables por cristalografa de rayos X. Pero por otro lado, si la AT salvaje funcionara siguiendo el
modelo de Monod, los investigadores esperaran obtener que las 6 subunidades catalticas cambiaron su
conformacin, debido a que el sustrato se uni a la nica subunidad capaz de unir sustrato en la quimera, y
con slo esta unin el equilibrio conformacional se desplazara hacia el confrmero R de la AT. En la figura
7.4 representamos estas dos hiptesis.

Fig. 7.4 Hiptesis alternativas para explicar los posibles resultados de incubar la AT quimrica en presencia de sustrato y cocristalizar el sistema para obtener su estructura cristalina. En el panel superior, se presenta el pre-equilibrio de la AT quimrica si
esta siguiera el modelo de Monod. Los crculos rayados y vacios indican las subunidades catalticas mutadas y salvajes respectivamente en el confrmero T. Por el contrario, los cuadrados representan las conformaciones (salvajes y mutadas) en el confrmero
R. En el panel inferior de la figura encontramos el mismo estado inicial, pero si el sistema siguiera el modelo de Koshland la nica
subunidad que sufrira un cambio conformacional sera la subunidad salvaje.

120

El resultado del experimento fue contundente. La estructura cristalina encontrada representaba a la forma R de la AT, esto es todas las subunidades de la AT quimrica se encontraban en su forma R (ver figura
7.4 panel superior). La interpretacin de este resultado fue entonces que el sustrato solamente desplaz el
equilibrio al unirse a la forma R y no indujo un cambio conformacional en la nica subunidad a la que se
uni (la subunidad salvaje). En la figura 7.5 mostramos una superposicin estructural de los confrmeros T y
R de la AT salvaje. Se pueden observar los cambios estructurales entre ambos confrmeros. Dependiendo
si la cristalizacin se realiz en presencia o ausencia de sustrato (o algn anlogo) se puede inferir si se
trata del confrmero R o T.
El experimento que elegimos mostrar es uno entre varios experimentos que soportan la idea que las protenas funcionan mayormente siguiendo el modelo de Monod.

Fig. 7.5 Confrmeros R (verde) y T (celeste) de la AT. La molcula orgnica en

el centro de la imagen es un anlogo del sustrato.

Problemas
1.

Para la ATCasa del ejercicio anterior se realizaron distintos estudios cinticos con supuestos activadores o inhibidores. Los resultados de dichos estudios se muestran en la tabla:
Enz con caSustrato

lent

aspartato

Enz
Enz nat

lent

Enz

mM

caEnz

0.1mM

nativa

4' a 60C

ATP

0.1mM CTP CTP

2mM

0.15

0.4

0.025

0.4

0.4

0.25

0.6

0.1

0.6

0.55

2.5

0.3

0.85

0.125

0.85

0.9

0.7

1.2

0.35

1.3

1.35

1.1

1.4

0.5

1.4

1.4

7.5

1.7

1.95

1.03

10

2.2

2.4

1.6

2.4

2.4

15

2.95

2.5

2.95

20

3.05

3.1

2.9

3.1

3.1

La actividad de la enzima se midi en micromoles de fosfato producido por hora.

121

En base a estos datos

a. Obtenga un grfico de la actividad en funcin de [S].
b. Cual es el efecto del CTP y del ATP?
c. Cual es el efecto del calentamiento sobre la cintica de la enzima? Para que se realiza este calentamiento?
2.

La glucokinasa (GK) es una enzima citoplasmtica que cataliza la fosforilacin de la glucosa. La GK

que se expresa en pncreas e hgado se cree que interviene en la regulacin de los niveles de glucosa
sangunea. Se ha descrito que ciertos tipos de diabetes (personas que tienen una capacidad nula o ineficiente de manejar los niveles de glucosa sangunea) podran verse beneficiados por la presencia de
efectores artificiales de la GK en sangre. Recientemente se ensayaron distintas concentraciones de uno
de esos efectores con el siguiente resultado:

a.
b.

Cual es el efecto de la accin del efector sobre la GK?

Explique las consecuencias cinticas del efector usando el modelo de Monod.

Bibliografia.
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell.
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Crdenas, M. (2013) Michaelis and Menten and the long road to the Discovery of cooperativity. Febs Letters.
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122

CAPTULO 8
Anlisis del Control Metablico
Augusto A. Melgarejo

En este captulo introduciremos algunas ideas bsicas que consideramos centrales en referencia al estudio de problemas desde una perspectiva Sistmica y Macroscpica. En el contexto de este marco terico
discutiremos en qu mediada el estudio de los problemas fuera del equilibrio en sus diferentes estructuras
deben ser pensadas desde un enfoque sistmico. En este sentido presentaremos aspectos generales sobre
la Termodinmica del equilibrio as como fuera del equilibrio y el concepto de estado estacionario. Por ltimo
presentaremos las ideas centrales de la Teora del Control Metablico as como algunas observaciones de
las limitaciones de este enfoque.

Qu Entendemos por una Descripcin Sistmica?

Los sistemas, en tanto totalidades organizadas, tienen dos caractersticas fundamentales:
Las propiedades del sistema, en un momento dado, no resultan de la simple adicin de las propiedades de los componentes. La vulnerabilidad o resiliencia, as como las condiciones de estabilidad, son propiedades estructurales del sistema en su conjunto.
La evolucin del sistema responde a una dinmica que difiere de las dinmicas propias de los
componentes. As, por ejemplo, el sistema total integra, en su evolucin, procesos de escala
temporales que varan considerablemente entre los subsistemas, e ndice cambios en estos ltimos.
Est claro que, aun cuando hablemos de esos sistemas como totalidades, ello no indica que tengan
lmites precisos, puesto que estn inmersos en una variedad de contextos que se van insertando en dominios cada vez ms amplios.

Intercambios con el Entorno y Entropa

En general este concepto est rodeado de un microclima especial y es central para la construccin de un
enfoque sistmico. Es probable que este microclima se origine en que, en las presentaciones clsicas, se
realizan una combinacin poco feliz de dos puntos de vista esencialmente distintos: el termodinmico propiamente dicho, y el mecnico estadstico. Este ltimo presupone de un modelo microscpico a partir del
cual encuentra las funciones termodinmicas tales como la Entropa. Uno de los elementos importantes que
aparece es que la Entropa definida en este marco, slo coincide con la termodinmica para los estados de
equilibrio. Lo que buscamos poner en evidencia es que las propiedades y el formalismo de las funciones
termodinmicas no dependen de la visin microscpica que se haga de los sistemas (modelo microscpico),
sino por el contrario, todo modelo mecnico estadstico debe satisfacer estas propiedades. Esto ltimo hace
que la termodinmica sea una herramienta de trabajo tan poderosa y til al momento de estudiar un sistema
del que conocemos pocas cosas.
Una idea fundante en la Termodinmica es el concepto de estado. En este sentido, vamos a hacer una
observacin acerca de los tipos de variables termodinmicas. Estas variables se clasifican en extensivas e
intensivas y, debido a que existe en la literatura una discusin bastante detallada sobre ellas, slo diremos
que lo que caracteriza a las variables extensivas es que en un sistema compuesto la variable extensiva del

123

sistema no es ms que la suma de la correspondiente variable extensiva de los subsistemas. Esta caracterstica no la presentan las intensivas. Esta clasificacin tiene por objetivo construir un formalismo donde el
estado de equilibrio quede definido slo por variables extensivas y no por intensivas, debido a que un formalismo basado en estas ltimas puede conducirnos a algunas contradicciones. Por ejemplo, si hacemos uso
de la idea intuitiva de equilibrio trmico, podemos dar una buena descripcin de estas posibles contradicciones. Es bien sabido que si tenemos dos sistemas en equilibrio termodinmico entre s, sus temperaturas son
iguales. Pero ocurre tambin que existen algunos sistemas vivos, que pueden encontrarse en equilibrio
trmico con el medio, pero de ninguna forma se encuentran en equilibrio termodinmico.

Entropa en el Primer Principio

Para introducir el Primer Principio de la Termodinmica, supondremos la existencia de una funcin de
estado macroscpica continua, a la que llamaremos energa interna del sistema U . Esta funcin puede
variar cuando el sistema interaccin con otro (por ejemplo, un sistema en contacto con su medio ambiente).
Para que la energa interna de un sistema vare, es evidente que debe recibir o entregar energa del entorno. Esto puede ocurrir por dos mecanismos posibles: intercambio de energa por medio de trabajo ( W ) o
por intercambio de energa por medio de calor ( Q ). Es conveniente notar que todava no hemos especificado el tipo de trabajo, el cual puede ser de origen mecnico o qumico. Notemos que en forma implcita ha
quedado definido el concepto de calor. ste no se trata de una forma de energa, sino de una forma de
transmitir energa, en un mismo pie de igualdad que el trabajo. Este anlisis se expresa mediante la relacin:
U Q W (8.1)
Tal como lo hemos discutido ms arriba, un estado de equilibrio termodinmico del sistema es un estado
en el que las variables extensivas estn bien definidas. Si escribimos el primer principio en forma diferencial
(o de pequeas intercambios) vemos que adopta la siguiente forma:

dU Q W (8.2)
Aqu las cantidades

Q , a diferencia de dU

que representa un cambio diferencial de la Energa

Interna U , no se corresponden con diferenciales de funciones si no intercambios pequeos de energa en

forma de trabajo ( W ) o en forma de calor ( Q ). La igualdad en la ecuacin (8.2) representa el lmite del
sistema. Es decir, el trabajo y el calor son formas que tiene el sistema de interaccionar Energa con su entorno. Intuitivamente podemos definir al intercambio de energa Mecnica mediante la relacin dW PdV
. La adopcin de esta definicin lleva implcita la convencin de signos que adoptaremos. Consideraremos
positiva a la energa transferida hacia el sistema y negativa a la transferida desde el sistema.
Para fijar ideas, supongamos que inicialmente tenemos que el sistema intercambia energa con el medio
ambiente slo en forma de trabajo, es decir en forma adiabtica ( Q 0 ). De la relacin (8.2) tenemos:

dU PdV (8.3)
Esto nos permite concluir dos cosas. En primer lugar, afirmar que el trabajo mecnico realizado sobre, o
por el sistema, genera un cambio en la energa interna a partir de la variacin de una variable extensiva, el
volumen. En segundo lugar, como la Energa Interna es una funcin continua y derivable de sus variables,
debe cumplirse que la presin debe ser la derivada de la Energa interna respecto al volumen

P U / V .

Si ahora consideramos un caso ms general en que el sistema adems de intercambiar Energa en forma de trabajo lo hace en forma de calor ( Q 0 ), tenemos de la relacin (8.2) que:

dU Q PdV (8.4)
La pregunta que surge inmediatamente es: si para el trabajo la variable extensiva del sistema que daba
cuenta de la variacin energtica es el volumen, cul es la variable extensiva asociada a un flujo energtico en forma de calor?

124

En este contexto introducimos una variable extensiva S a la que denominamos Entropa del sistema
que cumple la relacin: dQ TdS donde T es la temperatura y corresponde a la variable intensiva asociada al intercambio de energa en forma de calor. De esta manera, usando esta relacin en el resultado (4):

dU TdS PdV

(8.5)

Al igual que en el caso anterior, observamos que la Energa Interna cambia con la variacin del volumen
y la variacin de Entropa. De manera que la Energa Interna depende naturalmente de la entropa S y el
volumen V . Formalmente escribimos a esta relacin como U U ( S ,V ) , donde la Energa es la variable
dependiente. A esta forma de escribir la relacin llamamos Representacin Energtica en la que se considera a la Energa Interna como una funcin continua y diferenciable de sus variables por lo que se desprende directamente que:

T U / S V y P U / V S .

Segundo Principio de la Termodinmica

Asumiendo que la temperatura es positiva ( T 0 ), podemos concluir que, como la derivada de la Energa respecto a la Entropa es positiva, la Energa debe ser una funcin montona creciente de la Entropa.
Esta propiedad nos permite realizar un despeje y escribir formalmente a la Entropa como variable independiente, esto es S S (U ,V ) . Cuando escribimos a la Entropa en esta forma diremos que nos encontramos
en la Representacin Entrpica. En forma ms general y si agregamos un trmino que represente el intercambio de energa en forma de trabajo qumico, aparece una nueva variable extensiva la masa o nmero de
moles N como otra variable independiente. En este sentido, la dependencia funcional toma la forma:

S S (U ,V , N ) , o bien S S (U ,V , N1 ,..., Nr ) si el sistema posee r- componentes.

Las propiedades que posee la funcin Entropa son:
La funcin (denominada entropa) de los parmetros extensivos de cualquier sistema compuesto, est
definida para todos los estados de equilibrio con las siguientes propiedades:
1) Los valores que toman los parmetros extensivos, en ausencia de ligaduras internas, son aquellos
que maximizan la entropa respecto al conjunto de los estados de equilibrio ligados.
2) La entropa de un sistema compuesto es aditiva respecto a la de los subsistemas constituyentes.
3) La entropa es continua, diferenciable, y es una funcin montonamente creciente de la energa interna.
Lo que hemos presentando es un viejo anhelo (buscado y no siempre encontrado en la Fsica): expresar
las leyes por intermedio de principios extremales. En otras palabras, buscando el extremo de la funcin
Entropa, uno puede ser capaz de encontrar cules son los valores de las variables termodinmicas que
identifican al estado. Ms precisamente, si conocemos el estado inicial, estamos en condiciones de predecir
el estado final, conociendo la funcin S . Sin embargo, la consecuencia verdaderamente importante es que
contamos con una magnitud fsica la cual nos marca el sentido en el que el sistema va a evolucionar espontneamente, pero tambin nos dice algo que la experiencia cotidiana nos muestra en forma cotidiana, la
irreversibilidad de los procesos. Un proceso es irreversible si su entropa aumenta, formalmente S 0 . Si
su entropa permanece constante S 0 , se dice que el el proceso es reversible. Aunque este ltimo caso
es ideal, conceptualmente es muy importante ya que es una consecuencia de nuestro marco terico. Es
imprescindible no confundir proceso reversible con proceso cuasiesttico. Un proceso cuasiesttico (definido como una sucesin de estados de equilibrio) puede ser reversible o irreversible, pero un proceso reversible necesariamente debe ser cuasiesttico. La desigualdad S 0 marca la direccionalidad de los procesos espontneos. Esta desigualdad usualmente es conocida como Segundo Principio de la Termodinmica.

125

Sistemas Fuera del Equilibrio

A pesar de lo til que ha demostrado ser la caracterizacin de los estados de equilibrio por la teora de la
termosttica, debe admitirse que nuestro inters fundamental se enfoca con ms frecuencia hacia los procesos que hacia los estados. En biologa, particularmente, es el proceso vital el que atrae nuestra imaginacin, ms que el estado de equilibrio final hacia el cual se encamina inevitablemente todo organismo. La
termosttica facilita dos mtodos que nos permiten inferir cierta informacin limitada acerca de los procesos,
pero ambos mtodos son indirectos y proporcionan unos resultados muy pobres. En primer lugar, estudiando los estados de equilibrio inicial y final, es posible algunas veces aislar un proceso y luego determinar el
efecto del proceso en su totalidad. En segundo lugar, si cierto proceso se produce con lentitud extrema,
podemos compararlo con un proceso cuasiesttico, idealizado y no fsico. Pero ninguno de estos mtodos
se enfrenta al problema central de los procesos fsicos reales.
La rama de la termodinmica que se ocupa de las velocidades de los procesos fsicos es la teora de la
Termodinmica Irreversible o Termodinmica del no Equilibrio, como la llamaremos en el presente texto.

Afinidades y Flujos
Como preparacin para nuestro estudio, definiremos ciertas magnitudes que describen de manera apropiada los sistemas fuera del equilibrio. Bsicamente, se requieren dos tipos de parmetros: uno, para describir la fuerza que impulsa un proceso, y el otro, para describir la respuesta a dicha fuerza.
Los procesos de inters ms general se producen en sistemas continuos, tales como el flujo de energa
en una barra con un gradiente continuo de temperatura. Sin embargo, para sugerir la manera ms adecuada de seleccionar los parmetros en tales sistemas continuos, consideraremos primero el caso relativamente simple de un sistema discreto. Un proceso tpico en un sistema discreto podra ser el flujo de energa de
un subsistema homogneo a otro a travs de una separacin diatrmica infinitamente delgada.
Consideremos un sistema compuesto constituido por dos subsistemas. Un parmetro extensivo tiene valores

Xk

X 'k

en los dos subsistemas, y la condicin de cierre exige que:

X k X 'k cte
Por ejemplo si

Xk

(8.6)

representa el volumen, la suma del volumen de cada subsistema constituyente del sis-

tema en cuestin es constante. De la misma forma puede pensarse para el resto de las variables extensivas. Si X k y X 'k no estn ligados, sus valores de equilibrio estarn determinados por la anulacin de la
magnitud:

Fk
Si

S
S '

f k f k ' (8.7)
X k X 'k

Fk 0 , tiene lugar un proceso irreversible, que lleva al sistema hacia el estado de equilibrio.
La magnitud Fk que es la diferencia entre los parmetros intensivos en la representacin entrpica, act-

a como una fuerza generalizada que impulsa el proceso. Tales fuerzas generalizadas se denominan
Afinidades.
Precisando ms, consideremos dos sistemas separados por una pared diatrmica y sea X k la energa
interna

U , entonces la afinidad ser:

Fk (1/ T ) (1/ T ')

(8.8)

No pasa calor alguno a travs de la pared diatrmica si la diferencia entre las inversas de las temperaturas se anula. En cambio, una diferencia no nula de las inversas de las temperaturas, que acta como una
fuerza generalizada, activa un intercambio de energa en forma de calor entre los subsistemas.
La respuesta a la fuerza aplicada la caracterizaremos por la velocidad de cambio del parmetro extensivo asociado,

X k , que en el caso anterior sera la energa. El flujo se define entonces por:

126

J k dX k / dt

(8.9)

Por consiguiente, el flujo se anula si se anula la afinidad, y una afinidad diferente de cero conduce a un
flujo diferente de cero. Es la relacin entre flujos y afinidades lo que caracteriza las velocidades de los procesos fuera del equilibrio.
La identificacin de las afinidades en un tipo particular de sistema suele resultar ms cmoda cuando se
considera la velocidad de produccin de entropa. Derivando la Entropa
tiempo,

tenemos

(con

X 0 U , X1 V , X 2

el objeto
N1... ):

de

generalizar

hemos

realizado

S ( X 0 , X1 ,...)
la

con respecto al

siguiente

identificacin

dS
S dX i

Fi J i (8.10)
dt
i X i dt
i
As la velocidad de produccin de entropa es la suma de los productos de cada flujo por su afinidad
asociada y es una funcin positiva (dS / dt ) 0 .
La ecuacin de produccin de Entropa es particularmente til para extender la definicin de las afinidades a sistemas continuos en lugar de sistemas discretos. Con este objeto introducimos la idea de Entropa
Local:
Asociemos a cualquier regin infinitesimal una Entropa local donde, por definicin, la dependencia funcional de S con respecto a los parmetros extensivos locales

X 0 , X1 ,... X n

se considera idntica a la de-

pendencia en el equilibrio. Esto es, adoptaremos simplemente la ecuacin fundamental del equilibrio para
asociar una Entropa local a los parmetros locales

X 0 , X1 ,... X n . En este sentido para sistemas continuos

se extiende la Expresin para la Velocidad de Produccin de Entropa en la siguiente forma:

dS
fi J i 0 (8.11)
dt
i
Donde

Fi fi

es el gradiente de la variable intensiva y representa la fuerza generalizada. Para fijar

ideas, en nuestro ejemplo la fuerza generalizada sera (1/ T ) . Es decir lo que en sistemas discretos se
calcula como una diferencia, en sistemas continuos se transforma en un gradiente.
Es sabido que cada flujo J i se anula cuando se anulan las afinidades Fi , por lo que podemos desarrollar en potencias de las afinidades sin ningn trmino constante:

Coeficientes de Onsager
Para ciertos sistemas, los flujos en un instante dado dependen solamente de los valores de las afinidades en dicho instante. A tales sistemas les llamamos markoffianos aceptando la terminologa de la teora de
los procesos aleatorios. Limitaremos nuestra atencin a este tipo de sistemas.
Para un sistema markoffiano, por definicin, cada flujo local depende nicamente de las afinidades locales instantneas y de los parmetros intensivos locales.

J i Lij Fj Lijk Fj Fk ... (8.12)

j

ijk

Procesos Lineales
Se presenta una situacin de gran inters prctico si las afinidades son tan pequeas que pueden despreciarse todos los trminos de orden superior al primero en la ecuacin (8.12). Un proceso que pueda describirse adecuadamente por las ecuaciones truncadas aproximadas:

127

J i Lij Fj (8.13)
j

se denomina proceso lineal de Markoff. Para el anlisis de tales procesos, este desarrollo es una herramienta particularmente poderosa. Los coeficientes Lij se denominan coeficientes de Transporte con la propiedad que Lij L ji . La relacin (13) muestra las fuerzas como variables independientes y los flujos causados por todas las fuerzas intervinientes. Una consecuencia directa es la existencia de fenmenos acoplados
cuando los coeficientes Lij 0 .

Estado Estacionario: Rgimen Lineal en Sistemas Biolgicos

En el rgimen lineal, los estados que minimizan la velocidad de produccin de Entropa (dS / dt ) , se denominan estados estacionarios y se caracterizan porque las magnitudes que identifican el estado del sistema no dependen del tiempo.
Para fijar ideas y a modo de ejemplo abordaremos el proceso de conversin de energa usado en el
trasporte de sustancias a travs de la membrana celular. En este proceso la fuente de energa es el trifosfato de adenosina (ATP), que ha sido producido por la fosforilacin oxidativa (OP) en la membrana interna de
la mitocondria.
Lo pensaremos como un proceso acoplado de dos flujos. En particular veremos como el acoplamiento
entre flujos permite abordar y entender el transporte activo en sistemas biolgicos. Usaremos el acoplamien

to entre flujos para evaluar la fosforilacin oxidativa con una bomba de H como un proceso de transporte
por respiracin, suponiendo que el transporte de iones se encuentra en estado estacionario. En este contexto, las relaciones lineales fenomenolgicas se escriben como:

En donde

J1

J1 L11F1 L12 F2

(8.14a)

J 2 L12 F1 L22 F2

(8.14b)

representa el flujo neto de ATP,

J2

el flujo neto de oxgeno,

F1

el potencial fosfato y

F2

el

potencial redox entre el donor y el aceptor de electrones. El grado de acoplamiento se puede definir como:

Donde

L12

L11L22

1/ 2

(8.15)

0 q 1.

As mismo introduciendo el coeficiente estequimtrico fenomenolgico (diferente al molecular):

1/ 2

L
Z 11
L22

(8.16)

Y dividiendo entre si las ecuaciones (14), se obtiene la relacin entre flujos

la relacin entre las fuerzas

f F1Z / F2 ,

dada por:

f q
(8.17)
qf 1

128

j J1 /( J 2 Z ) en trminos de

Como la oxidacin conduce a la fosforilacin

tras que

F1 / F2

F1 0 , F2 0

J1 / J 2

representa la relacin P/O, mien-

es la relacin entre el potencial fosfato y el potencial redox. Existen dos tipos de estados

estacionarios.
s1 en el cual el flujo de ATP se anula.

s2

en el cual el potencial fosfato se anula.

Estos son dos casos extremos, pueden darse situaciones en los que ni
nuestros casos extremos, para
mo:

s1

el flujo de oxigeno

J 2 S

L22

ni

J1

se anule. Volviendo a

consumido y el potencial fosfato se expresan co-

L22 F2 1 q 2 (8.18)

F1 s
Donde

J2

F1

qF2
(8.19)
Z

se interpreta como el coeficiente de conductancia de la cadena respiratoria. Por lo tanto la

energa es convertida y consumida por la mitocondria.

En el estado estacionario

s2

la relacin entre los flujos se escribe como:

J1
qZ (8.20)
J 2 s2
Por lo tanto si el grado de acoplamiento es conocido es posible calcular Z midiendo la relacin P/O.
La eficiencia de la conversin lineal de energa queda definida en funcin del grado de acoplamiento:

J1F1
f q
(8.21)

J 2 F2
q (1/ f )

La eficiencia alcanza su valor ptimo entre los dos estados

s1

s2

dependiendo nicamente del grado

de acoplamiento:

op

Los valores de

q2

1 1 q2

f para op estarn dados por:

f op

q
1 1 q2

(8.22)

La velocidad de produccin de entropa en trminos de la relacin de fuerzas

miento q se escribe:

f y el grado de acopla-

dS
f 2 2qf 1 L22 F22 (8.23)
dt
Si suponemos que

F2

es constante la velocidad de produccin de entropa es mnima en el estado

relacin de fuerzas es f s1 q , y adopta el valor:

129

s1 , la

 dS
2
2
1 f L22 F2 (8.24)
dt
s1
Si evaluamos en el estado

s2

y el ptimo obtenemos:

1 f 2 L X 2
dS
dS
2
y

L
X
22 2

22 2

1 f 2
dt op
dt s2
2

Con estos resultados encontramos que:

dS
dS
dS
(8.25)
dt s1 dt op dt s2
La mnima disipacin (produccin de entropa) no ocurre para el estado ms eficiente. Para mejorar este
resultado debe agregarse un tercer flujo que represente la hidrlisis del ATP.

Ms All del Rgimen Lineal

Como se explicit ms arriba, la el uso de las relaciones (8.13) es adecuado cuando en el desarrollo
(8.12) pueden despreciarse los trminos de orden superior, en otras palabras cuando el sistema se encuentra cerca del equilibrio. La distancia respecto del equilibrio puede medirse por medio de los gradientes y
afinidades impuestas al sistema. Por ejemplo una reaccin qumica se encuentra en el rgimen lineal si la
afinidad es pequea comparada con RT ( A 2.5Kjoule / mol a T 300K ). Sin embargo, la mayora de
las reacciones se encuentran en el rango de 10 100Kjoule / mol , por lo que se encuentran lejos del
rgimen lineal y poseen ms de un estado estacionario posible, en algunos casos muestran bifurcaciones
que conducen a nuevos estados de organizacin. En este libro no discutiremos las estructuras tericas provenientes de la Termodinmica del no Equilibrio que permiten abordar estas situaciones. En su lugar y
centrndonos en el estudio de rutas metablicas como problema que posee estados alejados del equilibrio
en donde el rgimen lineal no aplica, haremos una breve presentacin la Teora del Control Metablico.

Anlisis de Control Metablico

Una ruta metablica se puede modelar por un conjunto de reacciones ezimticas acopladas parametrizadas por las concentraciones de los metabolitos involucrados. En este sentido el anlisis del control metablico (ACM) es un desarrollo matemtico para la descripcin de vas metablicas. ACM cuantifica como
las variables, los flujos o las concentraciones de metabolitos, dependen de los parmetros de la red en que
estn inmersas, en particular, es capaz de describir cmo las propiedades dependen de la ruta, (descritos
por determinados coeficientes llamados de control). Por lo tanto, en el ACM se estudia el control relativo
ejercido por cada uno de los pasos (reacciones enzimticas) en las variables del sistema (flujos y las concentraciones de metabolitos). Este control se mide mediante la aplicacin de una perturbacin mientras se
analiza o estudia el efecto en la variable de inters despus de que el sistema ha alcanzado un nuevo estado estacionario.

Coeficientes de control
El coeficiente de control mide el cambio relativo en estado estacionario en un sistema variable (por
ejemplo flujos o concentraciones) en respuesta a un cambio relativo en un parmetro (por ejemplo actividad
enzimtica). Los dos principales coeficientes de control son los de flujo y concentracin. En este sentido el
Coeficiente de control de flujo se define como:

130

CEJk

Ek J
(8.26)
J Ek

Y el Coeficiente de control de concentracin:

CESk

Ek S
(8.27)
S Ek

Aqu S representa a la concentracin de sustrato y no a la Entropa.

Se define como reaccin (o enzima) limitante, a aquella reaccin (enzima) cuyo coeficiente de control de
flujo es igual a la unidad. Encontrar la enzima limitante de una va implica encontrar aquella enzima o paso
que controla toda la va convirtindola en un objetivo ideal para el aumento de su flujo.

Coeficientes de elasticidad
El coeficiente de elasticidad cuantifica la capacidad de respuesta de una reaccin enzimtica a cambios
en un parmetro (por ejemplo concentracin de sustrato, producto, efectores, temperatura, etc.) mientras los
dems parmetros permanecen constantes. Operativamente se define como el cociente entre el cambio
relativo en la velocidad enzimtica ( v ) y el cambio relativo en el parmetro ( p ). El valor del coeficiente de
elasticidad nos proporciona, por lo tanto, una idea de la capacidad de respuesta de una reaccin enzimtica
al cambio en un determinado parmetro. De manera ms explcita, un valor alto nos dice que el sistema
posee una mayor sensibilidad y una baja sensibilidad en caso contrario. Matemticamente y en forma similar a los coeficientes de control, los coeficientes de elasticidad de definen como:

p v
(8.28)
v p

vp
Teoremas fundamentales

En esta parte del texto explicitaremos los teoremas fundamentales de la Teora del Control Metablico
encontrados independientemente por Kacser/Burns y Heinrich/Rapoport entre los aos 1960 y 1970. Slo
los enunciaremos y expondremos sus principales consecuencias. Los primeros de los teoremas corresponden a los Teoremas de suma que conducen a los siguientes resultados:

C
C

J
Ei

1 (8.29)

S
Ei

0 (8.30)

La suma de los coeficientes de flujos es una propiedad sistmica. Cuando se produce un cambio en una
de las reacciones, es compensado por cambios en el control en el mismo flujo por todas las otras reacciones.
Los segundos de los teoremas son los Teoremas de Conectividad que relacionan los coeficientes de
control con los coeficientes de elasticidad:

C
J
i

i
Sn
i

C
C

i
S

0 (8.31)

Si 0, n m
m

(8.32)

Sn
i

Si 1, n m (8.33)
m

La utilidad de este Teorema radica en que ponen de relieve la estrecha relacin entre las propiedades
cinticas de las reacciones individuales y las propiedades del sistema de una va. Dos conjuntos bsicos de

131

teoremas existen, uno para el flujo y otro para las concentraciones. Los teoremas de conectividad concentracin se dividen a su vez en funcin de si la especie de sistema

Sn

es diferente de las especies locales

Sm .
En la prctica es posible combinar los teoremas de sumas y conectividad para relacionar los coeficientes
de elasticidad y conectividad. Con este objetivo consideremos la siguiente ruta:
v1

v2

X 0 S X 1 (8.34)
Supongamos que

X0

X1

son especies fijas de manera que la ruta alcanza un estado estacionario.

Centrndonos en los coeficientes de flujo podemos escribir un teorema de conectividad y uno de suma para
la ruta:

CvJ1 CvJ2 1 (8.35)

CvJ1 Sv1 CvJ2 Sv2 0 (8.36)
Usando (8.35) y (8.36) podemos encontrar los coeficientes de control en funcin de los de elasticidad:

C
J
v1

Sv

Sv Sv
v
CvJ v S v
S S
2

(8.37)

(8.38)

Usando estos resultados podemos analizar algunos comportamientos extremos. Por ejemplo, supongamos que el primer paso es completamente insensible a su producto, es decir, no reacciona con l. En estas
condiciones tenemos que

Sv 0 .
1

CvJ1 1
CvJ2 0
El flujo a travs de la ruta queda determinado por el primer paso. Esta situacin representa el paso limitante clsico que se menciona con frecuencia en las presentaciones bsicas.
Un comentario que consideramos relevante para realizar como caracterstica limitantes del enfoque de la
Teora del Control Metablico es que se posee caractersticas locales, en el sentido que los coeficientes de
control o elasticidad, al estar definidos por derivadas de los flujos o concentraciones respectos a las concentraciones enzimticas, tienen valides en un entorno de los valores en que son determinados. De esta manera no pueden der predictivos en otras regiones de posible inters para los problemas que se estudian.

Problemas
La ecuacin fundamental del sistema A est dada por:
1/ 3

R2
SA

V0
Y la de un sistema B:

132

N AVAU A

1/ 3

1/ 3

R2
SB

V0

N BVBU B

1/ 3

Cul es la funcin compuesta para el sistema A+B?

Calcule la temperatura T para cada subsistema A y B.
Puede dar una expresin para la fuerza generalizada FT ?
Si

N A NB

VA VB . Puede indicar en qu direccin es el flujo de energa?

Bibliografa
Callen, H. B. (1985). Termodinmica. Madrid: Editorial AC.
Cornish-Bowden A. (2012) Fundamentals of Enzyme Kinetics, 4th ed. Londres: Wiley-Blackwell.
Fell D. (1996) Understanding the Control of Metabolism. Londres: Portland Press.
Kondepudi, D., Prigogine, I. (1998). Modern Thermodynamics: From Heat Engines to Dissipative Structures.
Chichester: John Wiley & Sons.

133

134

CAPTULO 9
Mtodos Empleados en la Purificacin de Enzimas
Daniela Bottero y Daniela Hozbor

Los errores tienen casi siempre un carcter sagrado. Nunca

intentis corregirlos. Al contrario: lo que procede es
racionalizarlos, compenetrarse con aquellos integralmente.
Despus, os ser posible subliminarlos.
SALVADOR DAL

Los organismos estan compuestos por una amplia variedad de protenas que aunque difieren en la secuencia de sus aminocidos, y en el plegamiento 3-D de la cadena de aminocidos, comparten una serie de
propiedades ya que se componen esencialmente de los mismos amincidos. Es as que varias protenas
que se encuentran en un mismo organismo pueden compartir algunas propiedades como por ejemplo su
tamao o su carga. En consecuencia cuando se busca purificar alguna protena se deben realizar una serie
de pasos secuenciales (marcha de purificacin) en los que se van discriminando diferencias que en muchos
casos resultan ser sutilies. El diseo de una estrategia purificacin de protenas es algo as como la
bsqueda de una ruta que debe transitarse en tramos eliminando lo innecesario hasta alcanzar el objetivo
con solo lo necesario. Diferentes rutas y diferentes tramos de rutas pueden ser exploradas y para continuar,
cada tramo andado debe ser analizado adecuadamente de forma de tomar decisiones sobre si retroceder o
seguir y en caso de seguir se debe analizar cul sera el mejor tramo para continuar el camino. La eleccin
de tramos se debe realizar en base a consideraciones sobre cmo evitar prdidas de lo necesario, favorecer
al mximo la eliminacin de lo innecesario y tambin los costos y tiempo. As en cado paso de purificacin
se debe evaluar no solo el rendimiento en la purificacin de la protena problema sino tambin la pureza
alcanzada de la misma. Si bien no hay una sola secuencia de tcnicas a seguir, en general se recomienda
empezar por tcnicas de alta capacidad y seguir con las de baja capacidad pero mayor especificidad. La
estrategia a emplear deber disearse teniendo en cuenta la cantidad y el grado de pureza que se quiera
alcanzar segn el uso que se dar a la protena. Para usos en investigacin, la escala es en general reducida y es mas importante la pureza que el rendimiento. Para usos teraputicos la escala es mayor y la pureza
requerida es mxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo costo y menor
pureza. Si el inters est en la protena y no importa el organismo de donde se la extraer, conviene buscar
una fuente fcil de obtener, que contenga esa protena en abundancia y de ser posible de bajo costo. Lo
ptimo sera producir la protena por mtodos de ADN recombinante. Dependiendo tambin de la finalidad,
la protena que se quiere purificar deber ser obtenida en conformaciones nativas o desnaturalizadas. Por
ejemplo para evaluar actividad biolgica la protena debe tener una estructura funcional, en cambio para
determinar la estructura primaria, la protena puede estar desnaturalizada.
En este captulo se presenta una descripcin que incluye los aspectos ms sobresalientes de las tcnicas ms utilizadas en el aislamiento, purificacin y caracterizacin de enzimas.
Antes de introducirnos en las tcnicas es importante tener en cuenta que es imposible disear y o realizar una estrategia de purificacin de una protena si no contamos con un mtodo cuali y cuantitativo especfico de la protena en cuestin. Debemos contar con metodologas que nos permitan analizar luego de cada
etapa de purificacin si la protena problema est, cmo est y de estar determinar en qu cantidad est. En
el caso de enzimas, mientras que la determinacin de las unidades enzimticas totales (Actividad enzimtica) resulta esencial para evaluar el rendimiento de su purificacin, las medidas de la actividad especfica
(AE, relacin entre la cantidad de protena que se purifica sobre la cantidad de protena total nos indica el
grado de purificacin alcanzado. El redimiento y el grado de purificacin pueden evaluarse en forma global
comparando los valores de actividad total y actividad especfica hallados en la etapa final de la marcha de
purificacin respecto de los obtenidos en la etapa inicial de la purificacin pero tambin puede evaluarse en
cada nueva etapa respecto de la etapa anterior. En el primer caso estariamos evaluando el proceso global
de la marcha de purificacin y en el segundo estas determinaciones nos hablarn de la eficiencia de una
etapa de purificacin en particular. A continuacin se presenta una tabla de purificacin y los clculos que
nos permitiran evaluar la marcha de purificacin realizada.

135

Tabla 9.1: Ejemplo de una marcha de purificacin

Paso de
Purificacin

Actividad Total (Unidades enzimticas totales; UET)

Actividad Especfica (UET /mg de pritena

total)

UETpaso 1

UETpaso 1/mg protena totalpaso 1

UETpaso 2

UETpaso 2/mg protena totalpaso 2

UETpaso 3

UETpaso 3/mg protena totalpaso 3

Rendimiento Global= UETpaso 3/ UETpaso 1 x 100

Rendimiento Paso 2 respecto del paso 1= UETpaso 2/ UETpaso 1 x 100
Rendimiento Paso 3 respecto del paso 2= UETpaso 3/ UETpaso 2 x 100
Grado de purificacin Global= Actividad especfica del paso 3
Actividad especfica del paso 1
Grado de purificacin alcanzado en el paso 2= Actividad especfica del paso 2
Actividad especfica del paso 1
Grado de purificacin alcanzado en el paso 3 respecto de la del 2 = Actividad especfica del paso 3
Actividad especfica del paso 2
Por otra parte, la calidad de muestra purificada se evalua generalmente a travs de corridas electroforticas en geles desnaturalizantes y en geles nativos los cuales pueden estar asociados o no a tcnicas especficas de inmunblot. Estas tcnicas son descriptas en este captulo.

Seleccin de la fuente de la enzima a purificar y solubilizacin de protenas

Como hemos mencionado para comenzar a purificar una protena debemos contar con una metodologa
que nos permita medir cuantitativamente la presencia de la protena problema. En el caso de ser una enzima esto se consigue mediante la evaluacin de la actividad enzimtica. Con esta metodologa se elige el
material de partida de forma de seleccionar aquel que contenga una gran cantidad de la protena de inters.
Una vez seleccionado el material de origen, es necesario en general realizar un procedimiento para lograr
que las protenas sean liberadas de la clula que la contienen y estn en solucin. El mtodo de eleccin
para este procedimiento depende de la localizacin de la protena en cuestin y del tejido o clula que la
contiene. Si la enzima de inters se encuentra en el citosol celular, su liberacin requerir de la lisis de la
clula. El mtodo ms sencillo y menos drstico para conseguirlo es la lisis osmtica. Este mtodo consiste
en suspender a las clulas en una solucin en la que la concentracin molar total de los solutos resulta ser
menor que la hallada en el interior de la clula de forma que las clulas se hinchen y estallen. Los detergentes y los solventes orgnicos como el tolueno o la acetona en condiciones adecuadas para no desnaturalizar a las protenas, pueden ser utilizados. A veces se requiere de rupturas mecnicas empleando un homogeneizador, un mortero de forma de moler un tejido congelado o una prensa francesa que permite romper
las clulas al hacerlas pasar con alta presin por un orificio muy pequeo. Tambin se puede lisar las clulas tratndolas con ultrasonido (sonicacin). En el caso de las bacterias suelen realizarse tratamientos con
enzimas como la lisozima que cataliza la hidrlisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de cido Nacetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina del peptidoglicano presentes en la pared bacteriana. Si la enzima
a purificar se encuentra en alguna organela, luego de la lisis debe separse la organela que la contiene generalmente mediante centrifugacin diferencial, es decir centrifugaciones secuenciales que difieren en la velocidad de centrifugacin para hacer separaciones por tamao. Una vez separada la organela se suelen realizar tratamientos con detergentes o solventes orgnicos para liberar a la protena en cuestin.
Una vez en solucin, las protenas (extracto crudo) deben preservarse de su desnaturalizacin/degradacin para ello se las suele disolver en soluciones amortiguadoras y manipular en frio y evitando
la formacin de espuma.

136

Fraccionamiento del extracto crudo

Una vez solubilizadas las protenas desde la fuente de origen (extracto crudo) se procede a la aplicacin
de distintas metodologas (pasos o etapas de purificacin) que con diferente fundamento buscan eliminar a
los contaminantes (otras protenas, otras biomolculas) preservando al mximo posible a la protena de
inters.
Las metodologas que generalmente se emplean para el fraccionamiento del extracto crudo se presentan
en el siguiente cuadro.

Cuadro 9.1 Metodologas corrientemente empleadas en el fraccionamiento de un extracto crudo

A continuacin presentaremos una breve descripcin de cada una de estas metodologas.

Diferencia de solubilidad de las protenas

Es posible separar unas protenas de otras mediante la modificacin de las condiciones del entorno de
forma de afectar diferencialmente su solubilidad. Aqu es importante recordar que la solubilidad de una sustancia es la medida de la capacidad de disolverse en un determinado medio, a una temperatura y presin
definidas. Las protenas en disolucin pueden cambiar su solubilidad diferencialmente de acuerdo a su
composicin aminoacdica en funcin de 1) concentraciones salinas, 2) disolventes orgnicos, 3) pH y 4)
temperatura.

Efecto del agregado de sales

Modificando la concentracin salina, se puede aumentar (salting in) o disminuir (salting out) la solubilizacin de las protenas. Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las protenas
globulares. A baja concentracin, las sales incrementan la solubilidad de muchas protenas, fenmeno que
recibe el nombre de solubilidad por salado o salting in, en el que los contraiones adicionales recubren con
mayor eficacia las numerosas cargas inicas de las molculas proteicas, con lo que se incrementa la solubi

137

1,4
1,2

Log (S/S)

1,0

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

1,0

2,0

3,0

4,0

Fuerza inica
Fig. 9.1. Solubilidad de la carboxihemoglobina en su punto isoelectrico
en funcin de la fuerza inica y el tipo de ion. S/S` son las solubilidad
de la protena en solucin salina y en agua pura respectivamente

lidad de las mismas. La efectividad en la solubilizacin de las protenas depende de la sal utilizada. Este
efecto lo observamos en la Fig 9.1 que muestra la solubilidad de la carboxihemoglobina en su punto isoelctrico dependiendo de la fuerza inica y del tipo de ion. S y S representan respectivamente las solubilidades
de la protena en la disolucin de la sal y en el agua pura.
La capacidad de las sales neutras para influir en la solubilidad de las protenas est en funcin de su
fuerza inica, que constituye una medida tanto de la concentracin como del nmero de las cargas elctricas aportados por la sal. Por otra parte, a medida que la fuerza inica aumenta, la solubilidad de una protena comienza a disminuir. A una fuerza inica lo suficientemente elevada, la solubilidad de una protena puede reducirse drsticamente, efecto llamado insolubilizacin por salado o salting out, que es el resultado de
la competencia por molculas de solvatacin entre los iones salinos agregados y los otros solutos disueltos.
As a concentraciones salinas elevadas el solvente disponible se torna insuficientes para disolver los otros
solutos y la interaccin de los solutos en estos casos se vuelven ms fuertes que la del soluto con el solvente y ello es lo que conduce a la insolubilizacin de los solutos.
La solubilizacin e insolubilizacin por salado, son procedimientos importantes para la separacin de
mezclas de protenas, ya que las diferentes protenas varan en su respuesta frente a la concentracin de
sales neutras. Generalmente las protenas insolubilizadas por salado retienen su conformacin nativa y
pueden disolverse de nuevo, normalmente sin experimentar desnaturalizacin. El sulfato de amonio es el
reactivo ms utilizado para precipitar las protenas por salado, debido a su gran solubilidad en agua (760 g
de (NH4)2SO4/1000 ml. de agua a una temperatura de 20C), lo que permite alcanzar fuerzas inicas muy
elevadas. Para ello generalmente se prepara una solucin saturada de (NH 4)2SO4 la cual es adicionada de
manera gradual de forma de permitir el fraccionamiento de una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas.
La ecuacin de la precipitacin con sales es como sigue:
= []
donde: S = Solubilidad de la protena a un valor dado de concentracin salina. A = Constante que depende
fuertemente del pH y la temperatura. Esta constante usualmente toma un valor mnimo en el punto isoelctrico, es caracterstica de cada protena e independiente del tipo de sal. m = Pendiente de la curva de solubilizacin por salado. Esta pendiente es independiente del pH y la temperatura, pero vara con el tipo de sal y
de protena. Las sales que contienen aniones polivalentes tales como sulfatos y fosfatos tienen valores de m
mayores que las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio y el magnesio disminuyen el
valor de m.

138

Efecto de los Solventes Orgnicos en la Solubilidad de las Protenas

La adicin de solventes orgnicos miscibles con el agua, particularmente etanol o acetona, disminuye la
solubilidad de las protenas porque sus bajas constantes dielctricas reducen el poder de solvatacin de las
soluciones acuosas hacia los iones disueltos como las protenas. El estudio cuantitativo de este efecto
muestra que la solubilidad de una protena a un pH y fuerza inica determinados est en funcin de la constante dielctrica del medio. As la adicin de etanol a una disolucin acuosa de protena incrementa la fuerza de atraccin entre las cargas opuestas, disminuyendo de este modo el grado de ionizacin de los grupos
R de la protena. Como resultado, las molculas de protena tienden a agregarse disminuyendo su solubilidad. El uso de solventes orgnicos generalmente se realiza a bajas temperaturas ya que a temperaturas
superiores a 10C pueden llevar a la desnaturalizacin de las protenas.
La reduccin de la constante dielctrica por el agregado de solventes orgnicos tambin aumenta las diferencias entre protenas respecto de su comportamiento en la insolubilizacin por salado, por lo que ambas
tcnicas pueden utilizarse combinadas.

Efecto del pH
La solubilidad de la mayor parte de las protenas globulares se halla profundamente influida por el pH del
sistema. Casi todas las protenas globulares muestran un mnimo de solubilidad, aunque el pH al que ello
ocurre vara de una protena a otra. El pH al que una protena muestra ese mnimo de solubilidad es su pH
isoelctrico (tambin denominado punto isoelectrico, pI), definido como aquel valor de pH al que la molcula
no posee carga elctrica neta y es incapaz de desplazarse en un campo elctrico. En estas condiciones no
existe repulsin electroesttica entre molculas de protena prximas y tienden a agregarse. Puesto que las
diferentes protenas poseen valores de pH isoelctrico variados, debido a que difieren en el contenido de
aminocidos con grupos R ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de otras, mediante precipitacin isoelctrica. Cuando el pH de una mezcla de protenas se ajusta al pH isoelctrico de uno de sus componentes, la mayor parte o casi todo el componente se insolubilizar, quedando en la disolucin las protenas cuyos valores de pH isoelctrico se hallen por encima o por debajo de aquel. La protena isoelctrica
insolubilizada permanecera en su conformacin nativa, y puede re disolverse en un medio de pH apropiado
y concentracin salina adecuada. Las protenas sin carga neta resultan ser insensibles a la concentracin
salina pero a medida que el pH se aleja del valor del pI de la protena, esto es a medida que la carga neta
de la protena aumenta, esta se ver cada vez ms influida por el fenmeno de solubilizacin por salado.

Efecto de la temperatura
Dentro de una fluctuacin limitada entre los 0C y los 40C aproximadamente, la solubilidad de mayora
de las protenas globulares aumenta al aumentar la temperatura, aunque existen algunas excepciones, como ocurre con los electrolitos sencillos. Por encima de los 40C y los 50C, la mayor parte de las protenas
aumentan su inestabilidad y comienzan a desnaturalizarse, generalmente con prdida de solubilidad en la
zona neutra de pH.

Mtodos cromatogrficos
La cromatografa es esencialmente un mtodo fisicoqumico de separacin en el que los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una inmvil (lecho estacionario), y otra mvil (fase mvil) la cual
percola circula? a travs de la primera. En la cromatografa durante el movimiento de los componentes de la
mezcla arrastrados por la fase mvil a lo largo del lecho estacionario (elucin) ocurren repetidos procesos
de adsorcin-desorcin, producindose la separacin debido a las diferencias en las constantes de distribucin de los componentes de la mezcla entre la fase estacionaria y la mvil. A la distribucin final de los
componentes en funcin del volumen de elucin, o del tiempo en que eluyen se le denomina cromatograma.
Esta tcnica fue descripta por primera vez por el botnico ruso M. Tswett (1910), quien la aplic para la
separacin de pigmentos de plantas. El nombre de cromatografa parece haber surgido como consecuencia
de las bandas coloreadas de pigmentos que se separaban por su adsorcin selectiva sobre columnas de
yeso. Esta tcnica aunque exitosa qued prcticamente olvidada hasta 1930, ao en que fue redescubierta
por Kuhn y Lederer, quienes la aplicaron para la separacin de carotenoides. A partir de este momento, el
uso de esta tcnica se fue extendiendo cada vez ms y un hito importante en el desarrollo de la misma lo

139

constituye el desarrollo de la cromatografa gas-lquido que encontr rpidamente aplicaciones de gran

importancia. En la actualidad no hay campo de la qumica, ciencias biolgicas, etc. en el que no se utilice la
cromatografa en alguna de sus formas, tanto en su formato preparativo como analtico.
Las tcnicas cromatogrficas pueden clasificarse en funcin del mecanismo de separacin de los componentes entre las fases. En funcin del mecanismo de separacin, las tcnicas de cromatografa pueden
clasificarse en: cromatografa por tamao molecular y forma, y cromatografa por carga.

Cromatografa por Tamao Molecular y Forma

Tambin llamada de permeacin de gel, de exclusin molecular o de tamiz molecular. Consiste en la separacin de las molculas basndose en su tamao y forma. Las fases estacionarias empleadas para este
tipo de cromatografa pueden ser inorgnicas (zeolitas), o geles orgnicos compatibles con disolventes
acuosos (agarosa, poliacrilamida) u orgnicos (copolmeros estireno/divinilbenceno) (Tabla 9.2). Estas fases
estacionarias poseen cavidades en las cuales las molculas de los compuestos a separar pueden penetrar
y ser retenidas, siendo las molculas mayores las eluidas de la columna en primer lugar. Por lo tanto, las
molculas ms grandes atraviesan la columna con ms rapidez, esto es, en un volumen de elucin menor
que el de aquellas molculas ms pequeas que si logran ingresar en los poros. El lmite de exclusin se
define como el peso molecular a partir del cual los compuestos pasarn a travs del lecho estacionario sin
experimentar retencin. El rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como el intervalo de
pesos moleculares que pueden ser separados. El volumen de elucin de una protena determinada, Ve,
refiere a la cantidad de solvente necesaria para eluir dicha protena desde el momento en que se puso en
contacto con el tamiz. El volumen muerto de una columna se define como el volumen del solvente que rodea a las esferas del tamiz. Este volumen se puede determinar experimentalmente midiendo el volumen de
elucin de una molcula ms grande que el lmite de exclusin del tamiz. As el comportamiento de una
protena particular en un tamiz se caracteriza por el cociente entre su volumen de elucin y el volumen
muerto de la columna. A este cociente se lo denomina volumen relativo de elucin.
Este tipo de cromatografa puede ser utilizado para determinar las masas moleculares de las protenas.
Para un rango considerable de masas moleculares existe una relacin lineal entre el volumen relativo de
elucin y el logaritmo de las masas moleculares. Es as que haciendo pasar una solucin de protenas de
masas moleculares conocidas puede construirse una curva de calibracin para luego con el dato de volumen de elucin relativo propio de la protena en cuestin puede estimarse su masa molecular. La precisin
de esta tcnica est limitada por la exactitud de la afirmacin subyacente que indica que las molculas conocidas y la desconocida tienen idnticas formas.
La cromatografa de exclusin molecular tambin puede utilizarse para eliminar sales de una solucin
proteica. Si por ejemplo se realiz una insolubilizacin por salado, la sal empleada puede eliminarse
haciendo una cromatografa de exclusin molecular con un lmite de exclusin menor que la masa molecular
de la protena. Al eluir la columna con el buffer, la protena abandonar la columna antes que la sal.

Tabla 9.2 Materiales frecuentemente empleados como relleno de las columnas de

exclusin molecular

Nombre

Tipo

Rango de fraccionamiento (kDa)

140

Cromatografa por Carga

Tambin llamada cromatografa de intercambio inico, este tipo de cromatografa permite la separacin
de molculas segn la carga elctrica. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostticas fijas, que retienen contraiones mviles que pueden intercambiarse por iones de la fase mvil, la cual
suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible
con agua que contiene especies inicas generalmente en forma de buffer. Los iones de sta compiten con
los analitos (en este caso protenas) por los sitios activos de la fase estacionaria. Las molculas cargadas
se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el entorno inico. La mayora de las protenas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir, hay un margen en el que no se desnaturalizan), en el que estn cargadas
positiva o negativamente. Por lo tanto si una protena es estable a valores de pH por encima del punto isoelctrico, se debe utilizar un intercambiador aninico. Si es estable a valores de pH situados por debajo del
punto isoelctrico, debe utilizarse un intercambiador cationico. Los intercambiadores aninicos poseen grupos con cargas positivas que unen aniones de forma reversible. Los intercambiadores catnicos son portadores de grupos con carga negativa que unen cationes de modo reversible. Las protenas que son portadores de cargas positivas y negativas pueden unirse tanto a los cambiadores de cationes como a los de aniones, dependiendo de su carga neta. La afinidad con la que un polielectrolito concreto se une a un cambiador
inico determinado depende de las identidades y de las concentraciones de los dems iones presentes en
la disolucin, debido a la competencia entre los diversos iones por los sitios de unin sobre el intercambiador inico. La matriz o relleno puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso ms corriente son el
dextrano, la celulosa, poliacrilamida, copolmeros del estireno y divinilbenceno, en los que el divinilbenceno
contiene los grupos cargados y se entrecruza con las cadenas de poliestireno. La eleccin entre intercambiadores fuertes o dbiles est basada en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se
va a cromatografar una sustancia dbilmente cida que necesita pH muy altos o muy bajos para su ionizacin, se requiere un intercambiador fuerte debido que este funciona a pH extremos. No obstante, si la sustancia es lbil, es preferible la utilizacin de intercambiadores dbiles. Los intercambiadores dbiles son
tambin excelentes para la separacin de molculas con una carga elevada de aquellas con poca carga,
debido a que los iones dbilmente cargados no se unen, por lo general, al intercambiador.
El primer paso para llevar a cabo esta metodologa consiste en el equilibrio de la fase estacionaria con
las condiciones iniciales deseadas para cargar la columna. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase
estacionaria se encuentra asociada a iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). El paso siguiente es sembrar la muestra y para ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y fuerza inica que
el buffer inicial para que todas las protenas cargadas se unan al intercambiador. Las molculas retenidas
por el intercambiador luego pueden ser eludas a travs de cambios en la composicin del buffer. La elusin
puede realizarse de dos formas diferentes; la ms usual consiste en aumentar progresivamente la concentracin de un contra in, de modo de desplazar el equilibrio de unin de la macromolcula hacia la forma
libre. El contrain es normalmente una sal, disuelta en eluyente (NaCl, KCl, etc). Las macromolculas de
una mezcla se irn desplazando de manera secuencial, de acuerdo a la fuerza de unin: las que posean
menos densidad de carga eluirn antes, mientras que para las de mayor carga neta el tiempo de retencin
ser mayor.
La otra manera es realizar un cambio en el pH del solvente; esta tcnica se emplea con intercambiadores dbiles. La lgica es que al cambiar el pH, de modo de acercarnos al pI de cada protena, la carga neta
de esta ir disminuyendo y en algn punto dejar de interaccionar con la matriz. Sin embargo, esta tcnica
posee sus desventajas dado que en este caso las protenas se eluirn a un pH igual a su pI su solubilidad
estar disminuida y pueden precipitar. El proceso de purificacin puede mejorarse si la columna cargada
con protenas se lava con el mtodo de elucin en gradiente. Con este mtodo, la concentracin salina o de
pH o ambos varan en forma continua a medida que se eluye la columna de manera de liberar en forma
secuencial a las distintas protenas que estn unidas al intercambiador inico. El gradiente ms utilizado es
el lineal. En todos los casos la distribucin final de los componentes en funcin de su posicin sobre el lecho
estacionario, o del tiempo en que eluyen se representan en un cromatograma como el que se muestra en la
Fig. 9.2.
Respecto al tipo de intercabiador, el dietilaminoetil (DEAE)-celulosa es el intercambiador aninico ms
utilizado mientras que la carboximetil (CM)-celulosa es el intercambiador catinico ms empleado.

Cromatografa de Afinidad.
Esta tcnica se fundamenta en la interaccin especfica de ciertas protenas por ciertos ligandos que
estn unidos covalentemente a una matriz inerte y porosa. La protena de inters al pasar a travs de este

141

Fig. 9.2. Cromatograma obtenido de un intercambiador inico.

material cromatogrfico se une al ligando mientras que las otras sustancias son arrastradas con el lquido de
elucin. La protena retenida puede luego recuperarse mediante un cambio en las condiciones de elucin
como puede ser un cambio de pH, de polaridad o incluso el agregado de una sustancia que tenga mayor
afinidad por el ligando que la protena de inters. Si la protena de inters es una enzima, el ligando puede
ser un anlogo de sustrato no hidrolizable o el propio sustrato pero agregado en condiciones tales que no
permitan el funcionamiento cataltico de la enzima.
La matriz utilizada en este tipo de cromatografa deber ser qumicamente inerte, altamente poroso y tener un elevado nmero de grupos funcionales capaces de unirse covalentemente al ligando. Uno de los
materiales que cumple con estos requisitos es la agarosa que posee numerosos grupos hidroxilos.
El poder de separacin de la cromatografa de afinidad en general es mucho mayor que el de las otras
tcnicas cromatogrficas. Esta caracterstica permitira reducir muchos de los pasos que se incluyen usualmente en una marcha de purificacin, logrando adems mayor pureza y mayor rendimiento.

Cromatografa de Interaccin Hidrofbica.

Este tipo de cromatografa permite separar molculas en base a su polaridad. Aqu la fase estacionaria
es de partculas de slica qumicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromticos
de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en una matrz apolar. Por lo tanto, para este tipo de
cromatografas se emplean mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo,
acetona y alcoholes alifticos. Las molculas se retienen en la columna en virtud de las interacciones
hidrofbicas que establecen con la slica modificada. Aunque, las interacciones hidrofbicas son en general
bastante dbiles, son tambin a menudo muy numerosas y para eluir las molculas es casi siempre necesario disminuir la polaridad del disolvente; para ello se puede substituir el agua de la fase mvil con un solvente orgnico cuya concentracin se va aumentando gradualmente. La versatilidad y eficiencia de este tipo de
cromatografa se ha visto incrementada con el uso de sistemas de alto desempeo (HPLC, del ingls "High
Performance Liquid Chromatography") que utilizan alta presin para mejorar la resolucin y reducir los tiempos de separacin.

Dilisis.
La dilisis es una forma de filtracin molecular (pero no es un proceso cromatogrfico) que implica el uso
de membranas semipermeables con poros menores a las dimensiones de las macromolculas. Estos poros
permiten que molculas pequeas como las de los disolventes, sales y metabolitos pequeos, se difundan a
travs de la membrana pero impiden el trnsito de molculas mayores. Rutinariamente esta metodologa se
emplea para cambiar el disolvente en el que se encuentran disueltas las macromolculas. Una disolucin
macromolecular se introduce en el saco o bolsa de dilisis, la cual se sumerge en un volumen del disolvente nuevo. Las molculas pequeas pasan a travs de la membrana al fluido externo hasta que se alcanza el

142

equilibrio, las macromolculas permanecern en el interior de saco de dilisis. El proceso puede repetirse
varias veces a fin de sustituir completamente un sistema disolvente por otro.
La dilisis puede usarse tambin para concentrar una solucin de protenas pero para ello se debe colocar la bolsa de dilisis dentro de un desecante polimrico como puede ser el polietilenglicol. La concentracin se logra por la difusin del agua a travs de la membrana para que la absorba el polmero.

Ultrafiltracin.
La ultrafiltracin es el proceso capaz de fraccionar, separar y concentrar sustancias sin que stas sufran
cambios. Aqu tambin se utiliza una membrana semipermeable con poros de tamao definido, que determina el tamao de las partculas que pasarn a travs de ella. Debido a que la membrana utilizada es semipermeable, es necesaria la presencia de una presin (entre 4 a 8 atm) que auxilie a las partculas a fluir a
travs de la misma. Este se puede lograr a travs de la centrifugacin.
Existen diferentes dispositivos y diferentes categoras de membrana. Estn aquellas membranas formadas por polmeros orgnicos que formando una capa definen el tamao de las partculas que podrn pasar.
Estas membranas tienen distinto tamao de poro por lo que pueden separar macromolculas de distinto
tamao. La segunda generacin de membranas de ultrafiltracin se prepara a partir de materiales cermicos. Las capas sucesivas se producen por un fritado de granos cermicos que generan poros residuales
cuyo tamao depende del tamao de los granos; para obtener una capa activa de ultrafiltracin es necesario usar suspensiones coloidales de xidos que luego se depositan sobre un material macroporoso y se
fritan. En la prctica se utilizan ambas, una delgada capa de las membranas orgnicas determina el tamao de macromolculas que se pueden separar, sobre una gruesa capa de las inorgnicas que le aportan
resistencia a la presin.

Electroforesis en Geles de Poliacrilamida.

Esta tcnica implica la migracin de iones en un campo elctrico y se emplea mayormente para la separacin de protenas, aunque tambin puede ser til para cidos nucleicos. Se puede emplear tanto con fines
preparativos como con fines analticos. El uso de la electroforesis en la separacin de protenas fue divulgado por primera vez en 1937 por el bioqumico sueco Arne Tiselius quien introdujo la tcnica denominada
electroforesis de entorno mvil que ocurra completamente en solucin. Esta tcnica requera de un equipo
sofisticado para prevenir la mezcla convectiva de las protenas durante la migracin. Luego fue reemplazada
por la electroforesis zonal que implica el desplazamiento de los iones en un soporte slido e inerte. Los geles de poliacrilamida se emplean usualmente en el caso de la separacin de protenas ya que es qumicamente inerte frente a las molculas biolgicas, transparentes y estables en un amplio intervalo de valores de
pH, temperatura y fuerza inica; son tambin resistentes a agentes desnaturalizantes (urea, detergentes) y
evitan la conveccin y minimizan la difusin. El gel de poliacrilamida que se forma por la polimerizacin de la
acrilamida y la N,N`-metileno bisacrilamida (Fig 9.3) inducida por radicales libres en un buffer se prepara de
modo que sus poros sean de un tamao comparable al de las protenas, de manera que produzcan un efecto de tamizado molecular.

Fig 9.3 Estructura de acrilamida, bisacrilamida y poliacrilamida

143

La separacin electrofortica en estos geles sin agentes denaturalizantes (geles nativos o no desnaturalizantes) depende entonces de la densidad de carga de las molculas y de su tamao, por lo que dos protenas con idntica densidad de carga, pero de tamao diferente pueden ser separadas, ya que el soporte
dificulta ms el avance de la de mayor tamao. La polimerizacin de la acrilamida se obtiene por la adicin
de catalizadores de la polimerizacin que inician y aceleran el proceso de formacin de un gel tridimensional. Normalmente, el proceso se inicia con la adicin de persulfato de amonio a una disolucin acuosa
(tampn) de ambos monmeros (acrilamida + bisacrilamida), seguido de la adicin de TEMED (N,N,N,Ntetrametilendiamina) que acta como propagador de la reaccin de polimerizacin a pH bsico (el pH cido
retarda la polimerizacin). Por lo tanto, ajustando las concentraciones de persulfato y TEMED puede controlarse la velocidad de polimerizacin. Siempre debe evitarse la presencia de oxgeno, pues inhibe la polimerizacin; por ello, la mezcla de polimerizacin debe desgasificarse a vaco (lo que impide, adems, la formacin de burbujas durante la polimerizacin que distorsionan el gel y alteran el campo elctrico). La temperatura ptima de polimerizacin es de 25-30C y el proceso ocurre en pocos minutos, aunque conviene dejarlo
transcurrir ms tiempo para que no queden restos de monmeros o de pequeas cadenas libres.
Los monmeros (ya sea en polvo o en disolucin) son neurotxicos por absorcin a travs de la piel o
por inhalacin. Por ello, deben manejarse con guantes y mascarilla. Una vez realizada la polimerizacin, la
toxicidad se reduce al mnimo, pero es recomendable continuar manipulando el gel con guantes, debido a la
posible presencia de radicales libres.
El tamao de poro de los geles de poliacrilamida viene determinado por la concentracin total de monmeros. As, un gel de poliacrilamida se define por el reticulado (%T) que es la concentracin total de monmeros (acrilamida + bisacrilamida; % p/v) y la dureza (%C) que viene dada por la relacin de la cantidad de
bisacrilamida al total de monmeros (es un valor bastante constante y, normalmente, inferior al 1%). Incrementando %T el tamao de poro decrece (los geles con %T inferiores a 2,5 % son casi lquidos y los geles
con un %T del 30% presentan un reticulado tan denso que molculas tan pequeas como 2000-3000 Da
difcilmente pueden atravesarlos). El tamao medio de poro es 800, 50 y 20 para valores de 2.5, 7.5 y
30%T respectivamente.

PAGE en Condiciones No Desnaturalizantes (Geles Nativos).

Esta tcnica implica realizar las corridas electroforticas en condiciones en las que no se altera la conformacin nativa de las protenas separadas, por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios de funcionalidad de dichas protenas (actividad enzimtica, capacidad de unin de anticuerpos, unin a
receptores, etc.).

Gel de concentracin
o stacking

KDa

Gel de resolucin
O separacin
Luego de la electroforesis
se desarma el disposi vo y se
procede a la ncin del gel

SDS-PAGE 12.5%
Tincin con Coomassie Blue R 250
Fuente de poder

Cuba electrofore ca

Fig 9.4. Electroforesis de protenas en geles de poliacrimida (PAGE) desnaturalizantes

144

Una modalidad de electroforesis no desnaturalizante que ms frecuentemente se utiliza es aquella en la

que el tampn presente en los reservorios es diferente al que impregna el gel, el cual tampoco es homogneo, ya que, en realidad, hay dos geles diferentes en uno solo: una zona de resolucin o separacin (donde
tiene lugar la separacin de las protenas) que se polimeriza sin colocar el peine (por lo que la parte superior
presenta un frente plano) y otra pequea zona de concentracin de 1-3 cm que se polimeriza sobre la anterior (quedan fundidas), que contiene los pocillos de aplicacin de la muestra y cuya finalidad es concentrar
la muestra en la zona de contacto con la zona de resolucin (figura 9.4). Este hecho es debido a que la
zona de concentracin tiene un tamao de poro muy grande (2.5-3.0%T), por lo que no es restrictiva frente
al de la zona de resolucin cuyo tamao de poro s es restrictivo.

PAGE en Condiciones Desnaturalizantes.

En presencia de algunos compuestos qumicos, las protenas pierden su estructura nativa; tales compuestos, llamados agentes desnaturalizantes, producen el desplegamiento de la protena perdiendo la organizacin tridimensional caracterstica de su funcionalidad biolgica.
En algunas protenas hay puentes disulfuro entre los residuos de Cys de una misma cadena polipeptdica
(puentes intracatenarios) o de diferentes cadenas (puentes intercatenarios) de algunas protenas con estructura cuaternaria. La ruptura de dichos enlaces puede lograrse mediante tratamiento con determinados
agentes reductores, como por ejemplo, el -mercaptoetanol (-Me) o el ditiotreitol (DTT).
Otros agentes desnaturalizantes de protenas, son la urea y determinados detergentes. La urea interfiere
con las interacciones hidrofbicas de las protenas y debe incluirse en el tampn de la muestra y en todas
las etapas que se empleen para la preparacin de los geles.
Los detergentes afectan a la estructura nativa de las protenas y a las interacciones con otras molculas
(protenas, lpidos, etc.), ya que las interacciones hidrofbicas de las protenas son sustituidas por interacciones detergentes-protena. Existen tres tipos principales de detergentes: Detergentes no inicos: Son
dbilmente desnaturalizantes y no alteran la carga de las protenas a las que se unen; se pueden utilizar en
geles con urea y en electroenfoque. Los ms empleados son el Triton X-100 y el octilglucsido, particularmente para solubilizar protenas de membrana. Se utilizan a concentraciones de 0.1-3.0% (p/v) y deben
incluirse en el tampn de la muestra y en el del gel. Detergentes inicos: Pueden tener carga positiva (catinicos) que se usan para la separacin de protenas muy cidas o muy bsicas; el ms utilizado es el cetiltrimetilamonio (CTAB). Otros poseen carga negativa y un fuerte carcter desnaturalizante; el ms empleado
es el dodecilsulfato sdico o lauril sulfato sdico (SDS). Detergentes anfteros: Son dbilmente desnaturalizantes y no afectan a la carga de las protenas; algunos, como el 3-(cloroamido propil)-dimetilamonio-1propanosulfato (CHAPS) solubilizan muy bien las protenas de membrana. Son compatibles con la utilizacin de urea y su uso es frecuente como alternativa a los detergentes no inicos.

SDS-PAGE.
Se trata de una electroforesis en la que sea adiciona el detergente SDS. Este detergente se une a las
protenas de modo que una molcula de SDS interacciona por cada dos aminocidos, lo que implica que las
cargas propias de las protenas quedan enmascaradas por la carga negativa que aporta la molcula de
SDS. De esta forma los complejos SDS-protena estn cargados negativamente de forma uniforme (la carga
por unidad de masa es prcticamente constante para todos los complejos). A diferencia del PAGE en el que
la movilidad electrofortica de las protenas es funcin del tamao y de la carga por unidad de masa; como
sta es constante para todos los complejos SDS-protena, la movilidad de las protenas en un gel SDSPAGE ser solamente funcin de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la masa molecular de la
protena, mayor ser la movilidad de la misma y viceversa.
En resumen, el SDS-PAGE es la electroforesis ms utilizada para el anlisis de protenas debido entre
otros a: -todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el mismo sentido. - la densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migracin tambin lo es y las electroforesis son muy rpidas, la separacin depende de un parmetro fsico-qumico, como es la masa molecular, que se puede calcular y - los complejos SDS-protena se tien fcilmente.
La preparacin de la muestra a colocar en el gel es importante ya que es all donde se logra la modificacin del estado conformacional y fisicoqumico de las protenas. Para preparar la muestra se agrega al
tampn en el que va disuelta la o las protenas (Tris HCl; 0.05M, pH = 6.8) un exceso de SDS (2% p/v); para
facilitar la unin del SDS a las protenas, la muestra se calienta a 100C durante al menos 3-5 minutos y,
opcionalmente, se aade -ME (5% v/v) DTT (20 mM) si se requieren condiciones reductoras. Para incrementar la densidad de la disolucin de la muestra, se aade glicerol o sacarosa al 10% (p/v) y como

145

marcador del frente de corrida, azul de bromofenol al 0.001% (p/v).

La cantidad de muestra que se aade depende de la sensibilidad de la tincin posterior que se vaya a
utilizar, pero como regla general y para geles de 20x20 cm de 1.5mm de espesor y tincin con azul de
Coomasie R250, se suele aadir entre 1-10g de muestra (ms de 100g de protena supone una sobrecarga del gel).
Para lograr condiciones desnaturalizantes el SDS debe tambin incluirse en el tampn de los reservorios, en los de los geles (de concentracin y de resolucin) y en el de la muestra para mantener las condiciones desnaturalizantes. El SDS-PAGE puede realizarse en condiciones reductoras o no reductoras; la
ausencia de reductores se traduce en que si las protenas poseen puentes disulfuro, el SDS slo producir
una desorganizacin parcial de la estructura. Si son dos o ms las cadenas unidas por puentes disulfuro
intercatenarios, en presencia de SDS, quedarn ms o menos desplegados en funcin de la posicin de los
puentes disulfuros.
Hasta aqu se describieron las principales tcnicas que se emplean usualmente en las marchas de purificacin. Lo importante de ellas es comprender sus fundamentos, sus alcances, la interpretacin de los resultados que arrojan pues ello permitir el uso adecuado de las mismas.
Como se ha mencionado en el comienzo del captulo un aspecto esencial es evaluar la purificacin en
trminos de rendimiento y pureza de acuerdo al objetivo planteado. Las medidas de actividad enzimtica
total y actividad especfica nos permitirn determinar rendimiento y grado de purificacin segn lo descripto
al comienzo del captulo.
En cuanto a calidad de la muestra obtenida, los geles nativos asociados a tcnicas inmunolgicas (inmunoblotting o western blot) sern las metodologas de eleccin por ser relativamente sencillas.
Para finalizar este captulo se incluye aqu una breve descripcin de la tcnica denominada inmmunlotting o western blot. Esta tcnica consiste en la transferencia de las protenas separadas a travs de corridas
electroforticas en geles de poliacrilamida a membranas microporosas generalmente bajo la influencia de
una corriente elctrica. Los perfiles de protenas obtenidos en los geles son as transferidos a la membrana.
La membrana con las protenas transferidas es luego tratada con una solucin de protenas ajenas al sistema de estudio (protenas de la leche) de forma que con este tratamiento toda la membrana quede cubierta
de protenas. El tratamiento de la membrana con aquella solucin de protenas se conoce como etapa de
bloqueo porque as se bloquean los sitios de la membrana de pegado inespecfico. La membrana bloqueada
luego es incubada con una solucin que contiene anticuerpos especficos de la protena de inters. Solo si
la protena de inters est presente en la membrana, el anticuerpo interaccionar especficamente con ella.
Esta interaccin puede ser luego detectada mediante la adicin de un segundo anticuerpo que interacciona
especficamente con el primer anticuerpo y que est unido a enzimas u otros marcadores. Las bandas que
interaccionaron con el primer anticuerpo y con el segundo se hacen luego visibles por incubacin con los
sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles que se depositarn en el lugar donde se
encuentran las bandas de protena (Fig. 9.5)

transferencia

Bloqueo
membrana

Incubacin
1er
an cuerpo

Incubacin
2do
an cuerpo

revelado

Fig 9.5.Pasos en la tcnica de western blot

146

Problemas
Problema 1
En la purificacin de una enzima se obtuvieron los siguientes resultados:
Fraccin
Extracto acuoso
Fraccin 40-50% de
sat. (NH4)2SO4
Eluato Ca3(PO4)2

Volumen total
(ml)
62
5

Actividad total (unidades enzim.)

4550
640

335

Protenas (mg/ml)
40,2
5,9
1,2

a. Calcular la actividad especfica en cada fraccin

b. Calcular cuntas veces se ha purificado la protena.
c. Calcular el rendimiento en todo el procedimiento.
d. Cmo supone Ud. que puede variar la actividad especfica a lo largo del proceso de purificacin?
(aumenta, disminuye, permanece constante). Por qu?
Problema 2
Se desean estudiar las propiedades de una enzima que se encuentra en plantas. Para ello se ha diseado
un mtodo de purificacin con el que se pretende obtener esta enzima en condiciones nativas, y se han
realizado algunos anlisis de sus propiedades.
Para la purificacin de esta enzima usted parti de hojas de espinaca y obtuvo un extracto crudo de 72 ml.
Seguidamente se precipit con sulfato de amonio por agregado de 117 ml de solucin saturada de dicha sal.
Luego de separar el precipitado, el mismo se resuspendi en buffer pH 7,0 en un volumen final de 25 ml. A
esta fraccin se la precipit isoelectricamente y se separ el precipitado del sobrenadante mediante centrifugacin. La fraccin conteniendo la enzima (precipitado) se resuspendi en 7.5 ml de buffer pH 7 y se cromatografi en DEAE-celulosa. Se juntaron todas las fracciones correspondientes al pico de actividad (volumen total 7,2 ml). Como ltimo paso se realiz una concentracin de la muestra.
A todas las fracciones de la purificacin se les midi actividad de la enzima y concentracin de protenas por
el mtodo de Lowry (0,2 ml de muestra en el tubo de colorimetra de volmen final 1,3 ml).
1- En base a los datos presentados: A qu grado de saturacin de sulfato de amonio precipita la enzima?
2- En cada etapa de la purificacin de esta enzima calcule: la actividad especfica, el rendimiento respecto
de la etapa anterior y del proceso total. Cree que el protocolo aplicado fue adecuado en todas las etapas?
Si no es as, explique por qu y sugiera las modificaciones que crea necesarias.
Fraccin
Extracto crudo
Ppdo. de sulfato
de amonio
Precipitacin isoelectrica
Cromatografa en
DEAE-celulosa
Concentrado de
protena

Actividad
UE/ml
342
653

Proteina
mg/ml
57
36

1262

433

2,6

1068

2,5

Actividad
Especfica

Factor de
Purificacin

Rendimiento

Problema 3. Se obtuvieron 250 g de una protena vegetal (Ch-pro) con suficiente grado de pureza para
intentar una caracterizacin fsico-qumica. Ch-pro es parte de un complejo de absorcin de luz, presentando un pico de absorcin a 520 nm, propiedad que es utilizada para seguir la marcha de su purificacin. Se
sabe que la actividad especfica de Ch-pro pura es 0,01 UA/g y que constituye el 0,9% del total de protenas celulares presentes en el extracto crudo (EC).
Para purificarla se procedi como se muestra en la tabla a continuacin. En la precipitacin fraccionada se
recuper el 90% de la actividad de Ch-pro y un 70% de las protenas solubles del extracto. En la cromato-

147

grafa de exclusin molecular se recuper (respecto al paso anterior) 11,4% de la protena total y 89% de
Ch-pro.
En el ltimo paso (cromatografa de afinidad) se recuper el 6% de las protenas totales. Considerando que
con esta marcha Ch-pro se purific 90 veces, complete la tabla (exprese el rendimiento y grado de purificacin respecto al extracto crudo).
Protena
(mg)

Act (U)

Act. Esp

Rendimiento

Purificacin

Extracto crudo
Precipitacin
fraccionada
Exclusin
cular

mole-

Cromatografa de
afinidad

0,25

90

Bibliografa
Janson, J.C. (2011) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, 3rd Edition.
New York: Wiley & Sons.
Simpson, R.J.. Adams, P.D., Golemis, E.A. (2009) Basic Methods in Protein Purification and Analysis: A
Laboratory Manual, 1st Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

148

CAPTULO 10
Protocolos de Ensayo de Actividad Enzimtica
Daniela Hozbor y Daniela Bottero

La sencillez es la hija de una complejidad de creacin que no se

nota, ni tiene por qu notarse. EDUARDO GALEANO

La vida es posible gracias a la accin coordinada y eficiente de cientos y miles de enzimas que en respuesta a seales intra o extracelulares modifican su sntesis y/o su actividad. Resulta fascinante poder
comprender el comportamiento de las enzimas, in vivo dada la exquisitez de los mecanismos involucrados
en su accin y regulacin. En contraposicin con lo complejo de las interrelaciones existentes en un sistema
in vivo, los investigadores intentamos desentraar este universo e hipotetizar sobre su comportamiento a
travs de uso de entornos simplificados dentro de tubos de ensayo en los laboratorios. En muchos casos
las aproximaciones son muy buenas. En este captulo nos centraremos en los mtodos que permiten medir
la actividad enzimtica in vitro haciendo hincapie en las consideraciones que deben tenerse en cuenta para
lograr un procedimiento adecuado.

Qu significa medir una actividad enzimtica?

Medir una actividad enzimtica implica medir la velocidad de una reaccin qumica catalizada enzimticamente. Dado que una enzima puede catalizar la reaccin en la que interviene un sustrato en particular o en una familia de sustratos relacionados estructuralmente, la medida de actividad enzimtica resulta
ser especfica para cada par Enzima-Sustrato. As, la medida de la actividad enzimtica brinda informacin
cuantitativa de la presencia de una enzima particular en una muestra en la que la enzima en cuestin puede no estar pura. La determinacin de la actividad enzimtica no slo ser reflejo de la cantidad de enzima
y de sustrato presentes en la mezcla de reaccin, sino tambin de las condiciones de temperatura, pH, concentracin y tipos de sales en las que ocurre la reaccin. La presencia de activadores e inhibidores en la
mezcla de reaccin tambin tendrn efecto sobre la velocidad de una reaccin.

Unidades para la Expresin de la Actividad Enzimtica

Como se ha mencionado, la actividad enzimtica se determina experimentalmente midiendo la velocidad de reaccin es decir, la cantidad de sustrato convertido a producto por unidad de tiempo evaluada en
condiciones de reaccin definidas. Dos unidades enzimticas utilizadas internacionalmente son, el katal
(kat) del Sistema Internacional de Unidades y la unidad Internacional (UI). Cada una de ellas se define como:
1 kat = cantidad de enzima necesaria para conviertir 1 mol sustrato en producto por segundo en condiciones de concentracin de sustrato saturante; temperatura, pH y fuerza inica ptimos para la enzima en
cuestin.
1 UI = cantidad de enzima necesaria para convertir 1 mol sustrato en producto por minuto en condiciones de concentracin de sustrato saturante; temperatura, pH y fuerza inica ptimos para la enzima en
cuestin.
Estas unidades luego se refieren en un cierto volumen de muestra. A modo de ejemplo podemos pensar
en el rtulo de un extracto que contiene a la enzima que es estudiada, en este caso la enzima galactosidasa, como:
-galactosidasa: 8 UI/ml

149

Esta notacin significa que el extracto de -galactosidasa contenido en el recipiente presenta por cada
mililitro, la cantidad de enzima capaz de catalizar la conversin de 8 moles de sustrato por minuto en condiciones de concentracin de sustrato saturante y pH, temperatura y fuerza inicas ptimos. Esta nomenclatura nos acerca a la idea de concentracin de la enzima en trminos de su funcionalidad siendo la forma
usual de expresin de concentracin enzimtica.
Si bien existe consenso internacional respecto de las unidades de actividad enzimtica ya mencionadas
es decir katales y unidades internacionales, cada experimentador puede generar una definicin propia de
unidad enzimtica en funcin de las caractersticas del sistema de estudio o de la facilidad para el manejo
de los datos. La definicin de esa unidad de actividad debe incluir: cantidad de sustrato, condiciones de
temperatura, pH, fuerza inica y sales utilizadas. Por ejemplo en el caso de la enzima -galactosidasa que
in vivo cataliza la reaccin de ruptura del disacrido lactosa, puede ser medida en el laboratorio utilizando
un anlogo de aquel sustrato, el o-nitrofenil d- galactopiransido (ONPG). Como producto de esa reaccin se obtiene un producto coloreado, el o-nitrofenol (ONP), que puede monitorearse espectrofotomtricamente a =420 nm:
ONPG ONP + galactosa
La reaccin se lleva a cabo en un medio conteniendo buffer Z (Buffer Z pH: 7;Na2HPO4.7H2O 16,1 g/l,
NaH2PO4.H2O 5,5 g/l, KCl =0,75 g/l, MgSO4.7H2O 0,246g/l, mercaptoetanol 2,7 ml/l). Teniendo en cuenta
todas estas caractersticas de la reaccin puede definirse una unidad enzimtica (UE) como sigue:
1UE= la cantidad de enzima necesaria para generar un cambio de 0,2 unidades de Absorbancia en la
mezcla de reaccin por minuto, en condiciones de [ONPG] saturante, a 37C y empleando el buffer Z.

Utilidad de las medidas de Actividad Enzimtica

La cuantificacin de la actividad enzimtica, brinda informacin til sobre la cintica enzimtica de la reaccin, posibilita caracterizar los mecanismos con los que la enzima funciona in vivo, desentraar mecanismos de regulacin, inhibicin y activacin de la misma. Las medidas de actividad enzimtica a distintos pHs
brindan adicionalmente informacin sobre la identidad de los residuos R aminoacdicos involucrados en el
sitio activo y en posiciones de la estructura proteica esenciales para estabilizar las conformaciones funcionales de la enzima. Ms an, dado que la actividad enzimtica es especfica del par enzima - sustrato, la utilidad de esta medida radica tambin en que es posible evaluarla an en mezclas complejas como el que se
puede encontrar durante una marcha de purificacin de protenas. Ante el desafo de purificar una enzima
en particular a partir de un tejido, clula u organela, es condicin necesaria contar con un procedimiento
estandarizado de cuantificacin de actividad enzimtica. La medida cuantitativa de actividad enzimtica
aplicada en los sucesivos pasos de una marcha de purificacin (ver para ms detella Captulo 9 de este
libro) ser indispensable para evaluar la marcha de purificacin en forma global y cada paso de purificacin
en particular. Puntualmente la medida de actividad enzimtica, se utiliza para calcular el rendimiento del
procedimiento de purificacin y la de actividad especfica (Actividad enzimtica total/cantidad de protena) el
grado de purificacin. Especficamente el rendimiento da cuenta del porcentaje de la cantidad de enzima de
inters que se ha podido recuperar despus de la purificacin respecto a lo que haba en el material de partida. El grado de purificacin refleja en forma cuantitativa cuntas veces se ha logrado purificar la enzima
luego del procedimiento de purificacin. Estas determinaciones de rendimiento y grado de pureza se pueden realizar respecto de un paso anterior de la marcha de purificacin segn se muestra a continuacin:
% =

Actividad total paso (i)

.100
Actividad total paso (i 1)

()
=

()

150

()
( 1)

Importante: con el fin de evitar errores de clculos hay que tener siempre presente cules son las unidades de cada
parmetro. El Rendimiento ser un porcentaje, la Actividad Especfica tendr unidades de Actividad Enzimtica (por
ejemplo UI) por masa de protenas (por ejemplo mg) o UI/mg mientras que el Grado de purificacin ser adimensional.

Cmo se mide la actividad de una enzima? Diseo de un protocolo

de medida
Consideremos una reaccin de primer orden catalizada por la enzima E en la que una molcula de un
Sustrato S se convierte a una molcula de Producto P segn se representa a continuacin:

La velocidad de esta reaccin se

determina como la cantidad de sustrato
consumido o de producto generado por unidad de tiempo segn la siguiente ecuacin:
=

[]

=
= []

Esta ecuacin es vlida para las reacciones catalizadas enzimticamente. Durante el avance de una reaccin qumica catalizada o no enzimticamente, la velocidad de la reaccin no ser constante en el tiempo.
De hecho, slo a tiempos cortos cuando todava no se ha formado suficiente cantidad de producto como
para que la reaccin inversa de P a S tenga lugar, la velocidad de la reaccin ser constante. Sin embargo
a medida que avanza la reaccin, la velocidad disminuir hasta finalmente hacerse cero (Figura 3.1). Esto
es, la velocidad que se mantiene constante por un periodo de tiempo y es distinta de cero puede calcularse
de la pendiente de la grfica que evalua la cantidad de sustrato transformado o producto formado en el
tiempo. El cambio en la concentracin de P o S en ese perodo de tiempo donde la reaccin inversa de P a
S no est teniendo lugar, se denomina velocidad inicial de reaccin o v0:
= 0 =
0

[]
[]
=

La velocidad de la reaccin como sabemos depende de concentracin inicial de sustrato en la mezcla de

reaccin, la cantidad de enzima, la temperatura y buffer por lo que todas estas variables deben ser definidas. En esas condiciones se podr hallar un valor de actividad enzimtica que eventualmente podr expresarse en las unidades enzimticas definidas es decir, katales, unidades internacionales o una unidad enzimtica propia. Para informar la actividad de un extracto enzimtico, ser necesario realizar clculos para
convertir el resultado en la Unidad definida y a un volumen de extracto enzimtico o al volumen de enzima agregado en la mezcla de reaccin.

Factores a tener en cuenta al momento de disear el protocolo

Disear un protocolo de medida de actividad enzimatica implica definir los componentes una mezcla de
reaccin en donde ocurrir la reaccin catalizada enzimticamente, los tiempos de medida, las condiciones,
la forma de medida y los controles. Respecto de la forma de medida, a la hora de disear de un protocolo
resulta escencial contar con una metodologa que permita cuantificar el sustrato o el producto de la reaccin. La metodologa especfica cuantitativa que se seleccione segn la reaccin tendr un rango de deteccin en el que se correlacionar directamente la seal detectada con la cantidad de la sustancia presente. Por tanto, el rango de deteccin del mtodo seleccionado ser una limitante a la hora de planificar el
experimento. Es decir, la reaccin debe transcurrir de forma que la cantidad (P) que se produzca o de (S)
que se convierta se encuentre entre el lmite inferior y el lmite superior de deteccin del mtodo empleado.
Por otra parte, la sensibilidad del mtodo de cuantificacin debe ser tal que permita detectar los incrementos
o disminuciones de la sustancia que se est monitoreando entre dos tiempos sucesivos de medida.
Otra condicin de contorno ineludible al planificar estos experimentos es que la medida debe realizarse
en condiciones de velocidad inicial de reaccin. Durante los clculos previos del diseo experimental se
considera que la condicin de v0, se mantendr hasta tanto no se haya consumido ms del 5% del sustrato
presente en la mezcla de reaccin. En esta condicin ser despreciable la reaccin inversa en la que el

151

producto se convertir a sustrato por lo que la velocidad de reaccin ser la velocidad instantnea de reaccin y constante.
Las medidas cuantitativas de sustrato consumido o producto formado pueden realizarse en dos formatos,
uno en que la determinacin se realiza de manera continua a medida que avanza la reaccin y otro discontinuo en el que se toman alcuotas de la mezcla de reaccin a distintos tiempos para detener la reaccin y
luego realizar la medicin analtica de sustratos o productos.
En el primer caso, es decir en los ensayos de medida continua, la reaccin transcurrir en una celda,
dentro del mismo equipo en el que se tomar la medida cuantitativa del sustrato o del producto, de modo
que el equipo de medida debe poder termostatizarse. Es muy frecuente el uso de tcnicas espectroscpicas
como la absorcin ultravioleta-visible y la emisin de fluoresecencia. As, si el sustrato o el producto son
coloreados o presentan un mximo de absorbancia en el espectro de luz UltraVioleta (ej: NAD(P)H: 340nm),
se podr emplear como equipo de medida un espectrofotmetro con control de temperatura. Mediante la
ecuacin de Lambert y Beer que relaciona la Absorbancia (Abs) con la concentracin (c) (Abs=bc) y conociendo el coeficiente de absortividad molar () especfico para la sustancia en las condiciones de medida y
el camino ptico (b), se podr calcular las concentraciones de sustrato o producto en la mezcla de reaccin
a cada uno de los tiempos que se quiera evaluar.
Cabe destacar que, an cuando no resulte posible determinar espectrofotometricamente la concentracin de S o P puede determinarse la velocidad de la reaccin a travs del empleo de estrategias como por
ejemplo el empleo de reacciones acopladas en las si puede evaluarse por espectrofotometra P o S de
esta reaccin acoplada. Brevemente, esta estrategia consiste en asociar una reaccin enzimtica a la reaccin de inters de manera que el producto de la reaccin de inters sirva como sustrato para la reaccin que
ha sido acoplada, de modo que se genere un nuevo producto que s podr ser medido cuantitativamente por
espectrofotometra. Es importante remarcar que los componentes que se introducen en la mezcla de reaccin para que la reaccin acoplada proceda de manera coordinada con la reaccin de inters, deben ser
tales que la velocidad de la reaccin dependa exclusivamente de la reaccin de inters. En trminos generales, la reaccin acoplada requerir de la incorporacin de una enzima adicional (E) y probablemente de
un nuevo sustrato (A) que slo se requiera para que la reaccin acoplada ocurra. Las cantidades de estos
componentes adicionales de la mezcla de reaccin E y A deben ser tales que no limiten la velocidad de la
reaccin catalizada por E. En general se emplean concentraciones de A saturante y de E en cantidades
mayores que E (10 veces ms E que E). As, conociendo la estequiometria de ambas reacciones y disponiendo de una metodologa cuantitativa para determinar la generacin del producto (B*) de la reaccin acoplada, la Actividad Enzimtica debida a la enzima E podr expresarse como el cambio en la concentracin
del nuevo producto B* cuantificable en el tiempo:
0 =

d[B ]

En muchos casos este tipo de ensayos acoplados se han utilizado para estudiar enzimas metablicas en
las que un producto dado puede ser oxidado o reducido por la intervencin coenzimas cromomognicas
como NAD(P)H en el mecanismo de reaccin.
En caso de que no pueda medirse el S o P porque ambos carecen de propiedades espectrofotomtricas
o porque las mismas son similares, es necesario recurrir a otro tipo de ensayos que implica la separacin y
el marcaje de sustrato o producto. Estos mtodos suelen clasificarse tambin como discontinuos ya que se
requiere de la separacin de alcuotas de la mezcla de reaccin a los tiempos de medida, la detencin de la
catlisis inmediata y la separacin eficiente de S o P. Una vez separadas las fracciones de S y P, se realizar el marcado de uno de ellos o se efectuar una reaccin qumica especfica para alguno, de manera de
realizar la cuantificacin. Para lograr la detencin instantnea de la catlisis se utilizan agentes desnaturalizantes como cidos, bases o sustancias quelantes aunque tambin puede utilizarse cambios bruscos de
temperatura. El agregado de compuestos con accin desnaturalizante sobre la enzima, aportar un entorno
qumico, que no deber interferir con el procedimiento posterior de separacin y deteccin de S o P. Un
ejemplo de marcaje, consiste en el empleo de ensayos radiomtricos que en general presentan elevada
sensibilidad. Usualmente se emplean isotopos radioactivos cuya vida media, es decir el tiempo en el que se
haya producido el decaimiento del 50% de los tomos, es mayor que el tiempo de medida de actividad en3
14
zimtica. En este sentido, los isotopos ms utilizados son H y C. En estas condiciones luego del recuento de centelleo al medio que contiene el producto purificado (por ejemplo, la resina de intercambio inico
donde se realiza un anlisis densitomtrico sobre el gel de electroforesis) se determinar la actividad segn
se especifica a continuacin:

152

cpm
=

( , cpm. mol1 )(vol, l) t, seg 2

Diseo del Protocolo de Medida de Actividad Enzimtica - Preparacin de las

Mezclas de Reaccin
Como hemos visto la medida de actividad enzimtica (o velocidad de reaccin) debe realizarse en condiciones de velocidad inicial de reaccin, es decir cuando el consumo del sustrato sea menor al 5% de la
concentracin de sustrato inicial o lo que es igual cuando la reaccin inversa de P a S no est teniendo lugar. Tambin tenemos que considerar que la mezcla de reaccin y los tiempos de medida deben establecerse de forma que la cantidad acumulada de producto o de sustrato consumido caigan dentro del rango de
deteccin del mtodo cuantitativo de deteccin.
El volumen final de la mezcla de reaccin estar sujeto al mtodo de deteccin que se vaya a emplear. En el caso ms sencillo de medidas espectrofotomtricas continuas, la mezcla de reaccin podr ser del
volumen de la cubeta espectrofotomtrica (habitualmente del orden de 1 ml). Estas celdas de medida tanto
las de plstico como las de cuarzo, en caso de medir compuestos coloreados (Absorbancias >400nm) o en
el espectro ultravioleta respectivamente, se colocarn dentro el espectrofotmetro que se programar de
manera de tomar en el tiempo medidas de Absorbancias. En caso de que las medidas sean discontinuas
deber tenerse en cuenta que el volumen final de la mezcla sea suficiente de modo tal que supere la suma
de los volmenes de al menos 5 alcuotas que se sometern a la cuantificacin a los distintos tiempos estipulados.
Cada mezcla de reaccin incluir los siguientes componentes: buffer de reaccin, extracto enzimtico y
sustrato(s). Todos estos componentes, se prepararn como stock a una concentracin mayor que la final
requerida en la mezcla de reaccin de modo que cuando cada uno se diluya en la mezcla de reaccin al
volumen final planificado, alcancen la concentracin deseada. En el caso particular del buffer de reaccin,
ste aportar no slo el pH adecuado al medio de la reaccin, sino tambin las sales (por ejemplo NaCl o
KCl), osmolitos (como polietilenglicol, glicerol, glicol o sacarosa) y agentes reducturos (como 2mercaptoetanol o ditiotreitol) en caso de necesitarse para mantener la estabilidad y la actividad de la enzima.. La preparacin de solucin stock de sustrato ms concentrada, tendr como limitante experimental la
solubilidad a la temperatura de trabajo seleccionado por lo que es deseable recabar esta informacin de
tablas.
La reaccin comenzar a hacerse visible cuando el S y la E entren en contacto. Se recomienda que la
enzima sea el primer componente a agregar en la mezcla de reaccin de forma de que se encuentre ya
termostatizada a la hora de que se agregue el sustrato. Es conveniente tambin disponer de una preparacin stock de enzima concentrada tal que, el volumen que se agregue a la mezcla de reaccin no supere el
10% del volumen final de la mezcla. El agregado de sustrato a la mezcla de reaccin marca el momento de
inicio de la catlisis o tiempo cero de la cintica a partir del cual se determinarn cantidades de producto
formado o de sustrato consumido en tiempos sucesivos. En el formato de ensayos de medida continuos,
una vez agregada el sustrato a la mezcla de reaccin e iniciado el conteo del tiempo, la cubeta de medida
se colocar inmediatamente dentro del espectrofotmetro para comenzar a tomar valores de Absorbancia.
Con los ensayos discontinuos, a los tiempos estipulados de medida se debern tomar alcuotas de la mezcla de reaccin que se combinarn con las correspondientes para la detencin de la reaccin (o solucin de
frenado o Stop). Cuando se plantea medir la actividad enzimtica en la medida de lo posible se buscar
determinar Vmax, es decir la velocidad de la reaccin cuando la concentracin de sustrato es saturante. Si el sustrato no es soluble en la condicin de sustrato saturante (100 veces el valor de Km) o si
es extremadamente caro, la determinacin de la actividad se realizar a una concentracin de sustrato que no ser la saturante, ser otra v0.
En paralelo se deben preparar blancos, que darn cuenta de componentes que absorban a la longitud
de onda del ensayo pero que no se originen en la catlisis. Estos blancos consistirn en mezclas de reaccin en las que se reemplaza en igual volumen final de mezcla de reaccin el volumen correspondiente al
Sustrato (Blanco de Sustrato) o el de Enzima (Blanco de Enzima) por agua. La absorbancia medida en el
Blanco de Sustrato ser debida a componentes del extracto enzimtico con un pico de Absorbancia a la
longitud de onda del ensayo mientras que la debida al Blanco de Enzima dar cuenta de la Absorbancia
debido al avance de la reaccin independientemente de la catlisis. Los dos valores de Absorbancia de
estos blancos debern restarse a las medidas de Absorbancia debidas a la catlisis en cada tiempo.
El paso siguiente en la confeccin de un protocolo de medida de actividad enzimtica, ser la elaboracin de una Tabla de tiempos, es decir estipular con anterioridad al inicio del ensayo los tiempos en que se
tomarn medidas de Sustrato convertido o de Producto formado. Los tiempos de medida debern asegurar
que en el menor de los tiempos se haya acumulado una cantidad del componente espectroscpicamente

153

activo suficiente que alcance el rango inferior de medida y en el otro extremo que en el ltimo de los tiempos
de medida no se supere el lmite superior del rango de medida. Debido a que en la mayora de los ensayos
de medida de actividad enzimtica no se conoce a qu velocidad proceder la reaccin, se eligen arbitrariamente tiempos de medida (por ejemplo 10 medidas entre 1 y 20 minutos) y considerando el rango de
deteccin de la metodologa que se utilice para la cuantificacin (por ejemplo para un compuesto que se
monitorea espectrofotomtricamente el rango de deteccin de la Absorbancia: 0,1- 1) se consigna que el
protocolo pautado ser til en un rango de Actividad determinado entre la velocidad mnima (Absorbancia
del lmite inferior en el mximo tiempo de medida: 0,1Abs/20minutos) y la velocidad mxima (Absorbancia
del lmite superior en el menor tiempo de medida: 1Abs/1minuto). El diseo de un protocolo que arroje valores de Actividad por fuera de este rango requerir de la modificacin de la cantidad de Enzima agregada en
la mezcla de reaccin.
Solo resta entonces ponerse manos a la obra y comenzar con las medidas!

Diseo de un protocolo experimental para la medida de actividad enzimtica Ejemplo

Les proponemos ahora, ensayar el diseo de un protocolo para la medida de la actividad enzimtica de
un extracto de la enzima -galactosidasa en UI/ml de extracto. Para efectuar esta medida disponemos de un
espectrofotmetro termostatizado con celdas de medida de 1ml y 1 cm de camino ptico que permite moni-1
-1
torear a =420 nm la aparicin de ONP ( ONP 420nm-nitrofenol = 4500 M cm ), se sabe el rango de linealidad del
equipo es 0,1 1 Absorbancia y se dispone de datos bibliogrficos del Km -galactosidasa 1,8 mM. Como reactivos se dispone del extracto enzimtico, Buffer Z 10X, solucin stock de [ONPG]= 18mM.
Debemos armar una mezcla de reaccin que nos permita monitorear la [ONP] en el tiempo ya que nuestro objetivo es calcular la actividad de un extracto enzimtico, es decir determinar la pendiente de la grafica
[ONP] en funcin del tiempo a tiempos tendiendo a cero. Idealmente querramos que la mezcla de reaccin
tenga una concentracin de sustrato saturante es decir del orden cien veces el valor de Km, en este caso
180mM, de modo de medir v0max. Dado que el ONPG presenta una solubilidad lmite de 18mM en buffer Z a
37C, tomaremos por ejemplo medidas de v0 a una [ONPG]=1,8mM y sabiendo que la enzima sigue un
comportamiento Michaeliano, se podrn transformar los valores de v 0 a Vmax. Usaremos una nica mezcla de
reaccin con volumen final de 1ml, la medida de [ONP] se realizar ajustando el espectrofotmetro a =420
nm y 37C, se tomarn medidas cada 30 segundos hasta 5 minutos (10 puntos, estipulados arbitrariamente
en el diseo del protocolo). La transformacin de los valores de Absorbancia a [ONP] se realizar con la
ecuacin Abs= ONP 420nm-nitrofenol) b C ya que nos referiremos a la concentracin del extracto enzimtico en
unidades de UI/ml de extracto . La eleccin del volumen del extracto que agregaremos es arbitraria ya que
no conocemos el valor de actividad enzimtica, sin embargo es conveniente utilizar volmenes del 10% del
de la mezcla de reaccin final.
Definidas estas variables la mezcla de reaccin quedar constituida segn:
ONPG= 100l
Buffer Z 10X = 100 l
Extracto enzimtico= 100 l
H2O= 700 l
-------------------------------------Volumen final= 1000 l
Como mencionamos tambin debemos preparar dos blancos de medida:
Blanco de enzima:

Blanco de sustrato:

ONPG= 100l
Buffer Z 10X = 100 l
H2O= 800 l
-----------------------------------Volumen final= 1000 l

Extracto enzimtico= 100l

Buffer Z 10X = 100 l
H2O= 800 l
-------------------------------------Volumen final= 1000 l

154

Estas dos mezclas se colocan a 37C y luego de 5 minutos se toma la medida de Absorbancia. Estos valores se restan a los que se obtengan a cada tiempo.
Resta definir los lmites de actividad enzimtica en los que es til este protocolo, como hemos mencionado
si en el primer tiempo de medida se toma un valor de 1Abs, es decir 1Abs/30 seg o 0,44moles de ONP/min
en la mezcla de reaccin, todas las cantidades de producto acumulado en la mezcla de reaccin en los
tiempos siguientes no se podr cuantificar. En el otro extremo, si al medir el ltimo punto a los 5min slo se
-3
alcanza una Abs de 0,1, es decir 0,1Abs/5min o 4,44.10 moles de ONP/min en la mezcla de reaccin est
ser la mnima v0 que se puede medir con el protocolo propuesto.
Lmites de velocidades medibles
con el protocolo propuesto

-3

= 0,44 4,44.10 moles de ONP/min

Para verificar que la medida de velocidad tomada es efectivamente una velocidad inicial, se debe corroborar que luego de trascurridos los 5 minutos de reaccin no se haya consumido ms del 5% del ONPG
presente en la mezcla de reaccin o sea 0,09moles. En caso de que se supere este lmite, debern tomarse medidas a tiempos menores o reducir la cantidad de enzima en la mezcla de reaccin mediante una dilucin del extracto enzimtico.

Problemas
Problema 1.
La glucoquinasa cataliza la siguiente reaccin:
glucosa + ATP glucosa-6-fosfato + ADP
El curso de reaccin se sigue colorimtricamente por el mtodo de Somogyi-Nelson, titulando la glucosa
remanente no fosforilada, previa precipitacin de la glucosa-6-P como sal de bario. Se ensaya la actividad
de una preparacin de hexoquinasa, en una mezcla de reaccin de 1 ml que contiene 0,4 ml de glucosa
++
0,01 M; 0,05 mg de enzima; Mg ; buffer pH 7,0 y ATP en exceso.
a) Si a los 3 minutos quedan 3,91 moles de glucosa/ml de mezcla de reaccin, calcule la velocidad inicial
de la reaccin expresada en moles de glucosa transformada por minuto.
-2
b) Calcule la Vmx sabiendo que KM = 0,8.10 M.
c) Calcule la cantidad total de glucosa fosforilada en los primeros 6 minutos, cuando a la mezcla de reaccin
se le agregan 0,6 ml de glucosa 0,01 M y 0,05 mg de enzima.
d) La glucosa-1,6-difosfato tiene una accin inhibitoria sobre este sistema enzimtico. Esquematice un protocolo para determinar experimentalmente qu tipo de inhibidor es.
Problema 2. La invertasa cataliza la reaccin de hidrlisis de la sacarosa:
sacarosa fructosa + glucosa
Su actividad se mide a 20 C, en una mezcla de reaccin que contiene buffer actico-acetato a pH 4,77, 20
mM. Los productos de reaccin se detectan por el mtodo de Somogii-Nelson, el cual detecta ambos monosacridos. El procedimiento consiste en parar la reaccin y desproteinizar con Ba(OH) 2 (para 0,5 ml de
mezcla de reaccin, 0,5ml de Ba(OH) 2 0,3M). Luego se agrega 0,5 ml de ZnSO4 0,3 M (precipita BaSO4), se
lleva a 5 ml finales y se filtra. A 1 ml del filtrado se le adicionan los reactivos de colorimetra (volumen final
10 ml). Los lmites del mtodo colorimtrico son 3-30 nmoles glucosa/ml mezcla colorimtrica. El KM de la
invertasa por la sacarosa es 0,01 M.
Se quiere estudiar si la urea acta como inhibidor sobre esta reaccin enzimtica. Se cuenta con los siguientes reactivos:
-Sacarosa 1 M
-Buffer HAc-Ac-, pH 4,77; 0,1 M.
-Urea 8 M.
-Reactivos de colorimetra (Somogii-Nelson).
-(OH)2Ba 0,3 M y ZnSO4 0,3 M.
-Glucosa 0,3 M.
-3
La preparacin de invertasa posee una actividad de 3.10 catales/litro.

155

a) Disee un protocolo para realizar el estudio mencionado. Especifique en el mismo:

-Mezclas de reaccin, aclarando volumen de cada reactivo, si es necesario dilucin previa de algunos de
ellos, y el orden de agregado de los mismos.
-Procedimiento para la determinacin de la actividad, incluyendo tiempos de toma de muestra, volmenes,
tubos que se utilizan y patrones necesarios.
-Controles a incluir.
b) Cmo relaciona los resultados que obtiene del experimento? Qu conclusiones puede obtener?
c) Si ud encuentra que la urea es inhibitoria de la reaccin, su experimento le permiti diferenciar entre un
inhibidor reversible o uno irreversible? Explique.
Problema 3.
Algunas bacterias y hongos son capaces de crecer utilizando como nica fuente de carbono y energa el D
(-), L (+) o el DL () mandelato. La oxidacin del mandelato requiere una actividad enzimtica, la mandelatodeshidrogenasa. En el caso de Rlzodotorula graminis (levadura) se ha podido aislar una D (-) mandelato
deshidrogenasa NAD+ dependiente.
Esta enzima cataliza la siguiente reaccin:
D (-) mandelato + NAD fenilglioxilato + NADH + H

En la caracterizacin de esta enzima se han realizado diversos experimentos (a concentracin de enzima

constante), cuyos resultados son los siguientes:
Tabla 1: Medidas obtenidas con la reaccin directa D (-) mandelato + NAD fenilglioxilato + NADH + H
KM (D (-) mandelato) M
pH
5.85
7.00
9.50
ND: velocidad no detectable

KM (NAD ) M

actividad especfica
Vmax/mg de protena

ND
309
77.5

ND
36.8
86.7

ND
3050
500

Tabla 2: Medidas obtenidas con la reaccin reversa fenilglioxilato + NADH + H D (-) mandelato + NAD
pH

KM (fenilglioxalato) M

KM (NADH) M

actividad especfica
Vmax/ mg de protena.

5.85
7.00
9.50

51.8
45.5
70.7

38
36
26.3

572
490
310

Ensayo enzimtico: a. Reaccin directa (oxidacin del D (-) mandelato). Volumen de reaccin: 1 ml
Buffer: Bicino/NaOH 200 mM pH: 9,5
NAD+; D (-) mandelato
Extracto enzimtico purificado
b. Reaccin reversa (reduccin de fenilfglioxilato)
Volumen de reaccin: 1 ml
Buffer: fosfato potsico 200 mM pH: 5,85
NADH; fenilglioxilato
Extracto enzimtico purificado
Las reacciones se realizan en cubeta termostatizada a 27C.
Se lee espectrofotomtricamente en forma continua a una longitud de onda: 340 nm
6
2
NADH: 6.22 10 cm /mol
+
El NAD no absorbe significativamente a 340 nm.
Unidad enzimtica: cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato por minuto en las
condiciones de reaccin antes descriptas y en concentracin de sustrato saturante.

156

a) Disee un protocolo para determinar el KM (D (-) mandelato) a pH:9.5. Suponga que la actividad especfica del extracto enzimtico es de 90 unidades/mg de protena
b) El L (4-) mandelato es un inhibidor de la reaccin directa Cree que el L (+) mandelato es un inhibidor
competitivo, no competitivo o acompetitivo? Por qu? Explique cmo hara para verificar su hiptesis (con
un esquema claro, pero no con protocolos detallados).
c) La influencia del pH sobre una reaccin catalizada enzimticamente puede deberse al efecto del pH sobre uno o sobre varios parmetro del sistema. Analice los datos de las Tablas 1 y 2, y sugiera cul o cules
parmetros de esta reaccin sern afectados por la variacin del pH.

Bibliografa
Bisswangner, H. (2008).Enzyme Kinetics. Principles and Methods Second Edition. Weinheim: Wiley-Vch
Verlag GmbH & Co.
Harris, T. K (2009). Measurement of Enzyme Activity. Methods Enzymol. 463: 57-71.
Marangoni, A. (2003). Enzyme Kinetics A Modern Approach. New York John Wiley & Sons.
Segel, I. H. (1975). Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons.

157

158

CAPTULO 11
Bsqueda de nuevas enzimas con actividades de
inters (por qu, para qu? cmo?): Minera de
nuevas actividades naturales. Ingeniera de protenas
hacia la creacin de enzimas de diseo.
M. J. Lozano y A. Lagares

En este captulo se introducir a la bsqueda y

diseo de nuevas enzimas. Se discutirn metodologas
asociadas a la bsqueda de nuevas actividades en
ambientes naturales. Se discutirn brevemente las
tecnologas asociadas a la modificacin de enzimas
conocidas hacia el diseo de variantes con cambios en
sus actividades catalticas (modificacin de sitios activos
y regulatorios, combinacin de dominios, shuffling).

La capacidad de las enzimas para catalizar reacciones altamente especficas en condiciones experimentales moderadas y sin la generacin de residuos txicos (condiciones amigables ecolgicamente), las ha
vuelto indispensables para una gran cantidad de procesos industriales y de estudios bsicos. En la actualidad son principalmente utilizadas en aplicaciones tcnicas (industria del papel, industria textil, formulacin
de detergentes/jabones) o para la catlisis de procesos relacionados a la industria alimentaria (incluida la
nutricin animal), en la industria cosmtica, en procesos de sntesis qumica, en la industria farmacutica, y
en actividades de investigacin y desarrollo. En el caso de la industria es frecuente, sin embargo, que la
utilizacin de enzimas sea considerada recin cuando se ha agotado el arsenal de reacciones qumicas
disponibles para un objetivo dado. Esto se debe, en general, a que en muchos casos se desconocen enzimas con las actividades requeridas (Adrio and Demain, 2014; Li et al., 2012). Por tal razn, el descubrimiento y la explotacin de nuevos tipos de enzimas, el mejoramiento de las propiedades de las mismas, y la
optimizacin de los procesos para su produccin, se han convertido todos en objetivos principales para la
innovacin en la industria de manufactura de enzimas. Con estos objetivos, adems del descubrimiento de
nuevas enzimas, en las ltimas dcadas se ha: a) incrementado la bsqueda de nuevas enzimas con caractersticas superiores a las actualmente disponibles, a partir de diferentes muestras naturales, b) desarrollado
en mayor magnitud la mejora mediante ingeniera gentica de las enzimas existentes, y c) desarrollado diferentes tecnologas para la optimizacin de los procesos catalticos.
En este captulo exploraremos las diferentes estrategias que han sido utilizadas en los ltimos aos para
la bsqueda de nuevas actividades en diferentes ambientes naturales, de genes codificantes de enzimas

159

con actividades de inters industrial, y finalmente nos dedicaremos a las herramientas de ingeniera gentica disponibles para la modificacin de enzimas.

Descubriendo Nuevas Enzimas

Entre las diferentes opciones para el descubrimiento de nuevas actividades enzimticas o de nuevas enzimas con caractersticas ms adecuadas para el uso industrial, una de las estrategias ms utilizadas ha
sido la exploracin de la biodiversidad, especialmente de microorganismos. Esta exploracin se ha focalizado principalmente en organismos que pueden ser crecidos en condiciones de laboratorio y para los cuales,
gracias a las nuevas tecnologas de secuenciacin (para una revisin ver Buermans and Dunnen, 2014),
existen cada vez ms genomas secuenciados (Land et al., 2015). En especial los microorganismos extremfilos, capaces de crecer en condiciones ambientales adversas, han resultado de gran inters, ya que de
ellos han podido aislarse enzimas ms robustas y con una mayor adaptabilidad a los procesos industriales
que se realizan en condiciones muchas veces agresivas para protenas de eubacterias (Littlechild, 2015).
La informacin actualmente disponible indica que slo aproximadamente 1% de los microorganismos del
ambiente son cultivables en condiciones de laboratorio, representando el 99% restante una fuente potencial
muy valiosa para la bsqueda de actividades aun no descubiertas, y que ha comenzado a aprovecharse con
ms intensidad en la ltima dcada mediante aproximaciones metagenmicas y ms recientemente metatranscriptmicas. Esto ha contribuido en gran manera al aumento del nmero de secuencias depositadas en
el SRA (Sequence Read Archive, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) que contiene toda la informacin cruda
generada por metodologas de secuenciacin masiva. A continuacin, describiremos brevemente las estrategias utilizadas para aprovechar los recursos genmicos disponibles (minera de datos), y para la generacin de nuevos datos en busca de funciones, prestando especial atencin a la metagenmica y metatranscriptmica.

Minera de Datos
Al da de hoy, existen genomas completos para ms de 50.000 organismos y ms de 2 petabases (2.000
terabases) de informacin gentica disponible de forma abierta. Tal reservorio de datos representa una
fuente muy valiosa de informacin para la bsqueda, por medio de herramientas bioinformticas, de genes
que codifiquen protenas con actividades enzimticas de inters (mejores que la de enzimas ya conocidas, y
nuevas actividades). Existen dos estrategias principales que permiten aprovechar esta informacin (Luo,
2012).
La primera, est orientada a la bsqueda, en un organismo del cual ya se conoce que posee una actividad de inters (Figura 11.1.a), cuales protenas son las mejores candidatas a corresponderse con la enzima/s buscada/s (se buscan secuencias/dominios que se conoce que estn asociados a las enzimas que se
buscan). Una vez identificadas las secuencias codificantes para dichas protenas es necesario clonarlas en
sistemas que permitan su expresin, y finalmente realizar una evaluacin funcional (Figura 11.1.a). La expresin es realizada normalmente a partir de microorganismos (procariotas o eucariotas) (Ghaemmaghami
et al., 2003; Rosano and Ceccarelli, 2014; van Oers et al., 2015), o mediante sistemas de expresin in vitro
(cell-free) (Katzen et al., 2005). La bsqueda de protenas homlogas puede realizarse mediante un nmero
creciente de aplicaciones bioinformticas. Las mismas se basan en la aplicacin de diferentes criterios de
bsqueda que van desde la comparacin de secuencias de ADN o protena en busca de similitudes, como
ya hemos dicho, hasta la bsqueda de patrones de estructura secundaria asociadas a las enzimas de inters. Incluso, si est disponible la estructura tridimensional (o se puede modelar) existen algoritmos que
permiten realizar alineamientos totales o locales (de dominios) de las estructuras tridimensionales, permitiendo bsquedas en homlogos ms distantes por similitud estructural de dominios relacionados al mecanismo cataltico de la enzima, a la unin de sustratos a la misma, etc, (Lok, 2015; Luo, 2012).
El segundo mtodo consiste en buscar en todas las secuencias depositadas en la base de datos aquellas con similitud de secuencia (genes/protenas) a enzimas de actividad conocida utilizadas como punto de
partida (Figura 11.1.b). En este caso, el clonado del gen codificante de la enzima de inters podr realizarse
a partir del gen sintetizado artificialmente (gene synthesis)(Kosuri and Church, 2014), lo cual permite adicionalmente introducir modificaciones como optimizar los codones presentes en el gen de inters para que
correspondan a los ms frecuentemente usados por la clula husped. Por esta metodologa se han podido
identificar muchas enzimas de microorganismos extremfilos (en general termfilos e hipertermfilos) que
presentan grandes ventajas para su implementacin industrial.

160

Fig 11.1. Minera clsica de datos para la bsqueda de actividades de inters en organismos que las expresan, o en la base de datos
general no redundante. El nmero EC (Enzyme Commission number, EC number) es un esquema numrico de clasificacin
enzimtica segn el tipo de reaccin qumica que catalizan.

Metagenmica y Metatranscriptmica
Como hemos mencionado anteriormente, estimaciones actuales indican que 85-99 % de bacterias y arqueas del ambiente no pueden ser al da de hoy propagadas en el laboratorio, lo que ha restringido severamente el conocimiento de la vida microbiana, e indirectamente el descubrimiento de nuevas enzimas. Con el
objetivo de explorar esta caja negra que representa la mayora de la biodiversidad bacteriana, surgi la
metagenmica como una herramienta que permite acceder a la genmica de comunidades complejas sin la
necesidad de crecer los microorganismos. La metagenmica puede definirse como el anlisis funcional
y de secuencia de ADN del colectivo de genomas microbianos presentes en una muestra ambiental
(para revisiones mirar Riesenfeld et al., 2004; Tringe and Rubin, 2005; Tringe et al., 2005). Existen dos
aproximaciones experimentales para la bsqueda de nuevas enzimas mediante metagenmica. La primera,
la metodologa de secuenciacin ambiental por shotgun (ESS, environmental shotgun sequencing)(Eisen,
2007), comenz a utilizarse previo al auge de las tecnologas de secuenciacin masiva, y se basa principalmente en la construccin de bibliotecas a partir del ADN aislado de muestras ambientales. Las ms
recientes, posibles gracias a los avances en las tecnologas de secuenciacin en los ltimos 10 aos, estn
basadas en la secuenciacin directa del ADN/cADN (ARN) aislado de muestras ambientales.

Bibliotecas Metagenmicas
La idea de analizar la diversidad microbiana en base a la secuenciacin de molculas de ADN / cADN
(ARN)(ARN 16S / 18S en los comienzos) de muestras ambientales surgi en los aos 80. Estos estudios
revelaron la gran cantidad de especies microbianas incapaces de ser cultivadas en el laboratorio. Recin en
el ao 2002 (Breitbart et al., 2002) se realiz el primer estudio orientado a la bsqueda de secuencias codificantes obtenidas a partir de muestras de agua marina enriquecidas en virus por la metodologa de secuenciacin ambiental por shotgun (ESS, environmental shotgun sequencing). En el ao 2003, utilizando la metodologa ESS Venter et al. (2004) tomaron muestras del Mar de Sargasso encontrando ms de 1 milln de

161

genes, de los cuales cientos de miles codificaron para enzimas. Un esquema de esta metodologa se muestra en la Figura 11.2.a.
La metodologa ESS implica la creacin de bibliotecas a partir de la clonacin del ADN aislado de la
5
muestra de inters. Una biblioteca es una coleccin de clones bacterianos , en donde cada clon contiene un
vector que posee un fragmento de ADN independiente (es decir en la mayora de los casos ser diferente,
pero puede haber clones con el mismo fragmento clonado en un evento independiente). Para la creacin de
una biblioteca metagenmica, el ADN aislado de la muestra de inters es fragmentado, lo que puede lograrse mediante diferentes mtodos (normalmente mediante la digestin con endonucleasas de restriccin) y
seleccionado por tamao para su posterior clonado en vectores de diferentes caractersticas (para clonado
de fragmentos de ADN de diferentes tamaos, que presenten alto o bajo nmero de copias por clula, de
expresin, etc) segn el objetivo del estudio metagenmico en cuestin.
Una vez creada la biblioteca, es necesario realizar un tamizado (screening), es decir una bsqueda analizando el total de los clones con un objetivo particular, cmo encontrar aquellos clones que contengan secuencias de ADN homlogas a la secuencia codificante de una enzima de inters, o bien, buscar directamente la funcin de dicha enzima (por ejemplo, si se dispone de protocolos rpidos y especficos para medir
su actividad) (Li et al., 2012). En el primero de los casos, el tamizado puede realizarse mediante la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de cebadores degenerados que hibridan especficamente con
una clase o familia de enzimas, o mediante metodologas basadas en hibridacin con sondas especficas
(colony blot). En el segundo de los casos, el objetivo es detectar directamente enzimas funcionales dentro
de la biblioteca. Este objetivo puede lograrse de diferentes maneras, pero posee fuertes limitaciones, principalmente, el requisito de un husped en el cual las protenas puedan expresarse y ser funcionales. Adicionalmente existen fragmentos que son imposibles de clonar por que resultan txicos. El husped ms utilizado es Escherichia coli, aunque hoy en da existen diversidad de huspedes disponibles.

Secuenciacin Directa y Secuenciacin de una Sola Clula (single cell sequencing)

Con el advenimiento de las tecnologas de secuenciacin de segunda y tercera generacin se facilit de
gran manera la secuenciacin de bibliotecas metagenmicas y se hizo posible el secuenciamiento directo
de ADN y cADN ARN (metatranscriptoma) aislado de muestras ambientales.
El esquema de trabajo (Figura 11.2.b-c) en este caso implica el aislamiento del ADN (o ARN, en el caso
de la metatranscriptmica) de la muestra de inters, la preparacin de bibliotecas de fragmentos (usualmente utilizando reactivos especficos segn la plataforma de secuenciacin), la secuenciacin y finalmente el
procesamiento de los datos obtenidos (Wooley et al., 2010).
En una primera etapa es necesario procesar con herramientas bioinformticas las lecturas de ADN obtenidas (millones / cientos de millones segn la plataforma utilizada)(Reuter et al., 2015) usualmente de un
tamao de entre 50 y 500 pares de bases, para obtener secuencias contiguas de mayor tamao (denominadas contigos) a partir de las cuales puede realizarse la bsqueda de genes. Este proceso, llamado ensamblado, es realizado mediante algoritmos eulerianos que son los encargados de solapar las regiones
idnticas entre todas las secuencias cortas de ADN para generar cntigos de mayor tamao, aunque raramente pueden ensamblarse genomas enteros debido generalmente a la existencia de secuencias repetidas.
A continuacin debe realizarse la prediccin de marcos abiertos de lectura (open reading frames - ORFs) y
la asignacin de una probable funcin a los mismos. Una de las estrategias ms utilizadas con este objetivo
(normalmente automatizadas mediante programas bioinformticos para anotacin de genomas o metagenomas) es la asignacin funcional basada en la identificacin de genes homlogos mediante alineamientos
de la secuencia incgnita (query) contra una base de datos conocida. Existen tambin, como ya se discuti
anteriormente, opciones basadas en alineamientos estructurales de protenas.
Adems de identificar nuevas secuencias codificantes de enzimas de inters pueden realizarse anlisis
de secuencias de rADN 16S/18S (o de otros genes marcadores de diversidad) con el objetivo de conocer la
biodiversidad presente en la muestra ambiental, y finalmente el binning (enlatado) por medio del cual se
pueden agrupar genes provenientes del mismo genoma. Esto es de mucho inters para el estudio de las
posibles rutas metablicas presentes en cada organismo.

Actualmente tambin se denomina biblioteca a la coleccin de fragmentos de ADN a secuenciar por tecnologas de secuenciacin
masiva.

162

Fig. 11.2. a. Aproximaciones metagenmicas al estudio de cominidades de microorganismos ambientales y de las funciones asociadas a ellos. Esquema de las etapas implicadas en la metodologa ESS (Secuenciacin ambiental por shotgun). b. Esquema general de las etapas implicadas en el anlisis metagenmicos por secuenciacin directa. c. Esquema del procedimiento para la secuenciacin de una sola clula.

El estudio metagenmico realizado a partir del ADN proveniente de mezclas de microorganismos posee
algunos inconvenientes que no siempre son solucionados durante el procesamiento de las secuencias. Uno
de los principales problemas es la posibilidad de generacin de secuencias quimricas a partir de fragmentos de ADN cuya secuencia es lo suficientemente similar para que puedan solaparse, pero que corresponden a organismos distintos. En la actualidad, es posible solucionar en muchos casos este problema mediante distintas estrategias. Una de ellas es mejorar el largo de las lecturas individuales de los equipos de secuenciamiento de modo de tener mayor certeza en el ensamblado de porciones de secuencias que correspondan a un mismo organismo y sean contiguas. Otra alternativa, hoy aun poco usada por su complejidad
tcnica (necesidad de reactivos de altsima calidad libres de ADN) es la secuenciacin de clulas nicas
(Figura 11.2.c). Esta tecnologa implica la separacin de clulas individuales mediante diferentes metodologas (separacin de clulas activadas por fluorescencia, FACS), microscopa de diseccin laser y otras tcnicas de micromanipulacin, para una revisin ver Wang and Navin, 2015), la amplificacin del genoma de
una clula individual, y su secuenciacin mediante plataformas de ltima generacin.

Mejorando las Enzimas Conocidas.

Como fue mencionado con anterioridad, una de las principales debilidades de los procesos biocatalticos,
es la inherente inestabilidad en el largo plazo de las enzimas. Durante la primer ola de biocatlisis, que comenz hace ms de un siglo, este problema pudo solucionarse, en algunos casos, mediante la inmovilizacin de las enzimas, lo que a su vez facilit su reutilizacin. Entre los aos 80s y 90s, surgi una segunda
serie importante de cambios al incorporar tcnicas de ingeniera de protenas principalmente basadas en

163

estudios estructurales (diseo racional), con lo que se logr extender el rango de sustratos de algunas enzimas y ampliar de esta forma el campo de aplicacin a la industria farmacutica y a la qumica fina. A partir
de los aos 90, comenzaron a usarse una serie de nuevas estrategias de biocatlisis, basadas en lo que
hoy se conoce como evolucin dirigida. La evolucin dirigida es una versin in vitro y acelerada que emula
algunos aspectos de la concepcin darwinista de la evolucin, en la que se realizan ciclos de mutaciones al
azar en la secuencia codificante de una determinada protena, luego de los cuales, mediante diferentes
estrategias de tamizado funcional se seleccionan aquellas variantes con mejores propiedades catalticas y
de estabilidad (Bornscheuer et al., 2012). Estos mtodos, de la mano de la capacidad de sintetizar genes y
operones han producido en los ltimos aos un gran avance en las posibilidades de diseo de nuevos procesos de biocatlisis.

Fig. 11.3. Esquema general de las estrategias utilizadas para el mejoramiento de enzimas.

La ingeniera de protenas involucra, normalmente, tres pasos que pueden realizarse mediante diferentes
estrategias experimentales: 1. elegir los cambios que se desea realizar, 2. realizar dichos cambios, y 3. evaluar el efecto de los mismos, lo que en general implica el tamizado de una coleccin de protenas modificadas (Figura 11.3). El grado de laboriosidad del tamizado en busca de molculas con actividades mejoradas
es variable, y cuando el mismo tiene capacidad de evaluar miles de variantes de modo eficiente se puede
eliminar por completo el diseo racional (evolucin dirigida).
En los prrafos que siguen describiremos algunos de los mtodos ms utilizados en experimentos de diseo racional de variantes moleculares, evolucin dirigida, y abordaremos brevemente los conceptos principales de ingeniera metablica.

Diseo Racional
El diseo racional de protenas implica la realizacin de mutaciones sitio dirigidas que producen un cambio de codn en la secuencia de ADN codificante de la macromolcula (en algunos casos tambin puede
ser de inters la insercin o delecin de codones) y, por lo tanto, requiere un conocimiento detallado de la
rotena que se desea modificar. Con la creciente informacin presente en las diferentes bases de datos, hoy
en da podemos obtener mucha de esta informacin con relativa facilidad. Los objetivos del diseo racional

164

de enzimas han sido principalmente alterar la especificidad y estero selectividad hacia diferentes sustratos,
modificar los sitios activos, y aumentar la estabilidad trmica.

Dnde realizar las Mutaciones?

Los estudios estructurales de enzimas aisladas de organismos termfilos (capaces de crecer a temperaturas altas y extremas) ha evidenciado que una caracterstica comn a estas enzimas es que poseen una
estructura ms rgida. Esta informacin y el conocimiento creciente de la estructura tridimensional de protenas y de las fuerzas e interacciones que las estabilizan (ver Captulo 2 de este libro), permite generar modelos computacionales en los que se puede evaluar el efecto estabilizador de diferentes modificaciones tendientes a introducir interacciones estabilizantes como puentes disulfuro, puentes salinos, y generar tambin
la estabilizacin de loops (mayor proporcin de prolina). Otros anlisis permiten evaluar la flexibilidad (Bfactor) de las cadenas polipeptdicas y focalizar la mutagnesis en las mismas (Kazlauskas and
Bornscheuer, 2009). Por otro lado, los estudios evolutivos concluyen que en muchos casos los aminocidos
ms conservados estn relacionados a una mayor estabilidad.
Como observacin general cabe destacar finalmente que diferentes estudios sealan que mientras las
mutaciones asociadas a efectos de mayor selectividad por diferentes sustratos e ismeros pticos suelen
encontrarse cercanas al sitio activo, las que se asocian a generar una mayor actividad enzimtica suelen
estar ms dispersas en toda la cadena polipeptdica.

Cmo Introducir las Mutaciones Deseadas?

Las estrategias para introducir mutaciones puntuales dirigidas (site directed mutagnesis, SDM) ms utilizadas actualmente estn basadas en mtodos similares al de QuikChange desarrollado por Stratagene
(existen varias posibilidades alternativas dirigidas a cambiar un codn especfico por otro). Este sistema
QuikChange en particular (Figura 11.4.a, parte sperior) utiliza un par de cebadores para introducir una (o
ms) mutaciones puntuales en una protena cuyo gen se encuentra clonado en un plsmido. El ADN
plasmdico que codifica para la protena salvaje (parental), se encuentra modificado por metilacin, y es
utilizado como molde para realizar una PCR utilizando los cebadores diseados para introducir la mutacin
deseada. A continuacin de la PCR se utiliza la endonucleasa DpnI capaz de degradar ADN modificado por
metilacin, por lo que el plsmido parental ser degradado, quedando solo el portador de la protena mutante.
Una mejora en el simple reemplazo de un codon por otro, es la utilizacin de metodologas como la mutagenesis de saturacin (site saturation mutagnesis, SST, Figura 11.4.a, parte inferior) (Kazlauskas and
Bornscheuer, 2009) que permite reemplazar de una misma vez un aminocido por los 19 restantes.
En algunos casos solo es posible ver efectos modificando ms de un aminocido, aunque aumenta exponencialmente la dificultad del tamizado.
Es interesante que en algunos casos en los que el reemplazo sitio dirigido de un codn por otro no ha
dado resultados, se han podido incorporar aminocidos no naturales, con caractersticas fisicoqumicas
diferentes, permitiendo un aumento en la actividad enzimtica. Para ello, se ha reemplazado el codn de
inters por un codn stop (UAG), y se ha utilizado un tRNA supresor aminoacilado con el aminocido no
natural (Mabbitt and Jackson, 2015).

Evolucin Dirigida
El termino evolucin dirigida agrupa una serie de metodologas vinculadas al modelo evolutivo darwinista
(cambio-seleccincambio-seleccivin). La estrategia implica la generacin de mutantes y el tamizado y seleccin de los que presenten las caractersticas deseadas en uno o en ms ciclos de trabajo. Se
han utilizado diferentes estrategias con este objetivo, apuntadas en general a reemplazar uno o muchos
aminocidos mediante metodologas de mutagnesis o recombinacin (para una revisin completa
verPacker and Liu, 2015). Las tcnicas ms importantes, asi como las estrategias para el tamizado se presentan en las secciones siguientes.

165

Cmo Generar las Bibliotecas de Mutantes?

Uno de los mtodos ms utilizados es la generacin de mutantes puntuales al azar. Aunque tradicionalmente las mutagnesis al azar se realizaron mediante mtodos qumicos, esta metodologa, sin embargo,
no es muy utilizada en evolucin dirigida ya que presenta sesgos en el espectro de mutaciones que puede
generar. La alternativa ms utilizada saca provecho del error de copia de las ADN polimerasas, y de la posibilidad de amplificarlo mediante modificaciones en las condiciones de la reaccin (error-prone PCR, Figura
11.4.b, parte superior). En el caso de las mutaciones puntuales, existen varias limitaciones, principalmente
el hecho de que las mutaciones beneficiosas ocurren con muy baja frecuencia por lo que es muy difcil lograr grandes mejoras. Adicionalmente, es necesario generar una gran diversidad de mutantes, y realizar el
tamizado funcional de los mismos. Para el caso de una protena de 200 aminocidos, existen 7.183.900
combinaciones para 2 sustituciones al azar, y para el caso de 3 sustituciones son 9.008.610.600 posibilidades (Bornscheuer et al., 2012). Normalmente, el proceso de evolucin dirigida por mutagnesis puntual se
realiza de forma iterativa, realizando mutaciones por un mtodo determinado, seleccionando las mejores
variantes (usualmente son mayoritarias las mutaciones deletereas), y volviendo a realizar el proceso.
Una metodologa para la generacin de variantes con una concepcin diferente (generar variantes de a
parches) es la metodologa de mezclado de ADN (DNA shuffling, Figura 11.4.b, parte inferior). En esta metodologa, la secuencia codificante para una enzima (modalidad de un solo gen) es fragmentada al azar
(usualmente con DNAsa I) y reensamblada mediante PCR (controlando el nivel de error) en secuencias
quimricas (Stemmer, 1994). Este proceso se repite iterativamente, incluyendo en algunas etapas secuencias salvajes para eliminar mutaciones innecesarias. Mediante esta metodologa es posible lograr una evolucin rpida y con grandes cambios de actividad.

Fig. 11.4. Estrategias generales de mutagnesis. Mutagnesis sitio dirigida (parte a., SDM) y mutagnesis con evolucin dirigida (parte
b., EP-PCR y DNA Shuffling)

166

Existen variantes que aumentan la potencia de esta metodologa, como son la metodologa de gene family shuffling (en la que se incorporan secuencias homlogas de diferentes orgenes aumentando de esta
forma la diversidad inicial) o synthetic shuffling (en donde se sintetizan oligonucletidos degenerados que
incorporan toda la diversidad deseada). Estas metodologas pueden ser combinadas con anlisis estadsticos multivariados (ProSAR, Fox et al., 2007), en los que se asigna un peso a cada mutacin, para decidir si
una mutacin debera pasar o no a la prxima iteracin para generar nuevas variantes por DNA shuffling.
De esta forma se ha logrado mejorar hasta 4.000 veces la actividad enzimtica.
alternativa al mezclado in vitro de secuencias de ADN, la metodologa de recombinacin de heteroduplex
(Volkov et al., 1999) permite la generacin de diversidad por recombinacin in vivo de diferentes secuencias
naturales (o mutantes) utilizados como punto de partida.
Adems de las metodologas anteriores, que son las que han sido ms utilizadas, existe una diversidad
creciente de estrategias para obtener mejores enzimas por evolucin dirigida que ofrecen mejoras en la tasa
de mutaciones [Random Chimeragenesis on Transient Templates, Assembly of Designed Oligonucleotides
(ADO), mutagenic and unidirectional reassembly (MURA), Nucleotide exchange and excision technology
(NExT), staggered extension process (StEP), Incremental truncation for the creation of hybrid enzymes (ITCHY), Non-homologous random recombination (NRR) y otros (Packer and Liu, 2015)]. En particular las metodologas ITCHY y NRR, basadas en recombinacin no homloga, presentan la ventaja de generar variantes que no existen en la naturaleza, pero al costo de generar protenas no funcionales.
Finalmente, la combinacin de estrategias de diseo racional durante las diferentes etapas iterativas del
proceso de evolucin dirigida, puede aumentar mucho las posibilidades de conseguir variantes proteicas
con mejores caractersticas de actividad y estabilidad.

Estrategias de Tamizado.
Como se describi anteriormente, todas las metodologas utilizadas en la generacin de bibliotecas de
mutantes para el mejoramiento de la actividad enzimtica terminan en un proceso de tamizado funcional.
Debido a la magnitud del espacio mutacional, el xito depende en gran forma en la capacidad de realizar el
tamizado sobre miles, incluso millones de variantes. Existen dos aproximaciones principales al tamizado de
bibliotecas enzimticas, y ambas requieren de la expresin de las enzimas en un husped determinado,
usualmente E. coli. La diferencia entre una y otra es el requisito de tener o no las enzimas separadas espacialmente (colonias aisladas / cultivos) (Packer and Liu, 2015) (Figura 11.5.a). La separacin de clones en
cultivos aislados tiene la ventaja principal de que casi todas las actividades enzimticas pueden ser determinadas en ensayos en placa, ya sea mediante la determinacin de cambios en la concentracin de productos coloreados / fluorescentes, o mediante resonancia magntica nuclear, HPLC, cromatografa gaseosa o
espectrometra de masas. La principal limitante es la infraestructura requerida, y que solo puede realizarse
el tamizado de un espacio mutacional reducido (usualmente no ms de 10.000 variantes por ronda). Este
tipo de screening es normalmente ms utilizado en diseo racional. En el caso de fenotipos observados
directamente (fluorescencia, morfologa de colonias, etc) el tamizado de un mayor nmero de variantes es
ms sencillo.
Sin embargo, la exploracin de un mayor espacio mutacional requiere de metodologas de alto rendimiento que evalan directamente poblaciones celulares y no requieren del aislamiento de clones individuales. Uno de los mtodos ms utilizados es la FACS o separacin celular activada por fluorescencia (Fluorescence-activated cell sorting, Figura 11.5.b) que permite realizar el screening de ms de 100 millones de
variantes en 24 horas, separando las clulas que poseen las variantes con mayor actividad. La FACS se
basa en la generacin de productos fluorescentes no difusibles, de modo que las clulas que expresan una
variante con mayor actividad sern ms fluorescentes en un menor tiempo, posibilitando su seleccin y separacin. Adicionalmente, FACS puede ser utilizado para el screening de protenas expresadas in vitro.
Para ello, han podido generarse pequeos compartimentos (en emulsiones agua/aceite/agua), cada uno de
los cuales posee un nico gen que es transcripto y traducido en la variante enzimtica correspondiente. La
micro emulsin tambin posee un sustrato que por catlisis enzimtica genera un producto fluorescente, el
cul al acumularse permite la separacin de las gotitas conteniendo las variantes enzimticas con mayor
actividad (Bernath et al., 2004).
En algunos casos es de inters seleccionar las protenas modificadas en base a su afinidad de unin al
sustrato. En ese caso, las metodologas de expresin de protenas en la superficie de bacteriofagos (phage
dysplay, Figura 11.5.c) o clulas eucariotas (yeast surface dysplay) ha sido de gran utilidad. Para ello, las

167

protenas son fusionadas a protenas expresadas en la superficie de la cubierta de fagos o en la membrana

celular respectivamente, y sometidas a una separacin por afinidad de unin a un sustrato inmovilizado.
Estas metodologas permiten aislar los fagos o clulas que contienen el gen codificante de las variantes
enzimticas que presentaron una mayor afinidad. Con una lgica similar, se han utilizado estrategias en las
que las protenas son unidas a los ribosomas (Ribosome dysplay) o RNA mensajeros (mRNA dysplay).
Finalmente, en algunos casos es posible acoplar la expresin de enzimas con mayor actividad a la supervivencia de una clula husped. Principalmente se ha utilizado esta estrategia para el tamizado de protenas implicadas (o que puedan vincularse indirectamente) en la resistencia a antibiticos, o para las cuales
se pueden generar mutantes auxotrficos en el husped. La seleccin se realiza entonces en base a la mejor capacidad de crecimiento en las clulas que expresan la enzima con mayor actividad.
Debe remarcarse que en todo proceso de tamizado el diseo cuidadoso del criterio y tecnologas de seleccin resulta una variable central para hacer aplicable (en trminos prcticos) la bsqueda de cualquier
nueva actividad. El diseo inteligente de la etapa de tamizado es por otra parte esencial para disminuir (muchas veces en rdenes de magnitud) los tiempos requeridos para la identificacin de las variantes moleculares buscadas.

Fig. 11.5. Esquema general de las estrategias utilizadas para el tamizado de clones que expresen enzimas con actividades de inters.

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170

Los autores
Alberto Capparelli
Es Licenciado en Qumica y Doctor en Qumica de la Universidad Nacional de La Plata e Investigador Principal del CONICET. Trabaja en cintica qumica y Fotoqumica en el INIFTA (CONICET-UNLP). Es Profesor
Emrito de la Ctedra de Fisicoqumica del Departamento de Qumica de la Facultad de Ciencias Exactas
de la UNLP. Ha dirigido numerosas tesis doctorales y publicado gran cantidad de artculos especializados y
libros. Asimismo, ha establecido numerosas colaboraciones con colegas del pas y del exterior y ha recibido
numerosos subsidios para investigacin, nacionales e internacionales.
Antonio Lagares
Es Bioqumico y Doctor en Bioqumica de la Universidad Nacional de La Plata e Investigador Principal del
CONICET. Trabaja en biologa molecular de las interacciones planta-bacteria, tambin en la genmica funcional de bacterias y en el estudio metagenmico de plsmidos bacterianos en el IBBM (CONICET-UNLP).
Es Profesor Titular del Area de Biotecnologa y Biologa Molecular del Departamento de Ciencias Biolgicas
de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP. Ha dirigido numerosas tesis doctorales y publicado gran
cantidad de artculos especializados y captulos de libros. Asimismo, ha establecido numerosas colaboraciones con colegas del pas y del exterior y ha recibido numerosos subsidios para investigacin, nacionales
e internacionales. Ha colaborado en el establecimiento de equipamientos de alta tecnologa para estudios
bioqumicos y moleculares.
Gustavo Parisi,
Es Bioqumico y Doctor en Bioqumica de la Universidad Nacional de La Plata e Investigador Independiente
de CONICET. Trabaja en Bioinformtica, especficamente en el desarrollo de herramientas computacionales
para el estudio de la evolucin y estructura de protenas. Es Profesor Titular de Bioqumica en el Departamento de Ciencia y Tecnologa de la Universidad Nacional de Quilmes y Profesor Adjunto en el Area de
Biotecnologa y Biologa Molecular del Departamento de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de
La Plata donde dicta Bioinformtica. Actualmente dirige el Programa Prioritario de Investigacin denominado
Simulacin de procesos moleculares de relevancia fisicoqumica y biolgica con sede en la UNQ. Ha dirigido numerosas tesis doctorales y publicado gran cantidad de artculos especializados y captulos de libros.
Asimismo, ha establecido numerosas colaboraciones con colegas del pas y del exterior y ha recibido numerosos subsidios para investigacin, nacionales e internacionales.
Anbal Lodeiro
Es Ingeniero Agrnomo de la Universidad de Buenos Aires, Doctor de la Facultad de Ciencias Exactas de la
Universidad Nacional de La Plata e Investigador Independiente de CONICET. Trabaja en microbiologa y
biologa molecular de las interacciones planta-micrrorganismo, especficamente en la movilidad de bacterias
en suelos. Es Profesor Adjunto del Area de Biotecnologa y Biologa Molecular del Departamento de Ciencias Biolgicas de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP. Ha dirigido numerosas tesis doctorales y
publicado gran cantidad de artculos especializados, captulos de libros y una patente. Asimismo, ha establecido numerosas colaboraciones con colegas del pas y del exterior y ha recibido numerosos subsidios
para investigacin, nacionales e internacionales.
Daniela Hozbor
Es Bioqumica y Doctora en Bioqumica de la Universidad Nacional de La Plata e Investigadora Principal del
CONICET. Trabaja en bioqumica y biologa molecular vacunas bacterianas, ms especficamente las dirigidas contra pertussis en el IBBM (CONICET-UNLP). Es Profesora Titular del Area de Biotecnologa y Biologa Molecular del Departamento de Ciencias Biolgicas de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP. Ha
trabajado en el establecimiento a nivel nacional de una red de diagnstico laboratorial para pertussis Ha
dirigido numerosas tesis doctorales, publicado gran cantidad de artculos especializados, captulos de libros
y patentes, y es editora acadmica de una revista internacional. Asimismo, ha establecido numerosas colaboraciones con colegas del pas y del exterior y ha recibido numerosos subsidios para investigacin, nacionales e internacionales. Ha colaborado en el establecimiento de plataformas tecnolgicas con equipamiento
de ltima generacin para estudios bioqumicos y moleculares.
Augusto Melgarejo
Es Licenciado en Fsica y Doctor en Fsica de la Universidad Nacional de La Plata.. Trabaja en sistemas
confinados y problemas fuera del equilibrio, especficamente en relacin con las redes metablicas y la bioenergtica bacteriana en el Departamento de Ciencias Bsicas de la Facultad de Ingeniera de la UNLP. Es

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Profesor Adjunto con Dedicacin Exclusiva en la asignatura Matemtica A (Calculo Diferencial en una y
varias variables) de la Facultad de Ingeniera de la UNLP. Ha publicado gran cantidad de artculos especializados y captulos de libros. Asimismo, ha establecido numerosas colaboraciones con colegas del pas y del
exterior y ha recibido subsidios para investigacin.
Daniela Bottero
Es Bioqumica y Doctora de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata e Investigadora Adjunta del CONICET. Trabaja en bioqumica y biologa molecular vacunas bacterianas, ms especficamente las dirigidas contra pertussis en el IBBM (CONICET-UNLP). Es Profesora Adjunta del Area de
Biotecnologa y Biologa Molecular del Departamento de Ciencias Biolgicas de la Facultad de Ciencias
Exactas de la UNLP. Ha sido Bioqumica Residente en hospitales de La Plata. Ha publicado gran cantidad
de artculos especializados y captulos de libros. Asimismo, ha establecido colaboraciones con colegas del
pas y del exterior y ha recibido subsidios para investigacin.
Mauricio Lozano
Es Bioqumico y Doctor de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata e Investigador Asistente del CONICET. Trabaja en estudios moleculares de las interacciones plantamicroorganismo, especficamente en la biologa molecular de la interaccin simbitica fijadora de nitrgeno
entre rhizobios y leguminosas. Es Jefe de Trabajos Prcticos del Area de Biotecnologa y Biologa Molecular
del Departamento de Ciencias Biolgicas de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP. Ha publicado
gran cantidad de artculos especializados y captulos de libros. Asimismo, ha establecido colaboraciones
con colegas del pas y del exterior y ha recibido subsidios para investigacin.

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