Вы находитесь на странице: 1из 65

ФГБОУ ВПО НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

КАФЕДРА АГРОХИМИИ И АГРОЭКОЛОГИИ

Титова В.И., Козлов А.В.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МИКРОБОЦЕНОЗА ПОЧВЫ, УЧАСТВУЮЩЕГО В ТРАНСФОРМАЦИИ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА

В ТРАНСФОРМАЦИИ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА НИЖНИЙ НОВГОРОД , 2011

НИЖНИЙ НОВГОРОД, 2011

ФГБОУ ВПО

Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия

Кафедра агрохимии и агроэкологии

Титова В.И., Козлов А.В.

Методы оценки функционирования микробоценоза почвы, участвующего в трансформации органического вещества

Научно-методическое пособие

Нижний Новгород, 2012

УДК 631.46 : 631.427 : 631.417.2 ББК 40.30 Т 45

ISBN 978-5-903180-67-7

Титова В.И., Козлов А.В. Методы оценки функционирования микробоце- ноза почвы, участвующего в трансформации органического вещества: Научно- методическое пособие / Нижегородская с.-х. академия. – Нижний Новгород, 2012. 64 с.

Пособие содержит описание методов определения численности и биоло- гической активности основных групп микроорганизмов, участвующих в транс- формации органического вещества почвы. Дана классификация почвенной микрофлоры, разобраны принципы ее существования, показаны направления динамики гетеротрофного микробоценоза почвы в связи с изменениями в усло- виях окружающей среды и химическом составе органического вещества, опи- саны основные деструкционно-синтетические функции и способы их количе- ственного учета. Материал сопровождается теоретическими пояснениями как по анализируемым объектам, так и по методам анализа. Пособие предназначено для освоения методики микробиологических

и биохимических исследований почвы и рассчитано на студентов, аспирантов

и специалистов агроэкологического профиля.

Печатается по решению редакционно-издательского совета Нижегород- ской государственной сельскохозяйственной академии.

Рецензенты:

И.Е. Постнов, докт. биол. наук, профессор, зав. кафедрой защиты растений Нижегородской ГСХА

К.Д. Дятлова, докт. пед. наук, профессор кафедры биохимии и физиологии растений Нижегородского ГУ им. Лобачевского

ISBN 978-5-903180-67-7

© Титова В.И., Козлов А.В., 2012

© Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия, 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ….……………………………………………………………………………………

4

1.

СТРУКТУРА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ………………………………

5

 

1.1.

Общая классификация почвенных микроорганизмов ………………………………

5

1.2.

Эколого-трофическая классификация микрофлоры почвы………………………

7

2.

БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГАЮЩИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧВЫ

12

 

2.1. Учет численности аммонифицирующей микрофлоры………………………………

12

2.2. Протеолитическая активность почвы…………………………………………………

14

3.

БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГАЮЩИХ БЕЗАЗОТИСТЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ПОЧВЫ.19

 

3.1.

Учет численности амилолитической микрофлоры……………………………………21

3.2.

Инвертазная активность почвы……………………………………………….…………21

3.3.

Учет численности целлюлолитической микрофлоры………………………………

26

3.4.

Целлюлолитическая активность почвы………………………………………………

29

4.

БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГАЮЩИХ ПРОМЕЖУТОЧНОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ………………………

34

 

4.1. Учет общей численности олиготрофных микроорганизмов почвы………………

35

4.2. Учет численности олигонитрофильной микрофлоры………………………………

35

4.3. Учет численности олигокарбофильной микрофлоры………………………………

36

5.

БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРЕОБРАЗУЮЩИХ СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ…………………………37

 

5.1.

Учет численности микроорганизмов-деструкторов гумуса………………………….40

5.2.

Полифенолоксидазная активность почвы……………………………………………

42

5.3.

Пероксидазная активность почвы……………………………………………………….47

6.

УЧЕТ МИКРООРГАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В СИНТЕЗЕ ГУМУСА ПОЧВЫ……………………………………….49

 

6.1. Учет численности грибов…………………………………………………………………50

6.2. Учет численности актиномицетов……………………………………………………….51

7.

ОЦЕНКА СТЕПЕНИ ОБОГАЩЕННОСТИ ПОЧВЫ МИКРООРГАНИЗМАМИ И РАСЧЕТ ЭКОЛОГО-ТРОФИЧЕСКИХ ИНДЕКСОВ ПОЧВЫ………………………

53

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………………

59

СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ………………………………………………………….60

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК………………………………………………………

3

63

ВВЕДЕНИЕ

Современное сельское хозяйство стремится к получению высоких урожаев сельскохозяйственных культур с приемлемым качеством продукции. Причем возделывание последних уже давно не ограничивается традиционным севом

в полевых условиях. Широкое распространение овощеводства закрытого грунта,

малообъемной культуры и культуры гидропоники, выращивания в условиях точ- ного полива или на искусственных грунтах, – все эти и многие другие методы растениеводства все больше внедряются в нынешние способы расширения пище- вой промышленности страны. Несмотря на это, как традиционное полеводство, так и практически все со- временные способы получения урожаев культурных растений, так или иначе, ос-

новываются на использовании субстрата для выращивания. Последний может представлять собой обычную почву, торф, а также различные грунты природного или искусственного происхождения, основная масса которых сложена органиче- ским веществом. Главным компонентом почв и традиционных грунтов является органиче- ская часть, поскольку в технологии выращивания культур она обеспечивает рас- тения элементами роста и развития, создает для корней оптимальные условия кислотности и буферности, а также выполняет многие другие функции. Формирование органической составляющей в почве происходит при непо- средственном участии микроорганизмов, многостороннее действие которых на предшествующие растительные и животные остатки невозможно описать

в виде нескольких биохимических реакций. Причиной тому является как очень

сложный химический состав органического вещества, так и совокупность чис- ленности и большого разнообразия его перерабатывающей микрофлоры. На сегодняшний день возрастающая потребность прикладной агрохимии

в методах диагностики пищевого режима почвы дошла до изучения микробиоло-

гической стороны доступности элементов питания и, в частности, до изучения микрофлоры, участвующей в трансформации органического вещества, поскольку именно оно может определять как потенциальное содержание, так и подвижность

питательных веществ растений. Кроме того, изучение микрофлоры различных

трофических уровней процесса переработки органической части почвы позволяет понять ее общее состояние как компонента экосистемы. Пособие содержит описание методов определения численности и биохими- ческой активности микроорганизмов, участвующих в трансформации органиче- ского вещества почвы, что поможет исследователю оценить характер изменений

в пашне как в системе питания сельскохозяйственных культур.

4

1. СТРУКТУРА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ

Микробное сообщество почвы является сложной системой взаимодейству- ющих организмов, чрезвычайно разнообразной и многочисленной по количеству обитающих видов, выполняемым функциям и отношению к окружающей среде. Предпосылкой формирования относительно постоянного и устойчивого микроб- ного пула в почвах различных географических широт послужила многовековая эволюция педосферы в меняющихся условиях окружающей среды. Ежегодные колебания температуры воздуха и наличия свободной влаги, а также количества свежего органического вещества привели к формированию таких условий жизни микроорганизмов, в которых они зачастую пребывали в физиологическом стрес- се, что и побудило почвенный микробоценоз к ведению активной борьбы за фак- торы жизни. Основная роль микроорганизмов в формировании и развитии почв Земли сводится к соединению в педосфере двух главных круговоротов вещества – большого геологического и малого биологического, в результате чего вещество планеты изменяется по общему биогеохимическому пути “органическое веще- ство – минеральное – органическое – минеральное…”. Биогеохимические процессы минерализации мертвого органического веще- ства растений и животных до конечных продуктов (Н 2 О, СО 2 , СО, СН 4 , NH 3 , N 2 , Н 2 и т.д.) с их возвратом в атмосферу идут при обязательном участии различных групп микроорганизмов, населяющих почву. Не случайно около 90% всего угле- кислого газа на Земле образуется из органических веществ при их микробном разложении и только 10% приходится на долю дыхания высших организмов и де- ятельности человека. Высвобождение углекислого газа, исходного для фотосин- тетического процесса, замыкает глобальную цепь превращения вещества планеты и, тем самым, движение материи не приостанавливается. Общее предназначение и, вместе с тем, разносторонняя деятельность поз- воляют всю совокупность микроорганизмов почвы классифицировать по многим признакам, но наиболее универсальные градации представлены в виде их общей и эколого-трофической классификации.

1.1. Общая классификация почвенных микроорганизмов Несмотря на крайне сложную и до конца нераскрытую организацию мик- роскопической жизни в почве, всю совокупность почвенных микроорганизмов условно классифицируют по двум основным признакам: по цитологическому (клеточному) признаку и по виду их основной деятельности в почве (функцио- нальному признаку). Вместе с тем, примеры приведенных классификаций не

5

охватывают всего почвенного микробонаселения, а указывают только на основ- ные его виды, так или иначе участвующие в преобразовании органического ве- щества.

1.

Классификация по клеточному признаку:

а). Неклеточные формы жизни вирусы (Virus), вироиды (Viroides) и фаги (Phages): не способны к самостоятельной жизни в почве вне клеток других ор- ганизмов, поскольку являются паразитами как растений, животных и человека (вирусы и вироиды), так и микроорганизмов (фаги). Их роль в почвенных про- цессах сводится скорее к регулированию численности и биохимической ак- тивности прочих микроскопических обитателей почвенного покрова; б). Клеточные формы жизни:

доядерные формы прокариоты (Procaryotae): археи или архебактерии (Mendosicutes); истинные бактерии (Eubacteria), в т.ч. цианобактерии (Cyanobacteria), актиномицеты (Actinomyces) и другие группы. Выпол- няют самые разнообразные биохимические реакции в почве, в том числе участвуют в преобразовании неорганических веществ (архебактерии), вы- зывают гниение мертвой растительной и, главным образом, животной мас- сы (многие из истинных бактерий), проводят фотосинтез и образуют пер- вичное органическое вещество (цианобактерии), образуют пигментные ве- щества и компоненты гумуса (актиномицеты);

ядерные формы эукариоты (Eucaryotae): грибы (Mycota), в т.ч. низшие, высшие и дрожжи; микроскопические водоросли (Algae); простейшие (Protozoa); лишайники (Lichenes) и другие группы. Грибы участвуют в де- струкции всех, в том числе трудноразлагаемых веществ почвы (лигнин, смолы, клетчатка, дубильные вещества, гумус, искусственные полимеры, нефтепродукты и т.п.) и, при этом, образуют пигменты, имеющие значение в гумусообразовании. Микроскопические водоросли проводят фотосинтез и дополнительно насыщают почву органическим веществом. Роль про- стейших в почве состоит, главным образом, в изменении численности кле- ток прокариотных микроорганизмов. Лишайники как симбиотические ор- ганизмы грибов и микроскопических водорослей способны участвовать в фотосинтезе, насыщая почву органическим веществом, а также способны разлагать компоненты минералов.

2.

Классификация по функциональному признаку:

6

а). Синтетики (продуценты) – вне зависимости от способа питания главная их роль в почве состоит в биохимическом образовании определенных компонен- тов, значимых для формирования органического вещества почвы:

бактерии-азотфиксаторы (связывая молекулярный азот воздуха, образуют

аммиак (NH 3 ) и белковые вещества); микроскопические водоросли (осуществляя фотосинтез, образуют моле- кулярный кислород (О 2 ) и первичные органические вещества – углеводы);

пигментированные бактерии, актиномицеты и грибы (синтезируя пигмен- ты, участвуют в образовании гумуса почвы);

б). Деструкторы (редуценты) – также вне зависимости от способа питания

главная их роль в почве состоит в разложении определенных веществ, как орга- нических, так и минеральных:

- органотрофы – разлагают преимущественно органическое вещество:

аммонификаторы (разлагают белковые вещества почвы);

амилолитики (разлагают углеводные соединения почвы);

целлюлозо-, лигнино-, пектинолитики;

гумусоразлагающие микроорганизмы;

углеводородредуцирующие и другие виды деструкторов;

- литотрофы – преобразуют преимущественно неорганическое вещество:

нитрификаторы (преобразуют NH 4 + в NO 3 );

денитрификаторы (преобразуют NO 3 в N 2 );

сульфатредуцирующие (преобразуют различные соединения серы);

фосфорные, силикатные, металлоокисляющие и другие виды.

1.2. Эколого-трофическая классификация микрофлоры почвы Почвенные микроорганизмы в большей или меньшей степени являются космополитами, но за счет их микрозонального развития в почве, при появлении в среде обитания какого-либо субстрата, они, так или иначе, начинают его преоб- разование. В таком случае говорят о выполнении местной микрофлорой, сформи- ровавшейся в той или иной микрозоне, определенной функции, которая проявля- ется в изменении качественных и количественных свойств самой почвы (напри- мер, плодородия пашни определенной территории). Общие теоретические положения о разделении почвенного микробоценоза и о его экологическом характере были высказаны еще в учении академика С.Н. Виноградского, которое позднее развил и дополнил выдающийся ученый- микробиолог Е.Н. Мишустин. В итоге сформировалось единое представление об

7

экологических нишах почвенной микробиоты, которое разбивает всю ее сово- купность на 4 условных группы микроорганизмов: зимогенная, олиготрофная, ав- тохтонная и автотрофная микрофлора. Первые три группы микроорганизмов относятся к гетеротрофам (органо- трофам), которые в своем питании нуждаются в готовом органическом веще- стве. В свою очередь, автотрофная микрофлора способна образовывать органи- ческое вещество в собственных клетках и для этого использует в питании веще- ства неорганической природы. Поэтому многие из автотрофных микроорганиз- мов почвы являются литотрофами. Зимогенная микрофлора (от греч. zyme – закваска, genes – рождающий) – в обычном состоянии почвы (неудобренность или промежуток времени между по- ступлениями растительных остатков в почву) небольшая по количеству группа микроорганизмов, которая, как правило, дает резкий подъем своей численности в момент поступления свежего органического вещества, так как специализирует- ся на разложении легкодоступных органических соединений растительного и жи- вотного происхождения. Из бактерий в эту группу входят представители р. Bacil-

lus, Pseudomonas, Arthrobacter, из грибов – р. Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, в том числе дрожжевые формы р. Lypomyces, Cryptococcus, Candida

и многие другие виды микроорганизмов. Олиготрофная микрофлора (от греч. oligos – немного, trophe – питание) составляет бóльшую часть почвенного микронаселения, представители которого усваивают питательные вещества из растворов с низкой концентрацией как азот- содержащих (олигонитрофилы), так и безазотистых углеродсодержащих органи-

ческих (олигокарбофилы) соединений. Названная “микрофлорой рассеяния”, эта группа, по сути, является преемницей минерализационного процесса, активируе- мого зимогенной микрофлорой, и завершает разложение остатков свежего орга- нического вещества. Сюда входят многие бактерии р. Hyphomicrobium, Ancalomi- crobium, Prosthemicrobium, Stella, Seliberia, Caulobacter, Renobacter и другие роды

и виды. Зимогенная и олиготрофная часть микробоценоза почвы объединяется в общую группу сапротрофных микроорганизмов (или сапротрофов), поскольку перерабатывают мертвое органическое вещество остатков растений и животных различной степени разложенности. Автохтонная микрофлора (от греч. autochtoes – абориген, местный, ко- ренной, исконный) представляет собою исходное сообщество микроорганизмов неудобренной почвы, характерное для конкретного ее типа, изначально в ней развивающееся и постоянно в ней присутствующее. По сути это потенциальный запас микроорганизмов любой почвы. Данная группа включает в себя множество

8

представителей различных таксономических классов, которые в условиях есте- ственного биоценоза завершают минерализацию труднодоступных органических соединений растительных и животных остатков и участвуют в процессах их гу- мификации, а в условиях агроценоза, где наблюдается минимальное поступление органического вещества и повышена аэрация почвы, минерализуют гумусовые вещества как единственный источник углеродной пищи. Поэтому автохтонную часть почвенного микробного сообщества в зависимости от складывающихся условий окружающей среды рассматривают как в качестве синтетиков гумуса, так и в качестве его деструкторов. Из автохтонных микроорганизмов наиболее подробно изучены бактерии р. Nocardia и р. Pseudomonas. Также в эту группу от- носят некоторые виды р. Flavobacterium, Arthrobacter, Micromonospora, Mycobac- terium, Rhodotula и другие виды. Автотрофная микрофлора (от греч. autos – сам, trophe – питание) – мик- роорганизмы, трансформирующие неорганические соединения почвы. В эту группу входят нитрифицирующие бактерии (р. Nitrosomonas, Nitrovibrio и дру- гие), разрушители минералов почвы – литотрофы (р. Metallogenium, Bacillus mu- cilaginous, siliceous) и многие другие виды микробиоты.

Понимание роли микрофлоры в эволюции и формировании почвы связано со знанием ее метаболизма. По типу питания строгих зимогенных микроорганиз- мов или олиготрофов в почве не существует. Причиной тому послужило ее мик- розональное состояние, создающееся вокруг единичных сообществ микроорга- низмов, которое диктует свой способ питания. Известно, что клетки микробов собраны в микроколонии, которые изоли- рованы друг от друга большими пространствами почвенных пор, прослоек воды, органического и минерального вещества, поэтому могут развиваться сравнитель- но индивидуально. Например, в условиях наличия свежего органического веще- ства на поверхности почвенной частицы в нем активно развивается зимогенная микрофлора. Следом за типичными сапротрофами на оставшейся части органи- ческого вещества будут развиваться олиготрофы. Но при этом внутри самóй ча- стицы, где практически нет запаса органической пищи, развиваются только оли- готрофы и автотрофы (рис. 1.1 и 1.2). Для более полного познания особенностей жизни микробоценоза почвы академиком Д.Г. Звягинцевым были сформулированы принципы взаимного су- ществования почвенных микроорганизмов. Принцип запаса микроорганизмов (принцип формирования в почве микроб- ного пула) – в почве всегда имеется избыточный запас микробов, не обеспечен- ных для полноценной жизнедеятельности органическим веществом и другими

9

элементами питания. В условиях данного лимитирующего фактора развитие и размножение микроорганизмов зачастую происходит сравнительно медленно. По этой причине почву также называют местообитанием с рассеянным пищевым достатком. С другой стороны, микробный пул – это не только огромная числен- ность, но и весьма большое разнообразие. По микробному генофонду почва явля- ется самым богатым субстратом на Земле и среди прочих местообитаний выжи- ваемость всего комплекса микроорганизмов в условиях неблагоприятной окру- жающей среды максимальна именно в почве.

максимальна именно в почве. Рис. 1 .1. Микрозональное развитие

Рис. 1.1. Микрозональное развитие бактерий (по Звягинцеву, 2005)

Рис. 1.2. Микрозональное развитие грибов (по Звягинцеву, 2005)

Принцип запаса микробных метаболитов – несмотря на то, что микроско- пическая жизнь в почве протекает медленно, только часть общего количества микроорганизмов находится в состоянии глубокого покоя (в виде эндоспор и анабиотических (некультивируемых) форм бактерий, спор актиномицетов и гри- бов). Причиной тому служит то, что в почве постоянно поддерживается запас легкодоступных органических веществ. В частности, главную роль в питании микроорганизмов играет запас внеклеточных метаболитов, который способствует выживанию микробных клеток в неблагоприятных условиях. Данный запас представлен некоторым количеством сахаров, органических кислот и спиртов, аминокислот, пуриновых, пиримидиновых оснований и други- ми соединениями. Этот запас не дает погибнуть микробам в периоды, когда в почву или в конкретную ее микрозону не поступают свежие органические веще- ства. Кроме того, почва обладает механизмом поддержания запаса метаболитов на необходимом уровне. Он основывается на накоплении внеклеточных гидроли- тических ферментов, благодаря работе которых запас простых органических ве- ществ пополняется в результате гидролиза гумуса и других устойчивых органи- ческих полимеров, имеющихся в почве.

10

В итоге запас гидролитических ферментов обеспечивает запас простых ор-

ганических веществ, а последний дает возможность существования в почве ко- лоссального пула микроорганизмов. Принцип дублирования выполняемых функций – все физиолого- биохимические процессы почвы строятся на существовании нескольких функци- онально дублирующих друг друга видах микроорганизмов. Например, нитрифи- кацию в почве проводят представители восьми основных родов микроорганизмов (р. Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio, Nitrobac- ter, Nitrospira и Nitrococcus), а функцию разложения органического вещества спо- собно выполнять бесчисленное множество видов почвенного микробонаселения. Принцип обратимости микробиологических процессов – любой процесс превращения вещества в почве микроорганизмы ведут в двух взаимно противо-

положных направлениях: разрушение белков, сахаров, целлюлозы, хитина и од- новременное их образование в собственных клетках. Принцип ненасыщенности комплекса почвенных микроорганизмов – риск мгновенной гибели чужеродных микроорганизмов (например, микрофлоры при- меняемых биопрепаратов, а также патогенных видов микроорганизмов, для кото- рых основным местом обитания является живое растение или животное), попа- дающих в почву, достаточно мал, поскольку почва является благоприятной сре- дой обитания. По этой причине микробы биопрепарата какое-то время активно развиваются и действуют, а возбудитель болезни растения (животного) не поги- бает и сохраняется в покоящейся форме.

В то же время внесенный инородный микроорганизм никогда не займет

доминирующего положения среди автохтонной части микробоценоза, поскольку не приспособлен к существованию в данных условиях. Вследствие этого биопре- параты имеют свой период активного действия, а фитопатогенные виды микро- бов в почве практически неактивны и сохраняются в цистах или спорах до изме- нения условий жизни (попадание возбудителя болезни в растение-хозяина).

В целом нельзя говорить о строгой организации почвенного микробоценоза

и абсолютной дифференциации микроорганизмов по выполняемым функциям. Однако можно констатировать, что почвенные микроорганизмы во всей совокуп- ности по-разному реагируют на изменения окружающей среды и, в частности, на количество и химические особенности поступающей для них пищи. Вслед- ствие этого изменяется структура и численность микробного пула почвы, которое неизбежно отражается на показателях ее плодородия.

11

2. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГА- ЮЩИХ АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧВЫ

Среднее количество бактерий в почве составляет примерно 70% от всех почвенных микроорганизмов, актиномицетов – 30%, грибов – 1-3% от объема микрофлоры. В зависимости от складывающихся условий каждая из этих групп выполняет в почве определенную роль, а конечный результат их деятельности будет определяться особенностями взаимоотношений между функциональными единицами микробоценоза (микробными консорциями) и изменением веществен- ного состава почвы. В целом же функциональный подход к учету деятельности микрофлоры почвы складывается из индивидуального изучения количества и биологической активности каждой микробной группы, что имеет большое значение в комплекс- ной оценке агроэкосистем. В условиях агроценоза основной массой ежегодно поступающего в почву органического вещества являются растительные остатки сельскохозяйственных культур, органические удобрения и сидераты, вещественный состав которых складывается, в основном, из азотсодержащих и безазотистых компонентов. Вме- сте с накопленной микробомассой все количество мертвого органического веще- ства растений подвергается процессу минерализации. Известно, что разложение органических соединений азота выполняется, главным образом, аммонифицирующими микроорганизмами. В дальнейшем со- единения азота перерабатываются нитрифицирующей и денитрифицирующей группами почвенного микробоценоза. Безазотистые органические вещества раз- лагаются по типу кислородного окисления и сбраживания амилолитиками, цел- люлолитиками и прочими группами микроорганизмов зимогенной части микро- боценоза почвы. Все эти процессы приводят к пополнению почвы биогенными элементами, доступными для растений.

2.1. Учет численности аммонифицирующей микрофлоры Процесс разложения органического азотсодержащего вещества почвы начинается с аммонификации. Аммонификация – разложение белковых соединений растительных, живот- ных остатков и органических удобрений, которое протекает под действием про- теолитических экзоферментов (протеаз) и сопровождается выделением аммиака. При наличии в почве свежего органического вещества аммонифицирующая микрофлора становится самой многочисленной и таксономически разнообразной.

12

Поэтому в таких условиях данная группа микроорганизмов временно занимает нишу зимогенной части микробоценоза почвы. Численность аммонификаторов, представленных аэробными и анаэробны- ми прокариотами, плесневыми грибами, актиномицетами и прочими видами мик- рожизни, может достигать 10 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) и выше. Образующийся в результате жизнедеятельности этой группы микроорга- низмов аммиак, а также промежуточные продукты распада белков (амины, ами- нокислоты и их производные) способны усваиваться растениями в качестве ис- точников главного элемента питания – азота. Поэтому учет численности аммо- нифицирующей микрофлоры и протеолитической активности почвы является важным этапом в микробиологической оценке состояния плодородия пашни и в почвенно-экологическом мониторинге сельскохозяйственных земель.

Общую численность аммонифицирующей микрофлоры учитывают чашеч- ным методом посева на мясо-пептонный агар (МПА) или методом предельных разведений с посевом на пептонную воду (ПВ). Посев на чашки с МПА производят из одного разведения почвенной сус- пензии на выбор (от 10 5 до 10 8 ) в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность поч- вы, тем большее ее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят в термостате при +28°С, подсчет выросших колоний проводят на вто- рой-четвертый день после посева. Приготовление мясо-пептонного агара проводят в соответствии с методи- кой, изложенной на упаковке готового сухого препарата МПА. Автоклавирова- ние приготовленной питательной среды проводят при давлении 1,5-2,0 атм. в те- чение 20-30 мин. Посев в пробирки с ПВ (по 5 мл среды на пробирку) производят из несколь- ких (3 х -4 х и более) разведений почвенной суспензии (от 10 2 до 10 8 ). Диапазон высеваемого разведения выбирают также в зависимости от содержания органиче- ского вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем более широкий интервал ее разведения необходимо взять для посева). В качестве микробиологического отклика аммонификаторов ожидают и фиксируют помутнение среды в пробирках, появление пузырьков NH 3 ↑ и поси- нение лакмусовой бумаги в парах воздуха пробирки. Инкубацию пробирок про- водят в термостате при +28°С, учет – на второй-четвертый день после посева. Приготовление пептонной воды ведут следующим образом: к 1 л дистил- лированной воды прибавляют 5 г пептона, размешивают стеклянной палочкой, ставят на асбестовую сетку, доводят до кипения и, помешивая, кипятят 15 мин

13

на медленном огне. Затем в горячий раствор вносят навески веществ:

MgSO 4 •7H 2 O – 0,5 г, КН 2 РО 4 – 1 г, К 2 НРО 4 – 1 г и NaCl – 0,5 г. Соли полностью растворяют перемешиванием, затем среду разливают по колбам, закрывают ват- ными пробками и автоклавируют при давлении 1,0 атм. в течение 25 мин. После подготовки питательных сред производят посев почвенной суспен- зии в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний на чаш- ках Петри (на МПА) или микробиологический отклик в пробирках (на ПВ) и пе- ресчитывают в численность КОЕ/1 г почвы. Методика посева почвенной суспензии на чашки и пробирки, а также рас- чет и оценка численности микрофлоры почвы подробно изложены в учебно- методическом пособии Титовой В.И., Козлова А.В. “Методы учета численности и биомассы микроорганизмов почвы” – Н. Новгород: НГСХА, 2011. – 40 с.

2.2. Протеолитическая активность почвы В связи с тем, что с повышением плодородия почвы наиболее тесно связана активность ферментов азотного режима и, в частности, ферментов протеаз, зна- чимость определения протеолитической активности почвы, в том числе и выра- батываемой аммонифицирующей микрофлорой, очень высока. Поэтому биохи- мическую активность разложения азотсодержащего органического вещества в почве оценивают по ее протеолитической активности, то есть по активности гидролитических ферментов класса протеаз. Протеазы – класс экзоферментов микробного и растительного происхож- дения, катализирующих гидролитическое расщепление белков растительных, жи- вотных остатков и органических удобрений до полипептидов и, далее до амино- кислот, действуя на пептидную связь по принципиальной схеме:

кислот, действуя на пептидную связь по принципиальной схеме: 14

14

Амины, аминокислоты и образующийся из них аммиак способны усваи- ваться культурными растениями и в целом влиять на азотный режим почвы, что, несомненно, важно в оценке продуктивности пахотных земель.

Определение протеолитической активности почвы по Галстяну и Арутюнян

Принцип метода Метод основан на способности протеолитических ферментов почвы рас- щеплять белковый субстрат до аминокислот с последующим определением их количества с помощью нингидрина. В качестве субстрата используют желатин. По количеству образующихся из желатина аминокислот судят о протеолитиче- ской активности почвы, которая выражается в мг глицина/1 г почвы за 24 ч. Для оценки уровня протеолитической активности почвы в схему опыта вводятся следующие варианты:

1) почва без субстрата (без желатина): показывает естественную протеоли- тическую активность почвы. Определяется количество глицина (К 1 ), ко- торое образуется из имеющегося в почве свежего азотсодержащего ор- ганического вещества. По сути это активность собственно фермента, имеющегося в почве на момент определения; 2) почва с субстратом (с добавлением желатина): показывает потенциаль- ную протеолитическую активность почвы. Определяется количество глицина (К 2 ), которое образуется из заведомо увеличенного количества органического вещества за счет добавления желатина. По сути это био- химическая активность аммонифицирующей микрофлоры, вырабатыва- ющей протеолитические ферменты для разложения субстрата; 3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность опреде- ления результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, ис- пользующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество гли- цина и других аминокислот (К 3 ), которые могут содержаться в воде и реактивах.

Ход работы В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических колбах на 100 мл закладывают три варианта опыта.

1). Вариант 1. Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу

15

на 100 мл, приливают 0,5 мл толуола и 10 мл фосфатного буфера (рН 7,4). Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно перемешивают круговыми движениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию в термостат при +30°С на одни сутки.

2). Вариант 2. Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу на 100 мл, приливают 0,5 мл толуола и 10 мл 1% раствора желатина, приготов- ленного на фосфатном буфере (рН 7,4). Колбу закрывают корковой или резино- вой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно перемешивают круговыми дви- жениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию в термостат при +30°С на одни сутки.

Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности и расчета K w .

3). Вариант 3. В коническую колбу на 100 мл приливают 0,5 мл толуола и 10 мл 1% рас- твора желатина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4). Колбу закры- вают корковой или резиновой (неплотно) пробкой и встряхивают в течение 30 мин. на ротаторе.

По окончании инкубации в колбы всех вариантов опыта приливают по 0,5 мл 0,1 n раствора H 2 SO 4 и 3 мл 20% раствора Na 2 SO 4 для осаждения бел- ков. Полученные суспензии в колбах перемешивают в течение 5 мин. на ротато- ре, переливают в три центрифужные пробирки и центрифугируют со скоростью 6000 об./мин. в течение 10 мин. Затем в три мерные колбы на 50 мл отбирают по 5 мл центрифугатов и приливают в каждую по 1 мл 2% раствора нингидрина, приготовленного на ацетоне. Смесь встряхивают и нагревают на кипящей водя- ной бане в течение 10 мин. В течение нагревания раствор приобретает сине- фиолетовый оттенок. Окрашенный раствор в каждой колбе доводят до метки ди- стиллированной водой и колориметрируют при λ = 540 нм (фотоколориметр ФЭК-56М, светофильтр 6) в кюветах на 5 мм.

Выбор искомого показателя протеолитической активности почвы и, соот- ветственно, сравнение окрасок растворов в кюветах производят согласно схеме, представленной в таблице 2.1.

16

2.1.

Схема фотоколориметрического сравнения окрасок растворов анализируемых образцов при определении протеолитической активности

   

Раствор сравнения (холостой раствор)

п/п

Искомый показатель

Раствор измерения

1

актуальная (естественная) протеолитическая активность (АПА)

раствор почвы, заложенной без желатина (К 1 )

раствор реактивов (К 3 )

2

потенциальная протеолитическая активность (ППА)

раствор почвы, заложенной с желатином (К 2 )

раствор реактивов (К 3 )

Построение калибровочного графика Навеску 0,1 г химически чистого глицина растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл: в 1 мл полученного рабочего раствора будет со- держаться 1 мг глицина. Затем берут 6 мерных колб на 50 мл, приливают в каж- дую определенный объем рабочего раствора в соответствии с таблицей 2.2, затем добавляют по 1 мл раствора нингидрина, встряхивают и ставят на кипящую водя- ную баню. Нагревание растворов проводят до появления устойчивой сине- фиолетовой окраски различной интенсивности, которая проявляется, как прави- ло, через 2-10 мин. с начала нагревания. Затем доводят до метки и проводят ко- лориметрирование калибровочных растворов относительно холостого раствора, приготовленного на дистиллированной воде (в дополнительную мерную колбу на 50 мл приливают 10 мл дистиллированной воды, добавляют 1 мл 2% раствора нингидрина, ставят на кипящую водяную баню примерно на 10 мин., затем дово- дят до метки и перемешивают).

2.2. Исходные данные для построения калибровочного графика

Объем рабочего раствора глицина, мл

Содержание глицина, мг/50 мл

 

колбы

Отсчет по прибору

1

1

1,0

 

2

2

2,0

 

3

4

4,0

 

4

6

6,0

 

5

8

8,0

 

6

10

10,0

 

По полученным данным строят калибровочный график, где по оси ординат откладывают значения отсчета по прибору (оптические плотности калибровоч- ных растворов), а по оси абсцисс – соответствующие им значения концентрации глицина (мг/50 мл).

17

Расчет результатов анализа Полученное по графику содержание глицина (мг/50 мл) в анализируемом об- разце почвы, заложенном без желатина, пересчитывают в актуальную протеоли- тическую активность почвы по следующей формуле:

АПА = А 1 V 1 K w / V 2 m

(1)

где АПА – актуальная протеолитическая активность почвы, мг глицина/1 г абс.-сух. почвы за 24 ч.; А 1 – количество глицина опытного образца К 1 , найденное по калибровочному графику, мг/50 мл; V 1 – общий раствор после инкубации почвы, из которого берется аликвота, мл (V 1 = 14 мл); V 2 – аликвота, взятая на анализ, мл (V 2 = 5 мл); m – навеска почвы, г (m = 2 г); K w – поправка на влажность почвы, рассчитываемая по формуле:

K w = (100 + W) / 100

где W – влажность почвы, %.

(2)

Полученное по графику содержание глицина (мг/50 мл) в анализируемом образце почвы, заложенном с желатином, пересчитывают в потенциальную про- теолитическую активность почвы по формуле (3):

ППА = А 2 V 1 K w / V 2 m

(3)

где ППА – потенциальная протеолитическая активность почвы, мг глицина/1 г абс.-сух. почвы за 24 ч.; А 2 – количество глицина опытного образца К 2 , найденное по калибровочному графику, мг/50 мл и т.п.

ФОРМА ЗАПИСИ

   

Объем

Отсчет

Количество

глицина,

Протеолитиче-

Оценка

Образец

Навеска

аликво-

по

найденное

ская активность, мг глицина / 1 г почвы за 24 ч.

активно-

почвы

почвы, г

ты, мл

при-

бору

по графику,

мг/50 мл

сти

m

V

2

А

ПА

табл. 7.3

почва

2

5

 

А 1

АПА –

 

почва + желатин

2

5

 

А 2

ППА –

 

18

Реактивы 1) раствор желатина 1%: 1 г желатина растворяют в 99 мл фосфатного бу- фера при нагревании на асбестовой сетке; 2) фосфатный буфер (рН = 7,4): готовят из раствора А (5,938 г Na 2 HPO 4 •2Н 2 О растворяют в дистиллированной воде в колбе на 500 мл

и доводят до метки) и раствора Б (0,908 г КН 2 РО 4 растворяют в дистилли-

рованной воде в колбе на 100 мл и доводят до метки), смешивая в химиче- ском стакане 400 мл раствора А и 100 мл раствора Б; 3) раствор H 2 SO 4 0,1 n: 2,8 мл конц. H 2 SO 4 (пл. 1,84) вливают в 500 мл ди- стиллированной воды в мерной колбе на 1 л, осторожно перемешивают

и доводят водой до метки;

4) раствор Na 2 SO 4 20%: 20 г сульфата натрия растворяют в 80 мл дистилли-

рованной воды при нагревании на асбестовой сетке; 5) раствор нингидрина 2%: 1 г нингидрина растворяют в стакане в 50 мл ацетона. Непосредственно перед анализом 47,5 мл ацетонового раствора нингидрина смешивают в химическом стакане с 0,5 мл концентрированной (ледяной) уксусной кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Полученный раствор используется только в свежеприготовленном виде; 6) глицин, х.ч.; 7) толуол, х.ч.

Определение численности аммонифицирующей микрофлоры в почве и определение почвенной протеолитической активности является важным звеном в комплексной микробиологической оценке биохимической активности как це- линных, так и окультуренных земель сельскохозяйственного производства.

3. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГА- ЮЩИХ БЕЗАЗОТИСТЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ ПОЧВЫ

Одновременно с активной жизнедеятельностью аммонифицирующих мик- роорганизмов, принимающих участие в разложении белков и их производных, в почве существуют целые популяции микробиоты, деятельность которых направлена на деструкцию безазотистых компонентов почвенного органического вещества. К данным группам микробоценоза относят многие виды неспоровых бактерий, большинство микроскопических плесневых грибов, некоторые актино- мицеты, лишайники и другие формы почвенной микрожизни. В то же время известно, что процессы разложения таких безазотистых ор- ганических веществ почвы, как крахмал, клетчатка, гемицеллюлоза, пектины, та-

19

нины и прочие, напрямую зависят от наличия в почвенном растворе доступного азота, поскольку последний принимает участие как в построении клеточных сте- нок данных микроорганизмов, так и в формировании ими выделяемых ферментов (амилаз, инвертаз, целлюлаз и других), разрушающих безазотистые полимеры. Усваивая минеральный азот, данные микроорганизмы получают дополнительную энергию для разложения небелковых компонентов почвенного органического вещества. Поэтому изучение процессов минерализации безазотистых органических веществ почвы начинают с учета численности микроорганизмов, способных им- мобилизировать неорганические формы азота.

Иммобилизация – процесс микробиологического связывания минерального азота, образующегося в результате аммонификации белковых веществ раститель- ных остатков и органических удобрений. Процесс иммобилизации азота почвенной микрофлорой играет значитель- ную роль в превращениях как азотсодержащих, так и безазотистых веществ. Известно, что при разложении каждых 100 г органического вещества рас- тительных остатков (или в среднем 50 г углерода) аммонификаторы на синтез белка своих клеток используют примерно 2 г почвенного азота (C : N = 25 : 1). При содержании азота в органическом веществе разлагающейся растительной биомассы менее 2% (C : N > 25 : 1) он, таким образом, может быть полностью иммобилизирован (связан) в клетках микроорганизмов, а при более высоком его содержании (C : N < 25 : 1) в почву будет выделяться свободный аммиак, кото- рый затем преобразуется в нитрат-ион (обе формы азота подвижны и способны к миграции). Именно поэтому навоз и другие органические удобрения животного происхождения насыщают почву аммиачным азотом, так как соотношение C : N в них очень узкое (C : N ≈ 5 : 1). В то же время внесение в почву соломы в качестве органического удобре- ния может приводить к азотному голоданию сельскохозяйственных культур, так как за счет широкого соотношения в соломе углерода и азота (C : N ≈ 50 : 1) ам- монифицирующая микрофлора для обеспечения своей жизнедеятельности и де- струкции соломы начинает использовать почвенный азот. Учитывая, что до 25% минерального азота удобрений может быть иммоби- лизировано в клетках микробов и какое-то время пребывать в недоступном для растений состоянии, следует признать, что явление микробного распределения неорганических соединений азота в почве очень важно для оценки его доступно- сти в питании культурных растений. Это дает возможность принять квалифици- рованные решения по улучшению питания растений, рекомендуя к внесению уг-

20

лерод- или азотсодержащие вещества, а также снизить (или предотвратить) газо- образные потери азота из почвы в окружающую среду (атмо- и гидросферу). Именно поэтому в рассмотрение микробиологического преобразования бе- зазотистых компонентов удобрений и почвы следует включать методы, позволя- ющие учесть численность и продуктивность микрофлоры, способной усваивать минеральные формы азота.

3.1. Учет численности амилолитической микрофлоры

Общую численность амилолитической микрофлоры, участвующей в разло- жении безазотистых соединений почвы и, одновременно с этим, обеспечивающей

иммобилизацию азота, учитывают чашечным методом посева на крахмало- аммиачный агар (КАА). Посев на чашки с КАА проводят из одного на выбор разведения почвенной

суспензии (от 10 4 до 10 6 ) в зависимости от содержания органического вещества

в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее

большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию чашек проводят

в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят на пятый-десятый

день после посева. Приготовление КАА производят путем последовательного растворения

в 1 л дистиллированной воды следующих реактивов: крахмал – 10 г, (NH 4 ) 2 SO 4

2 г, К 2 НРО 4 – 1 г, MgSO 4 •7H 2 O – 1 г, NaCl – 1 г, СаСО 3 – 3 г, агар-агар – 20 г. Со-

ли и агар полностью растворяют нагреванием на асбестовой сетке и перемешива- нием. Затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и авто- клавируют при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 20-30 мин. После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспен- зии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.

3.2. Инвертазная активность почвы

Определение инвертазной (инвертолитической) активности почвы, помимо ферментов инвертаз, вырабатываемых корнями растений, также основано на уче-

те биохимических особенностей микроорганизмов-иммобилизаторов минераль- ного азота, поскольку его усвоение данной микрофлорой сопровождается разло- жением углевода крахмала. После разрушения крахмала до олиго- и дисахаров, амилолитическая мик- робиота начинает продуцировать ферменты глюкозидгидролазы (инвертазы), способные расщеплять ди-, три- и полисахариды по гликозидным связям до мо- номеров по принципиальной схеме:

21

Так как углеводов и близких к ним соединений в почвенном

Так как углеводов и близких к ним соединений в почвенном органическом веществе, микробных клетках и растительных остатках достаточно много (до 60% биомассы растительных остатков составляют углеводы), а их гидролиз невозможен без наличия свободного аммиачного азота, определение активности глюкозидгидролазных ферментов (в частности, активности инвертазы) позволяет одновременно судить как о способности к преобразованию углеводов раститель- ных остатков, так и о иммобилизирующей способности микробоценоза почвы. Определение инвертазной активности почвы является одним из главных критериев оценки ее общей биологической активности. Уровень инвертолитиче- ской активности отражает содержание в почве легкогидролизуемых углеводов, которые служат энергетическим материалом для многих почвенных гетеротро- фов.

Определение инвертазной активности почвы по Купревичу и Щербаковой

Принцип метода Метод основан на способности глюкозы и фруктозы, образующихся при гидролизе сахарозы, восстанавливать медь, содержащуюся в реактиве Феллинга. По количеству образовавшейся закиси меди (Cu 2 O) определяют содержание мо- носахаров в растворе. Поскольку катализатором деструкции данных сахаров в почве является именно инвертаза, то по количеству образующихся гексоз и су- дят об инвертазной активности почвы, которая выражается в мг глюкозы / 1 г почвы за 24 ч.

22

Для оценки уровня инвертазной активности почвы в схему опыта вводятся следующие варианты:

1) почва без субстрата (без сахарозы): показывает естественную инвертаз- ную активность почвы. Определяется количество глюкозы и фруктозы (К 1 ), которое образуется из имеющегося в почве углеводистого органи- ческого вещества. По сути это активность собственно фермента, имею- щегося в почве на момент определения; 2) почва с субстратом (с добавлением сахарозы): показывает потенциаль- ную инвертазную активность почвы. Определяется количество глюкозы и фруктозы (К 2 ), которое образуется из заведомо увеличенного количе- ства органического вещества за счет добавления сахарозы. По сути это биохимическая активность амилолитической микрофлоры, вырабатыва- ющей инвертолитические ферменты для разложения субстрата; 3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность опреде- ления результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, ис- пользующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество глю- козы и других моносахаров (К 3 ), которые могут содержаться в воде и реактивах.

Ход работы В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических колбах на 100 мл закладывают три варианта опыта.

1). Вариант 1. Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек

в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу

на 100 мл, добавляют 5 мл ацетатного буфера (рН 4,9) и 4 капли толуола. Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое перемеши-

вают круговыми движениями и ставят на суточную инкубацию в термостат при +30°С.

2). Вариант 2. Навеску свежей почвы 2 г, просеянную через сито с диаметром ячеек

в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу

на 100 мл, добавляют 5 мл ацетатного буфера (рН 4,9), затем приливают 15 мл 8% раствора сахарозы и 4 капли толуола. Колбу закрывают корковой или резино- вой (неплотно) пробкой, содержимое перемешивают круговыми движениями и ставят на суточную инкубацию в термостат при +30°С.

23

Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности

и расчета K w (формула (2)).

3). Вариант 3. В коническую колбу на 100 мл приливают 15 мл 8% раствора сахарозы, за- тем добавляют 5 мл ацетатного буфера (рН 4,9) и 4 капли толуола. Колбу закры- вают корковой или резиновой (неплотно) пробкой и встряхивают в течение 30 мин. на ротаторе.

После инкубации содержимое колб всех вариантов доводят до кипения на асбестовой сетке, затем полученные суспензии фильтруют в три конических кол- бы. Далее берут три стеклянных бюкса, взвешивают каждый на аналитических весах с точностью до 0,001 г, затем из колб с фильтратами отбирают в соответ- ствующий бюкс по 8 мл полученной жидкости и приливают в каждый по 6 мл свежеприготовленного реактива Феллинга. После этого бюксы ставят на асбесто- вую сетку, содержимое доводят до кипения и кипятят в течение 2 мин. Далее бюксы с полученными кроваво-красными взвесями снимают с сетки

и отстаивают в течение 1 часа для осаждения осадка закиси меди (Cu 2 O). Затем осторожно, не взбалтывая, из каждого бюкса пипеткой с резиновой грушей уда- ляют надосадочную жидкость, после чего осадок закиси меди на дне бюксов дважды промывают горячей дистиллированной водой из промывалки, макси- мально удаляя промывную воду из бюкса пипеткой. Затем бюксы с влажными осадками помещают в сушильный шкаф и сушат до постоянного веса при +70°С. Выбор искомого показателя инвертазной активности почвы и, соответ- ственно, арифметическое вычисление необходимой массы осадка Cu 2 O находят по разности масс осадков закиси меди согласно схеме, представленной в таб- лице 3.1.

3.1. Схема математического сравнения масс осадков оксида меди (I) анализируемых образцов при определении инвертазной активности

 

Уменьшаемое значение массы осадка Cu 2 O

Вычитаемое значение массы осадка Cu 2 O

п/п

Искомый показатель

 

актуальная (естественная)

масса осадка Cu 2 O для почвы, заложенной без сахарозы (К 1 )

масса осадка Cu 2 O из реактивов (К 3 )

1

инвертазная активность (АИА)

 

потенциальная

масса осадка Cu 2 O для почвы, заложенной с сахарозой (К 2 )

масса осадка Cu 2 O из реактивов (К 3 )

2

инвертазная активность (ПИА)

24

Полученную разность в массах осадков закиси меди переводят в массу эле- ментной меди Cu (умножением на коэффициент 0,888), затем переводят в массу меди из объема взятой на анализ аликвоты (8 мл) на весь объем исходного рас- твора (20 мл). После чего по таблице 3.2 высчитывают количество глюкозы, со- ответствующее найденному количеству меди.

3.2. Количество глюкозы (мг), эквивалентное количеству меди (мг) (по Петербургскому, 1963)

Медь

Глюкоза

Медь

Глюкоза

Медь

Глюкоза

Медь

Глюкоза

20,4

 

10 64,6

 

33 105,8

56

144,5

79

22,4

 

11 66,5

 

34 107,6

57

146,1

80

24,3

 

12 68,3

 

35 109,3

58

147,7

81

26,3

 

13 70,1

 

36 111,1

59

149,3

82

28,3

 

14 72,0

 

37 112,8

60

150,9

83

30,2

 

15 73,8

 

38 114,5

61

152,5

84

32,2

 

16 75,7

 

39 116,2

62

154,0

85

34,2

 

17 77,5

 

40 117,9

63

155,6

86

36,2

 

18 79,3

 

41 119,6

64

157,2

87

38,2

 

19 81,1

 

42 121,3

65

158,8

88

40,1

 

20 82,9

 

43 123,0

66

160,4

89

42,1

 

21 84,7

 

44 124,7

67

162,0

90

43,9

 

22 86,4

 

45 126,4

68

163,6

91

45,8

 

23 88,2

 

46 128,1

69

165,2

92

47,7

 

24 90,0

 

47 129,8

70

166,7

93

49,6

 

25 91,8

 

48 131,4

71

168,3

94

51,5

 

26 93,6

 

49 133,1

72

169,9

95

53,4

 

27 95,4

 

50 134,7

73

171,5

96

55,3

 

28 97,1

 

51 136,3

74

173,1

97

57,2

 

29 98,9

 

52 137,9

75

174,6

98

59,1

 

30 100,6

 

53 139,6

76

176,2

99

60,9

 

31 102,3

 

54 141,2

77

177,8

100

62,8

 

32 104,1

 

55 142,8

78

   

Расчет результатов анализа Пример: закладывали опыт на определение потенциальной инвертазной ак- тивности почвы. В ходе опыта в бюксе опытного варианта № 2 образовалось 40,5 мг осадка закиси меди, в бюксе контрольного варианта № 3 – 0,5 мг осадка. Искомое количество осадка закиси меди составит 40 мг (40,5 – 0,5 = 40,0). Пере- считаем это количество в массу чистой меди: 40 × 0,888 = 35,52 мг. Оно соответ- ствует 8 мл реактива Феллинга, а 20 мл реактива будет соответствовать 88,8 мг меди (35,52×20 / 8 = 88,8). По таблице 3.2 находим два числа, между которыми располагается эта величина: 88,2 мг меди эквивалентно 46 мг глюкозы, а 90,0 мг – 47 мг глюкозы. Находим разницу: 90,0 - 88,2 = 1,8 мг меди. Следовательно, 1 мг

25

глюкозы (47 - 46 = 1 мг) соответствует 1,8 мг меди, а 1,2 мг (90,0 - 88,8 = 1,2 мг) будет соответствовать 0,67 мг глюкозы (1,2×1,0 / 1,8 = 0,67). Таким образом, искомая величина глюкозы, отвечающая 88,8 мг меди, со- ставится из следующих слагаемых: 46 мг + 0,67 мг = 46,67 мг. Полученный результат делим на 2 для пересчета на 1 г почвы и умножаем на поправку влажности почвы K w (формула (2)). Конечная оценка значения инвертолитической активности почвы произво- дится с использованием таблицы 7.3.

ФОРМА ЗАПИСИ

 

Навеска

Объем

Вес осадка Cu 2 O, мг

Количество глюкозы, найденное

по таблице, мг

Инвертазная активность, мг глюкозы / 1 г почвы за 24 ч.

Оценка

Образец почвы

почвы,

аликво-

актив-

г

ты, мл

ности

m

V

табл. 3.1

ИА

табл. 7.3

почва

2

8

   

АИА –

 

почва + сахароза

2

8

   

ПИА –

 

Реактивы 1) раствор сахарозы 8%: 8 г сахарозы растворяют в 92 мл дистиллированной воды; 2) ацетатный буфер (рН 4,9): раствор А – 136,1 г ацетата натрия растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л. Раствор Б – 82 мл конц. HCl (пл. 1,19) растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л. Ацетатный буфер приготавливают смешиванием 50 мл раствора А и 16 мл раствора Б, затем смесь доводят дистиллированной водой до метки в мерной колбе на 250 мл; 3) реактив Феллинга: раствор А – 40 г CuSO 4 •5H 2 O растворяют в дистилли- рованной воде и доводят до 1 л. Раствор Б – 200 г сегнетовой соли C 4 H 4 O 6 KNa•4H 2 O растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 150 г NaOH или KOH и доводят до 1 л. Реактив Феллинга – непосредственно пе- ред анализом растворы А и Б смешивают в химическом стакане в соотно- шении 1:1; 4) толуол, х.ч.

3.3. Учет численности целлюлолитической микрофлоры Из всего разнообразия безазотистых органических соединений, попадаю- щих в почву естественным или агрохимическим путем, наибольшее значение в питании сельскохозяйственных культур имеют компоненты, содержащие цел-

26

люлозу и ее производные, которые чаще всего (или прежде всего) определяют численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Целлюлоза (клетчатка) – наиболее распространенное углеродное соедине- ние, синтез которого в масштабах биосферы занимает первое место: более 50% от всего синтезируемого органического вещества. Продуцентами целлюлозы, в основном, являются высшие растения, а также некоторые грибы (класса Oomy- cetes) и редкие виды бактерий (уксуснокислые р. Acetobacter). Разложение целлюлозы, являющейся доминирующим компонентом поч- венного органического вещества, растительных остатков и удобрений, является одним из основных звеньев в цепи превращения органических соединений почвы. Кроме того, микробная минерализация безазотистых органических веществ в па- хотном слое, как весьма длительный и энергоемкий естественный деструкцион- ный процесс, является одним из самых масштабных в педосфере, играет очень важную роль в круговороте углерода и, в первую очередь, в процессе его возвра- та в атмосферу в виде СО 2 как сырья для процесса фотосинтеза. Разложение клетчатки как сложный комплексный процесс совершается при участии как минимум двух групп микроорганизмов: во-первых, истинных бакте- рий, миксобактерий и актиномицетов, ферменты которых действуют на субстрат при контакте клеточной поверхностью; во-вторых, грибной микрофлоры, более продолжительное воздействие которой обеспечивается выделяемыми ею в виде экзоферментов целлюлазами, разрушающими клетчатку. В целом развитие целлюлозоразрушающих микроорганизмов резко повы- шается при попадании в почву растительных остатков, соломы и других грубых органических веществ, что, как следствие, приводит к микробной иммобилизации от 40 до 80% минерального азота (в том числе и азота удобрений) с последую- щим сохранением его от вымывания. Кроме того, с процессом деструкции цел- люлозных компонентов напрямую связано образование гумусовых веществ поч- вы и формирование почвенной структуры. Агротехническая нагрузка на пашню ускоряет минерализацию клетчатки, вследствие чего активизируется почвенное дыхание и приземный слой воздуха насыщается углекислым газом. Это способствует оптимизации углеродного пи- тания культурных растений. Поэтому изучение жизнедеятельности целлюлоли- тической микрофлоры имеет столь же важное значение, как и изучение микроор- ганизмов, трансформирующих соединения азота в почве.

Численность целлюлолитических микроорганизмов учитывают чашечным методом или методом предельных разведений с посевом на агар или среду Гет- чинсона-Клейтона (АГК или СГК).

27

Посев на чашки с агаром Гетчинсона-Клейтона производят из одного раз- ведения почвенной суспензии на выбор (от 10 4 до 10 6 ) в зависимости от содер- жания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посе- ва). Инкубацию чашек проводят в термостате при +30°С, подсчет выросших ко- лоний проводят на восьмой-десятый день после посева. Приготовление АГК производят следующим образом: к 1 л дистиллиро- ванной воды поочередно прибавляют и растворяют при нагревании на асбестовой сетке следующие реактивы: NaNO 3 – 2,5 г, К 2 НРО 4 – 1 г, MgSO 4 •7H 2 O – 0,3 г, NaCl – 0,1 г, CaCl 2 •4H 2 O – 0,1 г, FeCl 3 •6H 2 O – 0,01 г, агар-агар – 15 г. Соли и агар полностью растворяют перемешиванием стеклянной палочкой. Затем к нагретой среде при непрерывном помешивании добавляют 5 г порошка натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na) и продолжают мешать до полного раство- рения реактива. Если такового нет в наличии, то его заменяют навеской 10 г фильтровальной бумаги, предварительно замоченной в стакане в 100 мл дистил- лированной воды и вручную разрыхленной стеклянной палочкой до состояния однородной волокнистой массы. После полного растворения и равномерного распределения волокон бумаги по среде с помощью индикаторной бумаги и 10% раствора NaOH уравновешива- ют рН среды до 7.0, доводят ее до кипения, разливают по колбам, закрывают ват- ными пробками и автоклавируют при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 30 мин. Посев в пробирки на среду Гетчинсона-Клейтона (по 5 мл среды на про- бирку) производят из нескольких (3 х -4 х и более) разведений почвенной суспензии (от 10 2 до 10 6 ), также в зависимости от содержания органического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем более широкий интервал ее разведения необходимо взять для посева). Литровый состав данной среды аналогичен среде чашечного метода за исключением из состава КМЦ-Na или фильтровальной бумаги, а также агара. Учет микробиологического отклика целлюлолитиков, выращиваемых на жидкой среде Гетчинсона-Клейтона с применением фильтровальной бумаги вме- сто КМЦ-Na, имеет свои особенности. После розлива питательной среды в пробирки и ее заражения почвенной суспензией, в каждую пробирку опускается узкая полоска стерильной фильтро- вальной бумаги длиной 7-8 см и шириной 0,5 см, половина которой должна нахо- диться над поверхностью среды. Стерилизацию бумаги проводят в сушильном шкафу при +105°С в течение 2 х ч. (нарезанные полоски перед стерилизацией за- ворачивают в небольшой лист крафт-бумаги).

28

Если же в качестве источника целлюлозы используется введенная в состав питательной среды соль КМЦ-Na, то полоски фильтровальной бумаги в анализе не нужны и после заражения среды почвенной суспензией закрытые пробирки сразу помещаются в термостат. Инкубацию проводят при +28°С, учет – на деся- тый-четырнадцатый день после посева. В качестве микробиологического отклика целлюлолитиков ожидают и фик- сируют помутнение среды в пробирках, появление желтых и оранжевых пятен как в объеме столбика среды, так и на его поверхности, разрушение фильтро- вальной бумаги на границе жидкости с воздухом. После подготовки питательных сред производят посев почвенной суспен- зии в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний на чаш- ках Петри (на АГК) или микробиологический отклик в пробирках (на СГК) и пе- ресчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.

3.4. Целлюлолитическая активность почвы Учет целлюлолитической активности почвы проводят по учету активности гидролитических ферментов целлюлаз, продуцируемых многими группами поч- венного микробоценоза.

Определение целлюлолитической активности почвы по Багнюку и Щетинской

Принцип метода Метод основан на способности целлюлолитических ферментов почвы рас- щеплять углеводные полимеры до глюкозы с последующим определением ее ко- личества с помощью антрона. В качестве субстрата используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na). По количеству образующейся из КМЦ-Na глюкозы судят о целлюлолитической активности почвы, которая выражается в мкг глюкозы/10 г почвы за 48 ч. Для оценки уровня активности целлюлолитических ферментов в схему опыта вводятся следующие варианты:

1) почва без субстрата (без КМЦ-Na): показывает естественную целлюло- литическую активность почвы. Определяется количество глюкозы (К 1 ), которое образуется из имеющегося в почве безазотистого органического вещества. По сути это активность собственно фермента, имеющегося в почве на момент определения; 2) почва с субстратом (с добавлением КМЦ-Na): показывает потенциаль- ную целлюлолитическую активность почвы. Определяется количество глюкозы (К 2 ), которое образуется из заведомо увеличенного количества

29

органического вещества за счет добавления КМЦ-Na. По сути это био- химическая активность целлюлолитической микрофлоры, вырабатыва- ющей фермент целлюлазу для разложения субстрата; 3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность опреде- ления результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, ис- пользующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество глю- козы и других соединений (К 3 ), которые могут содержаться в воде и ре- активах.

Ход работы В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических колбах на 100 мл закладывают три варианта опыта.

1). Вариант 1. Навеску свежей почвы 10 г, просеянную через сито с диаметром ячеек

в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу

на 100 мл, приливают 1,5 мл толуола и 5 мл ацетатного буфера (рН 5,5). Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно перемешивают круговыми движениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию в термостат при +35°С на двое суток.

2). Вариант 2. Навеску свежей почвы 10 г, просеянную через сито с диаметром ячеек

в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу

на 100 мл, приливают 1,5 мл толуола, 5 мл ацетатного буфера (рН 5,5) и 5 мл 1% раствора карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na). Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой, содержимое тщательно перемешивают круго- выми движениями в течение 5 мин. и ставят на инкубацию в термостат при +35°С

на двое суток. Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности и расчета K w (формула (2)).

3). Вариант 3. В коническую колбу на 100 мл приливают 1,5 мл толуола, 5 мл ацетатного буфера (рН 5,5) и 5 мл 1% раствора карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-Na). Колбу закрывают корковой или резиновой (неплотно) пробкой и встряхивают в течение 30 мин. на ротаторе.

30

После инкубации содержимое колб доводят до кипения на асбестовой сет- ке, затем во все три колбы приливают по 3 мл насыщенного раствора алюмокали- евых квасцов и встряхивают в течение 1 мин. После этого анализируемые раство- ры фильтруют (фильтр «белая лента») в три мерных колбы на 50 мл, затем филь- траты в каждой колбе доводят до метки дистиллированной водой. После чего бе- рут три пробирки и из полученных рабочих растворов в мерных колбах переносят в соответствующую пробирку 2 мл жидкости, в каждую из которых затем осто- рожно добавляют по 4 мл антронового реактива и перемешивают. Через 20 мин. полученный изумрудно-зеленый раствор исследуемых об- разцов колориметрируют при λ = 551 нм (фотоколориметр ФЭК-56М, свето- фильтр 6) в кюветах на 10 мм.

Выбор искомого показателя целлюлолитической активности почвы и, соот- ветственно, сравнение окрасок растворов в кюветах производят согласно схеме, представленной в таблице 3.3.

3.3. Схема фотоколориметрического сравнения окрасок растворов анализируемых образцов при определении целлюлолитической активности

Искомый показатель

Раствор

Раствор сравнения (холостой раствор)

п/п

измерения

1

актуальная (естественная) целлюлолитическая активность (АЦА)

раствор почвы, заложенной без КМЦ-Na 1 )

раствор реактивов (К 3 )

2

потенциальная целлюлолитическая активность (ПЦА)

раствор почвы, заложенной с КМЦ-Na 2 )

раствор реактивов (К 3 )

Построение калибровочного графика Навеску 0,02 г химически чистой глюкозы растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл: в 1 мл полученного стандартного раствора будет содержаться 0,2 мг (200 мкг) глюкозы. Затем в 6 конических колб приливают по 10 мл стандартного раствора, разбавляя его определенным объемом дистиллиро- ванной воды (таблица 3.4) и перемешивают. Объем колб подбирают в соответ- ствии с получаемым после смешивания растворов объемом жидкости. После этого берут 6 пробирок, в каждую пробирку из соответствующей колбы приливают по 2 мл полученного рабочего раствора, затем добавляют по 5 мл антронового реактива и через 20 мин. проводят колориметрирование калиб- ровочной серии относительно холостого раствора, приготовленного на дистилли- рованной воде (в дополнительную пробирку приливают 2 мл дистиллированной воды и добавляют 5 мл антрона).

31

3.4. Исходные данные для построения калибровочного графика

Исходный объем стандартного раствора глюкозы, мл

Объем

Содержание глюкозы в рабочем растворе, мкг/2 мл

Отсчет

колбы

по

воды, мл

прибору

1

10

390

10

 

2

10

190

20

 

3

10

90

40

 

4

10

56

61

 

5

10

40

80

 

6

10

30

100

 

По полученным данным строят калибровочный график, где по оси ординат откладывают значения отсчета по прибору (оптические плотности калибровоч- ных растворов), а по оси абсцисс – соответствующие им значения концентрации глюкозы (мкг/2 мл).

Расчет результатов анализа Полученное по графику содержание глюкозы (мкг/2 мл) в анализируемом образце почвы, заложенном без КМЦ-Na, пересчитывают в актуальную целлю- лолитическую активность почвы по следующей формуле:

АЦА = А 1 V 1 10 K w / V 2 • 1000 • m

(4)

где АЦА – актуальная целлюлолитическая активность почвы, мкг глюкозы/10 г абс.-сух. почвы за 48 ч.; А 1 – количество глюкозы опытного образца К 1 , найденное по калибровочному графику, мкг/2 мл; V 1 – общий раствор после инкубации почвы, мл (V 1 = 50 мл); V 2 – аликвота, взятая на анализ, мл (V 2 = 2 мл); 10 – коэффициент пересчета на 10 г почвы; m – навеска почвы, г (m = 10 г); 1000 – коэффициент пересчета мкг в мг; K w – поправка на влажность почвы, рассчитываемая по формуле (2).

Полученное по графику содержание глюкозы (мкг/2 мл) в анализируемом образце почвы, заложенном с КМЦ-Na, пересчитывают в потенциальную целлю- лолитическую активность почвы по формуле (5):

ПЦА = А 2 V 1 10 K w / V 2 • 1000 • m

(5)

где ПЦА – потенциальная целлюлолитическая активность почвы, мкг глюкозы/10 г абс.-сух. почвы за 48 ч.; А 2 – количество глюкозы опытного образца К 2 , найденное по калибровочному графику, мкг/2 мл и т.п.

32

ФОРМА ЗАПИСИ

       

Количество

Целлюлолитиче-

 

Образец

почвы

Навеска

почвы, г

Объем

Отсчет

глюкозы,

ская активность, мкг глюкозы / 10 г почвы за 48 ч.

Оценка

аликво-

по

найденное

активно-

 

ты, мл

прибору

по графику,

сти

 

мкг/2 мл

m

V

2

А

ЦА

табл. 7.3

почва

10

2

 

А 1

АЦА –

 

почва + КМЦ-Na

10

2

 

А 2

ПЦА –

 

Реактивы 1) раствор карбоксиметилцеллюлозы (натриевая соль) 1%: 1 г порошка КМЦ-Na растворяют в 99 мл дистиллированной воды при нагревании на асбестовой сетке и непрерывном помешивании; 2) ацетатный буфер (рН 5,5): раствор А – 1,15 мл конц. уксусной кислоты растворить в колбе на 100 мл и довести до метки водой. Раствор Б – 2,72 г трехводного ацетата натрия (CH 3 COONa•3H 2 O) растворить в колбе на 100 мл и довести до метки водой. Ацетатный буфер готовят смешиванием 8,9 мл раствора А и 41,9 мл раствора Б в колбе на 1 л с доведением до мет- ки дистиллированной водой; 3) насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов: реактив порционно (при- мерно по 10 г) всыпают в кипящую дистиллированную воду и растворяют помешиванием стеклянной палочкой. Затем раствор квасцов продолжают кипятить и растворять реактив до тех пор, пока на стенках внутри химиче- ского стакана не будет видна явная кристаллизация вещества. Необходимо помнить, что раствор после остужения быстро кристаллизуется, поэтому его нужно использовать горячим; 4) антроновый реактив: к 2,5 мл дистиллированной воды осторожно прили- вают 50 мл конц. H 2 SO 4 (пл. 1,84) и дают остыть в холодильнике. После охлаждения в раствор вносят 0,1 г антрона, растворяют и оставляют на 4 ч. на льду в морозильной камере. Полученный реактив длительному хране- нию не подлежит, поэтому должен быть использован в день приготовления; 5) толуол, х.ч.

Комплексный учет численности и биологической активности как амилоли- тических, так и целлюлолитических микроорганизмов позволяет более наглядно проследить за скоростью и направленностью процесса разложения безазотистого органического вещества почвы и привнесенных удобрений, поскольку показыва- ет особенности деструкционого процесса, и тем самым характеризует степень

33

разложенности крахмала, целлюлозы и их производных как главных составляю- щих неспецифических компонентов почвенного органического вещества.

4. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, РАЗЛАГА- ЮЩИХ ПРОМЕЖУТОЧНОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ

В процессе разложения органической части почвы, как естественного про- исхождения в виде растительного опада и остатков животных, так и привнесен- ного в нее извне в виде органических удобрений, количество простых соедине- ний достаточно быстро уменьшается за счет активного развития аммонифициру- ющей, амилолитической и других функциональных видов микроорганизмов, вхо- дящих в общую группу зимогенной микрофлоры. По мере снижения концентрации в почве простых сахаров, белков и низко- молекулярных жирных кислот рост и развитие первичных гидролитиков замедля- ется и на смену им приходит микрофлора олиготрофной группы. Сюда входят, как правило, неспоровые микроорганизмы, зачастую с необычной морфологией, которые, в отличие от зимогенных гидролитиков, длительное время живут в поч- ве и, по сути, составляют группу основных утилизаторов органического вещества на конечной стадии его превращения. Причиной тому является способность оли- готрофов жить и питаться в условиях с низкой концентрацией доступных компо- нентов пищи. С другой стороны, существует условное разделение олиготрофной микро- биоты почвы на олигонитрофилов, ассимилирующих из почвенного раствора ма- лые количества азотистых соединений, и олигокарбофилов, способных усваивать углеродсодержащие вещества. Данная градация олиготрофной части почвенного микробоценоза позволяет дифференцированно оценить переработку промежуточного вещества почвы по элементам, значимым с точки зрения агроэкологических исследований – угле- роду и азоту. Такой подход в исследованиях дает возможность проследить за степенью деструкции органического вещества, оценить направление микробиологической и сукцессионной стадии развития почвы и, в целом, охарактеризовать общую напряженность микробной переработки и подготовки вещества для процесса гу- мификации.

34

4.1. Учет общей численности олиготрофных микроорганизмов почвы Общую численность всей олиготрофной микрофлоры почвы учитывают чашечным методом посева на почвенный агар (ПА), приготовленный из той поч- вы, на которой проводят соответствующие агрохимические и иные исследования. Посев на чашки с почвенным агаром производят из одного на выбор разве- дения почвенной суспензии (от 10 2 до 10 4 ) в зависимости от содержания орга- нического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультурен- ность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкуба- цию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят на пятый-десятый день после посева. Если в программе исследований заложено изучение нескольких почвенных разностей, то почвенный агар приготавливают из каждого типа почвы, который требуется изучить. Но, при этом, при сравнении полученных результатов в каче- стве эталонной численности всех олиготрофов данной почвенно-климатической зоны выбирают численность на ПА, полученную из наиболее плодородной почвы этой зоны. Приготовление ПА производят смешиванием 1 кг исследуемой почвы с 1 л 0,1% раствора Na 2 CO 3 . Полученную суспензию доводят до кипения на асбестовой сетке, охлаждают и фильтруют через фильтр «белая лента» и кусок ваты. Затем к фильтрату добавляют 0,5 г СaCO 3 , 0,2 г К 2 HPO 4 и 20 г агар-агара, растворяют при нагревании на асбестовой сетке и перемешивании стеклянной палочкой, за- тем приливают дистиллированной воды до 1 л и снова доводят до кипения. Затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 2 атм. в течение 30 мин. После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспен- зии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.

4.2. Учет численности олигонитрофильной микрофлоры Олигонитрофилы – часть олиготрофных микроорганизмов, способных рас- ти в условиях незначительного количества доступного азота в почвенном раство- ре. Именно поэтому, а также за счет наличия в геномном аппарате особых генов, обуславливающих способность к фиксации азота воздуха, многие из них являют- ся несимбиотическими азотфиксаторами (диазотрофами) и способны фиксиро- вать атмосферный азот, который в последующем используют в своем питании. Поскольку процесс фиксации азота олигонитрофилами сложен и достаточ- но энергозатратен, он запускается только в том случае, когда концентрация ам- миака в почвенном растворе крайне низкая. В подобной ситуации диазотрофы,

35

поскольку имеют мощную ферментную систему, помимо азотфиксации начинают разлагать гумусовые соединения почвы, в частности азотистые компоненты гу- миновых и фульвокислот гумуса. Поэтому учет численности олигонитрофилов позволяет не только опреде- лить способность почвенного микронаселения к несимбиотической фиксации азота воздуха, что используется в снабжении растений доступными формами азо- та, но и проследить за активностью разложения гумусовых соединений.

Общую численность олигонитрофилов почвы учитывают чашечным мето- дом посева на агар Эшби (АЭ). Посев на чашки с агаром Эшби производят из одного на выбор разведения почвенной суспензии (от 10 2 до 10 4 ) в зависимости от содержания органическо- го вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультуренность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкубацию ча- шек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят на пя- тый-десятый день после посева. Приготовление агара Эшби производят следующим образом: к 1 л дистил- лированной воды поочередно прибавляют и растворяют при нагревании на асбе- стовой сетке следующие реактивы: сахароза – 20 г, К 2 SО 4 – 0,1 г, К 2 НРО 4 0,2 г, MgSO 4 •7H 2 O 0,2 г, NaCl 0,2 г, CaCО 3 – 5 г и агар-агар – 20 г. Соли и агар пол- ностью растворяют перемешиванием стеклянной палочкой, затем приливают 1 мл раствора микроэлементов по Федорову и доводят до кипения. Приготовление раствора микроэлементов по Федорову производят сле- дующим образом: к 1 л дистиллированной воды поочередно прибавляют и рас- творяют при медленном нагревании на асбестовой сетке и перемешивании стек- лянной палочкой следующие реактивы: Н 3 ВО 3 – 5,0 г, (NH 4 ) 2 MoO 4 •2H 2 O – 5,0 г, ZnSO 4 •7H 2 O – 0,2 г, КCl – 0,5 г, NaBr – 0,5 г и Al 2 (SO 4 ) 3 •18Н 2 О – 0,3 г. Затем среду разливают по колбам, закрывают ватными пробками и авто- клавируют при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 30 мин. После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспен- зии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы.

4.3. Учет численности олигокарбофильной микрофлоры Олигокарбофилы – другая часть олиготрофных микроорганизмов, способ- ных развиваться в условиях незначительного содержания доступных углеродсо- держащих соединений в почвенном растворе.

36

Данная подгруппа олиготрофов обладает высокой окислительно- восстановительной ферментативной активностью и, поэтому, по биохимической принадлежности наиболее приближена к автохтонной части микробоценоза поч- вы. В условиях минимального количества или полного отсутствия доступного уг- лерода в почвенном растворе олигокарбофилы начинают трансформировать сво- бодные и новообразованные фракции гумуса и, тем самым, участвовать в преоб- разовании специфического органического вещества почвы и изменять ее гумусо- вой режим.

Общую численность олигокарбофилов почвы учитывают чашечным мето- дом посева на водный агар по Эрскову (голодный агар – ГА). Посев на чашки с голодным агаром производят из одного на выбор разве- дения почвенной суспензии (от 10 2 до 10 4 ) в зависимости от содержания орга- нического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультурен- ность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкуба- цию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят на пятый-десятый день после посева. Приготовление голодного агара (ГА) производят растворением в 1 л ди- стиллированной воды 20 г агар-агара при нагревании на асбестовой сетке и пере- мешивании стеклянной палочкой. Раствор доводят до кипения, разливают по колбам, закрывают ватными пробками и автоклавируют при давлении 1,5-2,0 атм. в течение 30 мин. После подготовки питательной среды производят посев почвенной суспен- зии на чашки Петри в соответствии с методикой посева, учитывают количество колоний и пересчитывают в численность КОЕ/1 г почвы. Таким образом, проведение исследований по учету численности олиго- нитрофильных микроорганизмов позволяет проследить за степенью и направлен- ностью разложения промежуточного органического вещества почвы и, в целом, за состоянием почвенной среды как резервуара первичных компонентов гумифи- кации.

5. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРЕОБРА- ЗУЮЩИХ СПЕЦИФИЧЕСКОЕ ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЧВЫ

Автохтонная группа микроорганизмов характеризуется как коренная или собственно почвенная микрофлора, которая стоит последней в ряду деструкторов

37

поступающего в почву органического вещества и во многом определяет синтез и распад гумусовых соединений. Гумус является одним из специфических органических соединений почвы, слагающим ее плодородие, а его содержание находится в тесной зависимости от биохимического состояния почвы. К автохтонной группе почвенного микробоценоза относят те микроорга- низмы, которые способны в качестве единственного источника питания или наряду с другими источниками использовать гумусовые вещества. Данная группа микрофлоры при нормальном питательном режиме (целина, почвы естественных лесов и лугов) не доминирует в почве, так как в ней всегда имеется определенный запас легкоразлагаемого органического вещества, который способствует актив- ному развитию другой группы микробоценоза (сапротрофной). Кроме того, за счет химической сложности большинству развивающихся в таких условиях са- протрофных микроорганизмов агрономически ценный гумус недоступен. За счет уменьшения количества привносимых растительных остатков в па- хотные почвы по сравнению с целиной изменяется степень их гумификации. По- началу это может приводить к относительному увеличению содержания фракций гумуса, более устойчивых к микробному разложению, поскольку менее устойчи- вые начинают разлагаться активизированной автохтонной микрофлорой. Даль- нейшее освоение сельскохозяйственных земель ведет к возрастанию доли автох- тонных микроорганизмов, что, в итоге, влечет за собой еще более интенсивную минерализацию гумуса. Наиболее активное развитие автохтонов и, как следствие, усиление разло- жения гумусовых компонентов наблюдается в условиях высокого дефицита по- ступающего в почву легкоразлагаемого органического вещества (неудобряемая пашня, техногенно нарушенные земли). В целом, к внешним условиям, усиливающим процесс деструкции гумуса почвы относят:

1) смену сезонов года: весной и осенью происходит всплеск численности микроорганизмов, использующих легкогидролизуемое органическое вещество (сапротрофная часть), а в летнее время активнее развивается микрофлора, использующая собственно гумусовые компоненты (автох- тонная часть); 2) структуру севооборота: в почве под пропашными культурами гумусовые компоненты разлагаются более интенсивно, по сравнению с почвами, занятыми культурами, растущими сплошным покровом; 3) усиление аэрации почвы при частой культивации и перепашке; 4) паровой режим содержания полей;

38

5) одностороннее внесение минеральных, особенно азотных, удобрений; 6) полное отсутствие каких-либо удобрений при выращивании культур.

В результате многолетних исследований было установлено, что к автох- тонной группе микробоценоза почвы относятся многие представители бактерий р. Pseudomonas, Nocardia, Bactoderma, Micromonospora и Arthrobacter. Поскольку у таких видов микроорганизмов, в отличие от зимогенной микрофлоры, слабо выражена протеолитическая активность, данная микробиота не способна усваи- вать элементы питания из легкодоступного органического вещества. Эти микро- организмы способны использовать только специфические органические компо- ненты почвы различной степени гумификации как источник энергии, углеродно- го и азотного питания. Функцию активного участия в разложении гумуса также приписывают

многим другим представителям почвенного микробоценоза. Это некоторые виды родов Actinomyces, Aerobacter, Bacillus, Bacterium, Clostridium, Flavobacterium, Mycobacterium, Mycococcus, Rhodotornia, Rhodotorula и другие виды. Одним из главных участников деструкции гумуса почвы является грампо- ложительный актиномицет рода Nocardia, представленный палочковидными

и кокковидными формами и дающий на твердых средах характерные колонии

с мицелиальным налетом (воздушными гифами). Именно этому микроорганизму приписывается основная роль в разложении гуминовых и фульвокислот гумуса, поскольку у многих видов нокардий отсутствуют простые гидролитические фер- менты (протеазы, липазы, амилазы и инвертазы), что и ограничивает их участие в ассимиляции свежих органических остатков. С другой стороны, за счет продуцирования более активной системы редокс- ферментов (пероксидазы и полифенолоксидазы) на долю нокардий выпадает ис- пользование наиболее устойчивых продуктов распада органического вещества – восков, смол, углеводородов, ароматических (лигнин) и гетероциклических со- единений и их производных. Современные представления о роли нокардий в трансформации гумуса почвы позволяют определять не только их общую численность по количеству выросших колоний на чашке, но также по видовому разнообразию и доминиро- ванию видов определять состояние специфического органического вещества

и направленность процесса его синтеза-распада в почве. В таблице 5.1 представ- лена схема развития некоторых видов рода Nocardia и возможные пути измене- ния гумусового режима почвы.

39

5.1. Возможное изменение гумусового режима почвы в зависимости от видового состава нокардий в почве

Доминантный

Возможные условия активизации развития

Гумус как

источник…

Изменения

вид

рода Nocardia

гумусового

режима почвы

 

- бессменный пар;

   

N. rubra

- отсутствие органических удобрений;

углерода

чрезмерная активи- зация разложения гумуса почвы

N. corallina

и азота

- чрезмерная агротехническая нагрузка на почву

N. mucosum

- удобрение культур азотными туками;

углерода

разложение гумуса превосходит его мед- ленный синтез

- отсутствие известкования почвы

N. symbiotica

- выращивание культур сплошного сева с мощной корневой системой (озимые зерновые, травы);

азота

синтез гумуса превосходит его мед- ленное разложение

- целинные земли, территории естественных биогеоценозов

Таким образом, учет численности автохтонной микрофлоры почвы может сопровождаться не только констатацией количества микроорганизмов, способ- ных разлагать гумусовые соединения, но и по распределению различных их ви- дов дает возможность проследить за степенью деструкции специфического орга- нического вещества почвы и, как следствие, предположить возможные пути пре- образования гумуса.

5.1. Учет численности микроорганизмов-деструкторов гумуса Общую численность автохтонной группы микробоценоза, способной усва- ивать гумусовые компоненты почвы, учитывают чашечным методом посева на нитритный агар по Теппер (НА). Посев на чашки с нитритным агаром производят из одного на выбор раз- ведения почвенной суспензии (от 10 2 до 10 4 ) в зависимости от содержания орга- нического вещества в почве и ее общей окультуренности (чем выше окультурен- ность почвы, тем ее большее разведение необходимо взять для посева). Инкуба- цию чашек проводят в термостате при +28°С, учет выросших колоний проводят на пятый-десятый день после посева. Приготовление нитритного агара (НА) производят растворением в 1 л ди- стиллированной воды следующих реактивов: NaNO 2 – 1 г, К 2 HPO 4 – 0,5 г, MgSO 4 •7H 2 O – 0,5 г, NaCl – 0,5 г, Na 2 CO 3 – 1 г, FeSO 4 •7H 2 O – 0,4 г, агар-агар – 20 г. Соли и агар полностью растворяют перемешиванием и нагреванием на асбе- стовой сетке. Затем к раствору приливают 5 мл гумата натрия или гумата калия и доводят до кипения. После чего среду разливают по колбам, закрывают ватны- ми пробками и автоклавируют при давлении 2 атм. в течение 30 мин.

40

По окончании инкубации чашки достают из термостата, определяют общее число колоний и пересчитывают его в численность КОЕ автохтонной микрофло- ры почвы. Если требуется, то дополнительно определяют видовой состав микро- организмов.

По культуральным признакам вырастающих на нитритном агаре колоний дифференцируют следующие роды и виды микроорганизмов, наиболее типичные формы колоний которых представлены на рисунке 1.3.

а

в

представлены на рисунке 1.3. а в б г Рис. 1.3. Характерный рост
представлены на рисунке 1.3. а в б г Рис. 1.3. Характерный рост

б

г

на рисунке 1.3. а в б г Рис. 1.3. Характерный рост
на рисунке 1.3. а в б г Рис. 1.3. Характерный рост

Рис. 1.3. Характерный рост колоний автохтонной микрофлоры на нитритном агаре (по Теппер, 1993): а Nocardia, б Arthrobacter, в Micromonospora, г Bactoderma

р. Nocardia – колонии пастообразные, слизистые или сухие и складчатые, по периферии которых образуется ватообразная зона в виде мицелиального обод- ка. В центре колонии чаще преобладают фрагментированные гифы, поэтому сама колония имеет бархатистую поверхность. Колонии могут быть бесцветными, бе- лыми, серыми, лимонно-желтыми, желтыми, оранжевыми, рыжими, розовыми, красными, пурпурными или коричневыми. р. Arthrobacter – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, плоские или слегка приподнятые, чаще бесцветные, иногда могут иметь зеленовато-желтый оттенок.

41

По периферии колонии образуется кружевной или складчатый ободок, у отдель- ных представителей рода края колоний могут быть зазубренные. р. Micromonospora – колонии мелкие и, как правило, полностью погруже- ны в питательную среду. На поверхности агара кольцеобразно или радиально располагаются бесцветные или темноокрашенные комочки слизи. р. Bactoderma – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, имеют вид белой или розоватой бархатистой пленки. В центре колония складчатая, а по периферии – стекловидная; край колонии, как правило, волнистый или лопастной.

Среди рода нокардий (р. Nocardia), участвующих в трансформации гумуса почвы, по культуральным признакам вырастающих на среде колоний можно раз- личить основные виды:

N. rubra – колонии мелкие, округлые, 1,5-3,0 мм в диаметре, одиночные,

как правило сухие, плоские, с неправильным, лопастным или фестончатым краем. Мицелиальный ободок для рода rubra характерен, но развит слабо. Для данного рода отличительным признаком является немного переливающаяся бархатистая кроваво-красная окраска колоний.

N. corallina – колонии очень мелкие, округлые, 1-2 мм в диаметре, с купо-

лообразной поверхностью, при росте на среде собраны в грозди и напоминают скопления мелких шариков. Мицелиальный ободок для рода corallina не типичен. Окраска колоний, как правило, молочно-белая, ярко-желтая или красная.

N. mucosum – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, неправильной формы.

Цвет колоний бледный, серый, белый и другие оттенки бледного цвета. Мицели-

альный ободок у данного рода, как правило, присутствует. Отличительным при- знаком вида mucosum является наличие слизистой капсулы вокруг колонии.

N. symbiotica – колонии мелкие, 2-3 мм в диаметре, различных светлых

цветов, складчатые и сухие, по периферии которых образуется заметный мицели- альный ободок.

5.2. Полифенолоксидазная активность почвы В микробиологической части синтеза гумусовых веществ принимают уча- стие микробные редокс-ферменты полифенолоксидазы, а в процессах минерали- зации гумуса – пероксидазы. Все они относятся к классу оксидоредуктаз. Как правило, с увеличением содержания гумуса активность полифенолок- сидазы постепенно повышается, а активность пероксидазы – резко снижается. Комплексная оценка активности обоих окислительно-восстановительных фер- ментов дает более полную картину о биохимическом состоянии гумуса, посколь-

42

ку позволяет соотнести интенсивность образования гумусовых компонентов поч- вы и их деструкции.

Определение полифенолоксидазной активности почвы по Галстяну Ферменты полифенолоксидазы участвуют в превращении органических со- единений ароматического ряда в компоненты гумуса. Они катализируют окисле- ние определенных фенолов до хинонов в присутствии кислорода воздуха, кото- рые в дальнейшем при конденсации с аминокислотами и пептидами образуют первичные молекулы гуминовых кислот гумуса:

гуминовых кислот гумуса: Принцип метода Метод основан на

Принцип метода Метод основан на способности полифенолоксидазных ферментов почвы окислять фенольный субстрат до хинонов с последующим определением их ко- личества с помощью эфира. Действующим окислительным началом является кислород воздуха. В качестве субстрата используют пирогаллол. По количеству образующегося пурпурогаллина судят о полифенолоксидазной активности почвы (ПФА), которая выражается в мг пурпурогаллина/100 г почвы за 30 мин. Для оценки уровня активности полифенолоксидазных ферментов почвы в схему опыта вводятся следующие варианты:

1) почва без субстрата (без пирогаллола): показывает естественную поли- фенолоксидазную активность почвы. Определяется количество пурпуро- галлина (К 1 ), которое образуется из имеющегося в почве органического вещества. По сути это активность собственно фермента, имеющегося в почве на момент определения; 2) почва с субстратом (с добавлением пирогаллола): показывает потенци- альную полифенолоксидазную активность почвы. Определяется количе- ство пурпурогаллина (К 2 ), которое образуется из заведомо увеличенного количества органического вещества за счет добавления пирогаллола. По сути это биохимическая активность автохтонной микрофлоры, выраба- тывающей фермент полифенолоксидазу для разложения органического субстрата и образования гумусовых веществ;

43

3) контрольный вариант (раствор реактивов): повышает точность опреде- ления результатов, поскольку показывает чистоту реактивов и воды, ис- пользующихся в опыте. Здесь определяется остаточное количество пур- пурогаллина и других соединений (К 3 ), которые могут содержаться в во- де и реактивах.

Ход работы

В начале исследования согласно вышеприведенной схеме в конических

колбах на 250 мл закладывают три варианта опыта.

1). Вариант 1. Навеску свежей почвы 5 г, просеянную через сито с диаметром ячеек

в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу

на 250 мл, приливают 0,5 мл толуола и 100 мл 1% раствора K 2 SO 4 . Содержимое колбы встряхивают на ротаторе в течение 20 мин, после чего фильтруют. Затем в мерную колбу на 50 мл приливают 20 мл полученного фильтрата почвы и добавляют 10 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы встряхи- вают, плотно закрывают пробкой и ставят на 30 мин. инкубацию в термостат при +30°С. За время инкубации колбы достают из термостата и осторожно встряхи- вают 2 раза.

2). Вариант 2. Навеску свежей почвы 5 г, просеянную через сито с диаметром ячеек

в 5 мм и взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу

на 250 мл, приливают 0,5 мл толуола и 100 мл 1% раствора K 2 SO 4 . Содержимое

колбы встряхивают на ротаторе в течение 20 мин, после чего фильтруют. Затем в мерную колбу на 50 мл приливают 20 мл полученного фильтрата почвы и добавляют 10 мл свежеприготовленного 1% раствора пирогаллола. Со- держимое колбы встряхивают, плотно закрывают пробкой и ставят на 30 мин. ин- кубацию в термостат при +30°С. За время инкубации колбы достают из термоста- та и осторожно встряхивают 2 раза. Одновременно закладывают навеску почвы для определения влажности и расчета K w (формула (2)).

3). Вариант 3.

В коническую колбу на 250 мл приливают 0,5 мл толуола и 100 мл

1% раствора K 2 SO 4 . Содержимое колбы встряхивают на ротаторе в течение

5 мин, после чего фильтруют.

44

Затем в мерную колбу на 50 мл приливают 20 мл полученного фильтрата

добавляют 10 мл свежеприготовленного 1% раствора пирогаллола. После чего колбу плотно закрывают пробкой и ставят на 30 мин. встряхивание.

и

По окончании инкубации во все три колбы добавляют по 5 мл 20% раство- ра H 2 SO 4 и перемешивают. Затем порционно (по 10 мл) содержимое каждой кол- бы доводят диэтиловым (серным) эфиром до метки. После каждой прилитой пор- ции эфира колбу сильно встряхивают. Затем растворы переносят в делительные воронки, закрывают пробками и многократно встряхивают. В результате встря- хивания в делительной воронке образуется два слоя несмачивающих друг друга жидкостей. Нижний водный слой жидкости осторожно сливают в стакан через краник в воронке, после чего оставшийся желто-зеленый эфирный слой сливают в кювету на 20 мм и колориметрируют при λ = 490 нм (фотоколориметр ФЭК-56М, светофильтр 5). Выбор искомого показателя полифенолоксидазной активности почвы и, со- ответственно, сравнение окрасок растворов в кюветах производят согласно схеме, представленной в таблице 5.2.

5.2. Схема фотоколориметрического сравнения окрасок растворов анализируемых образцов при определении полифенолоксидазной активности

   

Раствор сравнения (холостой раствор)

п/п

Искомый показатель

Раствор измерения

 

актуальная (естественная)

раствор почвы, заложенной без пирогаллола (К 1 )

 

1

полифенолоксидазная активность (АПФА)

раствор реактивов (К 3 )

 

потенциальная

раствор почвы, заложенной с пирогаллолом (К 2 )

 

2

полифенолоксидазная активность (ППФА)

раствор реактивов (К 3 )

Построение калибровочного графика Навеску 0,75 г химически чистого бихромата калия (K 2 Cr 2 O 7 ) растворяют в мерной колбе в 1 л 0,5 n раствора HCl, что по интенсивности окраски будет со- ответствовать окраске, получаемой растворением 5 мг пурпурогаллина в 50 мл серного эфира. В результате чего 1 мл полученного рабочего раствора будет со- ответствовать 0,005 мг пурпурогаллина. Затем берут 6 мерных колб на 50 мл

и в соответствии с таблицей 5.3 в каждую приливают определенный объем рабо-

чего раствора и доводят раствор до метки дистиллированной водой. Затем прово- дят колориметрирование калибровочных растворов относительно дистиллиро- ванной воды.

45

5.3. Исходные данные для построения калибровочного графика

Объем рабочего раствора K 2 Cr 2 O 7 , мл

Содержание пурпурогаллина, мг/50 мл

Отсчет

колбы

по прибору

1

0,1

0,0005

 

2

0,5

0,0025

 

3

1,0

0,005

 

4

10,0

0,050

 

5

20,0

0,100

 

6

30,0

0,150

 

По полученным данным строят калибровочный график, где по оси ординат откладывают значения отсчета по прибору (оптические плотности калибровоч- ных растворов), а по оси абсцисс – соответствующие им значения концентрации пурпурогаллина (мг/50 мл).

Расчет результатов анализа Полученное по графику содержание пурпурогаллина (мг/50 мл) в анализиру- емом образце почвы, заложенном без пирогаллола, пересчитывают в актуальную полифенолоксидазную активность почвы по следующей формуле:

АПФА = А 1 V 1 • 100 • K w / V 2 m

(6)

где АПФА – актуальная полифенолоксидазная активность почвы, мг пурпурогаллина/100 г абс.-сух. почвы за 30 мин.; А 1 – количество пурпурогаллина опытного образца К 1 , найденное по калибровочному графику, мг/50 мл; V 1 – общий раствор почвы, мл (V