CuantificacindeClorofilaa

Clorofilas
Lasclorofilassonunafamiliadepigmentosdecolorverdequese
encuentranenlascianobacteriasyentodosaquellosorganismos
quecontienencloroplastosensusclulas(plantasyprotistas),es
crticaenlafotosntesis,procesoquepermitealosorganismos
absorberenergaapartirdelaluzsolarytransformarlaen
compuestosorgnicosyoxgeno,

 Laclorofilaautilizaparaestimarlabiomasa
planctnica
Todaslasplantasverdescontienenclorofilaa
Constituyeentreel1y2%delpesosecode
lasalgasplanctnicas
Productodedegradacin:clorofilides,
feoforbides yfeofitinas.
Lospigmentosseutilizanparaidentificarlos
grandesgruposalgales

Laestructuradelasmolculasdeclorofila
Unanillodeporfirina quecontiene
magnesioycuyafuncinesabsorberlaluz.
Unacadenahidrfobadefitol cuyafuncin
esmantenerlaclorofilaintegradaenla
membranafotosinttica

Lasclorofilastienen
tpicamentedosgruposde
absorcinenelespectro
visible:
Enlazonadelaluzazul
(400500nm)
Enlazonarojadel
espectro(600700nm).
Lasclorofilasreflejanlaparte
mediadecolorverde(500600
nm)

Precaucionesenelprocesamientodelas
muestras

Luz
Calor
cidos

MtodosdeCuantificacin
Espectrofotometra
Fluoromtrico
HPLC Highperformanceliquid
chromatographic

Fluoromtrico
Esmssensitivoqueel
espectrofotomtrico
Requieremenosvolumendemuestra
Puedeserutilizadoenmedicionesen
vivo.
Puedesobreobajoestimarla
concentracindeclorofilaa

Espectrofotomtrico
Concentracin
Extraccin
Clarificacin
Cuantificacin
Controlanalticointerno

Equipamientoyreactivos
Sonicador UltrasnicooMorterodevidrio
Centrfugademesada:3000rpm
SolucinsaturadadeMgCO3:Agregar1gde
MgCO3a100mL deaguareactivo.Fitrar
sobremembranadefibradevidriode1mde
poro.
Acetona90%:90partesdeacetona+10
partesdesolucinsaturadadeMgCO3

 EspectrofotmetroUV Visible:
Anchodebanda0.5a2.0nm
Cubetas
Acidoclorhdrico,HCL,0.1N
Patrndeclorofilaa:1mgdeAnacystis
nodulans Sigma

Concentracin
Homegeneizar suavementelamuestra
Filtrarlamuestrasobremembranadefibrade
vidriode0,7a1mdeporo
Antesdecompletarlafiltracinagregar20mL
desolucindeMgCO3
Envolveralresguardodelaluzenpapelde
aluminioycolocarenfreezer nomsde28
das,sinosevaprocesarinmediatamente.

Extraccin
RupturaCelular
Disruptor CelularUltrasnico
Mortero
Solvente
Acetona90%+10%MgCO3
Tiempoytemperaturadeextraccin
2a24ha4C

 Colocarlamembranaconelcontenidode
fitoplanctonenuntubodecentrifugacon5
mL deacetonaal90%.
Romperlasclulasdefitoplanctoncon
disruptor celularenuntubodecentrfuga,o
enmortero.
Ajustarelvolumentotala10mL conacetona
90%
Dejar2a24ha4Cenoscuridad

Clarificacin
Centrifugacin:3000rpm 20min
Extraer5mldelextractoclarificadoconpipeta
Filtracin:jeringaconfiltro0,45mdeporo
resistenteasolventes

Cuantificacin
Lecturadelextractoenespectrofotmetro
Longitudesdeonda:
664y750(antesdeacidificar
665y750(acidificadoconHCL0,1N)
Aplicarlaformulaparadeterminar
concentracindeClorofilaa.

 Porqueseacidifica?
Porquelaclorofilaapuedesersobreestimada
incluyendoalosfeopigmentos,queabsorben
cercadelamismalongituddeondaque
Clorofilaa
Alacidificarselaclorofilaapierdeeltomode
magnesio,convirtindoseenfeofitinaa.
Clorofilaapuraesconvertidaenfeofitinaa
puraporacidificacin,larelacines

 Clorofilaapuraesconvertidaenfeofitinaa
puraporacidificacin,larelacines
=1,70
Significaquenohayfeofitinaa
Estadofisiolgicodelasclulasesexcelente

 Feofitinaapuranoseproducelareaccinal
acidificarylarelacines
=1,0
Significaquetodoesfeofitinaa
Estadofisiolgicodelasclulasessenescente

 Lasmezclasdeclorofilaayfeofitinaatienen
rangosquevanentre1,0y1,7.Usando
Acetona90%comosolvente

Clculoyexpresindelosresultados
Restarlasabsorbanciasledasa750nm sin
acidificaryacidificadasalaslecturasa664y
665nm.Conlasabsorbanciascorregidas,
calcularlaconcentracindeClorofilaa
(664750) (665a750a)

Clorofilaa(mg/m3

26,7=Correccindeabsorbancia
664y665=DOcorregidas
V1=VolumendelextractoenL
V2=Volumendelamuestraenm3
L=recorridodeluzdelacubetaencm

Lasunidadesenmg/m3 sonequivalentesa/L

 Elvalor26,7eslaabsorbanciacorregidae
igual
AxK
A=Coeficientedeabsorbanciaparaclorofila
aa664nm=11,0
K=Correccinporacidificacin=2,43

clorofilaapura

clorofilaapura

feofitinaapura

,
,

=2,43

Controldecalidadanalticointerno
Evaluacindeunpatrn
Concentracin:Dentrodelrangodetrabajo
Frecuencia:Cadavezqueseanaliceunaseriede
muestras
Evaluacin:Cartacontroldemedias

PATRN CLOROFILA a 10 [ug/l]

Clorofila a [ug/l]

Ao 2015

12,10
11,70
11,30
10,90
10,50
10,10
9,70
9,30
8,90

Fecha

Controldecalidadanalticointerno
Anlisisdeblancos
Blanco:Aguareactivo
Frecuencia:Cadavezqueseanaliceunaseriede
muestras
Evaluacin:LD

Controldecalidadanalticointerno
Anlisisdeduplicados
Muestra:Aguacruda Patrnde10g/L
Frecuencia:Cadavezqueseanaliceunaseriede
muestras
Evaluacin:Cartadecontrolderangos

PATRN DE CLOROFILA 10 ug/l D1-D2

AO 2015
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0

PRECISIN - 1 ANALISTA
D1D2

CLOROFILA - AO 2015

150
140
130
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0