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Ion Exchange

Chromatography
Principles and Methods

18-1114-21
Edition AA
Ion Exchange
Chromatography
Principles and Methods

ISBN 91 970490-3-4
Contents
1. Introduction ............................................................................................9

2. Ion exchange chromatography .........................................................10


The theory of ion exchange .................................................................10
The matrix.....................................................................................11
Charged groups .............................................................................13
Resolution in ion exchange chromatography .................................13
Capacity factor ........................................................................15
Efficiency.................................................................................16
Selectivity.................................................................................17
Capacity ........................................................................................18

3. Product Guide .......................................................................................20


MonoBeads ...................................................................................20
MiniBeads .....................................................................................20
SOURCE .......................................................................................20
Sepharose High Performance ion exchangers .................................21
Sepharose Fast Flow ion exchangers ..............................................21
Sepharose Big Beads ion exchangers...............................................21
STREAMLINE ion exchangers ......................................................21
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B .......................22
DEAE Sephacel..............................................................................22
Sephadex ion exchangers ...............................................................22
Bulk quantities...............................................................................22
Equipment.....................................................................................22

4. MonoBeads and MiniBeads ..............................................................23


MonoBeads.....................................................................................23
Properties ......................................................................................24
Chemical stability ....................................................................24
Physical stability ......................................................................25
Flow rate..................................................................................27
Capacity ..................................................................................27
Recovery..................................................................................28
Reproducibility ........................................................................29
Availability ....................................................................................30
MiniBeads .......................................................................................30
Properties ......................................................................................31
Chemical stability ....................................................................31
Physical stability ......................................................................32
Reproducibility ........................................................................33
Availability ....................................................................................33

2
5. SOURCE ................................................................................................34
Properties ......................................................................................37
Chemical stability ....................................................................37
Flow rate..................................................................................38
Capacity ..................................................................................40
Recovery..................................................................................40
Reproducibility ........................................................................41
Availability ....................................................................................41

6. Sepharose based ion exchangers .......................................................42


Chemical stability ..........................................................................42
Physical stability ............................................................................43
Sepharose High Performance ion exchangers.........................43
Properties ......................................................................................44
Physical stability ......................................................................44
Capacity ..................................................................................44
Flow rate..................................................................................46
Availability ....................................................................................46
Sepharose Fast Flow ion exchangers ........................................46
Properties ......................................................................................47
Physical stability ......................................................................47
Capacity ..................................................................................47
Flow rate..................................................................................49
Availability ....................................................................................50
Sepharose Big Beads ion exchangers .........................................50
Properties ......................................................................................51
Physical properties ...................................................................51
Capacity ..................................................................................51
Flow rate..................................................................................51
Availability ....................................................................................51
STREAMLINE SP and STREAMLINE DEAE ......................52
Properties ......................................................................................53
Physical stability ......................................................................53
Capacity ..................................................................................53
Availability ....................................................................................54
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B .............54
Properties ......................................................................................54
Physical stability ......................................................................54
Capacity ..................................................................................55
Flow rate..................................................................................56
Availability ....................................................................................57

7. DEAE Sephacel .....................................................................................58


Properties ......................................................................................58
Chemical stability ....................................................................58
Physical stability ......................................................................59

3
Capacity ..................................................................................59
Flow rate..................................................................................60
Availability ....................................................................................60

8. Sephadex ion exchangers ...................................................................61


Properties ......................................................................................61
Chemical stability ....................................................................61
Physical stability ............................................................................62
Swelling ...................................................................................62
Ionic strength dependence ........................................................62
pH dependence ........................................................................62
Capacity ..................................................................................62
Availability ....................................................................................64

9. Experimental design ............................................................................65


Choice of ion exchanger ..............................................................65
Specific requirements of the application .........................................65
Column separation, batch separation or...................................65
expanded bed adsorption
The scale of the separation .......................................................65
The required resolution ............................................................65
The required throughput ..........................................................66
Scaleability...............................................................................66
Reproducibility ........................................................................67
Economy .................................................................................67
The molecular size of the sample components ................................67
Choice of exchanger group ............................................................68
Determination of starting conditions .......................................69
The isoelectric point .................................................................69
Test-tube method for selecting starting pH ...............................69
Electrophoretic titration curves (ETC) .....................................70
Chromatographic titration curves (retention maps) ..................74
Choice between strong and weak ion exchangers ...........................76
Choice of buffer.............................................................................76
Choice of buffer pH and ionic strength.....................................76
Choice of buffer substance .......................................................77
Test-tube method for selecting starting ionic strengths..............79

10. Experimental Technique.....................................................................80


Column chromatography ............................................................80
Choice of column...........................................................................80
Column design .........................................................................80
Column dimensions .................................................................81
Quantity of ion exchanger .............................................................81
Preparation of the ion exchanger ...................................................81
Pre-swollen ion exchangers ......................................................81

4
Pre-packed ion exchange media ...............................................81
Sephadex ion exchangers .........................................................82
Alternative counter-ions ...........................................................82
Decantation of fines .................................................................82
Packing the column........................................................................82
Column Packing Video Film.....................................................82
Checking the packing ...............................................................83
Equilibrating the bed ...............................................................84
Sample preparation........................................................................85
Sample concentration...............................................................85
Sample composition .................................................................85
Sample volume.........................................................................85
Sample viscosity .......................................................................85
Sample preparation ..................................................................86
Sample application ........................................................................87
Sample application with an adaptor .........................................87
Other methods of sample application.......................................89
Sample application onto a drained bed .....................................89
Sample application under the eluent .........................................89
Elution ..........................................................................................90
Change of pH ..........................................................................90
Change of ionic strength ..........................................................91
Gradient direction....................................................................91
Choice of gradient type ............................................................91
Resolution using a continuous gradient ....................................93
Choice of gradient shape ..........................................................94
Sample displacement ................................................................95
Gradient generation.......................................................................96
Gradient formation with two pumps or a single pump .............96
in combination with a switch valve
Gradient Mixer ........................................................................96
Batch separation ............................................................................97
Expanded bed adsorption ...........................................................98
Expanded bed technology ..............................................................99
Basic principle of operation............................................................99
STREAMLINE adsorbents ..........................................................100
STREAMLINE columns ..............................................................100
Auxiliary equipment ....................................................................100
Regeneration ................................................................................101
Cleaning, sanitization and sterilization procedures ............101
Cleaning ......................................................................................101
Sanitization .................................................................................101
Sterilization .................................................................................101
Protocols for cleaning-in-place (CIP),...........................................102
sanitization and sterilization

5
SOURCE and Sepharose Based ion exchangers......................102
MonoBeads and MiniBeads columns......................................102
DEAE Sephacel and Sephadex based ion exchangers..............103
Storage of gels and columns......................................................103
Prevention of microbial growth..............................................103
Storage of unused media ........................................................104
Storage of used media ............................................................104
Storage of packed columns.....................................................104
Determination of the available and dynamic capacities .....104
Calculation ............................................................................106

11. Process considerations .....................................................................107


Defining the purpose ..................................................................108
The strategic focus ......................................................................109
Capture .......................................................................................109
Intermediate purification .............................................................111
Polishing......................................................................................111
Selection of chromatography media .......................................112
Base matrix properies and derivitization chemistry.................113
Bead size ................................................................................113
Documentation and technical support....................................113
Regulatory support ................................................................113
Vendor certification ...............................................................114
Delivery capacity ...................................................................114
Method design and optimization ............................................114
Binding conditions.......................................................................114
Elution ........................................................................................115
Sample load .................................................................................116
Flow rate .....................................................................................117
Selecting a column ......................................................................118
Aspects of column design .............................................................119
Flow distribution system ........................................................119
Material resistance and durability ..........................................119
Sanitary design.......................................................................119
Pressure vessel safety..............................................................120
Regulatory support ................................................................120
Ergonomics............................................................................120
Packing large scale columns......................................................120
Column configuration .................................................................120
Packing the column......................................................................121
Scale-up .........................................................................................121

6
12. Applications ........................................................................................124
The design of a biochemical separation ........................................124
Application examples ..................................................................127
Enzymes ................................................................................127
Isoenzymes ............................................................................128
Immunoglobulins...................................................................129
Nucleic acid separation ..........................................................129
Polypeptides and polynucleotides...........................................130
Antisense phosphorothioate oligonucleotides .........................132
Areas of application.....................................................................133
Purification of a recombinant Pseudomonas ...............................136
aeruginosa exotoxin A, PE553D
Strategy..................................................................................141

13. Fault-finding chart .............................................................................143

14. Ordering information .......................................................................151


15. References ............................................................................................155

7
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• Assured long term supply of large batches, on time and with the right quality.
• Full technical and regulatory support to assist in process validation.
• Scaleable performance from bench top to production hall.
• Compatible large scale columns and equipment.
• Well documented cleaning and sanitization methods.
• Media shown to perform well in real downstream applications – from Capture to
Polishing, from synthetic oligonucleotides to recombinant proteins.
• High and reliable productivity in the production hall.

Media that fulfill the above described criteria are labelled with the BioProcess Media
symbol in Chapter 3.

8
1. Introduction
Adsorption chromatography depends upon interactions of different types between
solute molecules and ligands immobilized on a chromatography matrix. The first
type of interaction to be successfully employed for the separation of macromolecu-
les was that between charged solute molecules and oppositely charged moieties
covalently linked to a chromatography matrix. The technique of ion exchange
chromatography is based on this interaction.

Ion exchange is probably the most frequently used chromatographic technique for
the separation and purification of proteins, polypeptides, nucleic acids, polynucle-
otides, and other charged biomolecules (1). The reasons for the success of ion
exchange are its widespread applicability, its high resolving power, its high capaci-
ty, and the simplicity and controllability of the method.

This handbook is designed as an introduction to the principles of ion exchange


chromatography and as a practical guide to the use of the media available from
Amersham Biosciences. The handbook is illustrated with examples of different types
of biological molecules which have been separated using ion exchange chromato-
graphy and different ways the technique can be used. For information on specific
separations, the reader is recommended to consult the original literature.

9
2. Ion exchange chromatography
The theory of ion exchange
Separation in ion exchange chromatography depends upon the reversible adsorp-
tion of charged solute molecules to immobilized ion exchange groups of opposite
charge. Most ion exchange experiments are performed in five main stages. These
steps are illustrated schematically below.
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Fig. 1. The principle of ion exchange chromatography (salt gradient elution).

The first stage is equilibration in which the ion exchanger is brought to a starting
state, in terms of pH and ionic strength, which allows the binding of the desired
solute molecules. The exchanger groups are associated at this time with exchange-
able counter-ions (usually simple anions or cations, such as chloride or sodium).

The second stage is sample application and adsorption, in which solute molecules
carrying the appropriate charge displace counter-ions and bind reversibly to the
gel. Unbound substances can be washed out from the exchanger bed using starting
buffer.

In the third stage, substances are removed from the column by changing to elution
conditions unfavourable for ionic bonding of the solute molecules. This normally
involves increasing the ionic strength of the eluting buffer or changing its pH. In
Figure 1 desorption is achieved by the introduction of an increasing salt concentra-
tion gradient and solute molecules are released from the column in the order of
their strengths of binding, the most weakly bound substances being eluted first.

10
The fourth and fifth stages are the removal from the column of substances not elu-
ted under the previous experimental conditions and re-equilibration at the starting
conditions for the next purification.

Separation is obtained since different substances have different degrees of interac-


tion with the ion exchanger due to differences in their charges, charge densities
and distribution of charge on their surfaces. These interactions can be controlled
by varying conditions such as ionic strength and pH. The differences in charge
properties of biological compounds are often considerable, and since ion exchange
chromatography is capable of separating species with very minor differences in
properties, e.g. two proteins differing by only one charged amino acid, it is a very
powerful separation technique.

In ion exchange chromatography one can choose whether to bind the substances
of interest and allow the contaminants to pass through the column, or to bind the
contaminants and allow the substance of interest to pass through. Generally, the
first method is more useful since it allows a greater degree of fractionation and
concentrates the substances of interest.

The conditions under which substances are bound (or free) are discussed in detail
in the sections dealing with choice of experimental conditions, Chapter 9. In addi-
tion to the ion exchange effect, other types of binding may occur. These effects are
small and are mainly due to van der Waals forces and non-polar interactions.

Ion exchange separations may be carried out in a column, by a batch procedure or


by expanded bed adsorption. All three methodologies are performed in the stages
of equilibration, sample adsorption etc. described previously.

The matrix
An ion exchanger consists of an insoluble matrix to which charged groups have
been covalently bound. The charged groups are associated with mobile counter-
ions. These counter-ions can be reversibly exchanged with other ions of the same
charge without altering the matrix.

It is possible to have both positively and negatively charged exchangers (Fig. 2).
Positively charged exchangers have negatively charged counter-ions (anions) avai-
lable for exchange and are called anion exchangers. Negatively charged exchang-
ers have positively charged counter-ions (cations) and are termed cation exchang-
ers.

The matrix may be based on inorganic compounds, synthetic resins or polysaccha-


rides. The characteristics of the matrix determine its chromatographic properties
such as efficiency, capacity and recovery as well as its chemical stability, mechanical

11
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Fig. 2. Ion exchanger types.

strength and flow properties. The nature of the matrix will also affect its beha-
viour towards biological substances and the maintenance of biological activity.

The first ion exchangers were synthetic resins designed for applications such as
demineralisation, water treatment, and recovery of ions from wastes. Such ion
exchangers consist of hydrophobic polymer matrices highly substituted with ionic
groups, and have very high capacities for small ions. Due to their low permeability
these matrices have low capacities for proteins and other macromolecules. In addi-
tion, the extremely high charge density gives very strong binding and the hydro-
phobic matrix tends to denature labile biological materials. Thus despite their
excellent flow properties and capacities for small ions, these types of ion exchang-
er are unsuitable for use with biological samples.

The first ion exchangers designed for use with biological substances were the cellu-
lose ion exchangers developed by Peterson and Sober (2). Because of the hydrophi-
lic nature of cellulose, these exchangers had little tendency to denature proteins.
Unfortunately, many cellulose ion exchangers had low capacities (otherwise the
cellulose became soluble in water) and had poor flow properties due to their irre-
gular shape.

Ion exchangers based on dextran (Sephadex), followed by those based on agarose


(Sepharose CL-6B) and cross-linked cellulose (DEAE Sephacel) were the first ion
exchange matrices to combine a spherical form with high porosity, leading to
improved flow properties and high capacities for macromolecules. Subsequently,
developments in gel technology have enabled this macroporosity to be extended to
the highly cross-linked agarose based media such as Sepharose High Performance,
Sepharose Fast Flow and Sepharose Big Beads, and the synthetic polymer matrices,
MonoBeads, and SOURCE. These modern media enable fast, high capacity, high
resolution ion exchange chromatography to be carried out at both analytical and
preparative scales. Non-porous polymer matrices, e.g. MiniBeads, are available
for extremely high resolution micropreparative or analytical separations.

12
Charged groups
The presence of charged groups is a fundamental property of an ion exchanger.
The type of group determines the type and strength of the ion exchanger; their
total number and availability determines the capacity. There is a variety of groups
which have been chosen for use in ion exchangers (3); some of these are shown in
Table 1.

Table 1. Functional groups used on ion exchangers.

Anion exchangers Functional group

Diethylaminoethyl (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Quaternary aminoethyl (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Quaternary ammonium (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3

Cation exchangers Functional group

Carboxymethyl (CM) -O-CH2-COO-

Sulphopropyl (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Methyl sulphonate (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

Sulphonic and quaternary amino groups are used to form strong ion exchangers;
the other groups form weak ion exchangers. The terms strong and weak refer to
the extent of variation of ionization with pH and not the strength of binding.
Strong ion exchangers are completely ionized over a wide pH range (see titration
curves on page 49) whereas with weak ion exchangers, the degree of dissociation
and thus exchange capacity varies much more markedly with pH.

Some properties of strong ion exchangers are:


• Sample loading capacity does not decrease at high or low pH values due to loss
of charge from the ion exchanger.
• A very simple mechanism of interaction exists between the ion exchanger and
the solute.
• Ion exchange experiments are more controllable since the charge characteristics
of the media do not change with changes in pH. This makes strong exchangers
ideal for working with data derived from electrophoretic titration curves. (see
Chapter 9)

Resolution in ion exchange chromatography


This section discusses the main theoretical parameters which affect the separation
in ion exchange chromatography. For more in-depth information the reader is
referred to standard works on the subject (4, 5).
The result of an ion exchange experiment, as with any other chromatographic
separation, is often expressed as the resolution between the peaks of interest.

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The resolution (Rs) is determined from the chromatogram as shown in Figure 3.
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Fig. 3. Determination of the resolution (Rs) between two peaks.

The resolution is defined as the distance between peak maxima compared with the
average base width of the two peaks. Elution volumes and peak widths should be
measured with the same units to give a dimensionless value to the resolution.

Rs is a measure of the relative separation between two peaks and can be used to
determine if further optimization of the chromatographic procedure is necessary.
If Rs = 1.0 (Fig. 4) then 98% purity has been achieved at 98% of peak recovery,
provided the peaks are Gaussian and approximately equal in size. Baseline resolu-
tion requires that Rs ³1.5. At this value purity of the peak is 100%.

Note: A completely resolved peak is not equivalent to a pure substance. This peak
may represent a series of components which are not resolvable using the selected
separation parameter.

The resolution achievable in a system is proportional to the product of the selecti-


vity, the efficiency and the capacity of the system, the three most important para-
meters to control in column chromatography. The analytical expression for Rs is:

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Fig. 4. Separation results with different resolutions.

Capacity factor
The capacity or retention factor k is a measure of the retention of a component
and should not be confused with loading capacity (mg sample/ml) or ionic capaci-
ty (mmol/ml).

The capacity factor is calculated for each individual peak. For example k for peak
1 in Figure 5 is derived from the equation:
VR1 - Vt
capacity factor k =
Vt

In the equation for Rs, k is the average of k1 and k2.

Adsorption techniques such as ion exchange chromatography can have high


capacity factors since experimental conditions can be chosen which lead to peak
retention volumes greatly in excess of Vt (Vt is also often denoted Vm). This can

15
be seen in contrast with the technique of gel filtration where capacity is limited
since all peaks must elute within the volume (Vt - V0).

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Fig. 5. Hypothetical chromatogram. V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1,
VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, wb1 = peak width for peak 1, wb2 =
peak width for peak 2.

Efficiency
The column efficiency is related to the zone broadening which occurs on the
column and can be calculated from the expression:

VR1 2 where wh is the peak width


N = 5.54
( ) wh at half peak height

and is expressed as the number of theoretical plates (N) for the column under spe-
cified experimental conditions. Efficiency is frequently stated as the number of
theoretical plates per metre chromatographic bed, or expressed as H (height equi-
valent to a theoretical plate, HETP), which is the bed length (L) divided by the
plate number.

H = L/N

Since the observed value for N depends on experimental factors such as flow rate
and sample loading, it is important that comparisons are done under identical con-
ditions. In the case of ion exchange chromatography, efficiency is measured under
isocratic conditions, using a substance which does not interact with the matrix,
e.g. acetone.

16
One of the main causes of zone broadening in a chromatography bed is longitudi-
nal diffusion of the solute molecules. The effect is minimized if the distances avai-
lable for diffusion, in both the mobile phase and stationary phase, are minimized.
In practice this is achieved by using small uniform bead sizes and important deve-
lopments in ion exchange chromatography have been the introduction of 10 µm
and 15 µm diameter particles such as MonoBeads and SOURCE, to give high effi-
ciency preparative media. The highest efficiency is achieved with the non-porous,
3 µm diameter MiniBeads, designed for analytical and micropreparative
applications.

After bead size, the second major contributory factor to efficiency is good experi-
mental technique. Badly, unevenly packed chromatography beds and air bubbles
will lead to channelling, zone broadening and loss of resolution. Good separations
require well packed columns and the importance of column packing increases in
direct proportion to the performance required.

Selectivity
The selectivity (a) defines the ability of the system to separate peaks i.e. the distan-
ce between two peaks. The selectivity factor can be calculated from the chromato-
gram (Fig. 5) using the expression

k2 VR2 - V0 VR2
a= = Å
k1 VR1 - V0 VR1

Good selectivity is a more important factor than high efficiency in determining


resolution (Fig. 6) since Rs is linearly related to selectivity but quadratically related
to efficiency. This means that a four fold increase in efficiency is required to dou-
ble the resolution under isocratic conditions.

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Fig. 6. The effect of selectivity and efficiency on resolution.

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Selectivity in ion exchange chromatography depends not only on the nature and
number of the ionic groups on the matrix but also on the experimental conditions,
such as pH and ionic strength. It is the ease and predictability with which these
experimental conditions, and thus the selectivity, can be manipulated which gives
ion exchange chromatography the potential of extremely high resolution.

Capacity
The capacity of an ion exchanger is a quantitative measure of its ability to take up
exchangeable counter-ions and is therefore of major importance. The capacity
may be expressed as total ionic capacity, available capacity or dynamic capacity.

The total ionic capacity is the number of charged substituent groups per gram dry
ion exchanger or per ml swollen gel. Total capacity can be measured by titration
with a strong acid or base.

The actual amount of protein which can be bound to an ion exchanger, under defi-
ned experimental conditions, is referred to as the available capacity for the gel. If
the defined conditions include the flow rate at which the gel was operated, the
amount bound is referred to as the dynamic capacity for the ion exchanger. Availa-
ble and dynamic capacities depend upon:

The properties of the protein.


The properties of the ion exchanger.
The chosen experimental conditions.

The properties of the protein which determine the available or dynamic capacity
on a particular ion exchange matrix are its molecular size and its charge/pH rela-
tionship. The capacity of an ion exchanger is thus different for different proteins.

On a porous matrix used for ion exchange chromatography, molecules which are
small enough to enter the pores will exhibit a higher available capacity than those
molecules which are restricted to the charged substituents on the surface of the gel.

Similarly, since the interaction is ionic, the protein’s charge/pH relationship must
be such that the protein carries the correct net charge, at a sufficiently high surface
charge density, to be bound to a particular ion exchanger under the chosen buffer
conditions.

The properties of the ion exchange matrix which determine its available capacity
for a particular protein are the exclusion limit of the matrix, and the type and
number of the charged substituents. High available capacity is obtained by having
a matrix which is macroporous and highly substituted with ionic groups which
maintain their charge over a wide range of experimental conditions. Non-porous

18
matrices have considerably lower capacity than porous matrices, but higher effici-
ency due to shorter diffusion distances.

The experimental conditions which affect the observed capacity are pH, the ionic
strength of the buffer, the nature of the counter-ion, the flow rate and the tempera-
ture. The flow rate is of particular importance with respect to dynamic capacity,
which decreases as the flow rate is increased. These conditions should always be
taken into consideration when comparing available capacities for different ion
exchangers.

Methodologies for determining the available and dynamic capacities for an ion
exchanger are given in Chapter 10.

19
3. Product Guide
Amersham Biosciences manufactures a wide range of ion exchange media suitable for
analytical, micropreparative, small scale preparative, and process scale applica-
tions. The product range is summarized below.

MonoBeads (page 23)


Mono Q and Mono S are strong ion exchangers based on MonoBeads, monodis-
perse 10 µm hydrophilic polymer particles. Mono Q and Mono S are the establis-
hed standards for high performance ion exchange separations and are best suited
for analytical and small scale preparative applications.

MiniBeads (page 30)


MiniBeads, a non-porous matrix of monodisperse 3 µm hydrophilic polymer par-
ticles, is the base for two strong ion exchangers, Mini Q and Mini S. Both media
are available pre-packed in Precision Columns 3.2/3, for micropreparative chro-
matography in SMART System. With a specially designed column holder, these
columns can also be used in FPLC and HPLC systems.
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SOURCE (page 34)


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SOURCE 15Q, SOURCE 15S, SOURCE 30Q and SOURCE 30S are strong ion
exchangers based on the same type of rigid polymer matrix as MonoBeads, poly-
styrene/divinyl benzene beads. SOURCE 15Q and SOURCE 15S are based on
15 µm monodisperse particles while SOURCE 30Q and SOURCE 30S are based
on 30 µm mondisperse particles. SOURCE ion exchange media are designed for
high performance applications at both research and industrial scales. They provide
high capacity at high flow rates and at a minimum of back-pressure, thus allowing
short cycle times, high productivity and scaleability.

SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very high resolution (effici-
ency) is required. SOURCE 30 matrices gives, in comparison with SOURCE 15
matrices, slightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressu-
re. This makes SOURCE 30 ideal for purification with more complex samples and
larger volumes. Using SOURCE 30, a higher degree of purification can be obtai-
ned with high productivity. Typically working flow rate ranges for ion exchangers
based on SOURCE 15 and SOURCE 30 are 30-600 cm/h and 300-1000 cm/h
respectively.

20
BioProcess
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Sepharose High Performance ion exchangers
(page 43)
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Q and SP Sepharose High Performance are strong ion exchangers based on a 34


µm highly cross-linked agarose matrix, providing high physical and chemical sta-
bility. These media are ideal for intermediate and final purification. They should
be used when resolution is the main objective. As resolution and efficiency are
maintained with increasing column diameter and sample load, separations using
these media are easy to scale up. Typical working flow rates are 50-150 cm/h.
BioProcess
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Sepharose Fast Flow ion exchangers (page 46)


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Sepharose Fast Flow ion exchangers are based on 90 µm highly cross-linked 6%


agarose beads of high chemical and physical stability. The range consists of the
weak exchangers DEAE Sepharose Fast Flow and CM Sepharose Fast Flow as well
as the strong exchangers Q Sepharose Fast Flow and SP Sepharose Fast Flow. The
exceptional flow characteristics make these ion exchangers the first choice for
separating crude mixtures early in a purification scheme. Here, fast removal and a
combination of good resolution and high flow rate are essential. Typical working
flow rates for these media are 100-300 cm/h. Sepharose Fast Flow ion exchangers
are ideal for purifications with high demands on productivity.
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Sepharose Big Beads ion exchangers (page 50)


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Q and SP Sepharose Big Beads are strong ion exchangers designed for industrial
applications. They are based on 100-300 µm highly cross-linked 6% agarose
beads. The large particle size combined with high physical stability of the base
matrix ensures rapid processing, even for viscous samples. Sepharose Big Beads is
therefore the choice at the beginning of a purification scheme, where viscosity and
back-pressure may limit the throughput attainable with ion exchangers based on
smaller bead sizes, such as Sepharose Fast Flow ion exchangers. The medium
should be chosen when large volumes are handled and fast adsorption is required
and when resolution is of less importance.
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STREAMLINE ion exchangers (page 52)


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STREAMLINE adsorbents, available as STREAMLINE DEAE and


STREAMLINE SP, are specially designed for use in STREAMLINE columns for
expanded bed adsorption. Together they enable the high flow rates needed for
high productivity in industrial applications of fluidized beds. STREAMLINE
adsorbents, based on cross-linked 6% agarose beads with a mean particle size of
200 µm, are designed to handle samples directly from both fermentation homoge-
nates and crude samples from cell culture/fermentation at working flow rates of
typically 200-400 cm/h.

21
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B
(page 54)
DEAE and CM Sepharose CL-6B ion exchangers are based on 90 µm cross-linked
6% agarose beads. These two gels are the traditional agarose based ion exchang-
ers from Amersham Biosciences. Their performance has been demonstrated in several
hundred applications for the separation of proteins, polysaccharides, nucleic
acids, membrane components and other high molecular weight substances.
Sepharose CL-6B based ion exchangers are typically used with working flow rates
of up to 60 cm/h.

DEAE Sephacel (page 58)


DEAE Sephacel is a beaded cellulose ion exchanger for separations over a wide
molecular weight range (up to l x 106 for globular proteins). DEAE Sephacel is the
medium of choice when a cellulose ion exchanger is needed for standard chroma-
tography of proteins, nucleic acids or other biopolymers.

Sephadex ion exchangers (page 61)


Sephadex ion exchangers are bead-formed media based on cross-linked dextran.
They are available as strong and weak ion exchangers covering the pH range 2-10.
Sephadex ion exchanger are suitable for batch-type applications.

Bulk quantities
All Amersham Biosciences ion exchangers are available in larger pack sizes or larger
pre-packed columns. Contact your local Amersham Biosciences supplier for further
information.

Equipment
Amersham Biosciences also supply a full range of equipment for operating all of the
ion exchangers covered in this handbook. Information regarding specific equip-
ment is available upon request from Amersham Biosciences.

22
4. MonoBeads and MiniBeads
MonoBeads
MonoBeads are unique, highly efficient, pH stable ion exchange media, specifical-
ly designed for high resolution separations of proteins, peptides, and oligonucleo-
tides. An example of the type of separation which can be achieved is shown in
Figure 7.
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Fig. 7. Characterization of venom from the White Faced Hornet by cation exchange chro-
matography (6).
Conditions: Venom (7 mg) dissolved in 50 mM BICINE, pH 8.4 (buffer A); Column,
Mono S HR 5/5; Buffer B, 0.35 M NaCl in Buffer A; Gradient, 0-100% B in 40 ml; flow
rate, 1 ml/min; detection, 280 nm at 0.05 AUFS.

MonoBeads ion exchangers are based on a 10 µm beaded hydrophilic polystyre-


ne/divinyl benzene resin which has been substituted with quaternary amine groups
to yield the strong anion exchanger, Mono Q, or with methyl sulphonate groups
to yield the strong cation exchanger, Mono S.

Note: Substitution with the same ionic groups as Polybuffer Exchanger PBE 94
gives Mono P - the matrix used for high resolution chromatofocusing. For further
information on the technique and media for chromatofocusing the reader should
contact Amersham Biosciences.

23
The name MonoBeads is derived from the unique monodisperse nature of the
matrix. This monodispersity (Fig. 8) was accomplished through a process develo-
ped by Professor John Ugelstad of SINTEF, Trondheim, Norway.

Fig. 8. An electron micrograph of MonoBeads showing their distinct monodispersity.

The resolution which can be achieved on any chromatographic matrix is a result


of a combination of the efficiency and selectivity of the system. Maximum efficien-
cy is obtained through the use of small, perfectly spherical, monodisperse parti-
cles, optimally packed in a well designed column. All pre-packed MonoBeads
columns have efficiencies at about 25 000 plates per metre. High efficiency, coup-
led with the excellent selectivity of the Q and S substituents, results in high resolu-
tion separations.

Scale-up to SOURCE Q and S (see Chapter 5), Q and SP Sepharose High


Performance and Q and SP Sepharose Fast Flow (see Chapter 6) is simple, since
these gels have similar selectivities to MonoBeads based media.

Properties
Chemical stability
The gels are stable for continuous use in the pH range 2-12, although pH values as
high as 14 can be used during cleaning and sanitizing procedures. MonoBeads can
be used with solutions of most buffers used in biochemical separations of bio-
molecules and in water-alcohol (C1 - C4) and acetonitrile-water solutions.
The resistance of the MonoBeads matrix to organic solvents allows complete clea-
ning and the use of conditions necessary for the solubilization of very hydrophobic
samples. An example of the use of MonoBeads with organic solvents is given in
Figure 9, which shows the analysis of the peptide bacitracin on Mono S using
lithium chlorate as the eluting salt and 90% methanol as the liquid phase (7).

24
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(Work by Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Dimethylsulphoxide (DMSO) and similar solvents can be used, but will change the
separation properties of the gels. Aqueous solutions of urea, ethylene glycol and
similar compounds can be used but will increase the back-pressures due to their
higher viscosities. Non-ionic detergents, zwitterionic detergents or detergents with
the same charge as the ion exchange groups may be used. Oxidizing agents should
be avoided.

Physical stability
MonoBeads are based on highly rigid beads which means that they can be used at
high flow rates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix these
high flow rates do not result in high back-pressures. For example, an HR 5/5
column (5 mm inner diameter and 50 mm bed height) packed with a MonoBeads
matrix normally generates a back-pressure of 1.0-1.5 MPa (10-15 bar) when ope-
rated at a flow rate of 1 ml/min (300 cm/h).

Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratory
peristaltic pumps.

25
A summary of the characteristics of MonoBeads is shown in Table 2.

Table 2. Characteristics of MonoBeads.

Properties Mono Q Mono S


Type of gel strong anion exchanger strong cation exchanger

Charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O- -O-CH2-CHOH-CH2-O-


-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 -CH -CHOH-CH SO -
2 2 3
Total ionic capacity (µmoles/ml gel) 270-370 140-180
Total protein binding capacity (mg/ml gel)
Thyroglobulin (MW 669 000) 25 N.D.
HSA (MW 68 000) 65 N.D.
a-lactalbumin (MW 14 300) 80 N.D.
IgG (MW 150 000) N.D. 75
Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 75
Typical protein recoveries (%) 90-100 90-100
Typical enzyme activity recoveries (%) >80 >80
Average particle size (µm) 10 ±0.5 10 ±0.5
MW range (proteins) up to 107 up to 107
working pH range* 3-11 3-11
pH stability**
long term 2-12 2-12
short term 2-14 2-14

N.D. = Not determined


Solvent restrictions: The ion exchangers are stable in alcohol/water solutions (C1-C4). 100% dimethyl
sulphoxide, dimethylformamide, and formic acid can change the separation properties of the gel.
Avoid oxidizing and reactive reagents. Detergents can be used if they are non-ionic or have the same
charge as the gel.
* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

26
Flow rate
The rigid monodisperse nature of the media enables high flow rates to be used on
MonoBeads columns. Normal recommended flow rates for high resolution sepa-
rations are in the range 150 to 600 cm/h for HR 5/5 columns. Higher flow rates
can be used during column washing and regeneration.

In addition, the absence of buffering capacity means that buffer exchange and
re-equilibration can be executed quickly and with small amounts of buffer. Details
of the recommended flow rates to be used on the different columns are given in
Table 3.

Capacity
The high substitution levels coupled with the large pore size of the matrix, the
exclusion limit for globular proteins is 107, give MonoBeads exchangers high
capacities for large proteins as well as for smaller polypeptides and peptides.

Typical saturation capacities are in the range of 60 mg protein per ml of gel and
typical sample loading capacities are in the region of 25 mg of protein per ml of
gel. Data on the saturation capacities for some specific proteins are given in
Table 2.

Table 3. Chromatographic properties of pre-packed columns of MonoBeads.

Properties PC 1.6/5 HR 5/5 HR 10/10 HR 16/10 BioPilot Column


35/100 60/100
Column volume (ml) 0.1 1 8 20 100 300

Column dimensions 1.6x50 5x50 10x100 16x100 35x100 60x100


i.d. x bed height (mm)

Recommended working
flow rate range (ml/min) 0.01-0.40 0.5-2.0 up to 6 up to 10 up to 32 up to 94

Max operating 5 5 4 3 2 2
pressure (MPa)

Number of theoretical
plates per meter (N/m) 25 000 25 000 25 000 25 000 25 000 25 000

Normal separation
times (min) 5-20 5-20 40 40 60-90 60-90

27
The titration curves for Mono Q and Mono S (Fig. 10) show no buffering capaci-
ty which means that the loading capacity does not vary with pH over the working
range of the gel.
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Fig. 10. Titration curves for Mono Q and Mono S. (Work by Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden.)

Recovery
Non-specific interactions to the MonoBeads matrix are very low and consequent-
ly recoveries are high. Recoveries of protein mass are typically 90-100% and of
protein activity greater than 80%. Examples of protein activity recoveries are
shown in Table 4.

Table 4. Protein activity recoveries (%) from MonoBeads columns.

Protein Mono Q Mono S


b-Glucuronidase 106 N.D.
b-Glucosidase N.D. 93
Phosphodiesterase 80 N.D.
Creatine Kinase 90 N.D.
Enolase N.D. 95
Lactate Dehydrogenase N.D. 102
Aldolase N.D. 94

N.D. = Not determined

28
Reproducibility
The stability of the MonoBeads matrix together with controlled synthesis and
column packing procedures ensure very reproducible separations both over time
and from column to column. Figure 11 shows the reproducibility of a separation
performed on three different Mono S columns.
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Fig. 11. Reproducible separations on three Mono S HR 5/5 columns. (Work by


Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

29
Availability
Mono Q and Mono S are available pre-packed in columns HR 5/5, HR 10/10
and HR 16/10, containing 1, 8 and 20 ml of gel respectively. The media are also
available in BioPilot Columns 35/100 and 60/100 containing respectively 100 and
300 ml bed volumes, for chromatography at BioPilot scale. MonoBeads ion
exchangers are also available as Mono Q PC 1.6/5 and Mono S PC 1.6/5, pre-
packed columns specially designed for micropurification on SMART System.
These columns can also be used in other high performance chromatography sys-
tems by using a column holder for Precision Columns. For further information
about the column holder, please contact your Amersham Biosciences representative.
For ordering information, see Chapter 14.

MiniBeads
MiniBeads is the base matrix for 3 µm high resolution ion exchange media. This
non-porous matrix, consisting of monodisperse hydrophilic polymer beads is sub-
stituted with Q and S functional groups to give Mini Q and Mini S. Both media
are packed in Precision Columns 3.2/3 (3.2 mm inner diameter and 30 mm bed
height) for micropreparative chromatography on SMART System. With a special-
ly designed column holder, these columns can also be used in FPLC and HPLC sys-
tems.

MiniBeads are highly efficient pH-stable adsorbents designed for high performan-
ce micropurification of proteins, peptides and polynucleotides. The monodispersi-
ty permits the use of high flow rates at relatively low back-pressures. The main
properties are listed in Table 5.

Due to the smaller particle size, Mini Q and Mini S give faster separations with
higher resolution of peaks than ion exchangers based on MonoBeads, see
Figure 12. This resolution is crucial for success when separating complex samples
in the pg to µg micropreparative scale.

30
Sample: Chymotrypsinogen A, Ribonuclease A, Cytochrome C,
Lysozyme (6:10:6:5), 25 µg/ml gel (6 µg Mini S,
2.5 µg Mono S )
Buffer A: 20 mM acetic acid, pH 5.0
Buffer B: Buffer A with 0.5 M lithium chloride
Gradient: 0–100% B in 20 col. vols. (6 min Mini S, 10 min Mono S).
Flow rate: 10 cm/min (800 µl/min Mini S, 200 µl/min Mono S)
Instrument: SMART System with µPeak Monitor

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Fig. 12. Comparison of (A) Mini S PC 3.2/3 and (B) Mono S PC 1.6/5. Mini S PC 3.2/3
gives a faster separation and a better resolution of the peaks. Similar results have been
found with Mini Q PC 3.2/3 and Mono Q PC 1.6/5. (Work by Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden.)

Properties
Chemical stability
MiniBeads may be used in aqueous solutions and nearly all organic solutions com-
monly used in chromatography of proteins, oligonucleotides and peptides. As
examples, the matrix is stable to 100% acetonitrile, 75% acetic acid, 2 M NaOH
and 1 M HCl. Dimethylsulphoxide (DMSO), dimethylformamide, and formic acid
and similar solvents will change the separation properties of the gels. Aqueous
solutions of urea, ethylene glycol and similar compounds can be used but will
increase the back-pressure due to their higher viscosities. Non-ionic detergents,
zwitterionic detergents or detergents with the same charge as the ion exchange
groups may be used. Oxidizing agents should be avoided.

31
Physical stability
The combination, non-porous and monodisperse beads gives MiniBeads very high
physical stability. It has better flow kinetics and can withstand higher back-pressure
(up to 10 MPa) than MonoBeads.

Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratory
peristaltic pumps.

Table. 5. Main properties of Mini Q PC 3.2/3 and Mini S PC 3.2/3.

Properties Mini Q PC 3.2/3 Mini S PC 3.2/3


Type of gel strong anion exchanger strong cation exchanger
Charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O- -O-CH2-CHOH-CH2-O-
-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 -CH2-CHOH-CH2SO3-
Total ionic capacity (µmoles/ml gel) 60-90 16-30
Column dimensions i.d. x bed height (mm) 3.2 x 30 3.2 x 30
Column volume (ml) 0.24 0.24
Average particle size (µm) 3 µm 3 µm
Binding capacity (mg/column)
a-amylas (MW 49 000) Å 1.4 N.D.
Trypsin inhibitor (MW 20 100) Å 1.4 N.D.
Ribonuclease (MW 13 700) N.D. Å 1.3
Lysozyme (MW 14 300) N.D. Å 1.3
Max loading capacity (mg/column) 1-1.5 1-1.5
Practical loading capacity (µg/column) ²200 ²200
Typical protein recoveries (%) 70-90 70-90
working pH range* 3-11 3-11
pH stability**
long term 3-11 3-11
short term 1-14 1-14
Maximum flow rate (ml/min) 1.0 1.0
Operational pressure limit (MPa) 10 10
Normal separation times (min) 5-20 5-20

N.D. = Not determined


* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

32
Reproducibility
Figure 13 shows a long life test and reproducibility test on Mini S PC 3.2/3. Long
life and reproducibility are a result of the stabile nature of MiniBeads together
with controlled synthesis and column packing procedures.

Column: Mini S PC 3.2/3


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Sample: Chymotrypsinogen A, Ribonuclease A,
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Lysozyme 6 mg in proportions 1:3:1


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Buffer B: 20 mM acetic acid, pH 5.0 with 0.4 M NaCl
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Flow rate: 400 ml/min
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Fig. 13. Long life test on Mini S PC 3.2/3. The chromatograms show the 1st, 5th and 201st
separation of a series run on the same column. The same consistently good stability and
reproducibility have been confirmed on Mini Q PC 3.2/3 (data not shown here). (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Availability
Mini Q and Mini S are available pre-packed in Precision Columns 3.2/3. For
ordering information, see Chapter 14.

33
5. SOURCE
SOURCE ion exchangers are high performance media for fast and high resolution
separations of biomolecules such as proteins, peptides and oligonucleotides.
Examples are given in Figure 14, 18 and Figure 19.
SOURCE media are available in two
Column: RESOURCE S 1 ml
particle sizes, 15 and 30 µm, and as
6.4 mm diam x 30 mm bed height
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Sample: Snake venom 4 mg/ml, 0.1 ml
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Sweden.)

SOURCE is based on monodisperse, hydrophilized and rigid polystyrene/divinyl


benzene beads with controlled pore structure. The beads have a uniform size dis-
tribution, see Figure 15, and allow perfect packing of stable chromatography
beds. Monodispersity together with the absence of broken beads and fine particles
give low operating back-pressures.

Fig. 15. Light microscope


photograph of SOURCE.
Note the uniform size
distribution and absence of
broken beads and bead
fragments.

34
Table 6. Characteristics of SOURCE 15Q and 15S, and SOURCE 30Q and 30S.

Properties SOURCE 15Q SOURCE 30Q SOURCE 15S SOURCE 30S

Type of gel strong anion exchangers strong cation exchangers


Charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O- -O-CH2-CHOH-CH2-O-
-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 -CH -CHOH-CH SO -
2 2 3
Matrix Polystyrene/divinyl benzene
Bead form Rigid, spherical, porous monodisperse
Mean particle size (µm) 15 30 15 30
Dynamic binding
capacity* (mg/ml gel)
Lysozyme (MW 14 500) N.D. N.D. 80 80
BSA (MW 67 000) 45 45 N.D. N.D.
MW range (proteins) up to 107 up to 107 up to 107 up to 107
working pH range** 2-12 2-12 2-12 2-12
pH stability***
long term 2-12 2-12 2-12 2-12
short term 1-14 1-14 1-14 1-14
Maximum flow rate (cm/h) 1800 1
2000 2
1800 1
20002
Recommended working 30-600 300-1000 30-600 300-1000
flow rate range (cm/h)
Operating temperature (°C) 4-40 4-40 4-40 4-40

N.D. = Not determined


Solvent restrictions: SOURCE is stable in alcohol/water solutions (C1-C4). 100% dimethyl sulphoxide,
dimethylformamide, and formic acid can change the separation properties of the gel. Avoid oxidizing
and reactive reagents. Detergents can be used if they are non-ionic or have the same charge as the gel.
* Determined by frontal analysis at a flow rate of 300 cm/h, using a 5.0 mg/ml solution of protein in 20
mM sodium phosphate buffer, pH 6.8 (lysozyme) and 20 mM BIS TRIS PROPANE buffer, pH 7.0
(BSA).
** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.
1) Maximum flow rate to be applied, will depend on the pressure specification of the chromatographic
system used. A linear flow rate of 1800 cm/h will give a pressure drop of approximately 10 MPa at a
bed height of 3 cm.
2) Maximum flow rate to be applied, will depend on the pressure specification of the chromatographic
system used. A linear flow rate of 2000 cm/h will give a pressure drop of approximately 10 MPa at a
bed height of 10 cm.

A uniquely wide pore size distribution and a large specific surface area offer excel-
lent resolution and capacity for a wide range of molecules; from small peptides
and oligonucleotides up to large proteins. The performance is well maintained at
high flow rates and high sample loads. This is illustrated in Figure 16 and 17,
which show separations of model protein mixtures on SOURCE 30Q.

35
Column: SOURCE 30Q, 10 mm i.d. x 50 mm (4 ml)
Sample: Mixture of lactoglobulin B and amyloglucosidase
Sample load: 1 mg/ml bed volume
Eluent A: 20 mM BIS-TRIS PROPANE, pH 7.0
Eluent B: 0.5 M sodium chloride, 20 mM BIS-TRIS PROPANE, pH 7.0
Flow rate: a) 4 ml/min (300 cm/h)
b) 13 ml/min (1000 cm/h)
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Fig. 16. The influence of increasing flow rate on resolution. (Work by Amersham Biosciences,
Uppsala, Sweden.)

Column: SOURCE 30S, 5 mm i.d. x 50 mm (1 ml)


Sample: Mixture of chymotypsinogen, cytochrome C and lysozyme
Sample load: a)1 mg
b) 10 mg
Eluent A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8
Eluent B: 0.5 M sodium chloride, 20 mM sodium phosphate, pH 6.8
Flow rate: 1 ml/min (300 cm/h)
Gradient: 0-100% B, 20 column volumes ?
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Fig. 17. The influence of increasing sample load on resolution. (Work by Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)

SOURCE 15 and SOURCE 30 ion exchangers are designed for research and
industrial applications, with emphasis on high performance, high capacity, high
reproducibility, and easy scaleability.
In comparison with media based on SOURCE 15 matrix, SOURCE 30 gives
slightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressure. This
makes SOURCE 30 ideal for purifications with more complex samples and larger
volumes. Using SOURCE 30, a high degree of purification can be obtained with

36
high productivity. SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very high
resolution (efficiency) is required.

SOURCE 15 media are available in pre-packed RESOURCE columns. These


columns are convenient for lab research applications and method development.

Properties
Chemical stability
The hydrophilized polymeric matrix has high chemical stability and can be used
over a wide pH range allowing flexibility in the choice of conditions for separa-
tion.

The wide pH stability range, 1-14, allows cleaning and sanitization with harsh
agents like 1 M NaOH. Additionally, in applications such as the purification of
synthetic oligonucleotides, the wide pH stability also allows use of a high pH buf-
fer to prevent aggregation, see Figure 18.

Column: a) RESOURCE Q 1 ml (6.4 mm diam x 30 mm bed height)


b) SOURCE 15Q in BioProcess Special, 240 ml
(100 mm diam. x 30 mm bed height)
Sample: a) 800 µmoles synthesis of 19 mer DNA oligo, load 5 mg
b) As a), load 820 mg
Sequence: ATACCGATTAAGCAAGTTT
Eluent A: 10 mM NaOH pH 12
Eluent B: A + 1.5 M NaCl
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Flow rate: a) 1.6 ml/min (300 cm/h), b) 385 ml/min (300 cm/h)
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Gradient: 0.25-0.75 M NaCl in 30 column volumes
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Fig. 18. Purification of 19 mer DNA oligonucleotide on RESOURCE Q 1 ml scaled up to


BioProcess Special column 100 mm diameter. Separation optimized for sample load, yield
and purity of product. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

37
Flow rate
SOURCE media are based on highly rigid beads which allows use at high flow
rates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix, these high flow
rates do not result in high back-pressures. The back-pressure from SOURCE
media is much lower than for other media of the same particle size range. The low
back-pressure offers the advantage of being able to run at very high flow rates on
medium pressure equipment, as well as with acceptable flow rates on low pressure
equipment. As an example, when a RESOURCE 1 ml column is used at the maxi-
mum flow rate of FPLC or HPLC systems (about 10 ml/min, 1800 cm/h) separa-
tions are completed in less then 3 minutes, see Figure 19. At flow rates of 1
ml/min (180 cm/h) the extremely low back-pressures (typically around 0.1 MPa,
1 bar, 15 psi) allow high resolution separations in about 20 minutes with systems
based only on a peristaltic pump, see Figure 20.
Column: RESOURCE Q 1ml
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Buffer B: Buffer A + 0.4 ml NaCl
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Fig. 20. Separation of snake venom (Sigma) on RESOURCE S 1 ml at 1.0 ml/min (180
cm/h). System: GradiFrac equipped with Peristaltic Pump P-1. Although high performance
separations with RESOURCE Q and S do not put special demands on the pump, resolution
obtained on the column can be lost through mixing in dead spaces. Low dead volumes,
accurate gradient generation, and a good detector and fraction collector are also essential
for good results. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
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Fig. 21. Pressure versus flow rate curves that can be expected with SOURCE media. Curve
in a) shows that RESOURCE 1 ml columns can be used with high pressure equipment or
peristaltic pumps. The curves in b) are from a large scale column packed with SOURCE 15
media to 4 different bed heights. Curve c) shows the flow characteristics of the monosized
SOURCE 30 matrix compared with polysized media with mean diameters of 35 and 50 µm
respectively. The pressure flow data were determined in a 100 mm i.d. column with a bed
height of 10 cm. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)
POROS is a registred trademark of Perseptive Biosystems.
S HyperD F is a registred trademark of BioSepra.

39
Recommended flow rates for high resolution separations are in the range 30 to
600 cm/h for SOURCE 15Q and 15S and 300 to 1000 cm/h for SOURCE 30Q
and 30S.

Figure 21 shows pressure versus flow rate characteristics of SOURCE 15 and


SOURCE 30.

Capacity
SOURCE ion exchangers have high capacities for large proteins as well as for
smaller polypeptides, peptides and oligonucleotides. This is a result of an optimi-
zed pore size distribution, a high substitution level and a large binding surface
area. Figure 22 shows breakthrough curves at different flow rates on RESOURCE
Q and RESOURCE S.

SOURCE Q and S retain their charge and can therefore be used over a wide pH
range, 2-12, without variation in loading capacity.

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Fig. 22. Breakthrough curves at different flow rates (superimposed).


a) RESOURCE Q 1 ml. Sample: Bovine serum albumin (Sigma), 5 mg/ml.
b) RESOURCE S 1 ml. Sample: Lysozyme, 5 mg/ml (Sigma).
(Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Recovery
The recovery of protein mass is typically 90-100%. In the application described in
Chapter 12, purification of exotoxin A, the recovery in the SOURCE 30Q step
was 91%.

40
Reproducibility
Emphasis during development has been on quality, reproducibility and scaleabili-
ty, features which are particularly important for industrial applications under
strict regulatory control. Through the combination of high quality assurance stan-
dards and a patented manufacturing process, the particle structure is consistent
both bead-to-bead and batch-to-batch. Modal particle diameter varies between
batches within ± 1 µm for SOURCE 15 and ±2 µm for SOURCE 30. The reprodu-
cibility of a separation of a standard protein mixture performed on four different
production batches of SOURCE 30S, see Figure 23, is an example that reflects the
reproducible qualities of SOURCE media.

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Fig. 23. Quality control evaluation of 4 production batches of SOURCE 30S. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Availability
SOURCE 15Q and 15S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml, 200 ml, 500 ml
and 1 litre. SOURCE 30Q and 30S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml,
200 ml, 1 litre, and 5 litres.

RESOURCE Q and S are pre-packed columns with SOURCE 15Q and 15S respec-
tively. They are available in 1 and 6 ml sizes, packed to a bed height of 3 cm. For
ordering information please refer to Chapter 14.

41
6. Sepharose based ion
exchangers
Amersham Biosciences offers a range of ion exchange media based on agarose, which
is cross-linked to produce Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow,
Sepharose Big Beads, Sepharose CL-6B and STREAMLINE base matrices.
Exchanger groups are attached to the gels by stable ether linkages to the monosac-
charide units to give the final ion exchange gels.

The polysaccharide chains of Sepharose based ion exchangers are arranged in


bundles (Fig. 24). These bundles are further strengthened by different degrees of
intra-chain cross-linking which provide a high matrix rigidity. The resulting struc-
ture is macroporous and the capacity of the gels very good for globular proteins
up to 106 in molecular weight.

The gels, particularly the most highly


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Fig. 24. Structure of cross-linked agarose gels.

Chemical stability
Sepharose ion exchangers tolerate extreme working conditions of temperature,
pH and chemical agents. They are stable in water, salt solutions, and organic sol-
vents. Details on the pH stability range for each gel is given in the appropriate sec-
tion below.

The ion exchangers can be used in solutions of non-ionic detergents such as


Triton X-100® and with strongly dissociating solvents such as 8 M urea and 6 M
guanidine hydrochloride (9). The Sepharose based ion exchangers also tolerate
1 M acetic acid, 30% isopropanol, 30% acetonitrile, 70% ethanol and 1 M
NaOH. Under oxidizing conditions, limited hydrolysis of the polysaccharide
chains may occur.

The gel-forming fibres of agarose are stiff bundles of polysaccharide chains rather
than flexible single chains (10). For this reason the water in the gel can be replaced
by other solvents with relatively little effect on pore size. Sepharose ion exchangers
Triton® is a registred trademark of Rohm and Haas Co.

42
can be used in polar organic solvents and in aqueous/organic mixtures. The gel
matrix is stable in a wide variety of solvents including ethanol, dimethylformami-
de, tetrahydrofuran, acetone, dimethylsulphoxide, chloroform, dichloromethane,
dichloroethane and dichloroethane/pyridine (50:50).

Sepharose is very resistant to microbial attack due to the presence of the unusual
sugar, 3,6-anhydro-L-galactose. However, most buffers can support bacterial
growth and so a antimicrobial agent should be used in storage (see page 103).

Physical stability
The highly cross-linked structure of the modern Sepharose based ion exchangers,
e.g. Sepharose Fast Flow and Sepharose High Performance, not only gives them
increased chemical stability but also results in improved physical stability. This
improves flow properties enormously compared to Sepharose CL-6B gels. Cross-
linking prevents fluctuations in bed volume under conditions of increasing ionic
strength. Thus Sepharose ion exchangers can be regenerated and re-equilibrated
repeatedly in the column. Repacking between experiments is thus eliminated,
improving reproducibility.

Sepharose ion exchangers can be used at temperatures up to 70 °C and can be ste-


rilized repeatedly in the salt form by autoclaving at 121 °C, pH 7, for 30 minutes.

Sepharose High Performance ion


exchangers
Sepharose High Performance ion exchange media are based on 34 µm highly
cross-linked agarose beads. The small bead size gives the media high efficiency,
which in combination with high selectivity offers the possibility of high resolution
standard chromatography separations.

In addition, the use of identical functional groups to those used in Q and


SP Sepharose Fast Flow, Mono Q and Mono S and SOURCE Q and SOURCE S
media, at comparable substitution levels (i.e. same selectivity), simplifies scaling
up from FPLC and up to BioPilot and BioProcess scales.

43
Properties
Physical stability
The high degree of cross-linking of Sepharose High Performance renders the
media extremely stable physically. The high rigidity of the cross-linked agarose
matrix eliminates volume variations due to changes in pH or ionic strength.

Capacity
As is the case with all ion exchangers, the capacity depends upon the accessibility
of the charged groups and their number. Sepharose High Performance gels have
an exclusion limit of approximately 4 x 106 and are highly substituted with strong
ion exchange groups. Thus they remain charged and maintain consistently high
capacities for proteins over a broad working pH range (Table 7). This allows the
selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.
Titration curves for Q and SP Sepharose High Performance are similar to those
for Q and SP Sepharose Fast Flow, which are shown in Figure 26.

Capacity varies from case to case depending on protein properties and flow rate.
As an example, the dynamic capacity for human serum albumin on
Q Sepharose High Performance is approximately 70 mg per ml gel at 150 cm/h
(start buffer 20 mM Tris, pH 8.2). The dynamic capacity for ribonuclease on
SP Sepharose High Performance has been estimated to 55 mg/ml gel at 150 cm/h
(start buffer 0.1 M sodium acetate, pH 6.0). The characteristics of the media are
shown in Table 7. Characteristics specific for HiLoad, HiTrap and BioPilot
columns pre-packed with Q and SP Sepharose High Performance are shown in
Table 8.

44
Table 7. Characteristics of Q and SP Sepharose High Performance.

Product Q Sepharose SP Sepharose


High Performance High Performance

Type of gel strong anion strong cation


Total ionic capacity (µmol/ml gel) 140-200 140-200
Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)
BSA (MW 67 000) 70 N.D.
Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 55
Recommended working up to 150 up to 150
flow rate range (cm/h)
Approx. mean particle size (µm) 34 34
Particle size range (µm) 24-44 24-44
working pH range** 2-12 4-13
pH stability***
short term 1-14 3-14
long term 2-12 4-13

N.D. = Not determined


* The dynamic binding capacity was determined at a linear flow rate of 150 cm/h using a 10.0 mg/ml
solution of BSA in 20 mM Tris buffer, pH 8.2 and a 5.0 mg/ml solution of ribonuclease in 100 mM
sodium acetate, pH 6.0.
** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

Table 8. Characteristics of HiLoad, HiTrap and BioPilot columns pre-packed with Q and
SP Sepharose High Performance.

Product HiLoad HiTrap BioPilot Column


16/10 26/10 1 ml 5 ml 35/100 60/100

Column dimensions (mm) 16x100 26x100 7x25 16x25 35x100 60x100


(inner diameter x bed height)
Bed volume (ml) 20-22 53-58 1 5 100 300
Maximum flow rate* (ml/min) 5 13 4 20 25 70
Recommended working up to 5 up to 13 1 5 up to 24 (for SP) up to 70 (for SP)
flow rate range (ml/min) up to 16 (for Q) up to 47 (for Q)
Max pressure* (MPa) 0.3 0.3 0.3 0.31.1 1.1
Number of theoretical >12 000 >12 000 N.D. N.D. >10 000 >10 000
plates per meter** (N/m)

* Max. pressures and flow rates should not be used routinely.


** Determined with acetone.

45
Flow rate
The rigidity of Sepharose High Performance based ion exchangers together with
the small particle size distribution of the 34 µm beads confers excellent flow pro-
perties. Flow rates achievable with Sepharose High Performance media and pre-
packed columns are given in Table 7 and 8.

Availability
Q and SP Sepharose High Performance are available in packs of 75 ml, 1 and
5 litres.

To ensure optimal performance and reproducibility Sepharose High Performance


media are also available in pre-packed HiLoad columns with dimensions 16 and
26 mm in internal diameter and 10 cm in bed height.

Q and SP Sepharose High Performance are also available in pre-packed, ready-to-


use 1 ml and 5 ml columns, HiTrap Q and HiTrap SP respectively. They are desig-
ned for method scouting, group separations, sample clean-up or sample concen-
tration.

For pilot scale separations, Q Sepharose High Performance is available in pre-


packed BioPilot columns of 100 ml (35/100) and 300 ml (60/100).
SP Sepharose High Performance pre-packed in BioPilot columns 35/100 and
60/100 are available on request. For ordering information, please refer to
Chapter 14.

Sepharose Fast Flow ion exchangers


Sepharose Fast Flow ion exchangers are based on 90 µm agarose beads. A higher
degree of cross-linking, compared to Sepharose CL-6B based ion exchangers, is
used to give the media greatly improved physical and chemical stability. This high

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Fig. 25. Partial structure of Sepharose Fast Flow ion exchange media.

46
stability allows the gels to be used at the higher flow rates required for modern
laboratory separations as well as meeting the throughput and cleaning-in-place
requirements of process scale chromatography.

To give a complete range of ion exchange media Sepharose Fast Flow is available
with the weak exchanger groups, DEAE and CM and the strong exchanger groups
Q and SP. Figure 25 shows the partial structures of these media. Characteristics of
the different ion exchangers based on Sepharose Fast Flow is listed in Table 9.

Table 9. Characteristics of Q, SP, DEAE and CM Sepharose Fast Flow.

Product Q Sepharose SP Sepharose DEAE Sepharose CM Sepharose


Fast Flow Fast Flow Fast Flow Fast Flow

Type of gel strong anion strong cation weak anion weak cation
Total ionic capacity 180-250 180-250 110-160 90-130
(µmol/ml gel)
Recommended 100-300 100-300 100-300 100-300
working flow rate
range (cm/h)
Approx. mean
particle size (µm) 90 90 90 90
Particle size range (µm) 45-165 45-165 45-165 45-165
working pH range* 2-12 4-13 2-9 6-10

pH stability**
short term 1-14 3-14 1-14 2-14
long term 2-12 4-13 2-13 4-13

* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

Properties
Physical stability
Sepharose Fast Flow ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for pack-
ing or in pre-packed columns. The highly cross-linked nature of the matrix means
that the bead size and bed volumes do not change with changes in ionic strength
or pH.

Capacity
As is the case with all ion exchangers the capacity is dependent upon the accessibi-
lity of the charged groups and their number. Sepharose Fast Flow ion exchangers
are highly substituted and have an exclusion limit of approximately 4 x 106 giving

47
high capacity for proteins. Capacity data for Fast Flow ion exchange media are
given in Table 10. Characteristics specific for pre-packed columns with Q and SP
Sepharose Fast Flow, HiLoad columns, are shown in Table 11.

Table 10. Capacity data for Sepharose Fast Flow ion exchangers.

Ion Exchanger Q Sepharose SP Sepharose DEAE Sepharose CM Sepharose


Fast Flow Fast Flow Fast Flow Fast Flow

Total ionic capacity


(µmol/ml gel) 180-250 180-250 110-160 90-130

Dynamic binding capacity*


(mg/ml gel)
Thyroglobulin (MW 669 000) 3 N.D. 3.1 N.D.
HSA (MW 68 000) 120 N.D. 110 N.D.
a-lactalbumin (MW 14 300) 110 N.D. 100 N.D.
IgG (MW 160 000) N.D. 50 N.D. 15
Bovine COHb (MW 69 000) N.D. 50 N.D. 30
Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 70 N.D. 50

N.D. = Not determined


*Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of
75 cm/h. For anion exchangers (DEAE and Q) the starting buffer was 0.05 M Tris, pH 8.3
and for cation exchangers (CM and S) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the
respective start buffers containing 2.0 M NaCl.

Table 11. Characteristics of HiLoad columns pre-packed with Q and


SP Sepharose Fast Flow.

Product HiLoad 16/10 HiLoad 26/10

Bed volume (ml) 20-22 53-58


Maximum flow rate* (ml/min) 10 26
Recommended working up to 7 up to 18
flow rate range (ml/min)
Max pressure* (MPa) 0.3 0.3
Number of theoretical
plates per meter** (N/m) >3000 >3000

* Max. pressures and flow rates should not be used routinely.


** Determined with acetone.

Q Sepharose Fast Flow and SP Sepharose Fast Flow are highly substituted with
strong ion exchange groups. These groups remain charged and maintain consi-
stently high capacities over broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respective-
ly. This allows the selection of a pH value and buffer that best suit the properties
of the sample. Titration curves for both gels are shown in Figure 26. The working
pH ranges for DEAE Sepharose Fast Flow and CM Sepharose Fast Flow are 2-9
and 6-10 respectively.

48
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Fig. 26. Titration curves; approximately 5 ml Q and SP Sepharose Fast Flow in


50 ml 1 M KCl. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Flow rate
The optimal cross-linking of Sepharose Fast Flow confers excellent flow properti-
es on the matrix. This is illustrated in Figure 27 which shows the relationship bet-
ween flow rate and operating pressure for DEAE Sepharose Fast Flow.
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Fig. 27. Flow rate as a function of pressure drop of DEAE Sepharose Fast Flow.
Column: Amersham Biosciences XK 50/30 fitted with 1/4 inch tubing. Gel bed height 15 cm.
Gel volume 294 ml. Eluent 0.1 M NaCl. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

49
Flow rates achievable with Fast Flow media are above 300 cm/h at 0.1 MPa
(1 bar) in an XK 50/30 column packed with a 15 cm high bed of gel. In laboratory
separations where the best possible separation is frequently a major consideration
this flow rate is frequently traded off against improved resolution. In industrial
processing, the high throughput properties of Sepharose Fast Flow ion exchangers
give significantly reduced cycle times and improved productivity.

Availability
DEAE and CM Sepharose Fast Flow are available in packs of 500 ml, 10 and 60
litres. Q and SP Sepharose Fast Flow are available in packs of 25 ml, 300 ml, 5
and 60 litres and are also available pre-packed in HiLoad 16/10 and 26/10
columns. Q, DEAE and CM Sepharose Fast Flow are supplied in 20% ethanol and
SP Sepharose Fast Flow in 20% ethanol with 0.2 M sodium acetate. For ordering
information, please refer to Chapter 14.

Sepharose Big Beads ion exchangers


Sepharose Big Beads ion exchangers are based on 100-300 µm agarose beads. A
higher degree of cross-linking, compared to Sepharose CL-6B based ion exchang-
ers, is used to give the media greatly improved physical and chemical stability.
Due to its excellent physical stability and large bead size, Sepharose Big Beads can
be run at high flow rates even with viscous samples. Table 12, gives the characte-
ristics of Q and SP Sepharose Big Beads.

Table 12. Characteristics of Q and SP Sepharose Big Beads.

Product Q Sepharose Big Beads SP Sepharose Big Beads

Type of gel strong anion strong cation


Total ionic capacity (µmol/ml gel) 180-250 180-250
Recommended working
flow rate range (cm/h) 1200-1800 1200-1800
Approx. mean particle size (µm) 200 200
Particle size range (µm) 100-300 100-300
working pH range* 2-12 4-13
pH stability**
short term 2-14 3-14
long term 2-12 4-13

* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

50
Properties
Physical stability
Sepharose Big Beads ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for pack-
ing. The average bead diameter is 200 µm with a bead size distribution of 100-
300 µm. The highly cross-linked nature of the matrix means that the bead size and
bed volumes do not change with changes in ionic strength or pH.

Capacity
Q and SP Sepharose Big Beads are highly substituted with strong ion exchange
groups. These groups remain charged and maintain consistently high capacities
over broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respectively. This allows the
selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.
Figure 28 shows typical binding capacities of SP Sepharose Big Beads.

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Fig. 28. Typical binding capacities
of SP Sepharose Big Beads media.
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and format pH 4.1 for b-lactoglo-


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and 300 cm/h. (Work by amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Flow rate
Because of its flow characteristics, Q and SP Sepharose Big Beads is the choice for
initial purification when high viscosity precludes the use of ion exchangers with
smaller bead size, e.g. Sepharose Fast Flow ion exchangers. Even with viscosities
as high as 2.5 times water a high flow rate (500 cm/h) is maintained in industrial
column operation.

Availability
Q and SP Sepharose Big Beads are available in packs of 1 and 10 litres. For
ordering information, please refer to Chapter 14.

51
STREAMLINE SP and
STREAMLINE DEAE
STREAMLINE adsorbents are specifically developed for expanded bed adsorp-
tion, see page 98 for details, and are based on a modified Sepharose matrix, cross-
linked 6% agarose.

STREAMLINE adsorbents have been designed with a well-defined density distri-


bution, which is required in expanded bed adsorption. This is achieved through
inclusion of inert crystalline quartz material in the base matrix. Mean particle
density is approximately 1.2 g/ml drained gel. The porosity is comparable to
Sepharose Fast Flow ion exchangers, with an exclusion limit of 4 x 106 for
globular proteins.

Table 13. Characteristics of STREAMLINE ion exchange adsorbents.

Product STREAMLINE SP STREAMLINE DEAE

Type of gel strong cation weak anion


Total ionic capacity (µmol/ml gel) 170-240 130-210
Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)
Lysozyme (MW 14 500) 70 N.D.
BSA (MW 67 000) N.D. 55
Recommended working flow rate range (cm/h)
- sample application 200-400 200-400
- elution 50-150 50-150
Approx. mean particle size (µm) 200 200
Particle size range (µm) 100-300 100-300
working pH range** 4-13 2-9
pH stability***
short term 3-14 1-14
long term 4-13 2-13

N.D. = Not determined


*The binding capacity was determined in STREAMLINE 50 column at a linear flow rate of 300 cm/h
using a 2.0 mg/ml solution of protein in phosphate buffer, pH 7.5 (lysozyme) and 50 mM Tris-HCl
buffer, pH 7.5 (BSA).
** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

52
Properties
Physical stability
STREAMLINE adsorbents are supplied pre-swollen and ready for use. The avera-
ge bead diameter is 200 µm with a bead size distribution of 100-300 µm. The
highly cross-linked nature of the matrix means that the bead size and bed volumes
do not change with changes in ionic strength or pH.

Capacity
As is the case with all ion exchangers the binding capacity of STREAMLINE
adsorbents are dependent on each different molecule’s size and pI, the flow rate
etc. In general, the adsorption characteristics of STREAMLINE adsorbents are
similar to those of a packed bed in chromatography, a direct result of the stability
of the expanded bed during feed application. This is illustrated in Figure 29 which
compares the breakthrough curves for a model protein with STREAMLINE
DEAE in packed mode and expanded mode at two scales of operation.

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Fig. 29. Breakthrough capacity curve comparisons. Running conditions: BSA in 50 mM


Tris-HCl, pH 7.5, linear flow rate 300 cm/h. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden.)

STREAMLINE SP and STREAMLINE DEAE are highly substituted with ion


exchange groups. These groups remain charged and maintain consistently high
capacities over the working pH ranges of 4-13 and 2-9 respectively. This allows
the selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.

53
Availability
STREAMLINE SP and DEAE are available in packs of 300 ml and 7.7 litres.
For ordering information, please refer to Chapter 14.

DEAE Sepharose CL-6B


and CM Sepharose CL-6B
DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B are macroporous bead-formed
(mean particle size of 90 µm diameter) ion exchangers derived from the cross-
linked agarose gel Sepharose CL-6B. DEAE or CM groups are then attached to the
gel by ether linkages to the monosaccharide units to give the final ion exchange gel
(Fig. 30).

DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B have good chemical and physi-
cal stability and can be used to advantage in the ion exchange chromatography of
proteins, polysaccharides, nucleic acids, membrane components and other high
molecular weight substances.

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Fig. 30. Partial structure of Sepharose CL-6B ion exchangers.

Properties
Physical stability
DEAE and CM Sepharose CL-6B are supplied pre-swollen and ready for packing.
As stated earlier, the cross-linked nature of the matrix means that the bed volume
changes very little with changes in ionic strength or pH (approximately 2% chan-
ge when the pH is reduced from 10 to 4).

54
Capacity
Since DEAE and CM Sepharose CL-6B are weak ion exchangers, the number of
ligand groups which are charged and hence the capacity for macromolecules is
dependent upon pH. This dependency is illustrated by the titration curves for
DEAE and CM Sepharose CL-6B (Fig. 31).

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Fig. 31. Titration curves; Approximately 5 ml DEAE and CM Sepharose CL-6B both in
50 ml 1 M KCl. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

The working pH ranges for the media are 2-9 for DEAE Sepharose CL-6B and
6-10 for CM Sepharose CL-6B.

DEAE and CM Sepharose CL-6B have exclusion limits of approximately


4 x 106. Capacity data for Sepharose CL-6B ion exchangers are summarized in
Table 14.

55
Table 14. Characteristics of Sepharose CL-6B ion exchangers.

DEAE Sepharose CL-6B CM Sepharose CL-6B

Total ionic capacity (µmol/ml gel) 130-170 100-140


Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)
Thyroglobulin (MW 669 000) 2.0 N.D.
IgG (160 000) N.D. 9.5
Bovine COHb (MW 69 000) N.D. 75
HSA (MW 68 000) 170 N.D.
a-lactalbumin (MW 14 300) 150 N.D.
Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 120
Recommended working flow rate range (cm/h) up to 60 up to 60
Approx. mean particle size (µm) 90 90
Particle size range (µm) 45-165 45-165
working pH range** 2-9 6-10
pH stability***
short term 2-14 2-14
long term 3-12 4-13

N.D. = Not determined


*Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. For
the anion exchanger (DEAE) the starting buffer was 0.05M Tris, pH 8.3 and for the cation exchangers
(CM) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the respective start buffers containing 2.0 M
NaCl.
** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged and
maintain consistently high capacity.
*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of time
without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

Flow rate
The cross-linked structure of Sepharose CL-6B ion exchangers allows flow rates of
up to 100 cm/h to be used. Figure 32 illustrates the variation of flow rate with
pressure drop for DEAE and CM Sepharose CL-6B.

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Fig. 32. Flow rate as a function of pressure drop in columns (5x10 cm bed volume) of
DEAE and CM Sepharose CL-6B. pH 7.0; Ionic strength 0.02. (Work by Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)

As in all types of chromatography, resolution is dependent on flow rate (5). There-


fore in applications where resolution is critically important high flow rates should
be avoided or an exchanger based on Sepharose High Performance used.

For applications where high flow rates and large throughput of material are requi-
red, ion exchangers based on Sepharose Fast Flow or Sepharose Big Beads should
be used since these forms have been specially developed with these criteria in
mind.

Availability
DEAE and CM-Sepharose CL-6B are available in packs of 500 ml and 10 litres.
The gels are supplied in 20% ethanol. For ordering information, please refer to
Chapter 14.

57
7. DEAE Sephacel
DEAE Sephacel is a bead-formed cellulose ion exchanger produced from high
purity microcrystalline cellulose. Cellulose is a naturally occurring polymer consis-
ting of b(1-4) linked glucose units. In the native state, adjacent polysaccharide
chains are extensively hydrogen bonded, forming microcrystalline regions. These
regions are interspersed with amorphous regions with less hydrogen bonding.
Limited acid hydrolysis results in preferential loss of the amorphous regions and
gives so-called microcrystalline cellulose.

During the production of DEAE Sephacel the microcrystalline structure is broken


down and the cellulose is regenerated to give a bead-formed (40-160 µm) gel. The
gel is strengthened by cross-linking with epichlorohydrin, although the main struc-
ture-forming bonds are still hydrogen bonds. Functional groups are attached
during the synthesis by ether linkages to glucose units of the polysaccharide chains
to give the structure shown in Figure 33.

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Fig. 33. Partial structure of DEAE Sephacel.

Properties
Chemical stability
DEAE Sephacel is stable in aqueous suspension within the range pH 2-12. Hydro-
lysis may occur in strongly acidic solutions and the macromolecular structure is
broken down in strongly alkaline solutions. The free base form of the DEAE
group is inherently unstable at high pH values. Strong oxidizing agents should be
avoided.

DEAE Sephacel is susceptible to microbial attack, especially in the presence of


phosphates, and should therefore be stored in the presence of antimicrobial agents
when not in use (see page 103). Samples containing enzymes capable of hydro-
lysing b-glucosidic linkages should be purified on MonoBeads, MiniBeads,
SOURCE, Sepharose or Sephadex based ion exchangers.

58
Physical stability
The cross-linked bead form of DEAE Sephacel gives it increased physical stability
compared to ordinary microgranular celluloses. It has a stable bed volume over a
wide range of ionic strengths (approx. 5% change between I = 0.05 and I = 0.5)
and pH values and can therefore be re-equilibrated in the column.

DEAE Sephacel can be sterilized by autoclaving at pH 7 for 30 minutes at 121 °C.


During autoclaving, minute quantities of carbohydrate are released; these can be
washed away with sterile buffer solution.

Capacity
DEAE Sephacel is macroporous and has an exclusion limit for proteins with mole-
cular weights of approximately 1 x 106. The binding of substances with molecular
weights substantially greater than 1 x 106 will be restricted to charged groups on
the surface of the beads. Capacity data for DEAE Sephacel is summarized in
Table 15.

Table 15. Capacity data for DEAE Sephacel.

Total ionic capacity Dynamic binding capacity*


(mg/ml gel)
(µmol/mg gel) (µmol/ml gel) albumin thyroglobulin

DEAE Sephacel 130-150 100-140 160 10

*Capacity was determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. The
starting buffer was 0.05 M Tris, pH 8.3 Limit buffer was start buffer containing 2.0 M NaCl.

The adsorption kinetics for bead-formed cellulose ion exchangers are substantially
the same as for conventional cellulose ion exchangers (11). As with other weak ion
exchangers the capacity varies with pH. The titration curve for DEAE Sephacel is
shown in Figure 34.
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Fig. 34. Titration of 1 g DEAE Sephacel


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59
Flow rate
As with other ion exchangers, resolution decreases with increasing flow rate. Flow
rates of 10 cm/h are usually suitable for the resolution of protein mixtures on
DEAE Sephacel. Figure 35 illustrates the variation of flow rate as a function of
pressure drop for DEAE Sephacel. For applications requiring higher flow rates
SOURCE or Sepharose based ion exchangers should be used.

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Fig. 35. Flow rate as a function of the pressure drop across beds of DEAE Sephacel.
0.1 M Tris-HCl buffer solution pH 7.6. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Availability
DEAE Sephacel is supplied in packs of 500 ml as a suspension in 20% ethanol.
For ordering information, please refer to Chapter 14.

60
8. Sephadex ion exchangers
Sephadex ion exchangers are produced by introducing functional groups onto
Sephadex, a cross-linked dextran matrix. These groups are attached to glucose
units in the matrix by stable ether linkages.

Sephadex is suitable as a base for an ion exchanger matrix since it is hydrophilic


and shows very low non-specific adsorption.

Sephadex ion exchangers are derived from either Sephadex G-25 or


Sephadex G-50 and swell readily in aqueous solutions. Ion exchangers based on
Sephadex G-25 are more tightly cross-linked than those based on Sephadex G-50
and therefore swell less and have greater rigidity. Ion exchangers based on
Sephadex G-50 are more porous than those based on Sephadex G-25 and therefo-
re have a better capacity for molecules with molecular weights larger than 30 000.

The full range of Sephadex ion exchangers is shown in Table 16. Anion and cation
exchangers are designated as A-25 or A-50 and C-25 or C-50, respectively, depen-
ding on the matrix porosity.

Table 16. Sephadex ion exchangers.

Types Description Functional groups Counter ion

DEAE A-25 Weakly basic Diethylaminoethyl Chloride


Sephadex A-50 anion exchanger
QAE A-25 Strongly basic Diethyl-(2-hydroxy- Chloride
Sephadex A-50 anion exchanger propyl)aminoethyl
CM C-25 Weakly acidic Carboxymethyl Sodium
Sephadex C-50 cation exchanger
SP C-25 Strongly acidic Sulphopropyl Sodium
Sephadex C-50 cation exchanger

Properties
Chemical stability
Sephadex ion exchangers are insoluble in all solvents. They are stable in water, salt
solutions, organic solvents, alkaline and weakly acidic solutions. In strongly acidic
solutions, hydrolysis of the glycosidic linkages may occur and thus pH values
below 2 should be avoided, particularly at elevated temperatures. Sephadex ion
exchangers can also be used in the presence of denaturing solvents which can be
important when substances are to be separated on the basis of their electrostatic
properties alone (12, 13, 14).

Exposure to strong oxidizing agents or dextranases should be avoided. During


regeneration, the ion exchanger can be exposed to 0.2 M NaOH for a short time

61
without appreciable hydrolysis. Sephadex ion exchangers are susceptible to attack
by dextranases and should be stored in the presence of an antimicrobial agent (see
page 103).

Physical stability
Swollen Sephadex ion exchangers can be sterilized by autoclaving for up to 30 min
at 121 °C, at neutral pH in the salt form. During autoclaving, minute quantities of
carbohydrate are released; these can be washed away with sterile buffer.

Swelling
The swelling properties of Sephadex ion exchangers are related to those of the
parent Sephadex G-types, those based on 50-types swelling more than those based
on 25-types. Due to the presence of charged groups in the matrix, the swelling
varies with ionic strength and pH.

Ionic strength dependence


At low ionic strengths, repulsion between groups carrying the same charge on the
matrix is maximal, and swelling of the gel is at its greatest. The degree of swelling
decreases with increasing ionic strength.

Note: Sephadex ion exchangers should not be swollen in distilled water since the
bead structure may be broken down due to strong ionic interactions.

pH dependence
The degree of dissociation and hence the extent to which an ion exchanger is char-
ged is dependent on pH. Repulsion between charged groups is greatest at pH valu-
es where the ion exchanger is fully dissociated, and decreases at pH values close to
the pK of the charged groups.

Note: QAE Sephadex and SP Sephadex have swelling properties quite independent
of pH since they are charged over a very wide pH range.

Capacity
Due to differences in swelling characteristics, ion exchangers based on Sephadex
G-25 have a much higher ionic capacity per ml gel than those based on Sephadex
G-50. (Table 17).

62
Table 17. Total ionic capacity data for Sephadex based ion exchangers.

Ion exchanger Total ionic capacity


(µmol/mg dry gel) (µmol/ml wet gel)

DEAE A-25 3.5 ±0.5 500


Sephadex A-50 175

QAE A-25 3.0 ±0.4 500


Sephadex A-50 100

CM C-25 4.5 ±0.5 550


Sephadex C-50 170

SP C-25 2.3 ±0.3 300


Sephadex C-50 90

Thus for smaller biomolecules (MW < 30 000) the A-25 and C-25 types have a
higher available capacity. In the molecular weight range 30 000 to 100 000 howe-
ver, the A-50 and C-50 exchangers have higher available capacities due to their
larger pore size.

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Fig. 36. Titration of 0.1 gram of Sephadex ion exchangers in 50 ml 1 M KCl. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

63
If working with larger molecules (MW > 100 000), a higher available capacity is
frequently observed with the A-25 and C-25 types since at these molecular weights
binding is only occurring on the bead surface and the higher ionic capacity can be
used to advantage.

As capacity also depends upon the number of substituent groups which are char-
ged under given buffer conditions, it will also vary with pH. The variation of the
charge on Sephadex ion exchangers with pH is illustrated by their titration curves
(Fig. 36).

Dynamic capacity data for Sephadex ion exchangers are given in Table 18.

Table 18. Dynamic capacity (mg/ml wet gel) data for Sephadex ion exchangers

Protein Thyroglobulin HSA a-lactalbumin IgG Bovine COHb


(MW) (669 000) (68 000) (14 300) (160 000) (69 000)

Ion exchanger
DEAE A-25 1.0 30.0 140.0 N.D. N.D.
Sephadex A-50 2.0 110.0 50.0 N.D. N.D.

QAE A-25 1.5 10.0 110.0 N.D. N.D.


Sephadex A-50 1.2 80.0 30.0 N.D. N.D.

CM C-25 N.D. N.D. N.D. 1.6 70.0


Sephadex C-50 N.D. N.D. N.D. 7.0 140.0

SP C-25 N.D. N.D. N.D. 1.1 70.


Sephadex C-50 N.D. N.D. N.D. 8.0 110.0

N.D. = Not determined


Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. For
anion exchangers (DEAE and QAE) the starting buffer was 0.05M Tris, pH 8.3 and for cation
exchangers (CM and SP) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the respective start buffers
containing 2.0 M NaCl.

Availability
Sephadex ion exchangers are supplied as dry powders in packs of 100 g and 500 g.
Bulk quantities of 5 kg or more are available on request. For ordering infor-
mation, please refer to Chapter 14.

64
9. Experimental design
Choice of ion exchanger
No single ion exchanger is best for every separation. The choice of matrix and
ionic substituent depends on:

1. The specific requirements of the application


2. The molecular size of the sample components
3. The isoelectric points of the sample components

Specific requirements of the application


Column separation, batch separation or expanded bed adsorption
If the separation is to be carried out using a batch separation technique rather
than column chromatography, the flow and packing characteristics of the matrix
are of minor importance. The economy and high capacity of Sephadex based ion
exchangers make them a natural choice.

In large scale applications, capturing proteins from crude samples containing par-
ticulate matter, expanded bed adsorption using STREAMLINE has proven to be
effective and cost efficient.

The scale of the separation


The amount of sample to be processed is an important parameter when choosing
an ion exchange medium. For laboratory scale separations, any of the Amersham
Biosciences range of ion exchangers can be used. However for large scale separations,
which must satisfy the throughput and cleaning-in-place (CIP) requirements of
industry, the choice of a BioProcess Media such as SOURCE, Sepharose High Per-
formance, Sepharose Fast Flow, Sepharose Big Beads or STREAMLINE adsorbent
is indicated.

The same reasoning applies to experiments designed as method scouting for even-
tual scale-up since such procedures should be developed using the gel which will
eventually be used at the larger scale. SOURCE media and Sepharose Fast Flow
based exchangers are extremely well suited to this type of method optimization as
well as routine laboratory separations.

The required resolution


When choosing an ion exchanger it is important to decide the degree of resolution
required from the separation. Normally analytical or semi-analytical separations

65
place high demands on resolution. In contrast, resolution is frequently traded off
against capacity and speed in the case of preparative work.

Resolution in ion exchange chromatography depends upon the selectivity and effi-
ciency of the media. Maximum selectivity is often obtained by choosing one of the
gels carrying the strong exchanger groups Q or S/SP, since strong ion exchangers
can be used at any pH tolerated by the sample molecules.

Maximum efficiency is obtained by choosing a gel based on a small particle size


matrix. The media in order of their particle sizes and potential efficiencies are
MiniBeads (3 µm) > MonoBeads (10 µm) > SOURCE 15 (15 µm) > SOURCE 30
(30 µm)> Sepharose High Performance (34 µm) > Sepharose Fast Flow/ Sepharose
CL-6B/ Sephacel (90 µm) > Sephadex (40-125 µm in dry form) > STREAMLINE
adsorbents/Sepharose Big Beads (200 µm).

The media thus offering the highest degree of resolution are MiniBeads,
MonoBeads and SOURCE 15 exchangers for high resolution in SMART, FPLC
and HPLC systems and SOURCE 30 and Sepharose High Performance exchangers
for high resolution standard chromatography.

The required throughput


How much material which can be processed in a defined time is determined
amongst other things by the capacity, the flow characteristics of the media and the
size of the column. All of the ion exchangers available from Amersham Biosciences
have high capacities for macromolecules but differ considerably in their flow pro-
perties. The media which have optimal flow characteristics are MiniBeads for
micropreparative chromotography in SMART System, MonoBeads and SOURCE
15 for high performance, FPLC separations, and SOURCE 30, Sepharose High
Performance, Sepharose Fast Flow and Sepharose Big Beads media for laboratory
and process scale preparative separations.

The uniform size distribution of beads in SOURCE media provides comparatively


low pressure drops over packed beds and thus makes SOURCE ion exchangers
also ideal for scaling up in industrial applications such as the separation of closely
related product variants.

Scaleability
Frequently ion exchange separations are carried out initially on a small scale to
optimize conditions before committing the sample to full scale separations. It is
thus important to choose an ion exchanger which will allow simple and conveni-
ent scale up so that methods established on a small column can be applied more or
less directly to the larger column. Detailed information on scaling up ion exchange
separations is given in Chapter 11.

66
Reproducibility
Reproducibility is obtained when the characteristics of the chromatography bed
remain unchanged during the course of the separation and during regeneration of
the column. The more rigid varieties of Amersham Biosciences ion exchangers, such as
MiniBeads, MonoBeads, SOURCE, Sepharose High Performance, Sepharose Fast
Flow and Sepharose Big Beads, show no changes in bed size with changes in pH
and ionic strength and can thus be washed and regenerated in the columns provi-
ding additional reproducibility.

The use of media which are supplied pre-packed and tested, such as MiniBeads,
MonoBeads, RESOURCE, HiTrap columns pre-packed with Sepharose High Per-
formance and HiLoad columns pre-packed with Sepharose High Performance or
Sepharose Fast Flow assures reproducibility since variability in column packing is
eliminated.

Economy
Column or batch procedures in which the ion exchanger is used once and thrown
away, as well as applications requiring large amounts of gel, may make economy a
major consideration. Sephadex A-50 and C-50 ion exchangers are the least expen-
sive in terms of bed volume, followed by Sephadex A-25 and C-25 ion exchangers.
Using expanded bed adsorption, STREAMLINE product line, reduces the number
of operations in a process by fusing the function clarification, concentration and
adsorption into one operation. It offers process developers the selectivity afforded
by chromatography, the throughput of ultra-filtration and the convenience of
small scale centrifugation.

The molecular size of the sample components


The accessibility of the sample components to the charged groups will determine
the available capacity of the ion exchanger for those particular substances. All of
the ion exchange media supplied by Amersham Biosciences, with the exception of
Sephadex based media, have exclusion limits for globular proteins in excess of
1 x 106.

Steric factors only affect the separation of charged solutes via their influence on
the available capacity for each substance. When choosing ion exchangers it is
unnecessary to consider the possibility of gel filtration effects on the sample. Sam-
ple molecules, although always larger than those of the eluent buffer, cannot
migrate ahead of the eluting buffer since they then encounter conditions which
favour their re-binding to the matrix. Only uncharged solutes will be fractionated
according to size as in gel filtration. These uncharged molecules will normally be
removed during the initial isocratic elution phase which proceeds the application
of the gradient.

67
The exclusion limits for the different media and subsequent effects on available
capacity are given in the relevant sections covering each gel type.

When working with samples of unknown molecular weight the use of


MonoBeads, SOURCE and Sepharose based ion exchangers is recommended since
they are particularly easy to handle and have good capacities over a large molecu-
lar weight range.

Choice of exchanger group


Substances are bound to ion exchangers when they carry a net charge opposite to
that of the ion exchanger. This binding is electrostatic and reversible.

In the case of substances which carry only one type of charged group the choice of
ion exchanger is clear-cut. Substances which carry both positively and negatively
charged groups, however, are termed amphoteric and the net charge which they
carry depends on pH (Fig. 37). Consequently at a certain pH value an amphoteric
substance will have zero net charge. This value is termed the isoelectric point (pI)
and at this point substances will bind to neither anion or cation exchangers. The
pH ranges in which the protein is bound to anion or cation exchangers and an
arbitrary range of stability are shown in Figure 37.

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Fig. 37. The net charge of protein as a function of pH.

The pH of the buffer thus determines the charge on amphoteric molecules during
the experiment. In principle therefore, one could use either an anion or a cation
exchanger to bind amphoteric samples by selecting the appropriate pH. In practice
however, the choice is based on which exchanger type and pH give the best separa-
tion of the molecules of interest, within the constraints of their pH stability.

68
Methods for determining the optimum pH and corresponding ion exchanger type
are discussed later in this chapter.

Many biological macromolecules become denatured or lose activity outside a cer-


tain pH range and thus the choice of ion exchanger may be limited by the stability
of the sample. This is illustrated in Figure 37. Below its isoelectric point a protein
has a net positive charge and can therefore adsorb to cation exchangers. Above its
pI the protein has a net negative charge and can be adsorbed to anion exchangers.
However, it is only stable in the range pH 5-8 and so an anion exchanger has to be
used.

In summary:
1. If the sample components are most stable below their pI’s, a cation exchanger
should be used.
2. If they are most stable above their pI’s, an anion exchanger should be used.
3. If stability is high over a wide pH range on both sides of pI, either type of ion
exchanger can be used.

Determination of starting conditions


The isoelectric point
The starting buffer pH is chosen so that substances to be bound to the exchanger
are charged. The starting pH should be at least 1 pH unit above the isoelectric
point for anion exchangers or at least 1 pH unit below the isoelectric point for
cation exchangers to facilitate adequate binding. Substances begin to dissociate
from ion exchangers about 0.5 pH units from their isoelectric points at ionic
strength 0.1 M (15).

There are comprehensive lists of isoelectric points determined for proteins (16, 17)
which can be useful in the design of ion exchange experiments.

If the isoelectric point of the sample is unknown, a simple test can be performed to
determine which starting pH can be used.

Test-tube method for selecting starting pH


1. Set up a series of 10 test-tubes (15 ml).
2. Add 0.1 g Sephadex ion exchanger or 1.5 ml Sepharose or Sephacel ion
exchanger to each tube.
3. Equilibrate the gel in each tube to a different pH by washing 10 times with
10 ml of 0.5 M buffer (see page 78 for choice of buffers for ion exchange). Use a
range of pH 5-9 for anion and pH 4-8 for cation exchangers, with 0.5 pH unit
intervals between tubes.

69
4. Equilibrate the gel in each tube at a lower ionic strength (0.05 M for Sephadex
or 0.01 M for Sepharose and Sephacel ion exchangers) by washing 5 times with
10 ml of buffer of the same pH but lower ionic strength.
5. Add a known constant amount of sample to each tube.
6. Mix the contents of the tubes for 5-10 minutes.
7. Allow the gel to settle.
8. Assay the supernatant for the substance of interest. The results may appear as
shown in Figure 38 (a).

The pH to be used in the experiment should allow the substance to be bound, but
should be as close to the point of release as possible. If too low (or high) a pH is
chosen, elution may become more difficult and high salt concentrations may have
to be used. In Figure 38 the buffer chosen should be pH 7.0.
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Fig. 38. Test-tube methods for selecting ion exchange conditions.

Electrophoretic titration curves (ETC)


While information on the pI of the sample components gives valuable indications
concerning the choice of starting conditions, it does not give a picture of how the
charge on the molecules varies with pH (Fig. 37), nor indicate at what pH or on
which exchanger type maximum resolution could be expected.

Electrophoretic titration curves (Fig. 39) enable the determination of the charge
pH relationship for the molecules present across a continuum of pH and are a par-
ticularly useful way of predicting suitable conditions for an ion exchange separa-
tion (18).

An electrophoretic titration curve is obtained by electrophoresis of the sample at


right angles to a pH gradient in a horizontal slab gel of agarose or polyacrylamide
(19, 20). The pH gradient is established in the gel by isoelectric focusing prior to

70
sample application. A schematic
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description of the various steps is


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Prefocused ampholytes Electrophoresis is performed Electrophoretic mobility


in a gel provides a stable perpendicular to the pH gradi- of component B at pH
pH gradient for electro- ent. Positively charged mole- values 5 and 9 correlates
phoresis cules migrate to the cathode with its net charge
and negatively charged to the
anode.

Fig. 40. The major steps in making electrophoretic titration curves.

Electrophoresis of the sample perpendicular to the pH gradient produces a series


of curves, unique for each component, since the relative electrophoretic mobility
of each component will be different depending on its net charge at given pH valu-
es. The pH value where each curve intersects the line of sample application repre-
sents the pH at which that particular component has a zero net charge, the pI for
that component.

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Fig. 41. Column selection
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based on electrophoretic
titration curve analysis.

Maximum resolution can be expected at a pH where there is maximum separation


between the titration curves for individual solutes, using the ion exchanger type
indicated by the charge of the molecules at that particular pH. At this pH the diffe-
rence in electrophoretic mobilities and hence net charges between the species is
greatest. This principle is illustrated in Figure 41. The protein’s stability at the indi-
cated pH must be taken into consideration before applying these conditions to the
separation.

72
If maximum separation is observed at a pH where the sample molecules are positi-
vely charged, i.e. below their isoelectric points, maximum resolution will be obtai-
ned using a cation exchanger such as Mono S, SOURCE S or SP Sepharose Fast
Flow.

If the largest difference in electrophoretic mobility is found at a pH where the


components of interest are negatively charged, i.e. above their isoelectric points,
an anion exchanger such as Mono Q, SOURCE Q or Q Sepharose Fast Flow
should be chosen.

If maximum separation of the curves occurs at the position of sample application


i.e. at the isoelectric points of the molecules, then maximum resolution may be
achieved using the technique of chromatofocusing. Further information on techni-
ques and media for chromatofocusing is available on request.

Measurement of pH can be done using a surface electrode or by running pI cali-


bration proteins as a narrow band at the top or bottom of the slab gel during the
first dimension electrophoresis as the pH gradient is established in the gel. This
section of the gel is removed and stained before the sample is applied for the
second dimension electrophoresis and then afterwards replaced to estimate pH
values.

Staining the titration curve with a general protein stain such as Coomassie Blue
does not give any information about the charge/pH relationship for specific pro-
teins unless they can be clearly identified by their isoelectric points. To gain positi-
ve identification it is necessary to use a specific detection technique such as zymo-
graphic analysis or immunofixation as illustrated in Figure 42.

In addition to information regarding


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Fig. 42. The electrophoretic titration


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(19)

73
Since the lines on the ETC reflect the degree of charge of the components at diffe-
rent pH’s, the curves may be used to predict the order in which the components
will be eluted from the column. The molecular species with the lowest electropho-
retic mobility at a certain pH has logically the lowest charge at that particular pH
and should be the first substance eluted from the column in the gradient. Similarly
the species showing highest electrophoretic mobility will be the most strongly
retained on a column of opposite charge and should be eluted last. The order in
which solutes are eluted cannot be predicted with 100% certainty from the titra-
tion curve since electrophoretic mobility depends on the total net charge on a
molecule and ion exchange chromatography depends on the net charge on the
solutes surface.

Chromatographic titration curves (retention maps)


For those ion exchanger types which allow rapid separations, optimal starting pH
and choice of anion or cation exchanger can be determined using chromatographic
titration curves (18).

In a specified salt gradient, the retention of particular molecular species is depen-


dent upon the molecules net charge and charge density. These in turn depend upon
the pH of the eluent. The chromatographic titration curve is based on this rela-
tionship between retention and buffer pH.

The methodology is extremely simple. The sample is analysed in a series of rapid


separations, carried out on a cation exchanger (Mono S) or an anion exchanger
(Mono Q), using the same salt gradient but over a range of pH’s.

A plot is then made, for each separated peak, of elution salt concentration, elution
time or elution volume against pH. This will produce a series of curves as illustra-
ted in Fig. 43.

An analysis of this composite plot for the point of maximum separation will indi-
cate at what pH and on which type of exchanger maximum resolution between
any two or more components can be expected.

The conditions used (column type, buffers, pH, etc.) during the rapid runs for the
generation of the chromatographic titration curves can be directly applied when
developing the final optimized procedure.

74
A 280nm a) A 280nm b) A280nm f)
Mono S Mono S Mono Q
pH 3.0 pH 5.0 B pH 11.0
C
B
B
A
A
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Elution ionic
strength

Data from seven chromatograms plotted as chromatographic


titration curves - A, B, C.

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Mono Q
f

Fig. 43. Chromatographic titration curves.

75
Choice between strong and weak ion exchangers
Having selected a suitable starting pH to use on a cation or anion exchanger, it is
necessary to choose between a strong and weak ion exchange group. In those cases
where maximum resolution occurs at an extreme of pH and the molecules of inter-
est are stable at that pH, the choice is clearly to use a strong exchanger. The majo-
rity of proteins however, have isoelectric points which lie within the range 5.5 to
7.5 and can thus be separated on both strong and weak ion exchangers. Some
advantages in using a strong ion exchanger are discussed in Chapter 2.

Choice of buffer
As with the choice of ion exchanger, there are a number of variables which have to
be considered. These include:
1. The choice of buffer pH and ionic strength.
2. The choice of buffering substance.
3. The price of the buffer if it is to be used in production process.

Choice of buffer pH and ionic strength


The choice of buffer pH has been discussed in the previous section. It should be
pointed out, however, that in many applications the optimum separation may be
achieved by choosing conditions so that major and troublesome contaminants are
bound to the exchanger while the substance of interest is eluted during the wash
phase (21). This procedure is sometimes referred to as “starting state elution”.

Note: Concentration of sample does not occur with starting state elution.

The highest ionic strength which permits binding of the selected substances and
the lowest ionic strength that causes their elution should normally be used as the
starting and final ionic strengths in subsequent column experiments (i.e. the star-
ting and limiting buffers for gradient elution). A third and higher ionic strength
buffer is frequently employed as a wash step before column regeneration and
re-use.

The required concentration of the start buffer will vary depending on the nature of
the buffering substance. A list of some suitable buffers and suggested start concen-
trations is shown in Table 19. In the majority of cases a starting ionic strength of at
least 10 mM is required to ensure adequate buffering capacity.

Salts also play a role in stabilizing protein structures in solution and so it is impor-
tant that the ionic strength should not be so low that protein denaturation or pre-
cipitation occurs. A major advantage of using Amersham Biosciences ion exchangers is
that they have excellent capacities and so the initial ionic strength of the buffer can
be quite high without significantly affecting capacity for sample.

76
In the case of pre-packed ion exchangers and columns which can be run conveni-
ently quickly, trial experiments using salt gradients will allow the determination of
an optimal starting ionic strength.

In the case of Sephadex based exchangers for batch applications or where column
running times are prohibitively long, a simple test-tube technique is recommended
as a test for a suitable ionic strength.

Choice of buffer substance


If the buffering ions carry a charge opposite to that of the functional groups of the
ion exchanger they will take part in the ion exchange process and cause local dis-
turbances in pH. It is preferable, therefore, to use buffering ions with the same
charge sign as the substituent groups on the ion exchanger. There are of course
exceptions to this rule as illustrated by the frequency with which phosphate buf-
fers are cited in the literature in connection with anion exchangers. In those
instances when a buffering ion which interacts with the ionic groups on the matrix
is used, extra care must be taken to ensure that the system has come to equilibrium
before application of sample.

In cases where substances purified by ion exchange chromatography have to be


freeze dried it is advantageous to use volatile buffer systems. Examples of such sys-
tems are shown in Table 20.

77
Table 19. Buffer tables.

Buffer substances for cation exchange chromatography


pKa pH Substance Conc. dpKa/ Counter-ion Comments
(25°C) interval (mM)dT (°C)

2.00 1.5-2.5 Maleic acid 20 Na+ Dicarboxylic acid


2.88 2.38-3.38 Malonic acid 20 Na+/Li+ Dicarboxylic acid
3.13 2.63-3.63 Citric acid 20 -0.0024 Na+ Dicarboxylic acid
3.81 3.6-4.3 Lactic acid 50 Na+
*3.75 3.8-4.3 Formic acid 50 +0.0002 Na+/Li+
*4.21 4.3-4.8 Butanedioic acid 50 -0.0018 Na+
*4.76 4.8-5.2 Acetic acid 50 +0.0002 Na+/Li+
*5.68 5.0-6.0 Malonic acid 50 Na+/Li+ Dicarboxylic acid
*7.20 6.7-7.6 Phosphate 50 -0.0028 Na+ Often needs
purification
before use
*7.55 7.6-8.2 HEPES 50 -0.0140 Na+/Li+ Zwitterionic
*8.35 8.2-8.7 BICINE 50 -0.0180 Na+ Zwitterionic

Buffer substances for anion exchange chromatography


pKa pH Substance Conc. dpKa/ Counter-ion Comments
(25°C) interval (mM)dT (°C)

*4.75 4.5-5.0 N-methyl 20 -0.015 Cl-


piperazine
*5.68 5.0-6.0 Piperazine 20 -0.015 Cl-/HCOO-
*5.96 5.5-6.0 L-histidine 20 Cl-
*6.46 5.8-6.4 bis-Tris 20 -0.017 Cl-
*6.80 6.4-7.3 bis-Tris propane 20 Cl-
*7.76 7.3-7.7 Triethanolamine 20 -0.020 Cl-/
CH3COO-
*8.06 7.6-8.0 Tris 20 -0.028 Cl- Often needs
purification
before use and
*8.52 8.0-8.5 N-methyl- 50 -0.028 SO2-/Cl-/ especially
diethanolamine CH3COO- sensitive to
temperature
*8.88 8.4-8.8 Diethanolamine 20 at pH 8.4 -0.025 Cl- change.
50 at pH 8.8
*8.64 8.5-9.0 1,3-diamino- 20 -0.031 Cl-
propane
*9.50 9.0-9.5 Ethanolamine 20 -0.029 Cl-
*9.73 9.5-9.8 Piperazine 20 -0.026 Cl-
*10.47 9.8-10.3 1,3-diamino- 20 -0.026 Cl-
propane
11.12 10.6-11.6 Piperadine 20 -0.031 Cl-
12.33 11.8-12.0 Phosphate 20 -0.026 Cl-

* Recommended on the basis of experiments performed in our laboratories.

78
Table 20. Volatile buffer systems.

pH Substance Counter-ion

2.0 Formic acid H+


2.3-3.5 Pyridine/formic acid HCOO-
3.0-5.0 Trimethylamine/formic acid HCOO-
3.0-6.0 Pyridine/acetic acid CH3OO-
4.0-6.0 Trimethylamine/acetic acid CH3COO-
6.8-8.8 Trimethylamine/HCl Cl-
7.0-8.5 Ammonia/formic acid HCOO-
8.5-10.0 Ammonia/acid CH3COO-
7.0-12.0 Trimethylamine/CO2 CO - 3
7.0-12.0 Triethylamine/CO2 CO3-
7.9 Ammonium bicarbonate HCO3-
8.0-9.5 Ammonium carbonate/ammonia CO - 3
8.5-10.5 Ethanolamine/HCl Cl-
8.9 Ammonium carbonate CO3-

Test-tube method for selecting starting ionic strengths


1. Set up a series of tubes with ion exchanger as detailed on page 69.

2. Equilibrate the gel in each tube with 0.5 M buffer at the selected
starting pH (10 x 10 ml washes).

3. Equilibrate the gel in each tube to a different ionic strength, at constant


pH, using a range from 0.05 M to 0.5 M NaCl for Sephadex ion
exchangers and from 0.01 M to 0.3 M NaCl for Sephacel and
Sepharose ion exchangers. This will require 5 x 10 ml washes. Intervals
of 0.05 M NaCl are sufficient.

4. Add sample, mix and assay the supernatant to determine the maximum
ionic strength which permits binding of the substance of interest and the
minimum ionic strength required for complete desorption.

In the hypothetical example shown in Figure 38 (b) the ionic strength for sample
binding (start buffer) would be at most 0.15 M and for elution at least 0.3 M.

79
10. Experimental Technique
There are three ways of performing an ion exchange separation: by column chro-
matography, by batch methods, and by expended bed adsorption. This section will
mostly deal with column chromatography.

Column chromatography
Choice of column
Good results in column chromatography are not solely dependent on the correct
choice of gel media. The design of the column and good packing technique are also
important in realising the full separation potential of any gel. These factors are
built into the pre-packed columns supplied by Amersham Biosciences and should be
considered before packing a chromatography column in the laboratory.

Column design
The material used in the construction of the column should be chosen to prevent
destruction of labile biological substances and minimize non-specific binding to
exposed surfaces. The bed support should be designed so it is easily exchangeable
to restore column performance whenever contamination and/or blockage in the
column occurs. Bed supports made from coarse sintered glass or glass wool cannot
be recommended because they soon become clogged, are difficult to clean and
cause artifacts (22). Dead spaces must be kept to a minimum to prevent re-mixing
of separated zones.

The pressure specifications of the column have to match the back-pressure genera-
ted in the packed bed when run at optimal flow rate. This is particularly important
when using high performance media with small bead size.

Amersham Biosciences has developed a series of standard columns suitable for ion
exchange chromatography. All are easy to dismantle and reassemble to allow tho-
rough cleaning, which is a particularly important aspect when handling biological
samples.

Further information on the full range of Amersham Biosciences chromatography


columns are available upon request.

Larger chromatography columns, specially designed for pilot and process scale
chromatography are also available. Some aspects regarding process scale columns
are described in Chapter 11.

80
Column dimensions
As for most adsorptive, high selectivity techniques, ion exchange chromatography
is normally carried out in short columns. A typical ion exchange column is packed
to a bed height of 5-15 cm. Once the separation parameters have been determined,
scale-up is easily achieved by increasing the column diameter.

Quantity of ion exchanger


The amount of ion exchanger required for a given experiment depends on the
amount of sample to be chromatographed and on the available or dynamic capaci-
ty of the ion exchanger for the sample substances. For the best resolution in ion
exchange chromatography, it is not usually advisable to use more than 10-20% of
this capacity, although this value can be exceeded if resolution is adequate. The
capacity data given for each specific ion exchanger in respective product Chapter
serves as a guideline for calculating the required amount of ion exchanger needed
for a given experiment.

Preparation of the ion exchanger


Having chosen the appropriate ion exchanger and starting buffer it is essential
that the exchanger is brought to equilibrium with start buffer before sample appli-
cation. Preparation of Sephadex ion exchangers, which are supplied as powders,
differs somewhat from the other ion exchangers available from Amersham
Biosciences, which are supplied pre-swollen and/or pre-packed.

Pre-swollen ion exchangers


SOURCE, Sepharose based, and DEAE Sephacel ion exchange media are supplied
ready to use. To prepare the gel, the supernatant is decanted and replaced with
starting buffer to a ratio of approximately 75% settled gel to 25% buffer.

If large amounts of ion exchangers are to be equilibrated with a weak buffer, the
ion exchanger should first be equilibrated with a 10 times concentrated buffer
solution at the correct pH, and then with a few volumes of starting buffer.

Pre-packed ion exchange media


MiniBeads and MonoBeads are supplied pre-packed in PC and HR columns
respectively. SOURCE 15 are available pre-packed and ready to use in
RESOURCE columns, 1 or 6 ml. Pre-packed HiLoad columns are XK Columns
pre-packed with Sepharose Fast Flow and Sepharose High Performance ion
exchangers. Sepharose High Performance ion exchangers are also available pre-
packed in HiTrap columns, 1 and 5 ml. For pilot scale applications, Mono Q,
Mono S and Q Sepharose High Performance are available in pre-packed BioPilot

81
Columns of 100 ml(35/100) and 300 ml (60/100). SP Sepharose High Performan-
ce pre-packed in BioPilot Columns are available on request. For the above mentio-
ned pre-packed columns, the preparation consists of washing out the 20% ethanol
packing solution with 5 column volumes of start buffer.

Sephadex ion exchangers


Sephadex ion exchangers should be swollen at the pH to be used in the experi-
ment. Complete swelling takes 1-2 days at room temperature or 2 hours (at pH 7)
in a boiling water bath. Swelling at high temperature also serves to de-aerate the
gel. Vigorous stirring (e.g. with a magnetic stirrer) and swelling in distilled water
should be avoided due to the risk of damaging the beads.

The required amount of ion exchanger should be stirred into an excess of starting
buffer. Remove the supernatant and replace with fresh buffer several times during
the swelling period. Instead of decantation, the ion exchanger can be washed
extensively on a Büchner funnel after the initial swelling.

Alternative counter-ions
If ion exchangers are to be used with counter-ions other than those supplied (i.e.
other than sodium or chloride) then the following procedure should be used.

Suspend the required amount of ion exchanger in and excess of 0.5-1.0 M solution
of a salt of the new counter-ion. After sedimentation and decantation, re-suspend
the ion exchanger in the buffer to be used in the experiment. Decant and re-suspend
the ion exchanger in this buffer several times.

Decantation of fines
Decantation of fines is not necessary with any Amersham Biosciences ion exchangers.

Packing the column


As with any other chromatographic technique, packing is a very critical stage in an
ion exchange experiment. A poorly packed column gives rise to poor and uneven
flow, zone broadening, and loss of resolution.

Detailed packing instructions are to be found in the instructions supplied with


respective media.

Column Packing Video Film


A video film describing the correct methodologies for packing laboratory columns
is available and can be ordered from your local distributor of Amersham Biosciences
products.

82
Checking the packing
The bed should be inspected for irregularities or air bubbles using transmitted
light from a lamp held behind the column. Be careful in the choice of any dye sub-
stances used for checking beds as many of them are strongly charged. For exam-
ple, Blue Dextran 2000 binds strongly to anion exchangers.

Testing the bed is easily done by injecting a test substance on the column and cal-
culating the number of theoretical plates (N) or the height equivalent to a theoreti-
cal plate (H).

Choose a test substance which shows no interaction with the media and which has
a low molecular weight, to give full access to the interior of the beads.

Acetone at a concentration of 1% (v/v) can be used with all kinds of chromato-


graphic media and is easily detected by UV-absorption. Keep the sample volume
small to ensure a narrow zone when the sample enters the top of the column. For
optimal results, the sample volume should be ²0.5% of the column volume for a
column packed with a medium of approximately 30 µm bead diameter and ² 2%
of the column for a column packed with a medium of approximately 100 µm bead
diameter. Keep the linear flow rate low to reduce zone spreading due to non-equi-
librium at the front and rear of the zone. For 30 µm media the flow rate should be
between 30-60 cm/h and for 100 µm media, 15-30 cm/h. Use the following equa-
tions to calculate the number of theoretical plates (N) and the hight equivalent to a
theoretical plate (H).

2
VR
N = 5.54 x
() wh

H = L/N

where

VR is the volume eluted from the start of sample application to the peak maximum
and wh is the peak width measured as the width of the recorded peak at half of the
peak height, see Figure 44. L is the height of the packed bed.

Measurements of VR and wh can be made in distance (mm) or volume (ml) but


both parameters must be expressed in the same unit.

83
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Fig 44. A UV trace for acetone


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in a typical test chromatogram


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value calculations.

As a general rule of thumb, a good H value is about two to three times the mean
bead diameter of the gel being packed. For a 90 µm particle packing, this means
an H value of 0.018-0.027 cm.

Another useful parameter for testing the packed bed is the symmetry factor (As)
b
As =
a
where
a = 1st half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)
b = 2nd half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)

As should be as close as possible to 1. A reasonable As value for a short column


such as an IEX column is 0.80-1.80. (For longer gel filtration columns it will pro-
bably fall within 0.70-1.30).

An extensive leading edge is usually a sign that the gel has been packed too tightly
and extensive tailing is usually a sign that the gel has been packed too loosely.

Equilibrating the bed


Run at least two bed volumes of buffer through the ion exchange bed to allow the
system to reach equilibrium. Counter-ion concentration, conductivity, and pH of
the eluent should be checked against the ingoing solution. It is often sufficient just
to measure the pH of the effluent.

84
Sample preparation
Sample concentration
The amount of sample which can be applied to a column depends on the dynamic
capacity of the ion exchanger and the degree of resolution required. For the best
resolution it is not usually advisable to use more than 10-20% of this capacity
(23). Information on the available capacities for the different exchangers is given
in the relevant product sections. Methods for determining available and dynamic
capacities are given later in this chapter.

Sample composition
The ionic composition should be the same as that of the starting buffer. If it is not,
it can be changed by gel filtration on Sephadex G-25 using e.g. Amersham Biosciences
Disposable Column PD-10, Fast Desalting Column HR 10/10 or HiTrap Desalting
Columns, dialysis, diafiltration or possibly by addition of concentrated start buffer.

Sample volume
If the ion exchanger is to be developed with the starting buffer (isocratic elution),
the sample volume is important and should be limited to between 1 and 5% of the
bed volume. If however, the ion exchanger is to be developed with a gradient, star-
ting conditions are normally chosen so that all important substances are adsorbed
at the top of the bed. In this case, the sample mass applied is of far greater impor-
tance than the sample volume. This means that large volumes of dilute solutions,
such as pooled fractions from a preceding gel filtration step or a cell culture super-
natant can be applied directly to the ion exchanger without prior concentration.
Ion exchange thus serves as a useful means of concentrating a sample in addition
to fractionating it.

If contaminants are to be adsorbed, and the component of interest is allowed to


pass straight through, then the sample volume is less important than the amount
of contaminant which is present. Under these conditions there will be no concen-
tration of the purified component, rather some degree of dilution due to diffusion.

Sample viscosity
The viscosity may limit the quantity of sample that can be applied to a column. A
high sample viscosity causes instability of the zone and an irregular flow pattern.
The critical variable is the viscosity of the sample relative to the eluent. A rule of
thumb is to use 4 cP as the maximum sample viscosity. This corresponds to a pro-
tein concentration of approximately 5%. Approximate relative viscosities can be
quickly estimated by comparing emptying times from a pipette.

85
If the sample is too viscous, due to high solute concentration, it can be diluted
with start buffer. High viscosity due to nucleic acid contaminants can be alleviated
by precipitation with a poly-cationic macromolecule such as polyethyleneimine or
protamine sulphate. Nucleic acid viscosity can also be reduced by digestion with
endonuclease. Such additives may however be less attractive in an industrial pro-
cess since they will have to be proven absent from the final product.

Sample preparation
In all forms of chromatography, good resolution and long column life time depend
on the sample being free from particulate matter. It is important that “dirty” sam-
ples are cleaned by filtration or centrifugation before being applied to the column.
This requirement is particularly crucial when working with small particle matri-
ces, such as MiniBeads (3µm), MonoBeads (10 µm), SOURCE (15 and 30 µm) and
Sepharose High Performance (34µm).

The “grade” of filter required for sample preparation depends on the particle size
of the ion exchange matrix which will be used. Samples which are to be separated
on a 90 µm medium can be filtered using a 1 µm filter. For 3, 10, 15, 30 and 34 µm
media, samples should be filtered through a 0.45 µm filter. When sterile filtration
or extra clean samples are required, a 0.22 µm filter is appropriate.

Samples should be clear after filtration and free from visible contamination by
lipids. If turbid solutions are injected onto the column, the column lifetime, resolu-
tion and capacity can be reduced. Centrifugation at 10 000 g for 15 minutes can
also be used to prepare samples. This is not the ideal method of sample prepara-
tion but may be appropriate if samples are of very small volume or adsorb non-
specifically to filters.

Note: The latter may indicate that the substance in question may also adsorb
strongly to chromatography matrices. Care should therefore be taken and perhaps
a buffer additive such as glycerol or a detergent used.

Crude samples containing lipids, salts, etc. can be passed through a suitably sized
column of Sephadex G-25 e.g. Amersham Biosciences Desalting Column PD-10, Fast
Desalting Column HR 10/10 or HiTrap Desalting Column. Preliminary sample
clean-up can be achieved simultaneously in this way.

In expanded bed adsorption sample preparation is not as crucial as for column


chromatography. Samples can be applied directly to the expanded bed without
prior sample preparation, e.g. filtration, centrifugation etc. (Expanded bed
adsorption is described in detail on page 98.)

86
Sample application
There are a number of ways to apply the sample.

Sample application with an adaptor


This is the recommended method for all ion exchange media with the exception of
Sephadex based media and is always the method used with pre-packed columns or
when upward elution is employed. The sample may be applied to the column via
the adaptor in one of the following ways.
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Sample loops are a convenient way of


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flow on the column. Sample loops can be


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used in conjunction with LV-4 or SRV-4


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valves (Fig. 45) or in conjunction with the


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manual valves V-7 and IV-7 or the motor-


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Fig. 45. Sample application using an SA-5 in a @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0Y?


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sample loop system.

Sample applicators SA-5, SA-50. These are reservoirs which, used in combination
with a suitable valve, e.g. SRV-4, allow the sample to be introduced via a closed
sample loop system using a pump (Fig. 45). As well as their large capacity (up to 6
ml for the SA-5 and 45 ml for the SA-50) the sample applicator offers the advanta-
ge of serving as a pulse damper and bubble trap.

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Fig. 46. Sample application using V-7, IV-7 or motorized MV-7 or IMV-7 valves.

87
Superloops can be used together with the manual valves V-7 and IV-7 or the moto-
rised valves MV-7 and IMV-7 when larger volumes of sample have to be applied
(Fig. 47). Superloops are available with capacities of 10, 50 and 150 ml. (The 150
ml Superloop is most often used in BioPilot System.)
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Fig. 47. Sample application using a Superloop.

Syringe method (Fig. 48). The valves LV-3 and LV-4 can be used as syringe holders
to give a very simple method for the application of small samples in standard chro-
matography. Using this method the sample is allowed to run onto the column
under gravity.

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88
Sample reservoir (Fig. 49). In a similar way, a sample reservoir (e.g. R9, RK 16/26)
can be connected via a 3-way valve to apply larger samples.

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using a reservoir. This is also an
example of upward elution.

Other methods of sample application


The following methods can be used with Sephadex based ion exchangers where it
is not recommended to use an adaptor due to the variability of the bed height.
They are not recommended for the more rigid ion exchanger types.

Sample application onto a drained bed


This method requires the least equipment but is very difficult to do well. Allow
eluent to drain to the bed surface, then pipette the sample onto the gel surface and
allow it to drain into the gel. When all the sample has entered the bed, the top of
the column is washed with aliquots of starting buffer and is connected up for elu-
tion. The drawback with this system is that disturbances to the bed surface result
in uneven sample application and band skewing.

Sample application under the eluent


Here excess eluent is left on top of the column. Some very thin capillary tubing is
attached to a syringe and the free end is flared by gentle heating. The syringe is
filled with sample which is then layered on top of the bed by positioning the end of

89
the tubing just above the surface and slowly pressing out the sample. Note that the
sample must be denser than the eluent or made denser by the addition of a sugar,
e.g. glucose (24). The column can then be connected for elution.

Elution
If starting conditions are chosen such that only unwanted substances in the sample
are adsorbed, then no change in elution conditions is required since the substance
of interest passes straight through the column. Similarly no changes are required if
sample components are differentially retarded and separated under starting condi-
tions. This procedure is termed isocratic elution, and the column is said to be deve-
loped under starting conditions. Isocratic elution can be useful since no gradient
apparatus is required for the run and, if all retarded substances elute, regeneration
is not required.

Normally, however, separation and elution are achieved by selectively decreasing


the affinity of the solute molecules for the charged groups on the gel by continu-
ously changing either buffer pH or ionic strength or possibly both. This procedure
is termed gradient elution.

Change of pH
As shown in Figure 37 on page 68, the net charge on a molecule depends on pH.
Thus altering the pH towards the isoelectric point of a substance causes it to lose
its net charge, desorb, and elute from the ion exchanger. Figure 50 shows use of a
decreasing pH gradient in separation of haemocyanin fractions (25).
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Fig. 50. Elution pattern
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(25). (Reproduced by kind


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permission of the authors


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Since many proteins show minimum solubility in the vicinity of their isoelectric
points, care and precautions must be exercised to avoid isoelectric precipitation on
the column. The solubility of the sample components at the pH and salt concen-
trations to be used during separation should always be tested in advance.

90
Change of ionic strength
At low ionic strengths, competition for
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charged groups on the ion exchanger is W26XfW&


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Fig. 51. Isolation of mouse IgM on


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SP Sepharose Fast Flow. (Courtesy of Dr.


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H. F. J. Savelkoul, Erasmus University, @@@@@?


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Rotterdam, The Netherlands.)

Gradient direction
Guidelines for the choice of ascending or descending gradients are given in
Table 21.

Table 21. Choosing the direction of the gradient for elution.

Direction of Direction of
Ion exchanger pH gradient ionic strength gradient
Anion exchanger decreasing increasing
Cation exchanger increasing increasing

Choice of gradient type


The components in the sample usually have different affinities for the ion
exchanger and so variations in the pH and ionic strength of the eluent can cause
their elution at different times and thus their separation from each other. One can
choose to use either continuous or stepwise gradients of pH or ionic strength.

Stepwise pH gradients are easier to produce and are more reproducible than linear
pH gradients. In the case of weak ion exchangers the buffer may have to titrate the
ion exchanger and there will be a short period of re-equilibration before the new
pH is reached. Gradients of pH can be also used in combination with ionic
strength gradients.

91
Stepwise ionic strength gradients are produced by the sequential use of the same
buffer at different ionic strengths. Stepwise elution is technically simple and offers
the potential of high resolution in preparative applications. Care must be exerci-
sed in the design of the steps and the interpretation of results since substances elu-
ted by a sharp change in pH or ionic strength elute close together. Peaks tend to
have sharp fronts and pronounced tailing since they frequently contain more than
one component. Tailing may lead to the appearance of false peaks if a buffer chan-
ge is introduced too early. For these reasons a first separation using a continuous
gradient is always recommended as a means of characterising the sample and an
indication of suitable steps. The differences between continuous and stepwise gra-
dient elution are shown in Figure 52.

Continuous pH gradients are difficult to produce at constant ionic strength, since


simultaneous changes in ionic strength, although small, also occur. Linear pH gra-
dients cannot be obtained simply by mixing buffers of different pH in linear volu-
me ratios since the buffering capacities of the systems produced are pH dependent.
A relatively linear gradient can be produced over a narrow pH interval (Max.
2 pH units) by mixing two solutions of the same buffer salt adjusted, respectively,
to 1 pH unit above and 1 pH unit below the pKa for the buffer.

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Fig. 52. Continuous and stepwise gradient elution of b-galactosidase from Escherichia coli
on Mono Q HR 5/5 (26). (Reproduced by kind permission of the authors and publisher.)

92
Continuous ionic strength gradients are the most frequently used type of elution in
ion exchange chromatography. They are easy to prepare and very reproducible.
Two buffers of differing ionic strength, the start and limit buffers, are mixed toget-
her and if the volume ratio is changed linearly, the ionic strength changes linearly.

The limit buffer may be of the same buffer salt and pH as the start buffer, but at
higher concentration, or the start buffer containing additional salt e.g. NaCl.

Gradient elution generally leads to improved resolution since zone sharpening


occurs during elution. In all forms of isocratic elution, a limiting factor with
regards to achievable resolution is zone broadening as a result of longitudinal dif-
fusion. In gradient elution, the leading edge of a peak is retarded if it advances
ahead of the salt concentration or pH required to elute it. In contrast the trailing
edge of the peak is exposed to continuously increasing eluting power. Thus the
trailing edge of the peak has a relatively higher speed of migration, resulting in
zone sharpening, narrower peaks and better resolution.

Gradient elution also reduces zone broadening by diminishing peak tailing due to
non-linear adsorption isotherms.

Resolution using a continuous gradient


To optimize a separation it is important first to consider the objectives of the expe-
riment, since the desired features of a separation i.e. speed, resolution and capaci-
ty, are often mutually exclusive. In the case of ion exchange separations the speed
of separation is not solely related to the flow rate used in the experiment but also
to the steepness or slope of the gradient applied.

Novotny (27) has shown that the retention of charged molecules on an ion
exchange column is related to the volume of the column and the molarity differen-
ce across it. This means that long shallow gradients will give maximum separation
between peaks but that the separation time will be longer and peak broadening
larger. In contrast short steep gradients will give faster separations and sharper
peaks but the retention differences between peaks will be reduced. The effect of
gradient slope on resolution is illustrated in Figure 53.

It should be remembered that the sample loading also has a major influence on
resolution since the width of the peaks is directly related to the amount of substance
present.

In practice it is recommended that trial experiments be carried out to allow the


selection of optimal run parameters in terms of gradient shape and length.

As a general rule a gradient of 0.05 to 0.5 M salt over a volume of 10 to 20


column volumes at the flow rate recommended for the medium (see individual
media sections) can be used for initial investigative separations.

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Fig. 53. Effect of gradient slope on resolution. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden).

Choice of gradient shape


Linear Gradients. It is strongly recommended that initial experiments with a new
separation problem be carried out using linear gradient elution. The results obtai-
ned can then serve as a base from which optimization can be planned. If better
resolution is required then the separation can be improved by altering the shape or
slope of the gradient.

Convex gradients can be used to improve resolution in the last part of the gradient
or to speed up a separation when the first peaks are well separated and the last few
are adequately separated.

94
Concave gradients can be used to improve resolution in the first part of the gradi-
ent or to shorten the separation time when peaks in the latter part of the gradient
are more than adequately separated.

Complex gradients can be generated to use the maximum resolution offered by


isocratic resolution when required combined with steeper gradient portions where
resolution is adequate or unnecessary (Fig. 54). Complex gradients offer the maxi-
mum flexibility in terms of combining resolution with speed during the same sepa-
ration. A knowledge of the chromatographic behaviour of the sample obtained
from previous separations using simpler gradients is essential.

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Fig. 54. Anion exchange chroma-


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Sample, 100 µl of 100 µM NAD,


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100 µM NADH, 250 µM NADP


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and 250 µM NADPH; column,


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1 ml/min.

Sample displacement
When a sample of solutes, such as proteins, is applied to the top of an ion
exchange column the species with the highest charge density will bind at the top,
displacing more weakly bound species or preventing such from binding.

In effect a degree of separation occurs on the column during sample loading, with
the solutes stacked on the column in order of their relative charges and strengths
of binding.

On application of a gradient the increasing salt concentration will cause the most
weakly bound molecules to migrate and leave the column first. For this reason
“reverse flow elution” should never be used in the ion exchange separation of
complex mixtures. Under such conditions early desorbing substances would have
to migrate through all other bound species, possibly displacing them, and lead to
lost resolution.

95
Gradient generation
Accurate and reproducible pH and ionic strength gradients are best formed using
purpose designed equipment. The choice of gradient generating system will
depend upon the type of ion exchange media and the required complexity of the
gradient.

Gradient formation with two pumps or a single pump in combina-


tion with a switch valve
Maximum flexibility in terms of gradient production is achieved by using two
separate pumps for start and limit buffers or a single pump in combination with a
switch valve.

Using gradient programmers, e.g. GP-250 Plus or LCC-501 Plus, or using chroma-
tography systems which are controlled via a controlling software, e.g. UNICORN
and FPLCdirector, the proportions of the start and limit buffers which constitute
the eluent being supplied to the column are programmed for specific times or volu-
mes during the separation. The relative amounts of start and limit buffer then
increase or decrease in a linear fashion between two such “breakpoints” to produ-
ce the gradient. The more breakpoints which have been programmed the more
complex the gradient.

Further information on controlling software, gradient programmers and related


pump systems is available from Amersham Biosciences.

Gradient Mixer
The Amersham Biosciences Gradient Mixer
GM-1 can be used to make linear ionic ?W2@@@@@@@@@@@@6X?
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strengthen or pH gradients of up to 500 ml


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Fig. 55. Gradient elution system using the


Gradient Mixer GM-1.

96
An example of a decreasing pH gradient produced by the Gradient Mixer GM-1
is shown in Figure 56. The gradient was produced from 0.1 M solutions of Tris
(free base), pH 10.5 and Tris-HCl, pH 7.5.

Usually changes in pH also produce small changes in ionic strength.


These can be estimated by monitoring conductivity.
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Fig. 56. Gradient from pH 10.5 to 7.5 in 400 ml produced using the Gradient Mixer GM-1.
pH –, conductance - - -. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Batch separation
There is essentially no difference in separation procedure between a column deve-
loped by stepwise elution and a batch procedure. Either the substance of interest
or contaminants may be attached to the ion exchanger.

Although batch procedures are less efficient than column techniques they may
offer advantages in particular cases. When very large sample volumes with low
protein concentration have to be processed, the sample application time on a
column can be very long and filtration of such a large sample can also be rather
difficult to perform. Binding the sample in batch mode will be much quicker and
there will be no need to remove particulate matter.

A batch procedure can also be an attractive approach if high sample viscosity


generates high back-pressure in a column procedure or if high back-pressure is
generated by contaminants such as lipids, which may cause severe fouling and
clogging of the column.

Batch separation is a very rapid technique and no technical difficulties are caused
by the swelling or shrinkage of Sephadex ion exchangers. The shrinkage may even
be an advantage in some applications.

97
When working with batch ion exchange, the starting conditions are selected in the
same way as in column chromatography, i.e. choose buffer pH an ionic strength to
bind the substance of interest but to prevent as many contaminants as possible
from binding.

To maximize recovery, the starting conditions should be selected so that the pro-
tein of interest binds much stronger than is usual in column chromatography.
Unless the proteins adsorbs to 100%, losses during subsequent washing will be
inevitable, especially if the volume of liquid is large compared to the volume of
adsorbent. To keep recovery high, the pH in a batch experiment may have to be
several units away from the isoelectric point of the protein.

Batch separation is carried out by stirring the ion exchanger previously equilibra-
ted in the appropriate buffer with the solution to be treated until the mixture has
reached equilibrium. This usually takes about one hour. The slurry is then filtered
and washed with the buffer solution. In cases of incomplete adsorption this proce-
dure should be repeated on the filtrate with a new batch of ion exchanger. Then
elution buffer is added (1-2 times the volume of the sedimented gel) and stirred
until desorption is complete, which can take up to 30 minutes or more. Finally,
suction is used to filter the buffer containing the desorbed product of interest from
the adsorbent. The gel can also be packed in a column after the washing step and
be eluted stepwise in the same way as during normal column chromatography.
Resolution will however be lower for such a combined batch and column proce-
dure compared with a normal column procedure, since the sample is bound uni-
formly throughout the gel slurry and the subsequent chromatographic bed.
Under these conditions stepwise elution is recommended since gradient elution
will give broad bands and poor resolution.

Batch chromatography is very useful for concentrating dilute solutions and sepa-
rating the substances of interest from gross contaminants during the initial stages
of a purification scheme.

Note: Fines will be generated if the ion exchangers are stirred too vigorously. This
will increase the time required for filtration.

Expanded bed adsorption


Expanded bed adsorption is a unit operation that uses STREAMLINE adsorbents
and columns for recovering proteins directly from crude samples. Proteins are
recovered in a single pass without the need for prior clarification. STREAMLINE
has proven effective in purification proteins from fermentation or cell culture in
extracellular processes, and has demonstrated its suitability when used with broth
from cell lysis and homogenization in intracellular processes with soluble proteins.
STREAMLINE reduces the number of operations in a process by fusing the func-
tions of clarification, concentration and capture (see page 109) in one operation.

98
It offers the selectivity afforded by chromatography, the throughput of ultra-filtra-
tion and the convenience of small scale centrifugation.

Crude feed from the fermentor containing the desired product and undesired cells,
cell debris and particulates is applied to the expanded bed. Target products are
bound by the adsorbent while particulates and contaminants pass through unhin-
dered. The desired molecule is then eluted as in packed bed chromatography.

Expanded bed technology


Expanded bed adsorption is based on fluidization. The sedimented bed begins to
expand as the adsorbent particles are raised by an upward liquid flow. The diffe-
rence between a fluidized bed and expanded bed is that in an expanded bed the
adsorbent particles display very little back-mixing. This is achieved through the
unique design of the column and the adsorbents. The column has a special flow
distributor at the bottom, the adsorbent particles have a well-defined size and den-
sity distribution. The particles are kept in suspension by the balance between
upward flow rate and particle sedimentation velocity. As the bed expands with the
upward liquid flow, the movement of any given particle is very small. This creates
a stable, homogeneous expanded bed and a liquid flow which is characterized by a
constant velocity profile, i.e. plug flow. The stability of the expanded bed give
STREAMLINE characteristics that are similar to those of a packed bed in
chromatography.

Basic principle of operation


1. STREAMLINE adsorbent is poured into STREAMLINE column and allowed
to sediment (Fig. 57 a).

2. An upward liquid flow of equilibration buffer is applied to the column and


STREAMLINE adsorbent particles are suspended in the flow, creating a stable
fluidized bed (Fig. 57 b).

3. The sample, a mixture of soluble proteins, contaminants, cells, or cell debris,


is passed upwards through the expanded bed. The target proteins are bound
on STREAMLINE adsorbent while particulates and contaminants pass
through the expanded bed unrestricted. Loosely bound material is washed out
with the upward flow of the buffer (Fig. 57 c).

4. The liquid flow is reversed to downward flow. By using suitable buffer


conditions, the bound proteins are eluted from STREAMLINE adsorbent in a
sedimented bed mode. The eluate contains the target proteins, increased in con
centration, free from particulates and ready for further purification (Fig. 57 d).

99
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Fig. 57. The principle of
operation of expanded
Buffer Feed Eluate bed adsorption.

STREAMLINE adsorbents
STREAMLINE adsorbents are described in detail in Chapter 6.

STREAMLINE columns
STREAMLINE columns are designed to suit the different stages of process deve-
lopment. STREAMLINE 50 column is designed for method optimization. A set-up
with this column can handle 1-20 l from the fermentor at a throughput of 6 l/h. A
set-up with STREAMLINE 200 column, for pilot scale and verification of the
optimized methods, can handle 50-300 l of sample at a throughput of 100 l/h.
STREAMLINE CD column, custom designed for industrial manufacturing, can
handle production volumes of samples at a throughput of several thousands of
litres per hour.

Auxiliary equipment
To operate expanded bed adsorption in method optimization some auxiliary equ-
ipment is needed. For example, a peristaltic pump, manual valves, UV, pH and
conductivity monitors and a recorder, all standard laboratory equipment.
For production installations STREAMLINE is engineered to your specifications.

100
Regeneration
After each cycle, bound substances must be washed out from the column to resto-
re the original function of the media. Ion exchange adsorbents can normally be
regenerated after each run by washing with a salt solution until an ionic strength
of about 2 M has been reached. This should remove any substances bound by
ionic forces. The salt should contain the counter-ion to the ion exchanger to facili-
tate equilibration.

To prevent a slow build up of contaminants on the column over time, more rigo-
rous cleaning protocols may have to be applied on a regular basis, see below.

Cleaning, sanitization and


sterilization procedures
Cleaning
Cleaning-in-place (CIP) is the removal from the purification system of very tightly
bound, precipitated or denatured substances generated in previous purification
cycles. In some applications, substances such as lipids or denatured proteins may
remain in the column bed instead of being eluted by the regeneration procedure. If
contaminants accumulate on the column over a number of purification cycles,
they may affect the chromatographic properties of the column. If fouling is severe,
it may also block the column, increasing the back-pressure and reducing the flow
rate.

A specific CIP protocol should be designed according to the type of contaminants


that are known to be present in the sample. NaOH is a very efficient cleaning
agent that can be used for solubilizing irreversibly precipitated proteins and lipids.
NaOH can effectively be combined with solvent or detergent based cleaning methods.

Sanitization
Sanitization is the inactivation of microbial populations. When a packed column
is washed with a sanitizing agent, the risk of contaminating the purified product
with viable micro-organisms is reduced. The most commonly used sanitization
method in chromatography today is to wash the column with NaOH. NaOH has
a very good sanitizing effect and also has the addition advantage of cleaning the
column.

Sterilization
Sterilization, which is not synonymous with sanitization, is the destruction or eli-
mination of all forms of microbial life in the system.

101
Protocols for cleaning-in-place (CIP),
sanitization and sterilization.
Suggested protocols for cleaning-in-place (CIP), sanitization and sterilization that
can be applied to each specific ion exchanger from Amersham Biosciences are
summerized below.

SOURCE and Sepharose based ion exchangers


CIP, sanitization and sterilization protocols for SOURCE and Sepharose based ion
exchangers media are summarized in Table 22.

Table 22. Suggested CIP, sanitization and sterilization protocols for SOURCE 15 and 30,
and Sepharose based ion exchangers media from Amersham Biosciences.

Purpose Procedure
Removal of precipitated proteins 4 bed volumes of 0.5-1.0 M NaOH at 40 cm/h
followed by 2-3 bed volumes of water.

Removal of strongly bound 4-10 bed volumes of up to 70% ethanol or


hydrophobic proteins, lipo- 30% isopropanol followed by 3-4 bed volumes
proteins and lipids of water.
or
1-2 bed volumes of 0.5% non-ionic detergent
(e.g. in 1 M acetic acid) followed by 5 bed
volumes of 70% ethanol to remove the detergent,
and 3-4 bed volumes of water.

Sanitization 0.5-1.0 M NaOH with a contact time of 30-60


min.

Sterilization Autoclave the medium at 121 °C for 15 min.

MonoBeads and MiniBeads columns


Due to the small particle size of MonoBeads and MiniBeads, they are more sensiti-
ve to particulate matter such as precipitated proteins from the sample or buffer
solutions than the larger bead size matrices. Preventative measures to ensure cle-
anliness of the sample and buffers are essential to ensure long column life. Sample
preparation procedures are described earlier in this Chapter. Should precipitated
material be present, as indicated by a decrease in performance or an increase in
back-pressure, the columns may be cleaned using the detailed instructions inclu-
ded with the column.

102
DEAE Sephacel and Sephadex based ion exchangers
Due to the relatively large volume changes of Sephadex based gels in different sol-
vents, we recommend cleaning and washing with organic solvents on a Büchner
funnel, since the gel needs to be repacked after such treatment.

Remove ionically bound proteins by washing the column with 0.5-1 bed volume
of a 2 M NaCl solution.

Remove precipitated proteins, hydrophobically bound proteins and lipoproteins


by washing the column with 0.1 M NaOH solution, contact time 1-2 hours, follo-
wed by binding buffer until free from alkali. Alternatively, wash the column with
2 bed volumes of 6 M guanidine hydrochloride.

Strongly hydrophobically bound proteins, lipoproteins and lipids can be removed


by washing the gel with up to 70% ethanol or 30% isopropanol. Alternatively,
wash the gel with 2 bed volumes of a non-ionic detergent in a basic or acidic solu-
tion. Use for example, 0.1-0.5% non-ionic detergent (e.g. Triton X-100) in 0.1 M
acetic acid. After treatment with detergent always remove residual detergents by
washing with 5 bed volumes of 70% ethanol.

Re-equilibrate the ion exchanger with starting buffer.

Storage of gels and columns


Prevention of microbial growth
As well as endangering the sample, bacterial and microbial growth can seriously
interfere with the chromatographic properties of ion exchange columns and may
obstruct the flow through the bed. During storage an antimicrobial agent should
always be added to the ion exchanger. Antimicrobial agents may be eluted from
the columns during equilibration before starting a run.

Recommended antimicrobial agents for anion exchangers:


Equilibrate the column with 20% ethanol in 0.2 M acetate.

Recommended antimicrobial agents for cation exchangers:


Equilibrate the column with 20% ethanol or 0.01 M NaOH.

103
Storage of unused media
Unused media should be stored in closed containers at +4 °C to +25 °C. Note that
it is important that the media are not allowed to freeze as the structure of the
beads may be disrupted by ice crystals. This disruption will generate fines.

Storage of used media


Used media should be stored at a temperature of +4 °C to +8 °C in the presence of
an antimicrobial agent, e.g. 0.01 M NaOH or 20% ethanol according to the
recommendation given above. Note that it is important that the media are not
allowed to freeze as the structure of the beads may be disrupted by ice crystals.
This disruption will generate fines.

Storage of packed columns


Packed columns should be stored at a temperature of +4 °C to +8 °C in the presen-
ce of an antimicrobial agent, e.g. 0.01 M NaOH or 20% ethanol according to the
recommendation given above. For long-term storage, the packed column should
be thoroughly cleaned before equilibration with the storage solution. Recycling
the storage solution through the column or flushing the column once a week with
fresh storage solution is recommended to prevent bacterial growth.

Determination of the available and


dynamic capacities
The available capacity of an ion exchanger can be determined by a batch test-tube
method similar to that used for the determination of suitable buffer pH and bin-
ding and elution ionic strengths, see page 70 and Figure 38. In this case a series of
solutions with different concentrations of the protein are added to a known quan-
tity of ion exchanger, equilibrated at a suitable binding pH and ionic strength.
Assaying the supernatants after mixing will show the maximum protein concen-
tration which can be bound per ml of ion exchanger.

For a more realistic and useful measurement of the available capacity of an ion
exchanger, a dynamic method is recommended (see page 18 for definition of avai-
lable and dynamic capacity). The type of equipment necessary for this determina-
tion is shown in Figure 58. FPLC System can also be used for this determination.

104
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exchanger.

A defined amount of gel is introduced into the column (Normally a quantity of gel
to give a bed volume of approximately 1 ml is sufficient). The gel is packed and
equilibrated until the eluate is of the same pH as the starting buffer. The exact
volume of gel is calculated from the known column diameter and the measured
bed height. In the case of a pre-packed column the amount of gel is already prede-
termined.

The protein solution (1 to 5 mg/ml in start buffer) is applied to the column by


switching the sample application valve. To ensure that the column is fully loaded,

105
sample application is not interrupted until the recorder shows 50% full scale
deflection, FSD, (0% = starting buffer; 100% = the protein solution in starting
buffer).

Sample application is stopped by re-setting the valve to allow passage of start buf-
fer. Washing is continued until 0% full scale deflection is approached (Fig. 59).
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Fig. 59. Graph obtained with the set-


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nation of dynamic capacity.

After the wash phase, adsorbed protein is eluted with a stepwise change in ionic
strength (e.g. 2 M NaCl) or pH. Fractions are collected as long as the UV-absorp-
tion is above 2% FSD. These fractions are pooled and the UV-absorption of the
pool is measured.

Calculation
The maximum amount of protein that can be bound to the column (A) at the cho-
sen flow rate is:
A=CxV
C = The protein concentration in the pooled fractions (mg/ml).
V = volume of pooled fractions.
C = A280/ E

A280 = absorbance of solution at 280 nm in 1 cm cell.


E = absorbance of standard solution (1 mg/ml) at 280 nm in
a 1 cm cell.

The protein capacity is calculated as:


A/gel volume

This calculation assumes that the recovery of bound protein from the column is
100%. This can be checked by comparison with the quantity of protein applied to
the column.

106
11. Process considerations
When an ion exchange step is to be part of a purification sequence for a manufac-
turing process (in contrast to analytical chromatography or small scale preparati-
ve applications), method development work has to find conditions which give the
highest throughput with the highest yield and the lowest possible cost.

”What kind of application will the product be used in?”


What are the purity issues in relation to the source material and intended
use of final product? What has to be removed?

”What kind of starting material do I have?”


What are the major ”Headaches”?

”What final scale am I thinking of?”


What consequences will this have for the technical approach?

”What is my purification strategy?”

First, CAPTURE
What will be the major purpose for the initial chromatographic step? Is my
proposal rational?

Then, INTERMEDIATE PURIFICATION


What will be the major purpose with each subsequent chromatographic step?

Finally, POLISHING
What will be the major purpose of the polishing stage? Looking back upstream, does
the overall balance and sequence of techniques appear logical?

”How do I get the most out of my process?”


Will my process be more productive, safe, robust, economic and easier to use than
one which our competitors could do?
Will I arrive at the final process faster than our competitors?

Fig. 60. Questions that must be addressed to assure a rational process design

The design must ensure that the purity requirements of the final product are met,
and also considering the special safety issues involved in production of biophar-
maceuticals, such as infectious agents, pyrogens, immunogenic contaminants and
tumorigenic hazards. In general, the purity issues must be addressed in relation to
the nature of the source material and the intended use of the final product. It is
important to define the impurities and contaminants which have to be removed
from the source material during downstream processing.

107
Another important aspect of process development is to assure that scaleability,
robustness and consistency are designed into the process from the very beginning.
This is secured by careful selection of appropriate chromatography media, by the
way a particular chromatographic step is optimized and by an early identification
of different sources of variation and how they can be eliminated or controlled
during processing.

To assure a rational process design, a number of questions must be adressed.


These questions are summerized in Figure 60 and will be discussed below.

Defining the purpose


To reach the targets for yield and purity in as few steps as possible, and with the
simplest possible design, it is not efficient to add one step to another until the puri-
ty requirements have been fulfilled. Instead a specific purpose is assigned to each
step which is included in the complete scheme. The specific purification problem
associated with a particular step, will depend greatly on the characteristics of the
ingoing feed material to be processed in the step. Thus, the purpose of a particular
step depends on if it is placed at the beginning, to handle a crude feed stock, in the
middle, after partial purification or at the end when final purity is achieved.

The different stages in downstream processing can be divided into capture, inter-
mediate purification and polishing (Fig. 61).
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Fig. 61. Different stages in downstream processing

When ion exchange chromatography is applied in capture, the purpose will be to


adsorb the protein of interest quickly from the crude feed stock and isolate it from
critical contaminants such as proteases and glycosidases. The product should be
concentrated and transferred to an environment which will conserve potency/acti-

108
vity. At best, significant removal of other critical contaminants can also be
achieved.

In polishing, on the other hand, most impurities have already been removed except
for trace amounts or closely related substances such as microheterogeneous struc-
tural variants of the product. When ion exchange chromatography is applied in
such a step the purpose will be to reduce these variants and trace contaminants to
a level that will be acceptable for final product quality by applying scaleable high
resolution ion exchange chromatography techniques.

When ion exchange chromatography is applied in intermediate purification, i.e.


steps performed on clarified feed between capture and polishing, the purpose is to
remove most of the significant impurities such as proteins, nucleic acids, endotox-
ins and viruses down to safe levels.

The strategic focus


In any chromatographic step there are four main performance properties to adjust
to reach a fully optimized procedure (Fig. 62), resolution, speed, capacity and
recovery.
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J5
.Y
the context of competing
goals.

In general, optimization of any of these can only be realized at the expense of the
others. The relative priority of these parameters will vary depending on whether a
particular chromatographic step is for capture, intermediate purification or polish-
ing. This will steer the optimization of the critical processing parameters in any
particular step, as well as the selection of the most suitable chromatography
matrix to be used in the step.

Capture
In a typical capture situation, throughput (i.e. capacity and speed) will be very
important for processing of large sample volumes, keeping the scale of equipment

109
as small as possible and giving the shortest possible cycle time. Binding capacity
for the product in the presence of the impurities will be one of the most critical
parameters to reduce the scale of work as much as possible.

High speed may be required to reduce sample application time, particularly if


proteolysis or other destructive effects occur. The characteristics of the feed and
the anticipated final scale of work will form the basis for the balance between
capacity and speed in a capture situation (Fig. 63).
Fig. 63. In a typical capture situ-
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ation the strategic planning will
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J5
.Y means that a somewhat larger
bed volume is needed for proces-
sing of a specific amount of feed.

In capture, an important factor impacting capacity is the selectivity during sample


adsorption. Typically binding conditions are selected to avoid binding contamina-
ting substances so that more binding sites are available for the protein of interest.
This also allows stepwise elution of the product in concentrated form.

Recovery is another parameter that will be of great concern in any preparative


situation, especially for production of a high value product. Recovery generally
becomes more important further downstream because of the increased value of
the purified product. Recovery is influenced by destructive processes in the sample
and unfavourable conditions on the column.

Resolution of similar components is not of greatest concern in a typical capture


situation. However, there is usually significant resolution and purification from
molecules with gross physicochemical difference from the product.

In principle, a capture step is designed to maximize capacity and/or speed at the


expense of some resolution. The separation from impurities is usually achieved
during binding of the product which can simply be eluted, in concentrated form,
by a step.

110
Intermediate purification
In intermediate purification steps, achieving resolution of similar components will
be more and more important further downstream. Capacity will still be important
to maintain productivity, i.e. amount of product produced per volume of chroma-
tography media and time unit.

As in a capture step, selectivity during sample adsorption will be important, not


only to achieve high binding capacity, but also to contribute to the purification by
achieving a degree of separation already during sample application. However, in
contrast to a capture step, selectivity during sample desorption from the column
becomes important as we go downstream. This is usually achieved by applying a
more selective desorption principle, such as a continuos gradient or a multi-step
elution procedure.

Hence, the delicate problem in an intermediate purification step will be to decide


on the optional balance between capacity and resolution (see Fig. 64). Speed will
usually be less critical in a typical intermediate purification step due to the fact
that impurities causing proteolysis and other destructive effects should have been
removed in the capture step and also due to the fact that sample volume has been
reduced at this stage.

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Fig. 64. In a typical intermediate
?
@@@6X?
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@LfJ@
@??C@T2@6KO2@@?W2@6X@1e@?@@@@?W2@6T2@6X
@@@@>@Y?V@@Ue?7<?B@@@e@?N@?@?7<?B@@?B1
@??B@@@@@0R46X?@e?@@@e@??@?@?@e?@@??@
@?e@@X?fS,?3=?C@@@=?@??@?@?3=?C@@??@
@?e(R4@@@@@0Y?V4@0R+R4@@??@@@?V4@0R'??@
?
?
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purification situation the strategic
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planning will focus on resolution


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J@@@@@6X ?
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7Y@@@@@)K? ?
?J5?@@@@@@@6X?
?7H?3@@@@@@@,? ?
?
J5eN@@@@@@(Y?
7He?@@@@@@? ?
?
?J5?e?@@@@@@1 ?

and capacity. The requirements


W.Y?e?@@@@?@@L?
7Hg?@@W@@)X ?
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?J5?g?@@@>@@1
?7H?g?3@@@Y@@L? ?
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J5h?N@@@W@@1?
7Hhe@@@@Y@@L ?
?
?J5?he3@@@@@@)X? ?
?7H?heN@@@@W@@1?
J5hf?@@@@@Y@@L ?
?
7Hhf?@@@@@@@@)X? ?

for resolution must be defined in


?J5?hf?3@@@@@W@@1?
W.Y?hf?N@@@@@@Y@@L ?
?
7H
?J5? @@@@@@@@@)X?
3@@@@@@W@@1? ?
?
?7H?
J5 N@@@@@@@Y@@L
?@@@@@@@@@@)X? ?
?
7H
?J5? ?@@@@@@@@W@@1?
?3@@@@@@@@Y@@L ?
?
?7H? ?N@@@@@@@@@@@1 ?
J5 @@@@@@@@@?@@L? ?

context with the nature of the feed


?W.Y
?7H? 3@@@@@@@@@@@)X
N@@@@@@@@@@@@1 ?
?
J5
7H ?@@@@@@@@@@?@@L?
?3@@@@@@@@@@@@)X ?
?
?J5?
?7H? ?N@@@@@@@@@@@@@1
@@@@@@@@@@@?@@L? ?
?
J5
7H @@@@@@@@@@@@@@)X
3@@@@@@@@@@@@@@1 ?
?
?J5?
?7H? N@@@@@@@@@@@@?@@L?
?@@@@@@@@@@@@@@@)X ?
?

and the purity requirements in the


J5
?W.Y ?3@@@@@@@@@@@@@@@1
?N@@@@@@@@@@@@@?@@L? ?
?
?7H?
J5 @@@@@@@@@@@@@@@@1?
@@@@@@@@@@@@@@@@@L ?
?
7H
?J5? 3@@@@@@@@@@@@@@@@)X?
N@@@@@@@@@@@@@@@@@1? ?
?
?7H?
J5 ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@L
?3@@@@@@@@@@@@@@@@@)X? ?
?
7H
?J5? ?N@@@@@@@@@@@@@@@@@@1?
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L ?
?

final product. Capacity must also


W.Y? @@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X? ?
7H
?J5? 3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1?
N@@@@@@@@@@@@@@@@@?@@L ?
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J5 ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X?
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@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1 ?
?
?7H?
J5 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X ?
?
?W.Y N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1 ?

be considered to ensure a high


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J5 ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
?3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X ?
?
7H
?J5? ?N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L? ?
?
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J5 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1 ?
?
7H
?J5? N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X ?
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J5 ?3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
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J5
7H
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3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X?
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@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X?
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1?
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productivity. The optimal balance
7H N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L ?
?J5?
?7H?
J5
7H
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?7H?
J5
7H
?J5?
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@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
?3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
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must be defined which then will
W.Y? ?N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)?)X? ?
?W26X?
?7<I/?
@?hJ5
@?h7H
?3=?e)T26KO2@6KO2@6KO2@@?g?J5?
?V4@6X@(MB@@Y?V@@Y?V@@<?@?g?7H?
B@@He@@@@@@@@@@@@e@?g?@
7H
?J5?
?7H?
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1?
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@?
N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@?
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@?hW26X
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@Lg?W.MI/
@??@h?
J@L?g?
?
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?
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?N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@g?@g?V1?@(MB@Y?V1?7<I'@?N@H?@?7He?
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?f?3L??W2@@@@?@He@@@@@?@?e@??@e3X@?e?
/KeC@@??C@@X??W@XeW@=?@?f?@@@@6K??O2@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@?f?V/KO.R'X?@?@??C@@X?@?3=O&@??@L?N@5?e?
decide how selectivity parameters
V4@@0Y@@@0MI4@@0R4@@0R4@@?hI4@@@@@@X? ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0MhV40Y?V4@@?@@@0MI4@@?V40R'??@@??@H?e?
@?
@? ?I4@@@@6K?
?I4@@@@@6KI4@@@@@6K?
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?I4@@@@@6K I4@@@@@6K?
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?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0M?
?3X@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0M?
?N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0M
@@@@@@@@@@@@@@@@@@W@0M
3X@@@@@@@@@@@@@@@@0M
N@@@@@@@@@@@@W@0M?
?@@@@@@@@@@@@0M?
I4@@@@@6K?hf?@?@@@@@W@0M
@?
@? J5f?
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should be optimized during sam-
?I4@@@@6K?g?3T@@@@@0M ?
?I4@@@@@6K?V@>@0M?

@@@6X?
@??B1?
I4@@@0M? ?
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ple application to achieve the
@??C@T2@6KO26X?W2@6T2@?W2@@6T2@??@?W.? ?
@@@@>@Y?V@@<I/?7<?B@Y@?7@??V@@H??@?7H?
@??B@@@@@@@?e?@e?@?@?@@@@@@@e?3X@
@?e@@X??W@=O.?3=?C5?3T@@Xe?@e?N@5
@?e(R4@@0R40Y?V4@0Y?V+MI4@@@@f@H
?J5?
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?
?
?
?
?
?
?
?
?
requirements for resolution (puri-
fication) and capacity in the
system.

Polishing
In a polishing step the prime issue will be resolution, since this is the last chance to
reach the required quality of the product by removal of trace contaminants such
as host proteins, structural variants of product, reagents, leachables, endotoxins,
nucleic acids and viruses.

111
O2@@@@@@@@@6K? ?
?O2@@@@@@@@@@@@@@@6K ?
W2@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@6X?
?O&@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)K ?
?
?W2@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@6X ?
O&@@?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)K? ?
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?W&@?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X ?
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7@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1? ?
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N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@H? ?
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?V'@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@(Y ?
?
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Fig. 65. In a typical polishing situa-


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W.Y?hf3@@@@@@)X? ?
7H N@@@@@@@1? ?
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?7H? ?@@@@@@@@L
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tion the strategic planning will


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?7H? @@@@@@@@@)X?
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J5 N@@@@@@@@@@L ?
?W.Y ?@@@@@@@@@@)X? ?
?7H?
J5 ?3@@@@@@@@@@1?
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7H @@@@@@@@@@@)X? ?
?J5? @@@@@@@@@@@@1? ?

focus almost entirely on resolution.


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J5 3@@@@@@@@@@@@L
N@@@@@@@@@@@@)X? ?
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7H ?@@@@@@@@@@@@@1? ?
?J5? ?3@@@@@@@@@@@@@L ?
W.Y?
7H ?N@@@@@@@@@@@@@)X?
@@@@@@@@@@@@@@1? ?
?
?J5? 3@@@@@@@@@@@@@@L ?
?7H? N@@@@@@@@@@@@@@)X? ?
J5
7H ?@@@@@@@@@@@@@@@1?
?@@@@@@@@@@@@@@@@L ?
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However, since more expensive,


?J5? ?3@@@@@@@@@@@@@@@)X? ?
?7H? ?N@@@@@@@@@@@@@@@@1? ?
J5
7H @@@@@@@@@@@@@@@@@L
3@@@@@@@@@@@@@@@@)X? ?
?
?J5? N@@@@@@@@@@@@@@@@@1? ?
W.Y? ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@L ?
7H
?J5? ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
?3@@@@@@@@@@@@@@@@@@L? ?
?
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J5 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@1 ?
7H @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L? ?

J5
7H
?J5?
?7H?
?J5?
?7H?
J5
?W.Y
?7H?
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
?3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
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@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
high resolution media will be used,
J5 ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X ?

?7H?
J5
7H
?J5?
7H
?J5?
W.Y?
7H
?J5?
?3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
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@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
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?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
?3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
?N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
?
?
?
?
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it will also be important to verify
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?7H?
J5
7H
J5
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J5
7H
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N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
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@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?
3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@)X
N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1
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that the high resolution achieved
?J5? ?@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L? ?

W2@6X? ?O@?h7H
J5
7U?I/?@@6KO26X?W26KO2@@?g?J5?
@)K?e@?B@@YV1?7YV@@<?@?g?7H?
?I4@@?@??@@@@@?@@@@@e@?gJ5
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?7H?
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?N@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@L?f?@gS@1?@?B)KS@1?7<I'@?N@V1?7He?
during the scouting experiments at
/K?W5?@?C@@XW5?3XW@@=?@?f?W&Y @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@1?f?@f?@(Y@?@??@@(Y@?@e?@e@?@?@?e?
V4@0Y?@@0MI40Y?V40MI4@@?f?&@@@6K??O2@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@f@@@@e3@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@?f?3=?O.?3U?@?@?C@@U?@?3=O&@e@?3T5?e?
@?
@?
I4@@@@@@X?
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@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0M
3@@@@@@@@@@@@@@@@@0M
N@@@@@@@@@@@@W@0M?
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@?
@?
J@f?
@@f? ?
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laboratory scale can be maintained
?I4@@@@@6K ?@@@@@@@W@0M ?
I4@@@@@6K?g?3@@@W@@0M
?I4@@@@@6K?V@W@0M?

?@@@@@
I4@@@0M?
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also when preparative loadings are
?@e?@W26X?W26KO26T-X?W-T26T2@?/X?W. ?
?@eC@@YV1?7<I'@<B@R1?7R@YV@@H?N1?7H
?@@@@U@@@@?@e?@e@?@?@?@@@@@?e@?@?
?@eB@@XW5?3=O&@=C5?3T5?3XW@@?e3T5?
?@e?(R40Y?V40MI40Y?V+Y?V40R'?eN@H?
J@
@@
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?
?
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?
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?
applied in the final production
scale.

Selectivity during sample desorption from the column will be very important and
can be maximized by working on the shape and slope of a continuos gradient elu-
tion technique. The resolution required may not be achieved by working on the
selectivity alone, but high efficiency media with small bead size usually have to be
used in a typical polishing situation (see Fig. 65).

Selection of chromatography media


When chromatography media are to be selected for use in an industrial process
there are a number of important selection criteria to take into consideration to
assure a safe and smooth transfer from research phase to routine production.
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?O2@@0M?hI4@@6Khg ?
?O20M? I46Khf ?
?W2(M?h@?heI'6Xhe ?
O2@@@@@@@@@6K? ?7(Yhe@?he?V'1he ?
O2@@0Mh?I4@@6K? J(Y?he@?hfV'L?h ?
O20M
W2(MhW2@6X?g?I'6X? ?I46K? 7Hhf@?hf?N1?h
@?hf@? @Lh ?
?
7(Y?g?W.M?I/?hV'1? @Lhf@?hf?J@1h ?
?J(Yh?7H?hf?V'L 3)X?he@@@@@?hW&Y@h ?
?7H?h?@ N1 N@)X ?W&@@5h ?
?@he?3L?e@?he?@L? ?O2@@@@@@@@@6K ?3@)K? O&@?@Hh ?
?@L?h?V/K?C5?heJ@1? ?O2@@0M?hI4@@6K ?V'@@6K? O2@Y@@5?h ?
?@)XheV4@0Y?h?W&Y@?hf?W20M? I46X V4@@@@@6K?hO2@@@Y@@@0Y?h ?
?3@)X? W&@@5?hfW.M? I/X? I4@@@@@@@@@@@@@@@Y@@@@@0M?he ?
O2@@@@@@@@@6K? ?N@@)K ?O&@?@H?he?W.YhW2@@6Xh?V/X I4@@@@@@@?e@@@@@@@0M?hf ?
O2@@0Mh?I4@@6K? 3@@@6K ?O2@Y@@5hfW.Y?g?W.MeI/heV/X? I4@@@@@@@@@0M? ?
O20M ?I46K? V4@@@@@@6Kh?O2@@@@@@@0Yhf7Hh?7H? ?N1? I4@0M? ?
W2(M ?I'6X? I4@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0M @?h?@e?@@@hf@? ?
7(Y?h?W-XheV'1?
?J(Yhe?7R1he?V'L I4@@@@@@@?e@@@@@@@0M?
I4@@@@@@@@@0M? @?h?3L?eW@hf@L
@Lh?V/K?O&@he?J@1 ?
?
?7H?he?@?@hfN1 I4@0M? @)X?hV4@0R'heW&U@ O2@@@@@@@@@6K? ?
?@hf?@?@hf?@L? 3@)X ?W.R@5 O2@@0Mh?I4@@6K? ?
?@L?heJ@@@L?heJ@1? N@V)K? O&U?@H W20M ?I46X? ?
?@)Xh?W&<?B1?h?W&@5? ?3@@@6K? O2@R@@5? ?W.Mhe?@h?I/X ?
?3@)X?g?&@?e@?hW&@@H? ?V4@@@@@@6K?hO2@@@@@@@0Y? W.Y?he?@heV/X? ?
?N@@)K ?O&@@5 ?I4@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0M? ?W.Yhf?@he?V/X O2@@@@@@@@@6K?e ?
3@@@6K ?O2@@@(Y ?I4@@@@@@@e?@@@@@@@0M ?7H?hf?@hfN1 O2@@0Mh?I4@@@ ?
V4@@@@@@6Kh?O2@@@@@@0Y? O2@@@@@@@@@6K? ?I4@@@@@@@@@0M ?@ ?@hf?@L?hfO20M @6K? ?
I4@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0M? O2@@0Mh?I4@@6K? ?I4@0M ?@L?he/KC5hf?@1?heW2(Mg?)X?eW&g ?I'6X? ?
I4@@@@@@@?e@@@@@@@0M?
I4@@@@@@@@@0M? W20M
?W.M ?I46X?
?I/X O2@@@@@@@@@6K?
O2@@0Mh?I4@@6K?he?N@L ?31?heV40YhfJ@@?he7(Y?g?@)X?W&@g
?W&@5?h?J(Yh?@V1?7Y@g V'1? ?
W&U@H?h?7H?h?@?@?@?@g ?V'L
?
I4@0M? W.Y? V/X? O20M ?I46K?he3)X? N1 ?
?W.Yhe?@@@@@h?V/X W2(M ?I'6X?hV')K ?O&>@5he?@he?@?@?@?@g ?@L? ?
?7H?he?@ N1 7(Y?h@?e@?hV'1?h?V'@6K ?O2@R@(Yhe?@L?h?@?3T5?@g J@1? ?
?@hf?@ ?@L? ?J(Yhe@?e@?h?V'LheV'@@@@6Kh?O2@@@@@@(Y?he?@)Xh?@?V+Y?@g ?W&Y@? ?
?O2@@@@@@@@@6K ?@hf?@@@@?he?@1? ?7H?he@?e@?heN1he?V4@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0Yhf?3@)X? W&@@5? ?
?O2@@0M?hI4@@6K ?@L?he?@ J@@? ?@hf@@@@@?he?@L?hfI4@@@@@@@@@@@@@@@0M? ?N@@)K ?O&@?@H? ?
?W20M? I46X ?3)Xhe?@hf?W&@5? ?@L?he@?e@?heJ@1? I4@@@0M? 3@@@6K @@Y@@5 ?
W.M?g?@@@6XhI/X? ?N@)X?h?@hfW&U@H? ?@)Xhe@?e@?h?W&Y@? V'@@@@@@6Kh?O2@@@ @@@@(Y ?
?W.Yh?@eB1h?V/X 3@)K ?O&>@5 ?3@)X?h@?e@?hW&@@5? ?V'@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ @@@0Y? ?
W.Y?h?@eC5heV/X? O2@@@@@@@@@6K? V4@@6K ?O2@R@(Y ?N@@)K ?O&@?@H? V4@@@@@@@@@?e@@@@@@@5 @0M? ?
7Hhe?@@@@Uhe?N1?heO2@@0Mh?I4@@6K?hfI'@@@@6Kh?O2@@@@@@(Y? @@@@6K ?O2@Y@@5 ?I4@@@@@@@@@@@@@@@0Y ?
@?he?@eB1hf@LhW20M ?I46X?he?V4@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0Y ?I4@@@@@6Kh?O2@@@Y@@@0Y ?I4@@@0Mg ?
@?he?@eC5hf@1g?W.M
@Lhe?@@@0Yhe?J@@gW.Y?h@@@6X?hV/X? ?I/X I4@@@@@@@@@@@@@@@0M?
I4@@@0M? ?I4@@@@@@@@@@@@@@@Y@@@@@0M
?I4@@@@@@@e?@@@@@@@0M ?
?
3)X? W&@5f?W.Yhe@??I/Xh?V/X ?I4@@@@@@@@@0M ?
N@)X ?W&U@Hf?7H?he@?eN1heN1 ?I4@0M ?
?3@)K? O&R@5?f?@hf@?e?@he?@ O2@@@@@@@@@6K? ?
?V4@@6K? O2@@@(Y?f?@hf@?eJ5he?@L? O2@@0Mh?I4@@6K? ?
?I'@@@@6K?hO2@@@@@@0Yg?@L?he@??O.YheJ@1? O2@@@@@@@@@6K? W20M ?I46X? ?
V4@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@0Mh?3)Xhe@@@0Y?h?W&U@?hfO2@@0Mh?I4@@6K? ?W.Mh@??W2@g?I/X ?
?I4@@@@@@@@@@@@@@0M?he?N@)X? W.R@5?heW20M ?I46X? W.Y?h@?W.M?hV/X? ?
I4@@@0M? 3@)K ?O&U?@H?h?W.M ?I/X ?W.Yhe@W&Hhe?V/X ?
V'@@6K ?O2@R@@5heW.Y? V/X? ?7H?he@@@LhfN1 ?
?@@@@6X? ?V4@@@@@6Kh?O2@@@Y@@@0Yh?W.Yhe@@@@@?h?V/X
?I4@@@@@@@@@@@@@@@Y@@@@@0Mhe?7H?he@? N1hf@@@@@? ?@hf@?I/X?he?@L?
?@L?he@??N)Xhe?@1? W2@@@@he ?
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Fig. 66. Pre-selection of separation media.

112
The number of separation media on the market is quite enormous and it will not
be possible to include all different alternatives in the initial media screening. The
number of media have to be reduced to cut down time and effort spent on the
method scouting phase of process development. Only those media supporting the
issues of scaleability and suitability for the different stages in a process, listed insi-
de the filter in Figure 66, should be considered for testing.

Base matrix properties and derivitization chemistry


Base matrix properties and derivitization chemistry govern the chemical and phy-
sical stability of the chromatography media and are very closely related to the sca-
leability of the complete process. The design in of scaleability by selection of suita-
ble media will assure that the media can be packed in large scale columns without
change in performance and flow/pressure characteristics and that efficient mainte-
nance procedures can be applied to secure a long media life time. The possibility of
any toxic substances leaking from the media into the product stream is also closely
related to the properties of the base matrix and the chemistry used for coupling
spacers and ligands to the matrix.

Bead size
The particle size and the range of particle size distribution may also have an
impact on scaleability in the sense that particle size is closely related to the back-
pressure generated in the column during a chromatographic run. The optimal
bead size in any particular chromatographic step will depend on the characteris-
tics of the feed and the degree of purification required in this step. In a final polis-
hing step, for instance, there will be a need for smaller beads, i.e. high efficiency, to
accomplish separation of closely related compounds. In such a step, media with a
narrow particle size distribution will help to give a lower back-pressure at a given
bed height and flow rate compared to media with a wider particle size
distribution.

Documentation and technical support


Comprehensive documentation is required for chromatography media to be used
in industrial processes, to facilitate the work with setting up and validating the
complete process. Chromatography media used in production processes are trea-
ted as raw materials. As with any type of raw material, acceptance criteria have to
be established and every new batch of media has to be subjected to tests before it
can be brought into production.

Regulatory support
Information on possible extractable compounds and what kind of methods to use
to quantify these compounds should be provided by the vendor. Leakage data on
the most relevant extractable compounds should be available.

113
Vendor certification
Vendor certification programmes should be initiated for all vendors of critical
chemicals or materials and should certainly include the chromatography media
supplier. Such programmes should be implemented to assure a long term, reliable
supply of chromatography media of high quality and consistency.

Delivery capacity
The delivery capacity of the vendor is an important issue during the vendor certifi-
cation phase to secure timely deliveries of large quantities of media when the puri-
fication process is scaled up. The largest batch size that the vendor can provide
should be discussed and put in relation to the column size that will be used in the
final production scale. The stock situation and lead times should be discussed to
estimate the consequences for continuity in production in case of an urgent need
for a new batch of media.

Long-term contracts, based on forecasts provided by the user, should be discussed


to secure future timely deliveries. Long-term delivery guarantees should also be
discussed to assure that the same quality of chromatography media can be delive-
red during the entire life cycle of the product to be purified.

Method design and optimization


The main purpose of optimising a chromatographic step is to reach the pre-defi-
ned purity level with highest possible product recovery by choosing the most suit-
able combination of the critical chromatographic parameters. In process chroma-
tography, in contrast to analytical or small scale preparative chromatography, this
also has to be accomplished as quickly, cheaply and easily as possible. The method
must be designed carefully to be robust despite variations in feed stock and other
conditions in the production hall.

The following sections will give some guidelines for optimising the critical opera-
tional parameters which affect the maximum utilization of an ion exchange chro-
matography step to be used in a production process.

Binding conditions
Selectivity during adsorption to an ion exchanger is optimized by careful selection
of pH and ionic strength of the start buffer. A pH far away from the isoelectric
point of the molecule of interest will give stronger binding and increased capacity
but may also have a negative impact on selectivity due to increased binding of con-
taminating molecules. If retention of the molecule of interest is low at selected
start conditions, due to the pH being very close to the isoelectric point, it will start
to elute from the column during sample application (isocratic elution) when the
sample volume is increased in a preparative situation. The choice of optimal pH

114
will always be a balance between selectivity and capacity which in turn depends
on the purpose and strategic focus of any particular chromatographic step.

The buffer system should be selected to give maximum buffering power at the
least possible ionic strength to ensure high binding capacity of the molecule of
interest. To achieve this, the pKa of the buffer should ideally not be more than
0.5 pH units away from the pH being used. Generally, 10 mM of a buffer is the
minimum desirable level. Ideally, one of the buffering species should also be
uncharged, and so not contribute to the ionic strength. In large scale applications,
economic considerations often limit the choice to acetate, citrate, phosphate, or
other inexpensive components.

The pH and conductivity in the binding buffer can sometimes cause aggregation/
precipitation in the sample when it has been equilibrated to start conditions. If
aggregates are formed they may be excluded by the beads and lost in the flow
through fraction with loss of recovery as a consequence. The extent of aggrega-
tes/precipitate formation depends on the pre-column residence time, after sample
has been transferred to start conditions. This problem is often recognized as a
scale-up problem since the pre-column residence time may increase considerably
upon scale up.

Elution
Elution from ion exchangers is usually accomplished by applying a continuos or
stepwise increase of the ionic strength of the eluting buffer, thereby weakening the
electrostatic interaction between the bound molecule and the adsorbent.
Depending on the purpose and strategic focus, as previously outlined, different
desorption principles can be applied to achieve the objectives of any particular
chromatographic step in the most optimal way.
• Stepwise elution
• Gradient elution
• Isocratic elution
Stepwise elution is often preferred in large scale applications since it is technically
more simple than elution with continuos gradients. Stepwise elution will also
decrease buffer consumption, shorten cycle times and allow the molecule of inter-
est to be eluted in a more concentrated form.

Single-step elution and two-step elution can be characterized as being a ’’group


separation” technique. This type of elution is usually applied in initial chromato-
graphic steps (capture) where the purpose is to remove bulk impurities and sub-
stances differing greatly from the product. In a large scale initial chromatographic
step, using a crude feed material, media with a large bead size are favoured to
avoid problems with high back-pressure and reduced media life time due to high
viscosity and severe fouling during sample application. In such an application it
will be very difficult, unless the selectivity is extremely high, to resolve closely rela-

115
ted contaminants from the molecule of interest, even when applying very shallow
gradients. The strategy will be to resolve the ”group” of substances that the mole-
cule of interest belongs to from ”group(s)” containing the contaminating substan-
ces. This can most conveniently be achieved by eluting one ”group” at a time by
applying one or several steps with increasing eluting strength.

In later purification steps however, applying feed material that has been partly
purified and using chromatography media with higher resolving power, it will be
easier to resolve closely related substances by applying multi-step or gradient elu-
tion techniques. Resolution is maximized by working on the shape or slope of a
gradient or the eluting strength of different steps in a multi-step procedure. Such
eluting techniques can be characterized as being ”fine separation” techniques as
opposed to the ”group separation” refered to above.

In final purification steps (polishing), where the main focus will be to reach the
predefined purity of the molecule of interest, resolution is maximized by applying
shallow gradients or even isocratic elution using high resolution media with small
bead size.

When stepwise elution is applied, one has to keep in mind the danger of getting
artefact peaks when a subsequent step is administered too early after a tailing
peak. For this reason it is recommended to use continuos gradients in the initial
experiments to characterize the sample and its chromatographic behaviour.

Elution by pH gradients is not generally applied. This is because, changing the pH


by applying a pH gradient is frustrated by the buffering power of the molecules
adsorbed on the column and, in case of weak ion exchangers, the buffering of the
adsorbent groups themselves. For stepwise applications, pH elution can be quite
successful. The pH change will be delayed compared with the new buffer front
because of these titrations, but eventually the bound molecule is desorbed, coinci-
dent with a rapid pH change.

Sample load
When the selectivity parameters have been defined to achieve the most optimal
balance between resolution, capacity, speed and recovery, in ion exchange chro-
matography, as for most other adsorption techniques, there are then basically two
alternative routes to follow for optimization of sample load and flow rate to achie-
ve highest possible productivity in the system.

I. In a typical capture situation the sample will be applied to the column, non-
bound substances will be washed out from the column and the compound of inter-
est will be eluted from the column with a simple step elution procedure. The diffe-
rence in eluting strength, between the different steps will usually be large, i.e. it
will be possible to elute one group of compounds while the others are still retained
on the column. In this mode, the entire bed volume can be utilized for sample bin-

116
ding and the prime consideration when optimising for highest possible producti-
vity is to define the highest possible sample load over the shortest possible sample
application time with acceptable loss in yield.

The dynamic binding capacity for the protein of interest should be determined by
frontal analysis, i.e. by continuously applying sample on the column up to the
point where the compound of interest starts leaking off at the column outlet.
PAGE, ELISA or other appropriate techniques are used for the determination of
the break-through profile of the compound of interest.

II. In many intermediate purification steps, and always in a polishing step, the
requirements for resolution will set the limit for the amount of sample that can be
applied to the column. Sample is mainly bound in the upper part of the bed since
there will be a need for a certain bed height to achieve separation between closely
related substances moving down the column with different velocities in a shallow
gradient of elution buffer.

Maximum sample loading is defined by running a series of experiments with gra-


dually increased sample load. Optimal conditions will be the maximum sample
load that provides a resolution still high enough to meet the pre-defined purity
requirements.

Flow rate
The maximum flow rate that can be applied in any particular ion exchange chro-
matography step will differ between different parts of the chromatographic cycle.

Since low molecular weight substances show high diffusion rates, i.e. are transpor-
ted rapidly between the mobile phase and stationary phase, the flow rate during
equilibration, washing and regeneration procedures is limited primarily by the
rigidity of the chromatography media and by system constraints regarding pressu-
re specification. Larger molecules, i.e. the substances to be separated during the
chromatographic run, show a lower diffusion rate which will limit the flow rate
that can be applied during sample adsorption and desorption.

In a typical capture situation, the flow rate during sample application has to be
controlled so that the residence time in the column allows for a complete binding
without leakage in the flow through fraction. Maximum flow rate is defined by
running the frontal analysis test (break-through) refered to above at a number of
different flow rates. Optimal conditions will depend on the requirements for speed
and capacity in the system. If speed, i.e. sample application time, is critical due to
proteolysis or other detrimental effects in the feed material, a higher flow rate may
have to be used on the expense of the binding capacity in terms of amount of sam-
ple that can be applied per volume of media. If speed is not a big issue, binding
capacity can be increased on the expense of flow rate which will reduce the scale
of work in the final production process. Occasionally, high back-pressure, due to

117
the viscosity and crude nature of the feed, may set the limit for maximum flow
rate during sample application.
During elution, the flow rate will affect resolution between compounds to be
separated and also the concentration of these compounds in the product pool.
When there is a need for high concentration in the product pool, a lower flow rate
may have to be applied to minimise the volume (dilution) of the eluted
product/fractions. This is particularly important in a step preceding a gel filtration
step, where the sample volume is limiting for loading capacity.

Selecting a column
When a chromatographic step is being developed to be a part of a manufacturing
process and the time has come for scaling up, the next crucial step in ensuring a
reliable product quality and maximum production economy is the decision about
which column to use. Information on large scale columns from Amersham Biosciences
is available upon request. Different demands are put on a column for production
compared with one used for the initial laboratory scale and scale-up experiments.
Flexibility, which is needed in laboratory scale and scale-up is achieved by using a
column with a movable adaptor. In production, consistency in performance and
safety of the end product are the main concerns. Here the column packing has to
be reproducible, materials of construction have to be well characterized for leaka-
ge and the design mechanically stable.

A number of criteria have to be considered. These criteria are more dependent on


the scale of operation than on the media and are thus very similar in their impor-
tance for ion exchange, hydrophobic interaction, gel filtration and affinity chro-
matography. Their ranking and importance change when moving through a chro-
matographic process is shown in Figure 67.
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118
Aspects of column design
Flow distribution system
The most important factor in process column construction is to design the flow
distribution system to give as even a flow distribution as possible at the column
inlet and outlet. The aim is to retain HETP values of the same order as in the labo-
ratory column. This is usually achieved by a construction where the radial back-
pressure is negligible compared to the axial back-pressure at the column inlet, see
Figure 68. The simplest method is to place a coarse mesh net between the column
end piece and the finer mesh net retaining the bed, to create channels for radial
distribution. This may be combined with multiple inlet/outlet ports depending on
column diameter. Depth filters are more easily clogged due to the relatively large
filter surface. This may be a severe disadvantage in continuous operation.

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pressure in a column distribution


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system.

Material resistance and durability


Wetted components must be constructed from materials with high chemical resis-
tance against the harsh chemicals which are frequently used for cleaning-in-place
(CIP) and sanitization procedures such as 1 M NaOH, salts, acids, etc.
Stainless steel of high grades is most commonly used for very large columns.
However, stainless steel does not always have sufficient corrosion resistance when
high salt concentrations in acidic solution are used. In this case fluoroplastic coa-
ted stainless steel is recommended. Materials should be chosen to minimize leaka-
ge and be tested for toxicity.

Sanitary design
Effective cleaning and sanitizing of packed columns depends on the total column
design, including the absence of threaded fittings and the smoothness of wetted
surfaces. It is important to minimize dead volumes in the column to hinder bacte-
rial attachment and facilitate cleaning. Columns constructed from calibrated
borosilicate glass allow the use of thin O-rings in the adaptor and end piece and

119
give minimum dead volumes. Borosilicate also has a smooth and durable surface
which facilitates cleaning. Plastic columns are usually less expensive but most
plastics do not meet pharmaceutical industry demands for chemical resistance,
hygienic design and in-line cleaning. They may however be well suited for scale-up
experiments.

Pressure vessel safety


Large scale columns should be regarded as pressure vessels even if the actual work-
ing pressures usually are kept low. Large volumes of organic solvents may be
handled during cleaning which calls for explosion proof equipment. The column
design has to meet local regulations to be approved.

Regulatory support
Regulatory support for process scale columns should be available from the
column supplier to provide information on materials necessary for registration of
the process including chemical stability, toxicological tests, physical data and
column construction.

Ergonomics
For easy handling of process columns it is important that they are constructed in a
stable way and are easy to pack and clean. Large columns should preferably have
lockable wheels.

In laboratory columns, the bed height can easily be adjusted using moveable adap-
tors. In large columns, adaptors may be impractical and too heavy to handle.
Therefore, columns with fixed end pieces are selected in many applications.

Valves should be easy to reach and remove when the column is taken apart.

Packing large scale columns


Column configuration
Process columns with a moveable adaptor are essentially packed in the same way
as laboratory columns with adaptors. In essence, this means that the gel slurry is
compressed by a flowing liquid until the bed height has stabilized, at which point
the flow is stopped and the adaptor is lowered onto the gel surface and secured in
place.

Large scale columns are, however, frequently supplied with fixed end pieces. This
calls for a different packing technique. An extension tube is fitted on top of the
column as a reservoir for the gel slurry. When the bed has been packed and settled
at the join between the extension tube and the column, the extension tube is remo-
ved and the top column lid is secured in place. With this method it is important to

120
calculate the exact amount of media that is required to get the appropriate bed
height.

Packing the column


Detailed packing instructions for ion exchange media in process columns will not
be given here. Please refer to the instructions supplied with respective media and
respective column.

Scale-up
When the IEX step has been optimized at laboratory scale, the method can be sca-
led-up. Provided that scaleability has been ”designed-in” during the development
phase, scale-up to final production scale should be straightforward.
”Design-in” of scaleability has to do with how the chromatographic step has been
designed and optimized (robustness, simplicity, costs, capacity etc.) and the choice
of appropriate chromatography media (chemical stability, physical stability, bead
size, cost etc.).

Some general guidelines for scaling up are outlined in Table 23.

Table 23. Scale-up guidelines.

Maintain Increase Check system factors


Bed height Column diameter Distribution system
Linear flow rate Volumetric flow rate Wall effects
Sample concentration Sample load Extra column zone
Gradient volume/bed volume spreading

Increasing the bed volume by increasing the column diameter and increasing volu-
metric flow and sample load accordingly, will ensure the same cycle time as in the
laboratory scale method development. The column bed height, linear flow rate,
sample concentration and ratio of sample to gel, all optimized at laboratory scale,
will be kept the same. If a gradient is used for elution, the ratio of gradient volume
to bed volume will remain constant and, therefore, the time required for the gradi-
ent to develop and the effect on resolution, will remain the same on the larger
column. The same principle is applied for the volume of each step in a step elution
procedure.

Different system factors may affect performance after scale-up. If the large scale
column has a less efficient flow distribution system, or the large scale system intro-
duces large dead volumes, peak broadening may occur. This will cause extra dilu-
tion of the product fraction or even loss of resolution if the application is sensitive
to variations in efficiency (plate number) in the system used.

121
scaling up to a larger diameter column means that most of the bed support genera-
ted by the friction against the column wall is lost. This can give increased bed
compression and poorer flow/pressure characteristics.

If all the above aspects are taken into consideration, chromatographic variability
is normally not a major issue when scaling up.

Non-chromatographic factors may have a more significant effect on performance


during scaling up. These factors include: changes in sample composition and con-
centration that often occur as the fermentation scale increases, precipitation in the
feed stock due to longer holding times when large volumes are handled, non-
reproducibility of the buffer quality due to inadequate equipment for consistently
preparing large quantities of buffer solutions, and microbial growth in feed-stock
or buffers due to increased handling and longer holding times.

Figure 69 shows a 700-fold scale up of a model protein separation on SOURCE


30S going from a 2.2 ml column to a 1.57 liter column in one step.

122
Column: SOURCE 30S, a) 7.5 mm i.d. x 50 mm (2.2 ml)
b) 200 mm i.d. x 50 mm (1.57 l)
Sample: Mixture of chymotrypsinogen, cytochrome C and lysozyme
Sample load: 0.32 mg/ml bed volume
Eluent A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8
Eluent B: 20 mM sodium phosphate + 0.5 M NaCl, pH 6.8
Flow rate: 300 cm/h ; a) 2.2 ml/min b) 1.57 l/min
Gradient: 0-100% B; 20 column volumes
System: a) FPLC System
b) BioProcess Engineering System

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Fig 69. 700-fold scale up from a 2.2 ml lab-scale column to a 1.57


litre production scale FineLINE 200 column. (Work by Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)

123
12. Applications
Ion exchange has proven to be one of the major methods of fractionation of labile
biological substances. From the introduction of the technique in the 1960s´ to the
development of modern high performance media, ion exchange chromatography
has played a major role in the separation and purification of biomolecules and
contributed significantly to our understanding of biological processes. The exam-
ples given in the following section have been drawn from the published literature
as well as from work in our own laboratories.

For detailed information on specific subjects the reader is referred to the original
work.

The design of a biochemical separation


Ion exchange chromatography, in common with other separation techniques in
the life sciences, is rarely sufficient as the sole purification stage in the separation
or analysis of complex biological samples. Ion exchange is frequently combined
with other techniques which separate according to other parameters such as size
(gel filtration), hydrophobicity (hydrophobic interaction chromatography or
RPC) or biological activity (affinity chromatography).

Popularity of fractionation techniques


90

80
Homogenization
70

60

50
Precipitation GF
40 IEX

30 AC

20

10
Fig. 70. Frequency of use
of fractionation techniqu-
1 2 3 4 5 6 7 es (1). (Reproduced by
Stage in purification scheme kind permission of the
authors and publisher.)

Not only is the choice of techniques important. The order in which they are
employed will also play a role in determining the speed, the convenience and the
overall yield for the purification.

124
Sample loading, sample dilution and impurity contamination are usually maximal
at the beginning of a separation scheme. At this stage the high capacity, high selec-
tivity and concentrating effect of ion exchange makes the technique ideal.

This suitability is reflected in Figure 70 which shows the frequency of use of diffe-
rent fractionation techniques in published protein purification schemes (1).

The use of multi-dimensional chromatography with ion exchange as a first step is


well illustrated by the separation of monoclonal IgG2b from cell culture medium
(Fig. 71). An initial purification and concentration of the antibody from 500 ml
cell culture medium by cation exchange chromatography on SP Sepharose High
Performance was followed by a second fractionation by gel filtration using
Superdex 200 prep grade.
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Lane 1 and 5: Marker proteins HMW kit


Lane 2: Starting material (crude cell culture medium)
Lane 3: Pooled material after cation exchange chromatography
Lane 4: Pooled material after gel filtration

Native electrophoresis using PhastSystem with PhastGel 8-25 and


silver staining

1 2 3 4 5

Fig. 71. Purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.

The sample composition with regards to ionic strength and pH should be taken
into consideration when designing the separation scheme. In ion exchange chro-

125
matography solutes bind to the gel at low ionic strength and are eluted from the
column at a higher ionic strength. The converse situation occurs in hydrophobic
interaction chromatography. Thus if these two techniques are to be used in a sepa-
ration scheme it is logical to have them adjacent to each other. This principle is
illustrated in Figure 72 which shows the purification of human a2-macroglobulin
from Cohn Fraction III.

After initial purification by affinity chromatography on Blue Sepharose CL-6B to


remove albumin, the sample was applied to a Q Sepharose High Performance
column and eluted with an increasing salt concentration gradient. Relevant frac-
tions were then pooled and a2-macroglobulin was purified to homogeneity by
hydrophobic interaction chromatography on a Phenyl Sepharose High
Performance column.
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Lane M: Marker proteins HMW-kit


Lane 1: Cohn fraction III, 5% in 20 mM bis-Tris propane and 35 mM
sodium sulphate
Lane 2: Flow-through fraction from Blue Sepharose CL-6B.
6.5 mg protein.
Lane 3: Pooled fractions from Q Sepharose High Performance.
2.4 mg protein.
Lane 4: Purified a2-M from Phenyl Sepharose High Performance.
80 µg protein.
Lane 5: 3 incubated 2 hours with 200 mM methylamine, pH 8.0
M 1 2 3 4 5 Native PAGE using PhastSystem with PhastGel 4-15 and silver staining.

Fig. 72. Purification of human a2-macroglobulin. (Work by Amersham Biosciences,


Uppsala, Sweden.)

126
Towards the end of a separation scheme the complexity and the volume of sample
to be handled is smaller, but in most cases the need for higher resolution is increa-
sed. Ion exchange chromatography, particularly with MonoBeads, SOURCE, or
Sepharose High Performance media can also be used at this stage (Fig. 73).
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Fig. 73. Use of ion exchange in the final purification of cellulase. (Work by Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Application examples
Ion exchange chromatography has been used successfully to separate all classes of
charged biological molecules. The following are some representative examples.

Enzymes
In the purification of biologically active proteins such as enzymes the recovery of
biological activity is usually as important as the recovery of protein mass or degree
of homogeneity. Ion exchange chromatography has played a role in the purifica-
tion of thousands of enzymes, and using modern matrices with optimized separa-
tion conditions gives extremely high recoveries. This is exemplified by the separa-
tion of enzymes from chicken breast muscle on Mono Q (Fig. 74). The recovery of
creatine kinase in this separation was 89%.

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Fig. 74. Separation of creatine kinase from a partially purified preparation of chicken bre-
ast muscle on Mono Q. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Isoenzymes
Normally the isoforms of an enzyme have approximately the same molecular
weight. This makes their separation impossible by gel filtration. However, the
small differences in charge properties resulting from altered amino acid composi-
tion enable the separation of isoenzymes using ion exchange chromatography.

N-Acetyl b-D-glucosaminidases have been


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widely investigated in the diagnosis of hae-


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common acute lymphoblastic leukaemia,


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1 Form” has been reported (29). Using high


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resolution ion exchange chromatography


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(Fig. 75) this previously “single” peak has


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been resolved into a number of component


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detectable using isoelectric focusing.


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@?he@?f@?@@L?fW.Y?@??@g?@e@? ??

Fig. 75. Separation of Leukaemic cell N-Acetyl


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@?he@?fN@e3=O20Ye?J5??@g?@e@? ??
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@?he@?fW.Y??N1?f?@e?3L?f?@e@? ???

b-D-glucosaminidase isoenzymes by anion


@?he@?e?W.Yf@?f?@e?N1?f?@e@?
@?he@?eO.Y?f@?f?@f@?f?@e3Le@?@?@?
@?he@?W20Yg3Lf?@f@?f?@eN1e@?3T5?e'6X?
@?he@W.MhN1f?@f@?f?@e?@e@?N@H?eS@1? ??
@?h?J@(Y?h?@f?@f@?f?@e?@e@?J@L??@(Y@?
@?hW&(Yhe?@f?@f@?f?@e?@e@W&R)X?3U?@? ??
@?h7(Y?he?@f?@f@?f?@e?@e@@@?@)?V4@@?
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@?g?7@? @?e?@f@?f?@e?@
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exchange chromatography on Mono Q. NA-Glu


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@?g@?@? ?N1??@f?@f@?e?@e?@@L
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@?g@?@? @??@f?@f@?e?@e7H?@ ??

activities associated with distinct peaks (Ia-IXa)


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@?f@?e@? N1e@?f@He?3L? ?

are indicated in relation to the NaCl gradients


@?f@?e@?
@?f@??J@? ?3L?@?f@?e?N1?
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@??@g@?e?@M? ?3=?
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3=C5g@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@?
V40Y @? ?@ ?@ @? ??
@? ?@ ?@ @? ??

(29). (Reproduced by kind permission of the


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W&?W26X?heW26KO26Xhf?@6KO26XhfW&?W26X?h?@K? ??
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??
authors and publisher.)

128
Immunoglobulins
Ion exchange is frequently used for the purification of immunoglobulins. Figure
71 shows the purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant.
As illustrated in Figure 76 the technique can also be applied to the purification of
monoclonal immunoglobulin from ascites fluid.

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Fig. 76. Ion exchange purification of mouse monoclonal IgG1 from ascites fluid. (Reprodu-
ced by kind permission of Dr. LeRoy Baker, Eli Research Laboratories, Eli Lilly and Com-
pany, Indianapolis, USA.)

Nucleic acid separation


Nucleic acids, being charged molecules, can also be fractionated and purified
using ion exchange chromatography. A recent application of the technique in this
area is the purification of plasmids from bacterial cultures. This process is traditio-
nally done by centrifugation using CsCl gradients. Figure 77 shows the separation
of plasmid HB101 (pBR322) by anion exchange chromatography on Q Sepharose
High Performance. Subsequent analysis showed the electrophoretic purity of the
plasmid to be equivalent to that obtained by centrifugation, as was its behaviour
in ligation and transformation assays. The time, however, required for the prepa-
ration was 1 hour using the chromatographic method and approximately 8 hours
using centrifugation.

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Fig. 77. Ion exchange purification of plasmid DNA. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden.)

Polypeptides and polynucleotides


Ion exchange chromatography is not limited in its application to macromolecules
such as proteins and nucleic acids. The technique can be used in the separation
ofpeptides as illustrated by the separation of cyanogen bromide fragments of col-
lagen (Fig. 78).
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Fig. 78. Separation of CNBr-peptides from a-1 chains of collagen type 1. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

130
In peptide mapping applications ion exchange chromatography can be used
advantageously as a complement to reverse phase chromatography since both
offer high resolution but separate according to different parameters (30).
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Fig. 79. Ion exchange separation of DNA restriction fragments form pBR322 cleaved by
HaeIII (31). (Reproduced by kind permission of the authors and publishers.)

Analogously, ion exchange can be used to separate oligonucleotides such as


restriction fragments of DNA (31) (Fig. 79) and even individual nucleotides (32,
33, 34) (Fig. 80).
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Fig. 80. Ion exchange separation of nucleotides. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden.)

131
Antisense phosphorothioate oligonucleotides
Phosphorothioate analogs of DNA have been identified as promising candidates
for oligonucleotide therapy, a major advantage being their in-vivo resistance to
degradation by nucleases.

Technology for automated gram-scale synthesis of phosphorothioate DNA oligo-


mers has developed rapidly in recent years. In contrast, the large scale purification
technology for therapeutic or diagnostic oligonucleotides has received little atten-
tion, and has largely been based on scaling up methods suitable for analysis or
research.

In this application example, a novel method* for purifying synthetic phospho-


thioate oligonucleotides in large scale using SOURCE 30Q is shown. The method
includes adsorption of trityl-on oligonucleotide on SOURCE 30Q, washing with
10 mM NaOH and 2 M sodium chloride to remove non-tritylated failure sequen-
ces, on-column cleavage of the trityl groups using 0.4% trifluoroacetic acid, was-
hing with 10 mM NaOH and eluting the oligonucleotide with a sodium chloride
gradient to further purify it from shorter sequences. After elution, SOURCE 30Q
is regenerated with 30% isopropanol in 2 M sodium chloride to wash away the
adsorbed trityl-groups.

A 25-mer phosphorothioate oligonucleotide produced on OligoPilot II DNA/RNA


Synthesizer was purified with this method. A 25% ammonia solution containing
the crude oligonucleotide mixture obtained after synthesis was applied directly
onto a 0.8 liter SOURCE 30Q column. The chromatogram from the gradient elu-
tion is shown in Figure 81. Analysis of the pool revealed a yield of 1.56 g product
with a purity of 97% as determined by capillary electrophoresis, see Fig 82. The
overall recovery was approximately 70%. The complete process (cleavage and
purification) took less then three hours.
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Fig. 81. Preparative purifica-


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Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden.)
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*patent pending

132
Samples: All samples were desalted on NAP 10 Columns
a) Pool
b) Fraction 4
c) Fraction 10
Capillary: µPAGE (5% T, 5% C), capillary length: 40 cm (J&W Scientific, FISON)
Buffer: Tri-borate and urea buffer (J&W Scientific, FISON)
Running conditions: 8 kV, 10 s (sample) 16 kV, 30 min (run)
Data collection: FPLCdirector

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Fig. 82. Capillary electrophoresis of the pool and side fractions from the preparative puri-
fication of 25-mer phosphorothioate oligonucleotide shown in Fig. 81. (Work by
Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden.)

Areas of application
In the preceding chapters the examples which have been used to illustrate the
principles and practice of ion exchange chromatography have mostly been based
on analytical and preparative applications from the research laboratory.

Ion exchange chromatography also has many important applications in the field
of industrial and pilot scale preparations. Many blood products such as albumin
and IgG (35) as well as the products of recombinant DNA technology, such as
growth factors and pharmaceutically important enzymes (Fig. 83), are purified
using this technique.

An example of a pilot scale purification of a recombinant protein using ion


exchange chromatography is given at the end of this chapter. For further informa-
tion on the application of ion exchange chromatography at pilot and process sca-
les the reader is advised to contact Amersham Biosciences.

Analytical applications of ion exchange chromatography are to be found in diver-


se areas such as quality control of purified products or process monitoring in bio-
technology. Figure 84 shows the use of cation exchange in monitoring a fermenta-
tion process for the production of ß-galactosidase.

133
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chromatography on Q Sepharose Fast Flow. (Work by Amersham Biosciences, Uppsala,
Sweden.

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Fig. 84. Monitoring the production


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of b-galactosidase (36).

134
Other areas of application include food research where FPLC ion exchange can be
used in the study of wheat varietals (Fig. 85) and in clinical research where ion
exchange chromatography has been used in studies such as the relationship bet-
ween post-partum depression and b-endorphin secretion (Fig. 86) and the correla-
tion of proteinuria with different renal conditions (Fig. 87).

A chromatogram of the urine from patients exhibiting tubular proteinuria, due to


acute pyelonephritis, severe burns or renal transplants, shows distinct peaks cor-
responding to b2-microglobulin, retinol binding protein and a1-acid glycoprotein.
The disappearance of these peaks could be correlated with the reversal of their
causal lesion (39).
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Fig. 85. Protein profiles of wheat varietal gliadins (37).

Absorbance, b-endorphin immunoreactivity


,
Proportion of buf
fer B ( ) 280 nm MM ( ) pg/tube
1 23 1 23 Sample. 2 ml plasma from pregnant
A B woman in labour
1.0 10 100
Column: Mono S HR 5/5
0.9 9 90 Flow rate: 1.2 ml/min
0.8 8 80 Buffer A. 0.05 M NH4 Ac, pH 5.5,
70 20% acetonitrile
0.7 7 Buffer B. 0.05 M NH4 Ac, pH 5.5,
0.6 6 60 20% acetonitrile
50 Gradient: 2 min 0% B,
0.5 5
0-100% in 17 min
0.4 4 40 Detection: 280 nm and RIA
0.3 3 30 Fraction size: 0.6 ml

0.2 2 20
0.1 1 10

1 10 20 30 40 50 Fraction No. 1 10 20 30 40 50 Fraction No.

Cation exchange FPLC of a 2-ml plasma sample collected from a pregnant woman in labour . A. The elution pattern ( ) of
UV-absorbing material and the concentration of buf fer B (---). B. Elution ofb-endorphin immunoreactivity: the position of
[ ] b-endorphin (2) andb-lipotropin are shown by the vertical lines.
elution of referenceb-endorphin in (1). 125

Fig. 86. Cation exchange of chromatography by plasma b-endorphin (38).

135
A280nm b2 m ALB
Sample: 0.5 ml desalted urine
Column: Mono Q HR 5/5
Flow rate: 2 ml/min
Buffer A: 6.25 mM Bis-Tris propane, pH 7.5
Buffer B: BufferA + 0.35 M NaCl, pH 9.5
RBP Gradient: 0-100% in 25 ml
+
TSF Detection: 280 nm, 0.05AUFS
AGP
+
a1m

0 10 20 30 Vol (ml)
Urine protein chromatogram from a renal-transplant patient, illustrating the
distinct peaks of the low MW proteins.
The retinal-binding proteins (RBP) is Fig. 87. Anion
contaminated with a small amount of transferrin (TSF). exchange of urine in
b2m = b2 -microglobulin,AGP =a1-acid glycoprotein,a1m = a1 -microglobulin,
ALB = albumin. Diagonal line illustrates gradient from ferA
buf to buffer B.
renal proteinuria
(39).

Purification of a recombinant
Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, PE553D
This application shows a purification process for a genetically modified recombi-
nant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (MW 55 000) expressed in the peri-
plasm of E. coli. The process was developed for large scale production of modifi-
ed toxin, conjugation to a polysaccharide and use as a vaccine. The purification
strategy used chromatography media differentiated to tackle the problems of cap-
ture, intermediate purification and polishing (for further information please refer
to Chapter 11.)
The result was a highly purified exotoxin A from crude cell homogenate using
only four chromatography steps, and taking less than half the time of a more con-
ventional approach.

Exotoxin A was captured directly from unclarified E. coli homogenate by expan-


ded bed adsorption using STREAMLINE DEAE adsorbent in a STREAMLINE
200 column (Fig. 88). The following intermediate purification step was hydro-
phobic interaction chromatography (HIC) on Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high
sub) packed in a BPG 200 column (Fig. 89). This step removed a substantial part
of the UV absorbing material (including nucleic acids) that could interfere with
the following steps. The second intermediate purification step on SOURCE 30Q,
packed in FineLINE 100 column, removed the majority of the remaining conta-
minants (Fig. 90). The polishing step was HIC on SOURCE 15PHE (Fig 91). The
process resulted in a pure protein, according to PAGE and RPC analysis (Fig 92
and 93), and the overall recovery was 51 % (Table 24).

136
Column: STREAMLINE 200 (i.d. 200 mm)
Medium: STREAMLINE DEAE, 4.7 l
Sample: 4.7 kg of cells were subjected to osmotic shock and suspended
in a final volume of 180 litres 50 mM Tris buffer, pH 7.4 before
application onto the expanded bed.
Buffer A: 50 mM Tris buffer, pH 7.4
Buffer B: 50 mM Tris, 0.5 M sodium chloride, pH 7.4
Flow rate: 400 cm/h during sample application and wash
100 cm/during elution
System: BioProcess Modular
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Fig. 88. Capture by expan-


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ded bed adsorption on


STREAMLINE DEAE.

Column: BPG 200/500 (i.d. 200 mm)


Medium: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub), 4.7 L (150 mm bed height)
Sample: 4.5 L of the previous pool were adjusted to 0.6 M ammonium
sulphate and applied onto the column
A: 50 mM phosphate, 0.7 M ammonium sulphate, pH 7.4
B: 20 mM phosphate, pH 7.4
C: Distilled water
Flow rate: 120 cm/h
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Fig. 89. Intermediate purifi-


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Flow (high sub).


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137
Column: FineLINE 100 (i.d. 100 mm)
Medium: SOURCE 30Q, 375 ml (50 mm bed height)
Sample: from the previous pool, diluted 1 to 3 with distilled water
1.5 l/cycle were applied
Buffer A: 20 mM phosphate, pH 7.4
Buffer B: Buffer A + 1.0 sodium chloride
Gradient: 0 to 50% B, 20 column volumes
Flow rate: 600 cm/h

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Fig. 90. Intermediate purifica-
tion by ion exchange chroma-
tography on SOURCE 30Q.

Column: 35 mm i.d.
Medium: SOURCE 15 HPE
Sample: from the previous step, adjusted to 1.0 M ammonium sulphate,
0.5 l/cycle was applied
Buffer A: 1.0 M ammonium sulphate, 50 mM phosphate, pH 7.4
Buffer B: 50 mM phosphate
Gradient: 0-45%B, 15 column volumes
Flow rate: 200 cm/h

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V40R+R40MI40Y?
Fig. 91. Polishing by hydro-
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?@e@@?@?@?V40Y?3T5?@?@?@@?@?J5
?@e@@V@R1?*@@(?@?@V@R1?@@V1e@
V+Y?h?.Y phobic interaction chromato-
graphy on SOURCE 15PHE.

138
a
Lane 1 LMW markers
Lane 2 pool from
SOURCE 15 PHE
Lane 3 pool from
SOURCE 30Q
Lane 4 pool from
Phenyl Sepharose 6
Fast Flow (high sub)
Lane 5 LMW markers

1 2 3 4 5

1 2 3
Lane 1 pool from Phenyl Sepharose 6
Fast Flow (high sub)
Lane 2 pool from SOURCE 30Q
Lane 3 pool from SOURCE 15PHE

Fig. 92. a) SDS-PAGE on PhastGel Gradient 8-25


b) Native PAGE on PhastGel Gradient 8-25

Table 24

Purification step Volume, litre Total protein, gram Exotoxin A, gram* Step recovery*
Bacterial extract 180 351 10.8
STREAMLINE
DEAE 13.5 140 8.54 79
Phenyl Sepharose 6
Fast Flow (high sub) 11.4 41 6.60 77
SOURCE 30Q 30.2 12.6 6.04 91
SOURCE 15PHE 12.2 n.d. 5.5 91

*Activity was determined with a radial immunodiffusuin assay using Goat anti-exotoxin A antibodies
(List, USA).

139
?W-X?
Column: µRPC C2/C18, SC 2.1/10
?7R1?
?@?@?
J@@@L
7<?B1*?@@@1?7R@@6T26T-X
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S@>@T5?3T@@V@@V@R1
Sample: a) pool from Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)
b) Pool from SOURCE 30Q
c) Pool from SOURCE 15 PHE
W26Xe?W2@6T26X?
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@??@e?@@6X@e@?
@??@f?B@@e@?
3=C5e?/KC@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y? a) Sample load:
A:
50µL
0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in water
B: 0.1% TFA in acetonitrile
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7<B1e?W&@?7<B1?
@??@e?7Y@?@e@?
@??@e?@@@@@e@?
Gradient: 25-75% B over 47 minutes
3=C5f?@V'=C5?
V40Y?@e?@?V40Y?
Flow rate: 150 µL/min
System: SMART System
W26Xe?W26KO26X?
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3=C5e?/KS@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?

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3=C5f?@?3=C5?
V40Y?@e?@?V40Y?

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3=C5e?3=C@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?

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3=C5 7Yf?3=C5 @He?3=C5 3=C5e?3=C5 *US,e?3=C5
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V40Y?@?V40MI40Y?
b)

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V40Y?@?@@@0R40Y?

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V40Y?@e?@?V40Y?

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3=C5e?3=C@@=C5?
V40Y?@?V40MI40Y?

W26Xe?W26X W26Xe?W26X ?W&?e?W26X W2@@e?W26X W26Xe?W26X @?e@ @? ?@h@?e@?


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3=C5e?3=C5 7Yf?3=C5 @He?3=C5 3=C5e?3=C5 *US,e?3=C5 ?3T5?
V40Y?@?V40Y? @@@@?@?V40Y? @??@?V40Y? V40Y?@?V40Y? V40Y?@?V40Y? ?V+Y??3=C@@?3=?@?@?@?@?3X?f@??@?@?@e@?e?@
V40R'?V4@@?@?@?@?V4@@?e3L?@?@?@e@@@6T5
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V40Y?@e?@?V40Y?

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V40Y?@?V40MI40Y?
c)

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V40Y?@?V40MI40Y?

W26Xe?W26X W26Xe?W26X ?W&?e?W26X W2@@e?W26X W26Xe?W26X @?e@ @? ?@h@?e@?


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?? N1he?B@H
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Fig. 93. Reversed phase chromatography analysis of pools obtained after the purification
steps.

140
Strategy
The starting point for developing the purification strategy was experience from a
successful downstream process for purification of another modified Pseudomonas
aeruginosa exotoxin, LysPE38 (Fig. 94). Refinements included reducing the num-
ber of steps by the introduction of STREAMLINE DEAE for capture, and achie-
ving high flow rates through the use of high performance SOURCE media for late
intermediate purification and polishing.

Fig. 94. Comparison of the two purification schemes.

141
This approach of using media designed for different stages in a downstream pro-
cess speeded up process development and shortened the production schedule.
Comparison with the earlier process for purification of a similar exotoxin demon-
strates the dramatic savings in time achieved.

Interestingly, the use of ion exchange at more than one stage is a common charac-
teristic of large-scale processes. Note that the role and mode of use of the ion
exchanger is very different in the different stages. In the example shown, the
anion exchanger, STREAMLINE DEAE, is used for expanded bed adsorption of
the product from the crude, unfiltered E. coli lysate. STREAMLINE is optimised
to handle such crude feedstocks. Particles, the bulk of the impurities and much of
the water are removed in a group separation. Sample application conditions are
optimised to achieve maximum selectivity during capture of the product and the
stepwise elution conditions achieve maximum concentration during elution.

Later in the process, anion exchange is again used, but this time to remove pro-
teins which have very similar characteristics to the product. This time SOURCE
30Q is used with gradient elution. The uniform, small diameter particles help to
achieve good resolution with excellent flow rates and low back-pressures. The
linear salt gradient further improves resolution. Note also that a different pH has
been chosen to increases the binding strength of the product and further improve
the resolution during elution.

In other examples ion exchange can be used repeatedly in the same process under
even more divergent conditions, in one step to bind only impurities and allow the
product to pass through and later to bind the product. Furthermore, anion and
cation exchange can be combined in the same scheme or pH and salt gradient elu-
tion can be alternated to achieve removal of different impurities. All of this is an
indication of why ion exchange is such a useful technique in industrial purifica-
tion.

142
13. Fault finding chart
Problem Cause Remedy
Column is clogged. Presence of lipoproteins Prior to chromatography,
or protein aggregates. precipitate with 10%
Dextran Sulphate or 3%
polyvinylpyrrolidone.

Precipitation of proteins Modify the eluent to


in the column caused by maintain stability.
removal of stabilizing
agents during
fractionation.

Filter is clogged. Replace the filter. Always


filter samples and buffer
before use.

Microbial growth Microbial growth rarely


has occurred in the occurs in columns during
column. use, but steps should
always be taken to prevent
infection of packed
columns, buffers and gel
suspensions. Store gel in
the presence of 20%
ethanol or an antimicrobial
agent, see page 103.

No flow through Outlet closed. Open outlet.


the column

No flow from pump. With peristaltic pumps


check the condition of the
tubings. Check for leaks at
all connections.

Clogged end-piece or Remove and clean,


adaptor or tubing. if possible.

Reduced or poor Bed surface blocked Clean using recommended


flow through the by precipitated methods.
column. proteins.

143
Problem Cause Remedy
Reduced or poor Bed compressed. Repacking the column may
flow through the be necessary.*
column.

Microbial growth. Microbial growth rarely


occurs in columns during
use, but steps should
always be taken to prevent
infection of packed
columns, buffers and gel
suspensions. Store gel in
the presence of 20%
ethanol or an antimicrobial
agent, see page 103.

Fines. Do not use a magnetic stirrer; it


can break the beads.

Back pressure Turbid sample has been Improve sample solubility


increases during a applied to the column. by the addition of
run or during monoethylene glycol,
successive runs. detergents or organic
solvents.

Clogged column filter. Prefilter buffers and


samples. Change filter.

Precipitation of protein Clean the column and


in the column filter and/ exchange or clean the
or at the top of the gel bed. filter.

Change pH and/or add urea.


Develop a procedure with deter-
gents.

Additives which were used


for initial sample solubilization
should be included in the solu-
tions used for chromatography.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.

144
Problem Cause Remedy
Back-pressure Precipitation of Lipoproteins may be
increases during a lipoproteins at increased precipitated prior to
run or during ionic strength. chromatography by the
successive runs. addition of 10% dextran sul-
phate and1 M calcium chloride
to final concentrations of
0.2% and 0.5 M respectively.

The protein does Incorrect buffer pH. Use a buffer pH closer


not elute in the to the pI of the protein.
salt gradient.

Ionic strength too low. Use a more concentrated


limit buffer.

The protein does Solutions have wrong pH. Calibrate your pH meter,
not elute. prepare new solutions and
try again.

Protein elutes in Ionic strength of start Decrease ionic strength


the wash phase. buffer is too high. of start buffer.

The ionic strength of the Buffer exchange on sample.


sample is too high or the
pH is wrong.

The column is not Repeat or prolong the


properly equilibrated. equilibration step.

Ionic detergents or other Clean the column.


additives are adsorbed to
the column.

The resolution The gradient slope Use a shallower gradient


obtained is less is too steep. or a plateau in the gradient.
than expected.

Microbial growth has See above.


occurred in the column.

Flow rate is too high. Run the separation at a


lower flow rate.

145
Problem Cause Remedy
The resolution Proteins or lipids have Clean and regenerate the
obtained is less precipitated on the column.
than expected. column.

Improper filtration of Regenerate the column,


the sample before filter the sample and repeat
application to the the chromatography step.
column.

Aggregate formation of Use urea or zwitterions,


proteins in sample and betaine up to 10% or
strong binding to gel. taurine up to 4%.

Column is poorly packed. Check the packing by running a


coloured compound and obser-
ving the band. Repack the
column if necessary.*

Too much sample mass Decrease the sample load.


has been loaded onto
the column.

The column is dirty. Clean and regenerate the


column.

Detector cell volume is Change the flow cell.


too big.

Large mixing spaces in Reduce all post column


or after column. volumes.

Leading or very Overloaded column. Decrease the sample load


rounded peaks and repeat the run.
observed in the
chromatogram.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.

146
Problem Cause Remedy
Leading or very Column is poorly packed. Check the packing by
rounded peaks running a coloured
observed in the compound and observing
chromatogram. the band. Repack the
column if necessary.*

Column needs Clean and regenerate the


regeneration. column. If this does not help
replace with a new one.

Tailing of the peak Sample too viscous. Reduce the amount


is observed in the of protein.
chromatogram.

Precipitation of protein Remove nucleic acids.


in the column filter and/ Clean the column and
or at the top of the gel bed. exchange or clean the
filter.

Previous elution Incorrect buffer pH Prepare new solutions.


profile cannot be and ionic strength.
reproduced.

The sample has altered Prepare fresh sample.


during storage.

Proteins or lipids have Clean and regenerate the


precipitated on the column.
column.

Sample has not been Regenerate the column,


filtered properly. filter the sample carefully
and repeat this step.

Incomplete equilibration. Equlibrate until


conductivity is constant.

Previous elution Aggregate formation of Use urea or zwitterions,


profile cannot be proteins in sample and betaine up to 10% or
reproduced. strong binding to gel. taurine up to 4%.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.

147
Problem Cause Remedy
Low recovery of Sample substance may Determine the pH and
activity while not be stable in the salt stability of the protein.
normal recovery elution buffers and is
of protein. therefore inactivated.

Enzyme separated from Test by pooling fractions


co-factor or similar. and repeating the assay.

Microbial growth. Microbial growth rarely


occurs in columns during use,
but steps should always be taken
to prevent infection of packed
columns, buffers and gel
suspensions. Store gel in the pre-
sence of 20% ethanol or an anti-
microbial agent, see page 103.

Protein amount in The protein may have Add protease inhibitors


the eluted fractions been degraded by to the buffers to prevent
is much less than proteases. proteolytic digestion.
expected.

Adsorbtion to filter Use another type of


during sample filter or use detergents.
preparation.

Microbial growth has Microbial growth rarely occurs


occurred in the column. in columns during use, but steps
should always be taken to pre-
vent infection of packed
columns, buffers and gel suspen-
sions. Store gel in the presence
of 20% ethanol or an anti-
microbial agent, see page 103.

Protein amount in Non-specific adsorption. Try adding ethylene glycol


the eluted fractions (e.g. 10%) to the buffers to
is much less than prevent any hydrophobic
expected. interactions.

Sample precipitates. May be caused by removal


of salts or sample dilution.

Hydrophobic proteins. Chaotropic salts may be


used for elution.

148
Problem Cause Remedy
More activity is Different assay Use the same assay
recovered than conditions have been conditions for all the assays
was applied to used before and after the in your purification
the column chromatographic step. scheme.

Removal of inhibitors Replace if necessary.


during separation.

Peaks too small. Wrong sensitivity range Adjust.


on detector.

Sample absorbs poorly Use a different wavelength.


at the chosen wavelength.

Recorder range Adjust.


incorrectly set.

Excessive zone Check the column packing


broadening and re-pack if necessary.

Bubbles in the bed. Column packed or stored Small bubbles can often be
at cool temperature and removed by passing well
then warmed up. de-gassed buffer upwards
through the column. Column
may need to be re-packed. Take
special care if buffers are used
after storage in a fridge or cold-
room. Do not allow column
to warm up due to sunshine
or heating system. A water-
jacket is a good safeguard.
Use de-gassed buffers.

Eluent not properly De-gas the eluent


de-gassed. thoroughly.

Cracks in the bed. Large air leak in column. Check all connections for
leaks. Repack the column*.

Distorted bands as Air bubble at the top Re-install the adaptor


sample runs into of the column or taking care to avoid
the bed. in the inlet adaptor. air bubbles.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilot
columns.

149
Problem Cause Remedy
Distorted bands Particles in eluent or Filter or centrifuge the
as sample runs sample. sample. Protect eluents
into the bed. from dust.

Clogged or damaged net Dismantle the adaptor, clean


in upper adaptor. or replace the net. Keep particles
out of samples and eluents.

Distorted bands as Column poorly packed. Gel suspension too thick or


sample passes too thin. Bed packed at a
down the bed. temperature different from
run. Bed insufficiently packed
(too low packing pressure, too
short equilibration). Column
packed at too high pressure.

Negative peaks at Refractive index effects. Buffer exchange the sample


solvent front. to start buffer.

Strange peaks in Buffer impurities. Clean the buffer by running it


chromatogram. through precolumn. Use high
quality reagents.

Peaks on blank Incomplete elution. Wash the column according


gradients. to recommended method.

Spikes in Air bubble trapped Use de-gassed solutions.


chromatogram. in UV cell.

UV baseline rises Salt concentration, Work well below or above


with gradient. micelle formation. the CMC or change the
gradient so that the increase in
UV absorption does not occur
while the samples are eluting.

Impurities in buffers. Use high quality reagents.

150
14. Ordering information
Product Quantity/Pack Size Code No.

MonoBeads
Mono Q, PC 1.6/5 1 17-0671-01
Mono Q HR 5/5 1 17-0546-01
Mono Q HR 10/10 1 17-0556-01
Mono Q HR 16/10 1 17-0506-01
Mono Q 35/100 1 17-1001-01
Mono Q 60/100 1 17-1002-01
Mono S, PC 1.6/5 1 17-0672-01
Mono S HR 5/5 1 17-0547-01
Mono S HR 10/10 1 17-0557-01
Mono S HR 16/10 1 17-0507-01
Mono S 35/100 17-1021-01
Mono S 60/100 1 17-1022-01

MiniBeads
Mini Q, PC 1.6/5 1 17-0671-01
Mini S, PC 1.6/5 1 17-0671-01
Precision Column Holder 1 17-1455-01

SOURCE Q
RESOURCE Q 1 ml 1 17-1177-01
RESOURCE Q 6 ml 1 17-1179-01
SOURCE 15Q 10 ml 17-0947-20
SOURCE 15Q 50 ml 17-0947-01
SOURCE 15Q 200 ml 17-0947-05
SOURCE 15Q 500 ml 17-0947-02
SOURCE 15Q 1l 17-0947-03
SOURCE 30Q 10 ml 17-1275-10
SOURCE 30Q 50 ml 17-1275-01
SOURCE 30Q 200 ml 17-1275-02
SOURCE 30Q 500 ml 17-1275-03
SOURCE 30Q 1l 17-1275-04

SOURCE S
RESOURCE S 1 ml 1 17-1178-01
RESOURCE S 6 ml 1 17-1180-01
SOURCE 15S 10 ml 17-0944-10
SOURCE 15S 50 ml 17-0944-01
SOURCE 15S 200 ml 17-0944-05
SOURCE 15S 500 ml 17-0944-02
SOURCE 15S 1l 17-0944-03
SOURCE 30S 10 ml 17-1273-20
SOURCE 30S 50 ml 17-1273-01
SOURCE 30S 200 ml 17-1273-02
SOURCE 30S 500 ml 17-1273-03
SOURCE 30S 1l 17-1273-04

151
Product Quantity/Pack Size Code No.

Q Sepharose High Performance


HiTrap Q 5 x 1 ml 17-1153-01
HiTrap Q 5 x 5 ml 17-1154-01
HiLoad 16/10 Q Sepharose HP 1 17-1064-01
HiLoad 26/10 Q Sepharose HP 1 17-1066-01
BioPilot Column Q Sepharose HP 35/100 1 17-1011-21
BioPilot Column Q Sepharose HP 60/100 1 17-1012-21
Q Sepharose High Performance 75 ml 17-1014-01
Q Sepharose High Performance 1l 17-1014-03
Q Sepharose High Performance 5l 17-1014-05

SP Sepharose High Performance


HiTrap SP 5 x 1 ml 17-1151-01
HiTrap SP 5 x 5 ml 17-1152-01
HiLoad 16/10 SP Sepharose HP 1 17-1137-01
HiLoad 26/10 SP Sepharose HP 1 17-1138-01
BioPilot Column SP Sepharose HP 35/100 1 17-1031-21
BioPilot Column SP Sepharose HP 60/100 1 17-1032-21
SP Sepharose High Performance 75 ml 17-1087-01
SP Sepharose High Performance 1l 17-1087-03
SP Sepharose High Performance 5l 17-1087-04

Q Sepharose Fast Flow


HiLoad 16/10 Q Sepharose Fast Flow 1 17-1060-01
HiLoad 26/10 Q Sepharose Fast Flow 1 17-1062-01
Q Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0510-10
Q Sepharose Fast Flow 300 ml 17-0510-01
Q Sepharose Fast Flow 5l 17-0510-04

SP Sepharose Fast Flow


HiLoad 16/10 SP Sepharose Fast Flow 1 17-1135-01
HiLoad 26/10 SP Sepharose Fast Flow 1 17-1136-01
SP Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0729-10
SP Sepharose Fast Flow 300 ml 17-0729-01
SP Sepharose Fast Flow 5l 17-0729-04

DEAE Sepharose Fast Flow


DEAE Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0709-10
DEAE Sepharose Fast Flow 500 ml 17-0709-01
DEAE Sepharose Fast Flow 10 l 17-0709-05
DEAE Sepharose Fast Flow 60 l 17-0709-60

CM Sepharose Fast Flow


CM Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0719-10
CM Sepharose Fast Flow 500 ml 17-0719-01
CM Sepharose Fast Flow 10 l 17-0719-05
CM Sepharose Fast Flow 60 l 17-0719-60

152
Product Quantity/Pack Size Code No.

Sepharose Big Beads


Q Sepharose Big Beads 1l 17-0989-03
Q Sepharose Big Beads 10 l 17-0989-05

SP Sepharose Big Beads 1l 17-0657-03


SP Sepharose Big Beads 10 l 17-0657-05

STREAMLINE
STREAMLINE DEAE 300 ml 17-0994-01
STREAMLINE DEAE 7.5 l 17-0994-02

STREAMLINE SP 300 ml 17-0993-01


STREAMLINE SP 7.5 l 17-0993-02

Sepharose CL-6B
DEAE Sepharose CL-6B 500 ml 17-0710-01
DEAE Sepharose CL-6B 10 l 17-0710-05
CM Sepharose CL-6B 500 ml 17-0720-01
CM Sepharose CL-6B 10 l 17-0720-05

Sephacel
DEAE Sephacel 500 ml 17-0500-01
DEAE Sephacel 10 l 17-0500-05

Sephadex
DEAE Sephadex A-25 100 g 17-0170-01
DEAE Sephadex A-25 500 g 17-0170-02
DEAE Sephadex A-25 5 kg 17-0170-03
DEAE Sephadex A-25 40 kg 17-0170-07

DEAE Sephadex A-50 100 g 17-0180-01


DEAE Sephadex A-50 500 g 17-0180-02
DEAE Sephadex A-50 5 kg 17-0180-03
DEAE Sephadex A-50 40 kg 17-0180-07

QAE Sephadex A-25 100 g 17-0190-01


QAE Sephadex A-25 500 g 17-0190-02
QAE Sephadex A-25 5 kg 17-0190-03

QAE Sephadex A-50 100 g 17-0200-01


QAE Sephadex A-50 500 g 17-0200-02
QAE Sephadex A-50 5 kg 17-0200-03

CM Sephadex C-25 100 g 17-0210-01


CM Sephadex C-25 500 g 17-0210-02
CM Sephadex C-25 5 kg 17-0210-03
CM Sephadex C-25 40 kg on request

153
Product Quantity/Pack Size Code No.

CM Sephadex C-50 100 g 17-0220-01


CM Sephadex C-50 500 g 17-0220-02
CM Sephadex C-50 5 kg 17-0220-03

SP Sephadex C-25 100 g 17-0230-01


SP Sephadex C-25 500 g 17-0230-02
SP Sephadex C-25 5 kg 17-0230-03
SP Sephadex C-25 40 kg on request

SP Sephadex C-50 100 g 17-0240-01


SP Sephadex C-50 500 g 17-0240-02
SP Sephadex C-50 5 kg 17-0240-03

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Before any part of this handbook is reproduced, please request permission of
Amersham Biosciences. The following designations are trademarks owned by
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MonoBeads, MiniBeads, SOURCE, RESOURCE, FPLC, FPLCdirector,
UNICORN, SMART, OligoPilot II, FineLine, BPG, BioPilot, BioProcess,
PhastSystem, PhastGel.

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www.amershambiosciences.com

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