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Tema 2: Biologa molecular y principios de ingeniera gentica.

2.1.- Biologa molecular e informacin gentica.


2.1.1.- El ADN
2.1.1.1.- Replicacin del ADN
2.1.2.- El ARN
2.1.2.1.- Transcripcin del ADN
2.2.- Cdigo gentico.
2.3.- Sntesis de protenas.
2.4.- Mutaciones.
2.5.- Ingeniera gentica.
2.5.1.- Tecnologa del ADN recombinante
2.5.1.1.- Rplica inversa
2.5.2.- Secuenciacin
2.5.2.1.- Mtodo Sanger
2.5.2.2.- Mtodo de secuenciacin por terminador fluorescente
2.5.3.- Biosensores electroqumicos

2.6.- Bibliografa

2.1.- Biologa molecular e informacin gentica

2.1.1. El ADN

La informacin con la que se fabrican las molculas necesarias para el mantenimiento


de las funciones celulares est guardada en una molcula de cido nucleico llamada
cido desoxirribonucleico (ADN), que consiste en una doble hlice formada por dos
cadenas.

El ADN es un cido nucleico formado por nucletidos. Cada nucletido consta de tres
elementos:
a. un azcar: desoxirribosa en este caso (en el caso de ARN o cido ribonucleico,
el azcar que lo forma es una ribosa),
b. un grupo fosfato y
c. una base nitrogenada

Purinas: adenina (A) y guanina (G)

Pirimidinas: timina (T), citosina (C)

Si la molcula tiene slo el azcar unido a la base nitrogenada entonces se denomina


nuclesido.

Las bases nitrogenadas que constituyen parte del ADN forman puentes de hidrgeno
entre ellas, respetando una estricta complementariedad: A slo se aparea con T (y
viceversa) mediante 2 puentes de hidrgeno, y G slo con C (y viceversa) mediante 3
puentes de hidrgeno.

Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5-P (fosfato) y 3
OH (hidroxilo) en la desoxirribosa. Las dos cadenas se alinean en forma paralela, pero
en direcciones inversas (una en sentido 5 3 y la complementaria en el sentido
inverso), pues la interaccin entre las dos cadenas est determinada por los puentes
de hidrgeno entre sus bases nitrogenadas. Se dice, entonces, que las cadenas
son antiparalelas.

Figura 1. Estructura del ADN. El cido desoxirribonucleico es un polmero de dos


cadenas antiparalelas (orientacin 5 3 y 3 5).

2.1.1.1.- Replicacin del ADN


El proceso de replicacin de ADN es el mecanismo que permite obtener de una
molcula de ADN nica dos o ms "clones" de la primera. Esta duplicacin del material
gentico se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica
que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde
cada una para la sntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde,
de forma que cada nueva doble hlice contiene una de las cadenas del ADN original.
El ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idnticamente, gracias a la
complementariedad de las bases nitrogenadas (A-T, G-C) lo que permite que la
informacin gentica se transmita de una clula madre a las clulas hijas y es la base
de la herencia del material gentico.
La replicacin empieza en puntos determinados: los orgenes de replicacin.
Las protenas iniciadoras reconocen secuencias de nucletidos especficas en esos
puntos y facilitan la fijacin de las protenas helicasas que permitirn la separacin de
las dos hebras, mientras que la topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido

al superenrollamiento producido por la separacin de la doble hlice. Las protenas


SSB se unen a la hebra discontnua de ADN, impidiendo que sta se una consigo
misma.
Mediante este mecanismo se forma una horquilla de replicacin. El movimiento de
la horquilla es bidireccional en la mayora de los casos, es decir, a partir de un punto
se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.

La replicacin siempre se produce en sentido 5' 3', siendo el extremo 3'-OH libre el
punto a partir del cual se produce la elongacin del ADN. El ADN polimerasa slo
funciona en esta direccin, lo que plantea un problema, y es que una de las cadenas
debera ser sintetizada en direccin 3' 5'.
La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla (5' 3') de
replicacin se denomina hebra adelantada y se sintetiza de forma continua por la ADN
polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance se
denomina hebra retrasada, puesto que su sntesis se realiza de forma discontinua
teniendo que esperar a que la horquilla de replicacin avance para disponer de una
cierta longitud de ADN molde. Esto se debe a que la cadena debe avanzar en la
direccin 3' 5' y se sintetiza en tramos cortos, o fragmentos de Okazaki a partir de
los cuales el ADN polimerasa se encarga de continuar la sntesis de la cadena en
direccin 5' 3'. Estos fragmentos son formados gracias a cebadores de ARN
sintetizados por la ARN primasa. El ADN ligasa se encarga de unir los fragmentos de
Okazaki.

2.1.2.- El ARN
El cido ribonucleico es un cido nucleico formado por una cadena de ribonucletidos.
Est presente tanto en las clulas procariotas como en las eucariotas, y es el nico
material gentico de ciertos virus. El ARN celular es lineal y de hebra sencilla, pero en
el genoma de algunos virus es de doble hebra.
En los organismos celulares desempea diversas funciones. Es la molcula que dirige
las etapas intermedias de la sntesis proteica; el ADN no puede actuar solo, y se vale
del ARN para transferir esta informacin vital durante la sntesis de protenas. Varios
tipos

de

ARN

regulan

la expresin

gnica,

mientras

que

otros

tienen

actividad cataltica. El ARN es, pues, mucho ms verstil que el ADN.


La estructura primaria o qumica del ARN es similar a la del ADN con ciertas
diferencias:

Aunque el ARN suele formar cadenas simples, a veces puede plegarse como
resultado de la presencia de regiones cortas con apareamiento intramolecular de
bases que dan lugar a la estructura secundaria del ARN.
Otra caracterstica estructural del ARN que lo
distingue del ADN es la presencia de un grupo hidroxil
en la posicin 2 de la ribosa que hace que la hlice
las dobles hlices del ARN tengan una conformacin
distinta a la del ADN y adems, que en las zonas
donde no se forma la doble hlice haya una mayor
susceptibilidad a la hidrlisis qumica.
La estructura terciaria del ARN es el resultado del apilamiento de bases y de
los enlaces por puente de hidrgeno entre diferentes partes de la molcula.

Puesto que el ARN es muy verstil se encuentra una gran cantidad de tipos de ARN
cada uno con distintas funciones:

ARN mensajero (ARNm)

ARN de transferencia (ARNt)

ARN ribosmico (ARNr)

ARN reguladores

ARN de interferencia

ARN con actividad cataltica: ribozimas y espliceosoma

Etc...

2.1.2.1.- Transcripcin del ADN


La

biosntesis

de

ARN

est

catalizada

normalmente

por

la enzima ARN

polimerasa que usa una hebra de ADN como molde, proceso conocido con el nombre
de transcripcin.

Por tanto,

todos

los

ARN celulares

provienen

de copias

de genes presentes en el ADN.

La

transcripcin

comienza

con

el

reconocimiento por parte de la enzima de


un promotor, una secuencia caracterstica
de nucletidos en el ADN situada antes
del segmento que va a transcribirse; la
doble hlice del ADN es abierta por la
actividad helicasa de la propia enzima
(A).

continuacin,

la ARN

polimerasa progresa a lo largo


de la hebra de ADN en sentido 3'

5'

(B),

molcula

sintetizando

complementaria

una
de

ARN; este proceso se conoce


como

elongacin,

el

crecimiento de la molcula de
ARN se produce en sentido 5'
3'. La secuencia de nucletidos
del ADN determina tambin dnde
acaba la sntesis del ARN, gracias a
que posee secuencias caractersticas
que la ARN polimerasa reconoce como
seales de terminacin.

En virus, hay tambin varias ARN


polimerasas

ARN-dependientes que

usan ARN como molde para la sntesis


de nuevas molculas de ARN.

2.2.- Cdigo gentico.

El cdigo gentico es el conjunto de reglas que define la traduccin de una secuencia


de nucletidos en el ARNm a una secuencia de aminocidos en una protena en todos
los seres vivos. El cdigo define la relacin entre secuencias de tres nucletidos,

llamadas codones, y aminocidos. De ese modo,


cada codn se corresponde con un aminocido
especfico. El codn se considera la unidad bsica
del cdigo gentico.
La secuencia del material gentico se compone de
cuatro bases nitrogenadas distintas, que tienen una
funcin

equivalente

letras

en

el

cdigo

gentico: adenina (A), timina (T),guanina (G)


y citosina (C)

en

el

ADN

y adenina (A), uracilo (U), guanina (G)

y citosina (C)

en el ARN.
Debido a esto, el nmero de codones posibles es 64,
de los cuales 61 codifican aminocidos (siendo
adems uno de ellos el codn de inicio, AUG) y los
tres restantes son sitios de parada (UAA, llamado
ocre; UAG, llamado mbar; UGA, llamado palo).

La secuencia de codones determina la secuencia de aminocidos en una protena en


concreto, que tendr una estructura y una funcin especficas.

2.3.- Sntesis de protenas.

La biosntesis de protenas es el proceso anablico realizado en los ribosomas


mediante el cual se forman las protenas. El proceso consta de dos etapas, la
traduccin del ARN mensajero, mediante el cual los aminocidos del polipptido son
ordenados de manera precisa a partir de la informacin contenida en la secuencia de
nucletidos

del

ADN,

las

modificaciones

postraduccin

que

sufren

los polipptidos as formados hasta alcanzar su estado funcional.

Estructura de un ribosoma

El proceso de traduccin es el siguiente:

Iniciacin de la traduccin

El ARNm se une a la subunidad menor de los ribosomas. A stos se asocia el


aminoacil-ARNt, gracias a que el ARNt tiene en una de sus asas un triplete
de nucletidos denominado anticodn, que se asocia al primer codn del ARNm segn
la complementariedad de las bases. A
este grupo de molculas se une la
subunidad

ribosmica

mayor,

formndose el complejo ribosomal o


complejo

activo.

Todos

estos

procesos estn catalizados por los


llamados factores de iniciacin (FI). El
primer codn que se traduce es
generalmente
corresponde

el

AUG,

que

con

el

aminocido metionina en eucariotas.


En procariotas es la formilmetionina.

Elongacin de la cadena polipeptdica

El complejo ribosomal posee dos sitios de unin o centros. El centro peptidil o centro
P, donde se sita el primer aminoacil-ARNt y el centro aceptor de nuevos aminoacilARNt o centro A. El carboxilo terminal (-COOH) del aminocido iniciado se une con el
amino terminal (-NH2) del aminocido siguiente mediante enlace peptdico. Esta unin
es catalizada por la enzima peptidil transferasa. El centro P queda pues ocupado por
un ARNt sin aminocido. El ARNt sin aminocido sale del ribosoma. Se produce
la translocacin ribosomal. El dipeptil-ARNt queda ahora en el centro P. Todo ello es
catalizado por los factores de elongacin (FE) y precisa GTP. Segn la terminacin del
tercer codn, aparece el tercer aminoacil-ARNt y ocupa el centro A. Luego se forma el
tripptido en A y posteriormente el ribosoma realiza su segunda translocacin. Estos
pasos se pueden repetir mltiples veces, hasta cientos de veces, segn el nmero de
aminocidos que contenga el polipptido. La traslocacin del ribosoma implica el
desplazamiento del ribosoma a lo largo de ARNm en sentido 5'-> 3'.

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Terminacin de la sntesis de la cadena polipeptdica

Los codones UAA, UAG y UGA son seales de paro que no especifican ningn
aminocido y se conocen como codones de terminacin; determinan el final de la
sntesis proteica. No existe ningn ARNt cuyo anticodn sea complementario de
dichos codones y, por lo tanto, la biosntesis del polipptido se interrumpe.

Una vez finalizada la sntesis de una protena, el ARN mensajero queda libre y puede
ser ledo de nuevo. De hecho, es muy frecuente que antes de que finalice una protena
ya est comenzando otra, con lo cual, una misma molcula de ARN mensajero, est
siendo utilizada por varios ribosomas simultneamente.

2.4.- Mutaciones

En Gentica se

denomina mutacin

gentica, mutacin

molecular o mutacin

puntual a los cambios que alteran la secuencia de nucletidos del ADN. Estas
mutaciones en la secuencia de ADN pueden llevar a la sustitucin de aminocidos en
las protenas resultantes. Un cambio en un solo aminocido puede no ser importante si
es conservativo y ocurre fuera del sitio activo de la protena. En otro caso puede tener
consecuencias severas en la funcionalidad de las protenas sintetizadas.

Hay distintos tipos de mutaciones partiendo de la cadena original (normal):

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Estas mutaciones pueden ocurrir por la accin de diversos agentes o causas:

Espontneas
o

Radiaciones de fondo

Errores en la replicacin

Modificaciones por tautomera ceto-enlica en nucletidos

Inducidas
o

Por agentes fsicos




Anlogos

de

bases

de

cidos

nucleicos

(bromouracilo,

alcaloides, drogas,...)
o

Por agentes biolgicos




Virus

Bacterias

Etc.

2.5.- Ingeniera gentica

La Ingeniera Gentica es una rama de la gentica que se concentra en el estudio del


ADN, pero con el fin su manipulacin para obtener un producto ya existente con
diferentes propiedades o una nueva especie, por lo que abarca una gran cantidad de
posibilidades e intereses mdicos e industriales.
La ingeniera gentica incluye un conjunto de tcnicas biotecnolgicas, entre las que
destacan:

la tecnologa del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular


un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

La secuenciacin del ADN: Tcnica que permite saber el orden o secuencia


de los nucletidos que forman parte de un gen.

la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue


aumentar el nmero de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo
tanto, con una mnima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda
la que se necesite para un determinado estudio.

2.5.1.- Tecnologa del ADN recombinante

Los elementos que permiten estas modificaciones son: las enzimas de restriccin, los
vectores y la capacidad de bacterias para aceptar ADN ajeno.

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Enzimas

de

restriccin

endonucleasas.
Estas enzimas tienen la capacidad de
reconocer una secuencia determinada
de nucletidos y extraerla del resto de la
cadena. Esta secuencia puede volver a
colocarse con la ayuda de otra clase de
enzimas, las ligasas. Anlogamente, la
enzima de restriccin se convierte en
una "tijera de ADN", y la ligasa en el
"pegamento". Por lo tanto, es posible
quitar un gen de la cadena principal y en
su lugar colocar otro. Un ejemplo es la
escherichia coli.

Vectores de clonacin (plsmidos, virus...).

En el proceso de manipulacin tambin son importantes los vectores: partes de ADN


que se pueden autorreplicar con independencia del ADN de la clula husped donde
crecen. Estos vectores permiten obtener mltiples copias de un trozo especfico de
ADN, lo que proporciona una gran cantidad de material fiable con el que trabajar. El
proceso

de

transformacin

de

una

porcin

de

ADN

en

un

vector

se

denomina clonacin.

Clula husped

Debe ser una clula seleccionada para que sea capaz de mantener el vector de
clonacin con el material gentico externo de forma estable a lo largo de mltiples
generaciones,

proporcione

una

elevada

velocidad

de

crecimiento

bajos

requerimientos nutritivos.

2.5.1.1.- Replicacin inversa (retrovirus)


Los retrovirus son virus de ARN son capaces de modificar el ADN de las clulas
husped, sirviendo su ARN como plantilla. La transcripcin inversa de los virus de
ARN, utilizan la enzima transcriptasa inversa en su genoma para el paso de ARN en

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ADN, que se integra en el genoma husped y se replica junto con el, generando
nuevos virus.

2.5.2.- Secuenciacin

La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya


finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en
un oligonucletido de ADN.
La secuenciacin del ARN, que por razones tcnicas es ms sencilla de llevar a cabo
que la del ADN, se desarroll con anterioridad a la del ADN. El mayor hito en la
secuenciacin del ARN, que data de la era previa al ADN recombinante.

2.5.2.1.- Mtodo Sanger (marcado del cebador)

El mtodo clsico de terminacin de la cadena o mtodo de Sanger necesita una


hebra

molde

de

ADN

de

cadena

sencilla,

un cebador de

ADN,

una ADN

polimerasa con nucletidos marcados radiactivamente o mediante fluorescencia y


nucletidos modificados que terminan la elongacin de la cadena de ADN. La muestra
de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciacin separadas que contienen los
cuatro desoxinucletidos estndar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN

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polimerasa. En cada reaccin se aade solo uno de los cuatro didesoxinucletidos


(ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). Estos didesoxinucletidos terminan la elongacin
de la cadena al carecer un grupo 3'-OH que se necesita
para

la

formacin

del enlace

fosfodister entre

dos

nucletidos durante la elongacin de la cadena de ADN. La


incorporacin de un didesoxinucletido en la cadena
naciente de ADN termina su extensin, lo que produce
varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los
didesoxinucletidos

se

aaden

concentraciones

lo

suficientemente bajas como para que produzcan todas las


posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean
suficientes para realizar la secuenciacin.
Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo
son desnaturalizados por calor y separados por tamao
(con una resolucin de un solo nucletido) mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de
las cuatro reacciones de sntesis se corre en carriles
individuales (Carril A, T, G y C) y se visualizan las bandas de ADN mediante
autoradiografa o luz ultravioleta, y la secuencia de ADN se puede leer directamente a
partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel.

La secuencia encontrada es la complementaria a la del ADN molde, por lo que ser


necesario realizar el cambio AT

CG para obtener el cdigo correspondiente

al molde.

2.5.2.2.- Secuenciacin por terminador fluorescente (marcado del


terminador)

Una alternativa al marcado del cebador es el marcado de los terminadores de la


cadena, un mtodo conocido como "secuenciacin por terminador fluorescente". La
mayor ventaja de este mtodo es que la secuenciacin se puede llevar a cabo en una
sola reaccin, en lugar de en cuatro reacciones como en el mtodo del cebador
marcado. En una secuenciacin por terminador fluorescente se marcan cada uno de
los cuatro didesoxinucletidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente
diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de onda. Este mtodo es atractivo
por su gran capacidad y rapidez y actualmente es el mtodo de referencia en la

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secuenciacin automatizada con analizadores de secuencia controlados por


computadora.

2.5.3.- Biosensores electroqumicos

La hibridacin del ADN es


el

proceso

ms

comn

para analizar y detectar un


gen

particular

segmento

de

o
un

un
cido

nucleico. Como el ADN


tiene

propiedades

electroactivas,
desarrollado

se

han

sistemas

electroqumicos

de

deteccin sacando partido


de esta caracterstica para detectar directamente el ADN hibridado. De manera
general, el ADN se inmoviliza sobre un electrodo, y la diferencia de corriente elctrica
medida antes y despus de la hibridacin est relacionada con la cantidad de ADN
fijado sobre el electrodo.

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2.6.- Bibliografa

Diapositivas de la asignatura

Apuntes de bioqumica de Alicia Larena

http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/estado-del-arte/el-libro-de-la-vida-eladn/estructura_del_adn.php

http://es.wikipedia.org/wiki/Replicaci%C3%B3n_de_ADN

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ribonucleico

http://es.wikipedia.org/wiki/Bios%C3%ADntesis_proteica

http://es.wikipedia.org/wiki/Mutaci%C3%B3n_gen%C3%A9tica

http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html

http://www.monografias.com/trabajos5/ingen/ingen.shtml

http://es.wikipedia.org/wiki/Ingenier%C3%ADa_gen%C3%A9tica

http://es.wikipedia.org/wiki/Transcriptasa_inversa

http://es.wikipedia.org/wiki/Secuenciaci%C3%B3n_de_ADN

http://www.dignabiotech.com/cas/r_d.DNA.asp

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