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CARACTERIZACION Y SEPARACION QUIMICA DE LIPIDOS POR

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

Autores: Ortega Jeinny, Santiago Ligia


Corporacin Tecnolgica De Bogot, Tecnologa En Regencia De Farmacia
Bogot, Colombia
2016
RESUMEN
Los lpidos son biomolculas orgnicas insolubles en el agua que pueden extraerse de las clulas y
de los tejidos mediante disolventes no polares, por ejemplo, el cloroformo, el ter o el benceno.
Existen diferentes familias o clases de lpidos, pero las propiedades distintivas de ellos derivan de la
naturaleza de la cadena hidrocarbonada de la porcin principal de su estructura. En esta prctica se
obtiene fosfolpidos de la yema de huevo separados por medio de cromatografa de capa fina
La cromatografa en capa fina es un caso de cromatografa de reparto en la que los componentes de
una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes.

INTRODUCCION
Los lpidos poseen caractersticas comunes
entre s, entre estas cabe destacar la
extremadamente baja solubilidad en agua pero
muy elevada en solventes orgnicos, la
presencia de hidrocarburos de cadena larga en
su micelas y tambin el hecho de que son
encontrados en organismos vivos. Las
propiedades fsicas de los lpidos reflejan su
naturaleza hidrofbica y en este grupo estn
incluidas sustancias de diferentes estructuras y
propiedades fsico qumicas, incluyendo los
triglicridos, diglicridos, monoglicridos,
ceras,
fosfoglicridos,
esfingolpidos,
esteroides, tocoferoles, carotenoides, terpenos
e hidrocarburos policclicos.
Las materias grasas en general cumplen una
serie de roles en nuestra dieta, adems de ser
la principal fuente de energa. Son
constituyentes normales de la estructura

celular y funciones de la membrana. Son


fuente de cidos grasos esenciales para el
organismo animal, donde cabe destacar su
papel en la sntesis de las prostaglandinas.
Regulan el nivel de lpidos sanguneos. Son
vehculo de vitaminas liposolubles y aportan
otros
componentes
importantes
como
pigmentos, carotenoides, esteroles, etc. (L. &
M. Cox, 2009)
Los fosfolpidos constituyen la segunda clase
ms abundante de lpidos presentes en la
naturaleza
y
se
encuentran
casi
exclusivamente en las membranas celulares de
plantas y animales, compuestas del 40 a 50%
de fosfolpidos y de 50 a 60% de protenas.
Qumicamente,
los
fosfolpidos
estn
formados por una molcula de glicerol ligada
a dos molculas de cidos grasos y una cadena
conteniendo un grupo fosfato (a menudo un
cido fosfatdico) ligado a una base
nitrogenada o un compuesto polihidroxilado,

localizado casi siempre en la posicin sn 3 de


la molcula de glicerol.
Los fosfolpidos en general son aquellos
lpidos que contienen cido fosfrico. En el
campo de la ciencia y la tecnologa de los
alimentos, la expresin suele limitarse a los
derivados del cido glicerofosfrico, que estn
formados por una molcula de glicerol
esterificada en las posiciones 1 y 2 por dos
cidos grasos, con la posicin 3 esterificada
por un cido fosfrico que lleva unidas
adems otras estructuras, dependiendo del
fosfolpido de que se trate. De forma genrica
se denominan "lecitinas", aunque se considera
que la lecitina propiamente dicha es la
fosfatidilcolina.
Los fosfolpidos son un componente
importante de los lpidos de la yema de huevo,
lo que explica su buena capacidad como
emulsionante. Tambin se encuentra en la
membrana del glbulo graso de la leche (y
consecuentemente, en la mantequilla). Los
fosfolpidos utilizados como emulsionantes en
la industria (lecitinas) suelen proceder del
refinado del aceite de soja.
FUNDAMENTACION TEORICA
Separacin de molculas por cromatografa
El estudio y caracterizacin de las distintas
biomolculas (azcares, lpidos, protenas,
cidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos
casos su aislamiento y purificacin a partir de
mezclas complejas como son los preparados
de cualquier material biolgico. Una de las
tcnicas bioqumicas ms clsicas y utilizadas
para dicho fin es la cromatografa. La
cromatografa incluye una amplia gama de
tcnicas, que se pueden clasificar atendiendo
al fundamento fsico-qumico en el que se
basa la separacin (cromatografa de

adsorcin, de reparto, de cambio inico, de


filtracin molecular, hidrofbica y de
afinidad), o al material sobre el que se lleva a
cabo (cromatografa en papel, capa fina, en
columna y de gases).
Para el desarrollo de la cromatografa, las
muestras, en un disolvente adecuado, se
aplican puntualmente con la ayuda de jeringas,
micropipetas o capilares en un extremo de la
placa. El volumen de muestra a aplicar es
crtico, ya que va a afectar a la resolucin
(separacin de los componentes de una mezcla
compleja), y depende de la concentracin del
compuesto o compuestos de inters en la
muestra. Para soluciones concentradas bastar
una cantidad muy pequea (rango de l) para
aplicar suficiente cantidad de los solutos a
separar sin llegar a saturar la capacidad de
resolucin de la placa cromatogrfica. Para
soluciones muy diluidas, deber aplicarse un
volumen suficiente (de hasta varios ml) para
asegurar una cantidad detectable de soluto o
solutos de inters.
Se determina la posicin de cada mancha
relativa al frente alcanzado por el solvente,
calculndose el correspondiente valor de Rf.
La deteccin de los compuestos una vez
realizada la cromatografa se puede llevar a
cabo
en
base
a
sus
propiedades
espectroscpicas, fluorimtricas, hacindolos
reaccionar
con
reactivos
especficos,
radioisotpicamente, etc. La identificacin de
tales compuestos se suele realizar comparando
sus Rf con los de compuestos de referencia
(patrones) de naturaleza qumica conocida.
Alternativamente, los diferentes compuestos,
una vez localizada su posicin por un mtodo
no destructivo, pueden eluirse de la placa
raspando las zonas correspondientes y
extrayendo el polvo obtenido con un solvente
adecuado.

Definicin del RF y como se calcula


Rf es el registro y se define como:
Rf = distancia que recorre la muestra desde el
punto de aplicacin / distancia que recorre el
disolvente hasta el frente del eluyente
La distancia que recorre el compuesto se suele
medir desde el centro de la mancha, por el
cual se suelen hacer unas marcas en la placa,
si dichas manchas son extremadamente
grandes, el valor del RF ser errneo. As
realizamos unas marcas en la placa donde se
deposita con ayuda de un capilar un mnimo
de muestra.
Cuanto ms polar sea el compuesto, mas
retenido estar en el absorbente y por tanto ira
ms lento y el RF ser tambin menor. Por
otra parte los compuestos poco polares se
consiguen desplazar a ms distancia desde el
origen. La polaridad del disolvente influye en
el valor del RF por lo que se debe tener en
cuenta, as para un mismo tipo de compuesto,
un aumento de la polaridad del disolvente har
aumentar su desplazamiento en la placa y por
lo tanto tambin aumenta su RF. (Jorrn Novo,
Abril Daz, & Brcena Ruiz)
METODOLOGIA
En una cmara cromatogrfica se coloc
aproximadamente 5 ml de una solucin de nhexano: ter etlico: cido actico glacial
(70:20: 1) y se dej saturar por 20 minutos
Preparacin de la muestra
Se coloc en un mortero 3 g de yema de un
huevo cocido se agreg 10mL de una solucin
de etanol: ter: cloroformo (2:1:2) luego se
macero suavemente y filtro a travs de papel
filtro, recogiendo el filtrado en un vaso de
precipitados. Se evaporo el solvente
calentando cuidadosamente agitando el vaso

constantemente, hasta tener el extracto viscoso


o seco
Una vez seco, se redisolvio la muestra en 5
mL de ter, y adiciono 15 mL de acetona para
formar un precipitado, y se dej decantar
colocando el vaso de precipitados en forma
diagonal.
Se tom la fase lquida y se coloc en un vaso
de precipitado de 50 mL, se calent
cuidadosamente dejando reducir el volumen a
5 mL esta se tom como solucin 1
Se sec la fase slida en y redisolvio el slido
en 5 mL de ter etlico esta se tom como
solucin 2
Se separe 1 mL de solucin 1 y de solucin 2
para la cromatografa.
Pruebas cualitativas de composicin de
lpidos
Se tome en tres tubos de ensayo diferentes 1
mL de solucin 1, de solucin 2 y de solucin
de lecitina (control positivo). A cada tubo se le
adiciono 1 mL de molibdato de amonio y 1
mL de cido sulfrico concentrado lentamente
por las paredes del tubo; se agito y dejo
reposar por 3 minutos se adiciono 1 mL de
cido ascrbico. Se prepara un cuarto tubo de
ensayo con molibdato, cido sulfrico y cido
ascrbico (control negativo).
Se tome 1 mL de solucin 1, de solucin 2 y
de glicerina (control positivo). Se agreg una
cantidad pequea de KHSO4 a los tres tubos
anteriores y a un cuarto tubo vaco (control
negativo). Se caliento levemente cada tubo a
la llama y se not el olor desprendido en cada
tubo.
Se tom 1 mL de solucin 1, de solucin 2 y
de solucin de colesterol (control positivo). Y

agrego 3 mL de FeCl3, y 1 mL de cido


sulfrico concentrado a los tres tubos
anteriores y a un cuarto tubo vaco (control
negativo).

solucin reveladora (Sulfato de Amonio 10%)


luego se dej secar y se coloc la placa sobre
una plancha de calentamiento a 70C y retir
una vez se empezaron a revelar colores sobre
esta determinndose el Rf para cada muestra.

Separacin de lpidos por cromatografa en


capa fina
Sobre las placas cromatogrficas se marc con
un lpiz suavemente una lnea dejando una
distancia de 1 cm desde la base de la placa.

RESULTADOS Y DISCUSIONES
Al preparar las soluciones 1 y 2 se observa un
color amarillo lechoso para la primera
solucin y amarillo cristalino para la segunda
solucin.

Con un capilar se coloque sobre la placa las


muestras segn la figura:

Patrn
Patrn lecitina
Solucin
1
Solucin
2
colesterol
Solucin
2
Solucin
1

Solucin 1, solucin 2 y tubo 3 que contiene


lecitina

Se asegrese de marcar cada punto sembrado


luego se coloc la placa en la cmara,
tapndola y hasta que la fase mvil quedo a un
1 cm de la parte superior de la placa.
Luego de subir la fase mvil se sac la placa y
se marco con lpiz la zona hasta donde lleg
la fase mvil se deje secar la placa, y aplico la

Solucin 1, solucin 2 y tubo 3 contiene


colesterol

Etanol o Alcohol Etlico es un alcohol que se


presenta como un lquido incoloro e
inflamable con un punto de ebullicin 78C.
Es el solvente por excelencia de uso en el
laboratorio.
Calculo del RF

Se utilizaron solventes orgnicos ya que estos


permiten la ruptura de los enlaces covalentes y
la extraccin de las sustancias de inters.

35 mm

Se utilizaron los siguientes disolventes:


ETER: permiti diluir y homogenizar
completamente la mezcla
ACETONA: se us para dar miscibilidad
a la mezcla, pero se precipito formando
dos interfaces (una liquida y una slida).
ETANOL: permite la fcil filtracin de la
mezcla
Los Solventes
Los compuestos orgnicos basados en el
elemento qumico carbono. Su importancia y
patrn de uso determinan su clasificacin en
solventes activos, cosolventes, solventes,
latentes y diluyentes.
La Acetona es un solvente intermedio entre los
muy polares y los no polares, sirviendo para
hacer miscibles dos solventes que no lo son o
para extraer conjuntamente sustancias polares
y no polares.
El ter es un solvente de muy baja polaridad y
de bajo punto de ebullicin 35C, solvente
especial para los lpidos, resinas y grasas
minerales.

Solucin 1: No se calcul ya que se evidencia


una mancha demasiado grande por ende esto
arrojara un RF errneo Y es difcil determinar
su polaridad ya que tambin se observa una
macha en el punto donde se realiz la siembra
tal vez ese fue el error que indica el porqu de
la mancha tan grande en la parte superior.
Solucin 2: RF = 30mm/35mm=0,85
Segn se evidencia en la muestra la mancha
se encuentra con un desplazamiento y
distancia considerable con respecto al origen
por ende es un compuesto apolar y su RF es
mayor.
Colesterol: RF = 33mm/35mm=0.94
Segn se evidencia en la muestra la mancha se
encuentra con un desplazamiento y distancia
tambin considerables lo que confirma la
completa a polaridad del colesterol por ende
su RF tan grande lo confirma.

33 mm

Solucin 1: nuevamente para la segunda placa


se observan 2 manchas una en el origen la otra
en la parte inferior lo q hace difcil determinar
su polaridad y RF.
Solucin 2: RF = 30mm/33mm=0,90
Segn se evidencia en la muestra la mancha se
encuentra con un desplazamiento y distancia
considerable con respecto al origen por ende
es un compuesto apolar y su RF es mayor
coincidiendo con la primera placa.
Lecitina: RF = 32mm/33mm=0.96
Segn se evidencia en la muestra la mancha se
encuentra con un desplazamiento y distancia
tambin considerables lo que confirma la
completa a polaridad de la lecitina por ende su
RF tan grande lo confirma.
La lecitina es una sustancia orgnica
abundante en las membranas de las clulas
vegetales y animales, especialmente en las del
tejido nervioso; se obtiene de las grasas
animales, la yema de huevo y algunas semillas
y se emplea en la elaboracin de ciertos
alimentos, como la margarina o el chocolate, y
en cosmtica y farmacia.
CONCLUSIONES

En la presente prctica se puede verificar la


identificacin de los fosfolpidos derivados del
huevo y teniendo patrones de referencia como
la lecitina y el colesterol efectivamente los
lpidos son completamente apolares.
Y
presentan en estudios de cromatografa de
capa fina una distancia mayor tal cual como se
encuentra documentado.
Los lpidos se solubilizan con solventes
orgnicos por la presencia de cidos grasos
(glicridos o triglicridos) saturas o
insaturados que forman los tipos de lpidos
(simples compuestos) los solventes
orgnicos son molculas apolares de manera
tal que se solubilizan con ellos, en relacin
con el agua (molcula polar) tienen apata o no
afinidad por ser esteres de cidos grasos con
un alcohol llamado glicerina o glicerol.

BIBLIOGRAFA
Jorrn Novo, J. V., Abril Daz, M. N., &
Brcena Ruiz, J. A. (s.f.). Separacin
de aminocidos por cromatografa en
capa fina y deteccin mediante
reaccin con ninhidrina. Cordoba.
L., D. N., & M. Cox, M. (2009). Lehniger
Principios de Bioquimica. En D. N.
L., & M. M. Cox, Lehniger Principios
de Bioquimica (pg. 343). Madison,
Wisconsin: EDICIONES OMEGA.