Cromatografia

Qu
Qumica Anal
Analtica / JCAM

Cromatografia
 tcnica baseada nas diferenas de distribuio dos componentes a separar entre
duas fases: uma fase mvel e uma fase estacionria.
 tcnica em que os componentes duma mistura se separam de acordo com as
velocidades s quais so transportados por uma fase mvel atravs de uma fase
estacionria

fase mvel (eluente)

 fase que se move
gs - cromatografia em fase gasosa - GC)
lquido - cromatografia em fase lquida - LC

fase estacionria
 fase fixa (quer em coluna quer em superfcie plana)
normalmente um slido activo
pode ser um lquido depositado num suporte slido inerte (GC)

eluio
 processo de passagem atravs da fase estacionria (por aco da fase mvel)

Cromatografia - Evoluo histrica

Qu
Qumica Anal
Analtica / JCAM

1850 - Runge
 mistura de tintas em papel mata-borro

1861- Schoenbein - Goppelsroder

 sais, gua, vinho, leite, urina, ... / separao por capilaridade

1906 - Tswett
 pigmentos de plantas / coluna de giz modo (carbonato de clcio)

1938 - Ismailov e Schraiber (1956 - Stahl)

 primeira descrio do TLC / CCF - camada fina / uso de alumina na separao de
tinturas farmacuticas

1941 - Martin e Synge (prmio Nobel em 1952)

 cromatografia de partilha (aminocidos) / cromatografia gs-lquido

1967 - Huber e Hulsman

 desenvolvimento da cromatografia Lquido-Lquido (HPLC)
 uso de partculas de 5 a 10 m / presso elevada
12 Prmios Nobel (entre 1937 e 1972) esto directamente relacionados com trabalhos em cromatografia

Cromatografia - classificao
Qu
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Analtica / JCAM

quanto forma do suporte

 coluna - a fase estacionria est confinada num tubo por onde forada (presso
/ gravidade) a passagem da fase mvel
 planar (camada fina / papel) - fase mvel avana por capilaridade ou gravidade

quanto aos processos fsico-qumicos

 adsoro - separao baseada nas diferenas de afinidades adsorventes dos
componentes pela superfcie do slido activo
 partilha - separao baseada nas diferenas de solubilidade dos componentes na
fase estacionria (GC) ou entre a duas fases (LC)
 permuta inica - separao baseada nas diferentes tendncias dos componentes
inicos ou ionizados permuta com ies da fase estacionria

quanto natureza da fase mvel:

 fase gasosa (GC) / fase lquida (HPLC) / fluido supercrtico (SFC)

quanto forma de introduo da amostra

 frontal - contnua (eluio aps a saturao da fase estacionria)
A+B+C

no permite a separao entre todos os componentes da mistura

 zonal - descontnua (permite a separao total)

A+B
A

Cromatografia - classificao
Qu
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Analtica / JCAM

quanto ao objectivo da separao

 analtica - controlo de qualidade (impurezas / pureza / doseamentos)
 preparativa - produo / purificao (evita as tcnicas de extraco qumica)

quanto composio da fase mvel

 isocrtica - composio do eluente constante ao longo da eluio
 gradiente - composio do eluente varia de forma contnua

quanto ao modo de operao

 anlise por deslocamento
fase mvel saturada com substncia de maior afinidade para com a fase
estacionria, deslocando os componentes da amostra de acordo com os
respectivos graus de afinidade.

 anlise por eluio

a fase mvel passa continuamente na coluna arrastando a amostra e provocando o
processo de separao. A separao dos componentes da mistura depende
apenas do seu coeficiente de partilha entre as fases mvel e estacionria

 anlise por gradiente de temperatura

a separao feita por um gradiente trmico no sentido da eluio da amostra
isotrmica / temperatura escalonada / temperatura programada linearmente

Mtodos cromatogrficos
Qu
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Analtica / JCAM

Cromatografia - processo de separao que exige um equilbrio competitivo entre a fase estacionria
a fase mvel e as molculas da amostra.
Cromatograma - registo da concentrao do soluto vs. tempo (volume) de eluio
Cromatgrafo - equipamento constitudo por sistema de injeco, coluna e detector adequado para a
realizao de separao (anlise) e quantificao de misturas.

Tipo de cromatografia

fase mvel

fase estacionria

processo de distribuio

Cromatografia de partilha (coluna)

partilha

Cromatografia de papel

partilha

Cromatografia gs-lquido (GLC)

partilha

Cromatografia de adsoro (coluna)

adsoro

Cromatografia em camada fina (TLC)

adsoro

Cromatografia gs-slido (GSC)

adsoro

Cromatografia permuta inica

reaco qumica reversvel

Cromatografia de permeao gel

crivagem molecular

Conceitos e equaes bsicas

Qu
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Separao dos componentes

 separao aumenta com o tempo de eluio (devido s diferenas de afinidades)

Alargamento dos picos (bandas)

 os picos tendem a alargar com o tempo de eluio (diminuio da eficincia de separao)
A eficincia da separao cromatogrfica depende das velocidades relativas de
eluio e, consequentemente, dos respectivos coeficientes de partilha

Coeficiente de partilha (K)

 razo entre a concentrao na fase estacionria (CS) e a concentrao na fase mvel (CM)
idealmente, K constante !!

K=

CS
CM

Coeficiente de reteno (Rr)

 razo entre a velocidade mdia do soluto e a velocidade mdia do eluente

Factor de reteno (Rf) - muito usado em TLC

 razo entre a distncia percorrida pela banda e a distncia percorrida pela frente do eluente
no mesmo tempo.
Questo: um solvente atravessa uma coluna em 3 minutos mas o soluto demora 9 minutos a eluir!
Qual a frao do tempo que o soluto passa na fase mvel?

Conceitos e equaes bsicas

Qu
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Tempo morto (tm)

 tempo necessrio para um produto no retido atravessar a coluna

Tempo de reteno (tr)

 tempo que decorre desde a injeco at meia eluio

Tempo de reteno relativo (trr)

 tempo de reteno calculado em relao ao pico
principal (ou de referncia)

tm
tr1

Volume de reteno (Vr)

tr2

 volume de eluente introduzido desde a injeco at meia eluio

Velocidade mdia de eluio

Factor de capacidade (k)





L
v = ------tr

tr - tm
k = ------------tm

descreve a velocidade com que dado composto migra ao longo da coluna

valores tpicos esto entre 1 e 5
em GC, k varia mudando a temperatura e o enchimento da coluna
em LC, k varia alterando a composio da fase mvel e da fase estacionria

Conceitos e equaes bsicas

Qu
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Factor de selectividade
 razo entre os coeficientes de partilha do soluto mais retido pelo menos retido
 medida da separao de dois solutos
K
K'
t t
= B = B = rB m
 sempre superior a 1
K
K'
t t
A

rA

Forma dos picos

 tipicamente gaussianos (simtricos)
 alargamento resulta da variaes de velocidade das molculas de soluto ao longo
da coluna - o tempo de residncia em cada fase no constante
Tailing - arrastamento provocado por coeficientes de partilha no lineares
Fronting - provocado por coef. partilha no lineares / amostra demasiado grande

Modelos que descrevem a separao cromatogrfica

 Modelo de equilibrio - modelo dos pratos tericos
 Modelo dinmico modelo cintico

Modelo dos pratos tericos

Qu
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 considera transferncias sucessivas entre as quais se estabelece equilbrio

termodinmico / em vez de considerar o avano real da fase mvel
 cada volume assim definido um prato terico
 N = L / H em que L - comprimento da coluna e H (HETP) - altura do prato terico
 a eficincia de uma coluna aumenta com o nmero de pratos (ou inv. a H), podendo
variar de algumas centenas (HPLC) a vrias centenas de milhar (GC)

Considerando uma distribuio aproximadamente gaussiana, N pode ser

obtido por:
N = 16 (tr/
)2

ou

N = 5,54(tr/ )2

 a largura do pico na base (considerando tratar-se de um tringulo)

 a largura a meia altura do pico
A largura do pico representa uma boa medida da eficincia da coluna (permitindo a
comparao entre colunas)
Apesar do modelo no caracterizar os vrios parmetros que influenciam a separao,
a sua simplicidade favorece a utilizao

Modelo cintico
Qu
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 a separao cromatogrfica um fenmeno cintico e no esttico

 a deformao dos picos est associada ao fluxo da fase mvel e pode ter vrias
origens:
existncia de vrios trajectos possveis (anisotropia)
difuso molecular longitudinal
resistncia transferncia de massa

Anisotropia
 independente do fluxo
 exprime o movimento turbulento de difuso
da fase mvel atravs da fase estacionria
 reflecte a homogeneidade da fase estacionria (enchimento)
 diminui com o dimetro das partculas e nula
para uma coluna vazia

HA = dp = A
dp - dimetro das partculas
l - irregularidade do enchimento

Modelo cintico
Qu
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Difuso longitudinal
 representa a disperso das molculas
 inversamente proporcional ao fluxo
Hb = B / U
B - difuso
U - velocidade da fase mvel

Resistncia transferncia de massa

 as molculas colocadas no centro do fluxo avanam mais
rapidamente
 a fase estacionria no tem uma forma regular - diferenas
de reteno das molculas
 as diferenas (desfasamento) aumentam drasticamente com o fluxo provocando o
alargamento progressivo do pico
Hc = C . U
C - transferncia entre fases
U - velocidade da fase mvel

Equao de van Deemter

Qu
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HH==AA++ BB/ /UU++CC. .UU

H representa a altura equivalente de um prato terico
N=L/H

- anisotropia

B/U - difuso
C.U - transferncia

A separao mxima para H mnimo.

B domina para U baixos e C domina para
U elevados

A difuso muito menos significativa

em HPLC (lquido). A tambm menor
em HPLC pelo que H min cerca de 10x
menor que em GC e obtem-se para
valores de U cerca de 10x inferiores.
Os picos tendem a alargar mais em GC
que em HPLC.
U - velocidade da fase mvel

Partculas
Qu
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Resoluo
Qu
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Resoluo de uma coluna mede a capacidade de separar dois solutos

R=

2(t rB t rA )
N 1 k 'B
=

wA + wB
4 1 + k 'B

B o soluto mais lento ( maior tr)

A resoluo depende de 3 factores:

 selectividade deve ser superior a 1 (importante mas insuficiente)
 factor de capacidade k - deve estar compreendido entre 1 e 10
 eficcia da coluna N - deve ser a maior possvel (ainda que seja pouco influente
- raiz quadrada)

R=1

- separao quase completa

R > 1,5 - separao completa

Nota: muitas vezes exigida um R de 4-5 para que
as impurezas existentes sejam separadas.