BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Uji ELISA merupakan salah satu bentuk perkembangan sisitem uji imun yang telah
dikembangkan sebagai alternatif penggunaan radioisotop. Sebagai gantinya digunakan enzim.
Semula ELISA diperkenalkan dalam upaya meningkatkan kepekaan, tetapai karena sistem ini
sangat bergantung pada aviditas antibodi, maka upaya ini tidak berhasil. Dibanding dengan
teknik yang menggunakan radioisotope, di sini tidak perlu. Di samping itu, konjugat enzim
bersifat lebih stabil dibandingkan dengan protein bertanda iodium radioaktif.
Satu hambatan ELISA adalah diperlukannya spektrofotometer yang sesuai untuk
mengukur volume sampel yang sedikit. Untuk pemeriksaan sampel dalam jumlah besar lebih
bermanfaat jika tersedia suatu alat automatis yang memang dirancang untuk ELISA.
Dalam teknik ini beberapa enzim dapat dikonjugasi pada antigen dan antibodi. Dalam
praktiknya, enzim dipilih yang menunjukkan kinetika sederhana, dan dapat diuji dengan
prosedur sederhana. Pertimbangan lain dalam penggunaan teknik ini adalah murah,
ketersediaan dan kestabilan substrat. Berdasarkan alas an-alasan ini, enzim yang paling
umum digunakan adalah fisfatase alkali, -D galaktosidase, dan perioksidase lobak.
Dua macam antibodi yang digunakan dalam ELISA, antibodi pertama (primary
antibody) mengikat pada antigen dan antibodi kedua (secondary antibody) atau antibodi
antiglobin mengikat pada antibodi pertama. Antiglobin ini yang dilabel dengan enzim seperti
horseradish peroxidase, alkalin phospatase yang mempermudah untuk monitor dengan
perubahan warna. Adanya reaksi dari enzim ini secara kuantitatif antibodi pertama dapat
dianalisis.
Metode ELISA pertama kali diperkenalkan oleh Engvall dan Perlmann (1971) dengan
cara mengkonjugasikan enzim dalam immunoassay. Karena tingkat sensitivitasnya tinggi
terutama untuk tes serologis pada awal infeksi, maka semenjak itu banyak peneliti
menggunakan metode ini yang diikuti dengan produksi enzim besar-besaran terutama yang
banyak dikomersilkan adalah Horseradish Peroxidase (HRP), Fospatase Alkali (AP), urease
beta galaktose dan glukose oksidasi. Pemilihan enzim tentu saja berdasarkan atas antara lain
homogen, murah, spesifik dan stabil.
Didasari dari pesatnya perkembangan teknik diagnostik dan penelitian, maka model
ELISA berkembang antara lain direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, Iosliche
ELISA, Fangan ELISA dan sel ELISA. Sedang model aplikasinya dapat dipergunakan untuk
mendeteksi infeksi dini melalui deteksi antigen maupun antibodi dari infeksi virus, bakteri,

parasit, dan juga deteksi hormon maupun bahan-bahan toksik. Dalam bidang bioteknologi
sering digunakan untuk skrining produksi antibody monoklonal hasil hibridisasi.
ELISA adalah salah satu system immunoassay yang terbagi menjadi dua sistem, yaitu
sistem homogen dan system heterogen. Sistem homogen dipengaruhi oleh aktivitas enzim
dan tidak diperlukan pencucian dan reaksi bertahap. Kerugian tes ini adalah tidak sensitif
sehingga tidak digunakan untuk skrining.
Sistem heterogen adalah sistem uji yang tidak dipengaruhi oleh aktivitas enzim, jadi
konjugat tidak mempengaruhi reaksi antigen-antibodi. Tetapi pencucian dan reaksi dilakukan
bertahap merupakan keharusan dan diperlukan reagen partner. Sistem heterogen terdapat dua
model yaitu kompetitif ELISA dan non kompetitif ELISA.
Kompetitif ELISA kebanyakan digunakan untuk pengukuran antigen melalui kompetitif
antara antigen yang tidak dilabel dan antigen yang yang dilabel pada antibodi yang dilapiskan
pada mikroplate polystirol atau polyvinyl. Sedang non kompetitif ELISA adalah sistem yang
paling banyak digunakan dan dikembangkan karena lebih sensitif dibanding model sistem
lainnya. Contoh dari sistem ini adalah direct ELISA (antibodi pertama dilabel), indirect
ELISA (antibodi kedua yang dilabel), jembatan antibodi (antibodi ketiga yang dilabel, seperti
Peroxidase Anti Peroxidase/PAP).
Model ELISA dikembangkan kebanyakan berdasarkan pada kegunaan praktis di setiap
laboratorium yang disesuaikan dengan kebutuhan, misalnya untuk mendeteksi antigen,
antibodi, hormon, antibiotik, toksin interleukin dan lain-lain.
1. Direct ELISA
Direct ELISA adalah salah satu model ELISA yang langsung diikatkan antara
antigen dan antibodi, dimana antibodi harus ddilabel dahulu baru divisualisasi dengan
cara menambahkan substrat. Kelemahan model ini adalah diperlukan keahlian dalam
melakukan konjugasi atau melabel antibodi dengan enzim, sehingga tahap ini
memerlukan tahapan purifikasi antibodi dan setelah itu dilanjutkan dengan pelabelan.
Keuntungannya dari segi ekonomis sedikit lebih murah.

Antibodi-enzim-konjugat

Antibodi dilapiskan pada

mikroplate

2. Indirect ELISA
Model ini banyak digunakan di berbagai tingkatan laboratorium, karena bahan
yang digunakan untuk uji ini sudah banyak dipasarkan dan mudah dibeli di pasaran.
Model ini tidak memerlukan keahlian khusus untuk konjugasi hanya saja dari segi
biaya sedikit lebih besar. Hal ini disebabkan karena model ini memerlukan konjugat
fragmen immunoglobulin anti immunoglobulin yang akan dideteksi. Misalnya yang
akan dideteksi adalah IgG maka diperlukan konjugat fragmen imunoglobin anti IgG.
Hasil dari uji ini lebih spesifik dibandingkan dengan direct ELISA. Model ini sering
digunakan secara rutin untuk diagnosis antigen maupun antibodi. Model lain yang
lebih spesifik lagi adalah indirect ELISA model Fang antibodi. Model ini dilakukan
dengan cara melapiskan antibodi pada dasar mikroplate selanjutnya ditambahkan
dengan antigen dan diinkubasi dalam waktu 45 menit pada temperature 37 oC baru
ditambahkan antibody monoclonal dan akhirnya ditambahkan substrat yang dilabel
dengan enzim alkalin fosfatase atau peroksidase.
Indirect ELISA melalui pelapisan antigen

Antibodi sekunder terlabel enzim

Antibodi primer

Antigen

3. Sandwich ELISA
Sandwich ELISA adalah model tes ELISA yang menggunakan perangkat tiga
macam antibodi. Antibodi pertama biasanya menggunakan antibody monoclonal yang
dilapiskan pada mikroplate dan selanjutnya direaksikan dengan antigen. Setelah
dilakukan pencucian baru ditambahkan antibodi kedua atau sampel serum yang akan
dideteksi dan selanjutnya direaksikan dengan antibodi ketiga yaitu fragmen
immunoglobulin anti immunoglobulin yang akan dideteksi. Model ini sering
digunakan untuk mendeteksi antigen selain pada serum, plasma, juga antigen maupun
antibodi pada cairan serebrospinal (cerebrospinal fluid), cairan ludah, sekresi air mata.
Model ini karena mempunyai tingkat spesifitas dan sensitifitas lebih tinggi
dibandingkan dengan kedua model sebelumnya, maka sering digunakan untuk

mendeteksi antigen dan antibodi yang mempunyai konsentrasi lebih rendah

dibandingkan dengan kedua model sebelumnya.

Antibodi sekunder terlabel enzim

Antibodi primer
Antigen
Antibodi monoklonal

Aplikasi ELISA
Aplikasi ELISA untuk mendeteksi infeksi virus dapat dilakukan dengan dua cara, yang
pertama adalah mendeteksi reaksi imun (interferon, sitokin, antibodi) dan yang kedua adalah
mendeteksi antigennya. Model ELISA direct maupun indirect dan sandwich ELISA baik
dengan sistem peroksidase maupun alkali fospatase dapat digunakan.
Sampel yang dapat digunakan untuk deteksi antigen antara lain jaringan, sekresi dan
eksresi, walaupun ada factor pembatas. Jika kadar antigen tidak cukup banyak maka harus
dilakukan pembiakan pada sel kultur. Tetapi bila antigen dalam sampel cukup maka dapat
langsung dilakukan ELISA. Misalnya sampel untuk virus golongan flavivirus plasma atau
serum adalah merupakan sampel yang banyak mengandung virus.
Jika sampel rusak dan tidak mungkin dilakukan multiplikasi pada media pertumbuhan
virus, maka yang paling baik dan banyak diterima adalah dengan menggunakan antibodi
monoklonal karena lebih spesifik pada epitop tertentu dibandingkan dengan antibodi
poliklonal. Bahan lain yang cukup representative untuk pemeriksaan antigen adalah berasal
dari tinja. Model pengumpulan sampel dari tinja ini kebanyakan digunakan untuk mendeteksi
virus yang menyerang pada saluran pencernaan seperti rotavirus, coronavirus, parvovirus.
Sementara itu untuk mendeteksi virus yang menyerang saluran pernapasan sampel yang dapat
dideteksi antigennya adalah nasofarinks dan trakea, seperti virus IBRV (infectious bovine
rhinotracheitis virus), ND virus, IB, ILT dan sebagainya.