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Toda la informacin gentica esencial para la vida de la bacteria est contenida en una nica
molcula de cido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace
covalente. Dicha molcula se denomina cromosoma bacteriano.
Las bacterias Gram (-) no necesita el tratamiento con lisozima (Enzima bactericida que impide
infecciones y que est presente en numerosas sustancias segregadas por los seres vivos, como las
lgrimas, la saliva o la leche.) que si necesitan las bacterias Gram (+) que son ms difciles de
lisar y necesitan para ellos enzimas lticos.
Lisis celular
1. Aadir 1.5 ml de un cultivo overnight a un tubo de 1.5 ml.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.
3. Aadir 600 l de Solucin de Lisis al pellet (denominacin genrica, utilizada para referirse a
pequeas porciones de material aglomerado o comprimido) celular y pipetear para resuspender y
lisar las clulas.
4. Incubar las muestras a 80C durante 5-10 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Precipitacin del ADN
1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600l de
isopropanol. Mezclar por inversin varias veces.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 3 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante. Aadir 600 l de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el
pellet de ADN.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar todo el etanol. Vigilar
no perder el pellet de ADN
5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratacin del ADN 1.
Aadir 500-750 l de Solucin de Hidratacin del ADN. Resuspender mediante micropipeta el
pellet blanco. La incubacin a 55C con peridicas agitaciones con vortex ayudar a la
disolucin del ADN.
(BIOTED, S.f)
Bibliografa
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http://bioted.es/protocolos/EXTRACCION-ADN-BACTERIANO.pdf
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http://www.scielo.org.co/pdf/biote/v15n2/v15n2a21.pdf
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Extraccin de protenas
Mtodos en estado slido.
Moler en un mortero: Las clulas son rotas por medio de una molienda con abrasivos
como la arena o almina.
Molino con perlas: Las clulas son trituradas con esferas de vidrio o acero.
Shock osmtico: Ruptura osmtica de la membrana. La clulas se hacen estallar al
someterlas a un medio hipotnico, lo cual hace que la membrana no resista la presin
osmtica. Puede ocasionar el dao a las membranas de algunas organelas. No se
recomienda porque en algunas organelas se lesiona la membrana. Es utilizado para el
aislamiento: Mitocondria y Cromosomas Mitticos.
METODOS FISICOS
Descompresin de gas: Ruptura esplnica de las clulas por la generacin de burbujas al
disminuir la presin (ley de Henry).
Cavitacin hidrodinmica: Consiste en la formacin de micro burbujas de vapor
producidas de forma mecnica en un medio lquido por variaciones en la presin, lo cual
induce al rompimiento de la pared celular.
Desecacin: Puede ser secado por aire forzado, secado al vaco y secado por solventes y
consiste en la deshidratacin celular, provocando un rompimiento de las mismas.
pH extremos: Transiciones en la escala de pH, bsico y cido. Algunas clulas no son
resistentes a estas variaciones.
Detergentes: Permeabilizacin de clulas por solubilizacin de protenas de membrana,
debido a apertura de poros. Ejemplo: Triton X-100, SDS, Tween, Spam.
Mtodos qumicos.
Solventes orgnicos: Disuelven la pared celular fundamentalmente por la disolucin de
lpidos asociados a membranas. Ejemplo: Tolueno, acetona.
Antibiticos: Algunos se utilizan por sus propiedades en la sntesis de la pared celular,
como algunas penicilinas.
Agentes quelantes: Algunos como el EDTA atrapan cationes divalentes (Ca+2) que
debilita la membrana celular.
Agentes caotrpicos: Urea o sales de guanidina favorecen la disolucin de protenas y
minerales de la pared celular de algunas bacterias ocasionando su ruptura. Otro agente
caotrpico utilizado es el isotiocianato de guanidinio.
Adicin de enzimas: Lisozima + EDTA; esta combinacin digiere las paredes celulares
por ruptura de los enlaces (14) glicosdicos entre el cido N-acetilmurmico (NAM) y
la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopptido. Otro ejemplo es: la proteinasa K junto
con SDS.
Mtodos biolgicos
Autolisis: Es un proceso biolgico por el cual una clula se autodestruye, en vegetales la
absorcin de agua en exceso puede causar el rompimiento de vacuolas; en animales la
produccin de la enzima autolisasa puede ocasionar la hidrlisis celular; en bacterias las
enzimas autolticas de la pared bacteriana (autolisinas) lleva a la lisis celular.
Lisis inducible: Exponer las clulas a soluciones concentradas con sales y/o tratamiento
radioactivo puede inducir la lisis celular.
Inhibidores de pared celular: Algunas sustancias alteran la permeabilidad de la
membrana celular, como: polienos, polimixinas e imidazoles.
Lisis celular
Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos animales, pero no es suficiente
para clulas vegetales o bacterias. Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica
(ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior
de la clula, causando su hinchamiento y rotura.
BIBLIOGRAFIA.