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INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

I.

INTRODUCCIN

En los ltimos aos, la biotecnologa ha experimentado grandes avances y,


paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos
qumicos, en la industria alimentaria y farmacutica. Los procesos
catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya
que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores
convencionales no biolgicos: Presentan una gran actividad cataltica;
Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y
regioespecificidad); Son muy activos a temperatura ambiente y presin
atmosfrica. A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se
ha generalizado en los procesos qumicos industriales debido a que la
mayora de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por
otra parte al ser solubles en agua, su separacin de los sustratos y
productos es difcil, y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la
inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos
inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea
econmicamente rentable.

II.

ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIN DE ENZIMAS


La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza
a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas
insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas
repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel
proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de
libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a
un soporte.

Ventajas De La Inmovilizacin:
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar
3:
1. El aumento de la estabilidad de la enzima.
2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los
costes del proceso.
3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y
control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada.

Desventajas De La Inmovilizacin:

1. Origina limitaciones de difusin, por su naturaleza heterognea,


que reducen y alteran la actividad de lo que se inmoviliza.
2. Hay alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su
estado nativo.
3. Siempre hay una prdida de actividad de la enzima durante la
inmovilizacin.
4. Hay heterogeneidad del sistema enzima soporte donde pueden
existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un
diferente nmero de uniones al soporte.
Los diferentes tipos de reactores enzimticos aparecen en la Figura 1.
Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de
cargas elevadas de enzima, la cual mantendr su actividad durante ms
tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la
obtencin de productos con mayor pureza.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son:

La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su


estado nativo.
La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde
pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con
un diferente nmero de uniones al soporte.
Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima
durante la movilizacin.
El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

Figura 1: reactores
inmovilizadas.

enzimticos

que

emplean

enzimas

III.

METODOS DE INMOVILIZACION
FSICA

DE ENZIMAS POR RETENCIN

A. Atrapamiento:

Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de


una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros
fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato,
carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a
cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero.
Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o
mediante la adicin de un reactivo qumico.
El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms
resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el
interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra
ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento,
de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca
cantidad de enzima para obtener derivados activos.
Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su
estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de
las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la
naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.

Atrapamiento En Capas De Geles: la enzima queda atapada en


el interior de un gel.
Atrapamiento En Fibras De Geles: la enzima queda ocluda
dentro de las
microcavidades de una
fibra sinttica. El
atrapamiento es ms fuerte. Se da para inmovilizar penicilina
acilasa, lactasa, aminoacilasa.

B. Inclusin en membranas:

1) Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas


de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas
de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas
semipermeables pueden ser permanentes (originadas por
polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por
surfactantes,
tambin
llamadas
micelas
reversas).
Las
microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos
comprendidos entre 1 y 100 m de dimetro. Mediante este mtodo
se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de
enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo
determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos.
2) Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que
contengan enzimas atrapadas ha despertado gran inters en la
industria. Estos reactores emplean membranas permeables al
producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente
impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un
flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor. En general, en esta
metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin de la enzima
sobre la membrana que formar el reactor.

Esta adsorcin se puede realizar de dos formas:

Mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a


travs de la membrana
Por contacto continuo de una solucin de enzima con la
membrana.

IV.

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA

1. UNIN A SOPORTES:
Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone
de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace
resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador.

Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el


sustrato, disminuya la inhibicin, amplie el intervalo de pH ptimo y reduzca
las posibles contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener
resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y
ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado.
Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la
inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao,
densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en
forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas.
a. Adsorcin
En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar
mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes
de hidrgeno. Los principales factores que influyen en la adsorcin, son:
El pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas
que presenta la superficie de la protena y del slido;
La fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la
desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con
ms fuerza al soporte que la protena;
El dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el
tamao del eje mayor de la enzima;
La presencia de iones que acten como cofactores de la enzima,
ya que pueden incrementar la carga enzimtica del derivado.
Como principales ventajas de este mtodo destacan:

Su preparacin sencilla,
Su bajo coste,
No hay cambios de especificidad enzimtica,
Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo
contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:


la optimizacin de las variables que controlan la adsorcin,
los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecnico,
la unin al soporte es dbil.

Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear


resinas de intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y
contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan
cambios en la matriz insoluble.

b. Unin covalente:
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de
inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La
metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos
qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las
protenas (Tabla 1). De entre los 20 aminocidos diferentes que se
encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la
formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la
cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el
triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. El resto de
aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran
expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden
intervenir en la unin covalente.
Este mtodo presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla;
2. La carga de enzima permanece constante despus de la
inmovilizacin;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo,
empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la
temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener
estabilizada su estructura terciaria.
En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta
una serie de inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad
de superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzimasoporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a
derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del
centro activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la
inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro
activo.
3. La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas
enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc.

2. RETICULADO:

Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica


que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas
enzimas. El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos
bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas
de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear
dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e,
incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida. El resultado del
reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles
capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. El coreticulado, permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas
a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con
una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de lisina (por
ejemplo, la albmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilizacin
muy comn consiste en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una
resina de intercambio inico o un soporte polimrico (con lo que se
consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente aadir el
reactivo bifuncional.
Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la
cristalizacin de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehdo
(Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se
basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las molculas de
enzima estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de protena.
De esta manera la propia enzima acta como soporte, y su estructura
terciaria est estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares.
La estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50) que
permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde
se cataliza la reaccin. Estos cristales pueden soportar temperaturas
elevadas y pH extremos, as como la accin de las proteasas. Esta
tecnologa se ha aplicado a enzimas muy diferentes , las cuales se han
utilizado en la obtencin de compuestos enatiomricamente puros y en
la sntesis de pptidos.

1. Reticulado Puro: hace uso de los reactivos bifuncionales. Es un


ejemplo de este proceso el entrecruzamiento de la glucosa
isomerasa por el glutaraldehdo .
2. Coreticulado: Se da mediante el entrecruzamiento de las
enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en
residuos de lisina (ejemplo, albmina bovina). Permite eliminar las
prdidas de actividad enzimtica debida a efectos difusionales

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

FACULTAD DE CIENCIAS
Escuela Acadmica Profesional de Biologa Microbiologa

Seminario de biotecnologa
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS
Pertenece a

OSCAR FORA QUISPE


JOSE SANDOVAL NIEBLES

ASIGNATURA

BIOTECNOLOGA

PROFESOR

Ms. Daladier Castillo Cotrina

AO

5TO

TACNA PERU
2015

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