TEMA 1.2.

- TCNICAS BSICAS EN LABORATORIO DE

BIOQUMICA
1.1.- Pesada de sustancias
Una de las primeras operaciones que se realizan en el laboratorio es la
de pesar una sustancia para determinar su masa. Esta operacin es de una
importancia primordial. De que se realice bien o mal va a depender, por
ejemplo, que una disolucin tenga la concentracin adecuada, que un anlisis
resulte positivo o negativo o que el rendimiento de una reaccin sea el correcto.
Para pesar un cuerpo se utiliza la balanza. Hay distintos tipos de
balanza y el uso de una u otra depender de la magnitud del peso a medir.
Generalmente la precisin de una balanza est relacionada con su capacidad,
es decir, a mayor capacidad menor precisin y a la inversa.
TIPO DE BALANZA
Granatario
Analtica
Semi-micro
Micro

CAPACIDAD
2 kg
200 g
100 g
30 g

Para un adecuado uso y conservacin de las balanzas, se debe tener en

cuenta los siguientes aspectos:
1.- El platillo de la balanza debe estar siempre limpio. Tras las pesadas siempre
se limpiar.
2.- Los reactivos slidos nunca deben ponerse sobre el platillo, ya que no solo
se producir contaminacin entre slidos sino que se producir la corrosin del
mismo.
3.- Para pesar cualquier slido (Prctica 1) deben seguirse las siguientes
instrucciones:
- Tener en cuenta las caractersticas generales e instrucciones de la balanza a
utilizar.
- Mantenerla siempre nivelada.
- Para pesar se utilizar un recipiente limpio y seco: vaso de precipitado, vidrio
de reloj, etc.
- Pesar el recipiente y realizar la lectura o bien, tarar.
- Agregar al recipiente anterior el slido con sumo cuidado para evitar
derramamientos, aadindolo poco a poco hasta alcanzar la medida deseada.
4.- Para pesar lquidos (Prctica 2) se proceder de la misma manera que para
la pesada de slidos, slo que siempre se utilizar un vaso de precipitado para
las correspondientes pesadas. Para ajustar el peso se aadir o se retirar
lquido con una pipeta de Pasteur.
1

1.2.- Medicin de volmenes: Dispensadores, pipetas y

micropipetas.
Las mediciones y transferencias de volmenes exactos y precisos son
requisitos bsicos en bioqumica. Estos procedimientos son realizados
utilizando instrumentos como las pipetas manuales, las micropipetas, las
buretas, las probetas o matraces aforados. El grado de precisin de los mismos
puede variar considerablemente as que la utilizacin de un instrumento u otro
para realizar una medicin en particular es un paso importante para obtener el
resultado esperado. Es necesario, adems, realizar con agilidad conversiones
de unidades de volumen, sobre todo las ms utilizadas en el laboratorio de
bioqumica que van de los mililitros a los nanolitros.

Dispensadores (Prctica 3)

El dispensador es un equipo de la familia de las

pipetas. Son dispositivos que acoplados a un
recipiente, se pueden graduar para que, mediante un
mbolo, puedan dispensar un volumen definido de
lquido. En el laboratorio se encuentran diversas
clases de dispensadores, manuales (analgicos y
digitales) y automatizados, controlados mediante
programas de ordenador.

Pipetas. Tcnica de pipeteo. (Prctica 4 y 5)

El PRIMER PASO de una buena tcnica de pipeteo es seleccionar la pipeta

ms apta para el volumen que se desea medir. Es precisamente este volumen
el que determina la pipeta a utilizar: el volumen a pipetear debe ser lo ms
cercano posible a la capacidad mxima de la pipeta. Adems, debe
considerarse que el volumen mnimo que una pipeta puede dispensar con
precisin es aproximadamente el 10 % de su capacidad.
Es necesario familiarizarse con estos tipos de pipetas y sus escalas.
El SEGUNDO PASO es ajustar en la boquilla de la pipeta el dispositivo que
se utilizar para crear vaco y succin denominado propipeta que consiste en
un dispositivo mecnico de aspiracin que se conecta a la parte superior de la
pipeta para evitar la ingestin accidental de sustancias txicas.
Existen varios tipos:

Pera de goma. Consiste en un elemento globular

de caucho con tres vlvulas. Forma de uso:
1) Para expeler el aire presione la vlvula A sobre la
parte superior del bulbo.
2) Succione el lquido hacia arriba presionando la
vlvula S (A) ubicada en la parte inferior.
3) Para descargar presione la vlvula E que se
encuentra al costado de la vlvula S (C). Las tres
vlvulas poseen bolillas de vidrio que controlan el
vaco para un preciso trabajo de llenado y vaciado
de las pipetas.

Propipetas de mbolo. Consisten en tubos de

plstico, con un mbolo en un extremo y un
tubito de caucho en el otro, ruedecilla y
palanca. Forma de uso: ajustar el extremo de
caucho a la pipeta, aspirar hasta la medida
deseada girando la ruedecilla, dispensar el
lquido apretando la palanca, eliminar la ltima
gota apretando el mbolo.

 Propipetas automticas.
Pueden ser
elctricas o con bateras, poseen regulador
de velocidad de aspirado y dispensado,
provistas de filtro hidrofbico que previene la
sobre
aspiracin.
Algunas
incluyen
adaptadores intercambiables para varios tipos
de pipetas, indicador de batera baja y
soporte incorporado que posibilita dejar la
propipeta con la pipeta puesta cuando no se
utiliza.

El TERCER PASO es medir el volumen deseado.

Para ello aspiraremos el lquido hasta el enrase
adecuado, teniendo en cuenta, que la medida ser
precisa cuando el fondo del menisco formado
coincida con el mismo, es decir, que la marca de la
medida sea tangente a la convexidad del menisco.
Para ello debemos fijar la vista al mismo nivel del
enrase.

Micropipetas. (Prctica 6)

Las micropipetas son dispositivos mecnicos de alta precisin que permiten

medir y transferir volmenes muy pequeos de soluciones con elevada
exactitud. Son un instrumento fundamental en el laboratorio de Bioqumica que
permite medir volmenes pequeos que van desde 1 l hasta 1 ml o ms. Las
hay de volumen fijo o volumen variable, as como unicanal o multicanal. En las
de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de
valores determinados. Utilizan puntas o tips desechables plsticos que se
ajustan al extremo de la micropipeta. En estas puntas de plstico es donde se
deposita el lquido a medir.

Instrucciones de manejo.
1. Seleccin de la micropipeta segn el volumen a dispensar. La mayora de
las micropipetas indican en el botn pulsador el rango o volumen mximo que
pueden pipetear. Para prevenir un dao en el mecanismo interno de la
micropipeta nunca se debe sobrepasar los volmenes mximos permitidos
para cada micropipeta.
2. Las micropipetas que tienen un rango de volumen ajustable, es necesario
seleccionar el volumen a medir. Para ello se debe localizar el indicador de
volumen, compuesto de tres dgitos que se deben leer de arriba hacia abajo.
En la parte ms baja del indicador hay una escala que permite el ajuste del
volumen al ltimo dgito o decimal permitido segn el caso.

3. Para ajustar el volumen de la pipeta suelen tener un botn pulsador giratorio

o una rueda de graduacin del volumen. Girando uno u otro, se ajusta el valor
deseado.
4. Seleccionar la punta o tip plstico apropiado para la micropipeta: la punta
debe ajustarse al cono de la micropipeta. Al insertar la punta en el cuerpo de la
pipeta hay que aplicar una fuerte presin con movimiento giratorio para
asegurar la hermeticidad. Nunca usar la pipeta con lquidos sin la punta
colocada. Es posible que la punta plstica se encuentre en una caja tambin
plstica que facilita su uso. Si la punta no queda bien ajustada o no est en
caja, deber ajustarse con la mano sin tocar la superficie que estar en
contacto con la solucin a extraer.
5. Aspiracin: apretar el botn pulsador hasta el primer tope.
6. Con la pipeta en posicin vertical, sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm en
la muestra.
7. Lentamente se aspira el lquido al relajar la presin del dedo sobre el botn
pulsador. Si este paso no se realiza con atencin, puede entrar aire en la punta
y la cantidad de muestra aspirada no ser la adecuada.
8. Esperar un segundo y retirar la punta del lquido.
9. Dosificacin: colocar la parte inferior de la punta contra la pared interior del
recipiente donde se depositar el lquido, con un ngulo entre 10 y 40.
10. Apretar el botn pulsador suavemente hasta el primer tope y esperar un
segundo.
11. Apretar el botn pulsador hasta el segundo tope para vaciar el resto del
lquido.
12. Manteniendo apretado el botn pulsador en el segundo tope, retirar la
pipeta deslizando la punta por la pared del recipiente. Soltar luego el botn
pulsador.
13. Expulsar la punta apretando el botn del expulsor.

Para no daar el sistema interno de pistones que posee la micropipeta:

- el lquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta
- nunca vuelque la micropipeta con la parte de arriba hacia abajo
- nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene lquido
- nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta
Con respecto a la micropipeta multicanal, stas tienen la ventaja de que
se puede pipetear el mismo volumen al mismo tiempo en varios recipientes a la
vez. Estas micropipetas fueron diseadas principalmente para los ensayos en
formato micro, donde se utiliza tambin un plato de plstico de 96 pocillos para
trabajar esa cantidad de ensayos de forma simultnea. Las micropipetas
multicanal son dispositivos ms complejos que las micropipetas unicanal ya
que bsicamente pueden repetir en un solo momento la funcin que realiza
esta ltima varias veces. Para ello, poseen un solo mango, botn pulsador, etc
pero un cono que permite la insercin de 4 hasta 12 puntas al mismo tiempo.
Para su uso, se deben tener los mismos cuidados que con las micropipetas
unicanal, adems de cerciorarse que todas las puntas estn bien colocadas,
que extraigan la misma cantidad de solucin y que no se observen burbujas de
aire en ninguna.

Uso de buretas (Prctica 7 y 17)

Las buretas son tubos largos, graduados, de dimetro interno

uniforme, provistas de una llave en su parte inferior. Se usan para
verter cantidades variables de lquidos, y por ello estn graduadas
con pequeas subdivisiones (dependiendo del volumen, de dcimas
de mililitro o menos). Su uso principal se da en volumetras, debido a
la necesidad de medir con precisin volmenes de lquidos.
Para llenar una Bureta, se cierra la llave de paso completamente. Se
vierte el lquido por su extremo superior utilizando un embudo o
pipeta de Pasteur.
Anterior a la titulacin, se llena la bureta con solucin del agente
valorante y se verifica que la solucin fluya libremente, procediendo
al desage. Con esta maniobra se asegura que no quede gota
residual alguna de agua.
Verificar, tambin, que no aparezca una burbuja de aire en la punta de la
bureta. Eliminarla burbuja tocando el lado de la punta de la bureta mientras la
solucin fluye. Si una burbuja de aire est presente durante una titulacin, se
cometera un error en las lecturas de volumen.
Posteriormente, se enjuagua la punta de la bureta con agua utilizando un
frasco lavador y se seca cuidadosamente. Despus de un minuto verificar que
la bureta no gotee. La punta debe estar limpia y seca antes de tomar una
lectura del volumen inicial.
Una vez llena, sin burbujas de aire o goteras, tomar una lectura del
volumen inicial leyendo el fondo del menisco con el ojo a nivel del menisco, no
por encima o por debajo. La lectura desde otro ngulo, que no sea el recto, da
por resultado un error de paralelismo.
Liberar la solucin al frasco de la titulacin utilizando la llave de paso. Se
debe liberar la solucin rpidamente hasta un par de [mL] antes del punto final.
Debe acercarse al punto final despacio, gota a gota.

3.3.- Preparacin de soluciones

Una solucin es una mezcla homognea de al menos dos sustancias,
una que se conoce como soluto y otra que se conoce como solvente,
disolvente o diluyente y que generalmente est en mayor proporcin que la
primera. El solvente universal es el agua y por lo tanto no es de extraar que
casi todas las soluciones utilizadas en bioqumica utilicen agua como
disolvente.

Clculo del soluto

La concentracin de una solucin se expresa bsicamente en dos tipos

de expresiones: aquellas que expresan la concentracin de forma porcentual
(unidades fsicas) y aquellas que la expresan como unidades qumicas
(fundamentalmente molaridad y normalidad).
Las concentraciones expresadas en unidades fsicas de forma
porcentual se refieren a partes de soluto por 100 partes de la solucin, de ah el
trmino porcentaje o por cien. Estas pueden enunciarse como:

-Peso por unidad de peso (o peso en peso o p/p): (Prctica 8) los dos, el soluto
y el solvente son pesados en gramos y la proporcin de soluto se expresa por
100 g de solucin.
-Peso por unidad de volumen (o p/v): (Prctica 9) nmero de g de soluto en
100 ml de solucin
-Volumen por unidad de volumen (o v/v): (Prctica 10) nmero de ml de soluto
en 100 ml de solucin. Ejemplo: una solucin de HCl al 1% (v/v) contiene 1 ml
de HCl puro por 100 ml de solucin.

Si el porcentaje no especifica la forma de expresin, es decir, p/p, v/v o

p/v, se asume que el porcentaje est expresado en peso por unidad de
volumen.
Con respecto a las unidades qumicas, la molaridad expresa la
concentracin de una sustancia en trminos de nmero de moles por litro de
solucin (su smbolo es M) y la normalidad expresa el nmero de
equivalentes gramos por litro de disolucin (N). (Prcticas 11 y 12).

Procedimiento

Para preparar disoluciones deben seguirse los pasos siguientes:

Calcular las cantidades de solutos y disolvente necesarias.

Pesar o medir la cantidad de soluto.

Transferir a un matraz aforado, el cual debe ajustarse al volumen de

disolucin a preparar. Si el soluto es slido y se ha pesado en vidrio de
reloj, se traspasar a un vaso de precipitados, con un frasco lavador se
enjuagar el vidrio para que no quede slido adherido. Posteriormente
se aade ms disolvente al vaso de precipitado y con ayuda de una
varilla se transfiere al matraz. Se vuelve a enjuagar el vaso de
precipitados y se vuelve a trasvasar al matraz. Debe tenerse en cuenta
que nunca se debe sobrepasar la cantidad de solvente a utilizar en la
preparacin de la disolucin.

Aadir el resto del solvente al matraz aforado hasta acercarse al

enrase.

Enrasar con una pipeta de Pasteur.

Colocar el tapn, invertir y agitar suavemente hasta que el soluto se disuelva

completamente.

3.4.- Clculo y expresin de diluciones (Prcticas 13 a 16)

Una dilucin consiste en preparar una solucin menos concentrada a
partir de una ms concentrada. Esta prctica es muy comn en los laboratorios
y de ella depende en gran parte el resultado final analtico que se obtenga. Por
lo tanto es imperativo el manejo de este tipo de clculos para cualquier persona
que trabaje dentro de un laboratorio. Las diluciones generalmente se expresan
como una razn matemtica, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10 (o 1/10), etc. En el
caso de una dilucin 1:5, sta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una
sustancia en un volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un
volumen (o peso) total de 5 volmenes. Ntese que el volumen total o final
estar compuesto de 1volumen de la sustancia a diluir y 4 volmenes del
disolvente. Para calcular la concentracin final de una solucin diluida, se
multiplica la concentracin de la solucin original por la dilucin expresada
como fraccin. Ejemplo: una solucin de urea cuya concentracin es de 5
mg/ml es diluda 1/10. La concentracin final de la solucin diluida es 5 X 1/10=
0.5 mg/ml.
La ecuacin ms comnmente utilizada para preparar diluciones es:
V1 X C1 = V2 X C2
donde V1 es el volumen de la solucin concentrada que se debe aadir para
preparar la solucin diluida,
C1 es la concentracin de la solucin concentrada
V2 es el volumen de la solucin diluida
C2 es la concentracin de la solucin diluida.
Al utilizar esta ecuacin debe tomarse en cuenta que tanto las unidades
de V1 y V2 as como las de C1 y C2 deben ser las mismas.
El factor de dilucin representa el nmero de veces que fue diluida la
solucin concentrada. Si se hace no una sino una serie de diluciones, la
concentracin de la solucin final se obtiene al multiplicar la concentracin
original por el producto de los factores de dilucin. Ejemplo: si una solucin de
glucosa de 45 mol/l es primero diluida 1/9 y luego 1/100, la concentracin final
de la solucin ser 45 X 1/9 X 1/100= 0.05 mol/l, con un factor de dilucin de
900.
Las diluciones seriadas son tambin muy tiles. Estas diluciones son
aquellas en las cuales todas las diluciones hechas a partir de la primera o luego
de la primera poseen el mismo factor de dilucin. Ejemplo: para determinar la
concentracin de protenas en un suero animal, la muestra es diluida 1/5
mediante la adicin de 0.02 ml de suero a 0.08 ml de solucin salina en el tubo
nmero 1. Los tubos 2 al 8 contienen 0.5 ml de solucin salina como diluyente.
La dilucin seriada se realiza al transferir 0.5 ml del tubo 1 al tubo 2, mezclar y
transferir 0.5 ml del tubo 2 al tubo 3 y as sucesivamente hasta el tubo 8. La
concentracin de suero en los tubos 2 al 8 decrece por un factor de 2, siendo
cada dilucin: tubo 1:1/5, tubo 2: 1/10, tubo 3: 1/20, tubo 4: 1/40, tubo 5: 1/80,
tubo 6: 1/160, tubo 7: 1/360 y tubo 8: 1/640.