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Universidad Nacional

“San Luis Gonzaga”

DEGRADACIÓN DE PETRÓLEO POR


BACTERIAS HIDROCARBUROCLÁSTICAS
PRACTICA N°5 DE BIOTECNOLOGÍA

DOCENTE:

DRA. ROSA ALTAMIRANO DÍAZ

PRESENTADO POR:

BRAVO ROMERO, ANGELA F.


HUAMÁN CAICHIHUA, NADIA
LOPEZ MONTOYA, VICTOR W.
RAMOS BURGOS, ALFREDO J.
VALVERDE LUNA, KATHERINE

X CICLO

ICA – PERÚ
2010
DEGRADACIÓN DE PETRÓLEO POR BACTERIAS HIDROCARBUROCLÁSTICAS
PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA

PRACTICA N°5
DEGRADACION DE PETROLEO POR BACTERIAS HIDROCARBUROCLASTICAS

I. INTRODUCCIÓN

La industria petroquímica es importante en una sociedad moderna, no obstante la falta de un


programa de protección ambiental, hace que el medio ambiente se contamine al producirse
derrames de petróleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los oleoductos,
descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a través de fisuras de la
corteza terrestre y debido a la producción, transporte y almacenamiento de este recurso
natural (3).
El petróleo crudo es una mezcla extremadamente compleja y variable de compuestos
orgánicos, donde la mayoría de los ellos son hidrocarburos, que varían en peso molecular
desde el gas metano hasta los altos pesos moleculares de alquitranes y bitúmenes. Estos
hidrocarburos pueden presentarse en un amplio rango de estructuras moleculares: cadenas
lineales y ramificadas, anillos sencillos, condensados o aromáticos. Los dos grupos principales
de hidrocarburos aromáticos son los monocíclicos, el benceno, tolueno y xileno (BTEX) y los
hidrocarburos policíclicos (PAHs) tales como el naftaleno, antraceno y fenantreno (2).
Los dispersantes químicos utilizados para favorecer la biorremediación de los ambientes
contaminados pueden causar un mayor impacto ecológico que el mismo derrame, por su
toxicidad y recalcitrancia a la biodegradación. Por tanto, una mejor alternativa de solución es
el proceso de biorremediación, que es el tratamiento biológico del suelo, aire y agua,
mediante la biodegradación de compuestos tóxicos para transformarlos en compuestos de
menor o ningún impacto ambiental. Así en la biodegradación de hidrocarburos, se utilizan
bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas: Brevibacterium, Spirillum,
Xanthomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Nocardia, Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter,
Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp.,
Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aureofasciens, etc., las cuales disminuyen la
concentración de hidrocarburos presentes en el ambiente y al mismo tiempo son inocuas
para la salud y el medio ambiente. Estas bacterias producen bioemulsificantes y
biosurfactantes que disminuyen la tensión superficial entre el petróleo y el medio acuoso
facilitando el acceso microbiano a la fuente de carbono insoluble para su degradación (1).
Es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo fundamental evaluar el potencial de
biodegradación de hidrocarburos que tiene un consorcio bacteriano recientemente aislado,
determinando la biomasa inicial y final en el biorreactor, y que sirva como una alternativa
para la solución de los problemas generados por estos compuestos en la industria petrolera
peruana.

OBJETIVO BACTERIANO
DEGRADACIÓN DE PETRÓLEO POR BACTERIAS HIDROCARBUROCLÁSTICAS
PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA

II. MATERIALES

Material biológico: Utensilios:

 Cepas mixtas de Bacterias  Asa y porta-asa microbiológica


Hidrocraburoclásticas  Mechero
 Pinzas de disección
Equipo:  Perlas de vidrio

 Balanza analítica Varios:


 Incubadora
 Biorreactor burbujeado.  Algodón
 Papel Craff
Cristalería:  Papel aluminio
 Ligas
 Matraz Erlenmeyer de 500 y 1000  Cinta de pH.
mL
 Pipetas de 5 y 10 mL Insumos y Reactivos:
 Vaso de precipitados de 250 y 1000
mL  Caldo Petróleo al 5%
 Tubos de Ensayo 18 x 150  Agar Nutritivo
 Tubos de Ensayo 18 x 150  Agar Plate Count
 Placas petri  NaCl
 Frasco Schott  Agua destilada

III. PROCEDIMIENTO

a) REACTIVACIÓN DE LA CEPA

Se repicó por estría dos cultivos mixtos de bacterias hidrocarburoclásticas aisladas en


tubos con agar nutritivo. Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.

Repicaje de las cepas

b) PREPARACIÓN DEL INÓCULO

Proliferación celular:

Se sembró en toda la superficie de 2 placas con agar nutritivo e incubó a 37ºC por 24
horas.
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Cultivo proliferado

Cosecha celular:

a. Añadimos 3 ml de SFF estéril en cada placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio estériles.
Luego movimos las placas suavemente hasta obtener una suspensión celular.

Agregando la Solución Salina Fisiológica Removiendo células con perlas de vidrio

b. Se extrajo la suspensión celular y lo colocamos en un frasco schott de 150 ml estéril.

Extrayendo la suspensión bacteriana.


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Obtención del inóculo:

a. Realizamos el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar Plate


Count de diluciones seriadas del cultivo (aprox. Entre 107 y 108 UFC/ml).

EL CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DEL INÓCULO SE OBTENDRÁ EN LOS PASOS


SIGUINTES

c) PREPARACIÓN DEL BIORREACTOR

Armar y esterilizar el biorreactor de columna burbujeado.

Armando el Biorreactor de columna burbujeado

d) PRODUCCIÓN DE BIOMASA

a. Se colocó 5 ml. del inóculo y el medio base + petróleo (caldo petróleo) al 5% hasta un
volumen de trabajo de 800ml. en el biorreactor.

Caldo petróleo al 5%

Agregando el caldo petróleo


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Agregando el inóculo

b. Se sembró por incorporación en 3 placas con agar Plate Count para obtener la
Concentración Inicial de Fermentación y con este dato obtener la Concentración del
Inóculo y se incubó a 37ºC por 24 horas.

Calculo de la Concentración del Inóculo

 Concentración Inicial de Fermetación obtenida: 8.3 x 1010 UFC/ml.

Ci = ? CIF = 8.3 x 1010 UFC/ml.


V1= 5 ml. V2 = 805 ml.

Ci x V1 = CIF x V2
(Ci) x (5 ml.) = (8.3 x 1010 UFC/ml.) x (805 ml.)

CIF = 1.33 x 1013 UFC/ml

c. Poner en funcionamiento ininterrumpidamente por espacio de 7 días a temperatura


ambiente.

Con solo 1.35 de VVM

Comienzo de fermentación
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IV. RESULTADOS

La evaluación de la Biodegradación del Petróleo se llevó a cabo solo por siete díaz,
obteniendo lo siguientes datos:

A. CARACTERÍSTICAS DEL FERMENTO

TABLA N°1
Características del Medio de Fermentación a los siete días

Carácterística Primer día (*) Sétimo día

Menos turbio al principio Mas turbio al término de la


Turbidez dado que los hidrocarburos concentración dado que hay
del Petróleo están intactos. un aumento de subproductos
del petróleo solubles.

Ascenso rápido de micelas de Ascenso lento de micelas,


Consistencia del Petróleo, debido a la mínima debido a gran degradación de
Petróleo degradación hasta esa las cepas bacterianas al
momento. Petróleo

Concentración Sin aumento Aproximadamente a continúa


Bacteriana en aumento, ya que todavía
hay presencia de micelas.

(*) Se considera primer día al tiempo “0”

B. CONCENTRACIÓN FINAL DE FERMENTACIÓN

La concentración final de fermentación del Caldo Petróleo al 5% a los 7 días posterior al


agregado el inoculo fue de: 2.1 x 1018

Recuento Final

Biorreactor a los 7 días de fermentación


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V. DISCUSIÓN

En Perú se registran derrames de petróleo desde 1978, los cuales contaminan el medio
ambiente. Ante este problema surge la biorremediación como alternativa de solución, la cual
es el tratamiento biológico de suelos, agua y aire, mediante la biodegradación.
Adicionalmente es necesario la utilización de procedimeintos industriales adaptados para
este método, debido a su validez adquirida a lo largo del tiempo y el tratamiento de grandes
volúmenes.

En el presente estudio, después de determinar un inóculo de 1.33 x 1013 UFC/ml, se presentó


notable efectividad al realizar un proceso en la mitad del tiempo requerido, es decir que
siendo necesario un tiempo de 15 días en el biorreactor, bastó con 7 días para poder
visualizar y comprobar la degradación del petróleo.

VI. CONCLUSIONES

• El experimento fue un éxito, debido a que se determinó un resultado mediante el


proceder de técnicas preestablecidas en la degradación de petróleo mediante un
biorreactor de columna burbujeado.

• El inóculo agregado al medio fermentación con petróleo al 5% fué más eficiente de lo


esperado a los 7 días.

• Se logró determinar el incremento de especimenes bacterianos hidrocarburoclásticos, a


través del conteo de UFC del boirreactor antes y después de la fermentación. Teniendo
en un principio de la degradación una cantidad de 8.3 x 1010 UFC/ml. y 2.1 x 1018 UFC/ml.
al final de la degradación.

• El incremento de la carga bacteriana hizo evidente una degradación parcial de los


hidrocarburos del petróleo, lo cual se observó a simple vista en la parte superior del
biorreactor.

• El biorreactor de columna burbujeado utilizado fué efectivo para este procedimiento


realizado con microorganismos aerobios, ya que el suministro de oxígeno (1.35 VVM) fue
difundido aparentemente con notoria homogenicidad.
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PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA

VII. REFERENCIAS

1. Aycachi R. Biodegradación de Petróleo Diesel. [Internet]. Chiclayo-Perú, 2008. [Acceso 15


de abril del 2010]. Disponible en:
http://www.scribd.com/doc/6440793/Biodegradacion-de-Petroleo-DieselPRESENTACION

2. Vargas, A. y col. Biorremediación de Residuos de Petróleo. [Base de datos en Internet].


Colombia, 2004. [Acceso 15 de abril del 2010]. Disponible en:
http://ciencias.uniandes.edu.co/pdf/petroleo.pdf

3. Wedel, R.; Mosquera, J.; Goldsmith, D.; Hater, G.; Wong, A.; Fox, T.; Hunt, W.; Paules, M.;
Guiros, J.; Iegand, J.1988. Biodegradación Bacteriana de Hidrocarburos del Petróleo
en aguas residuales, in situ, en California. Water Science and Technology. 20
(11/12):501-530.

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