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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE


BIOTECNOLOGA
FISIOLOGA DE LA NUTRICIN
PRCTICA NM. 3
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS INDISPENSABLES
(METODO ESPECTROFOTOMETRICO PARA LA DETERMINACIN DE
TRIPTFANO SEGN BEAVEN Y HOLLIDAY)

1. OBJETIVOS
1.1.

Evaluar la importancia de conocer el contenido de aminocidos


indispensables en los alimentos naturales y procesados.

1.2.

Determinar el contenido de triptfano en algunos alimentos naturales y


procesados.

2. INTRODUCCIN
La mayora de los aminocidos constituyentes de protenas son prcticamente
transparentes en la regin 250-320 nm del espectro ultravioleta, y es sabido que
fenil alanina, tirosina y triptofano son los responsables de la absorcin de la luz
ultravioleta en soluciones de protenas. La fenil alanina presenta una absorcin
muy dbil en este intervalo de longitud de onda y en soluciones acuosas de NaOH
0.1M presenta un mximo de absorcin a 258.5 nm, teniendo un coeficiente de
extincin molar de valor bajo.
La absorcin de la luz ultravioleta ejercida por tirosina (Tyr) y triptofano (Try) es
mucho mayor que la absorcin presentada por fenil alanina en la misma regin del
ultravioleta, por lo que puede despreciarse el valor de sta ltima, y por tanto, se
puede considerar a la solucin de protena como un sistema de 2 componentes
para el anlisis espectrofotomtrico. Las soluciones equimoleculares de Tyr y Try
presentan la misma absorcin a 294 nm se encuentran en solucin alcalina 0.1M.
El mtodo est basado en dos observaciones hechas sobre el espectro de
absorcin ultravioleta en la regin de 250 a 320 nm, de la mezcla de Tyr y Try

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

puros a concentraciones equimoleculares conocidas en solucin 0.1M de NaOH.


El mximo de absorcin de Try se observa a 280 nm y a 294 nm para Tyr. Figura
(3)
Este mtodo de mezclas es estrictamente aplicable cuando se mantiene la ley de
Lambert-Beer. En los casos de aminocidos aromticos, la ley de Lambert-Beer es
vlida slo para ciertos intervalos. Las mediciones de absorbancia de una solucin
de protenas en lcali N/10, determinadas para las longitudes de onda de 280 a
294 nm, a la vez referidas a los valores del contenido de nitrgeno, se utilizan para
calcular la cantidad de Triptfano presente, por sustituciones desarrolladas por
Beaven y Holliday (1).
M Try = (0.263 A280 0.170 A294) x 10-3
M Tyr = (0.592 A294 0.263 A280) x 10-3

3. INVESTIGACIN PRELIMINAR.
3.1. Explicar los fundamentos en los que se basa la tcnica para la determinacin
de triptfano.
3.2. Investigar el contenido de triptfano en los alimentos que se analizarn en la
prctica.
3.3. Investigar sobre la importancia de conocer el contenido de aminocidos
indispensables en los alimentos.

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
4.1. El profesor responsable de la prctica indicar los alimentos que se
analizarn.
4.2. Llevar a cabo la determinacin que se indica a continuacin:
Espectro de absorcin de la mezcla de las soluciones de triptofano y tirosina
REACTIVOS
Solucin de NaOH 0.1 M
Prctica Nm. 3

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

PROCEDIMIENTO
A una mezcla equimolecular de los aminocidos Try y Tyr (0.1 mM) se le
determina el valor de absorcin en la regin ultravioleta del espectro de la luz
entre 270 y 315 nm y para las regiones de mxima absorcin se determina la
absorbancia a intervalos entre 5 a 1 nm de longitud de onda. Se construye una
figura con los valores de absorbancia obtenidos para longitud de onda. El valor
mximo de absorcin para tirosina se obtuvo a una longitud de onda de 294 nm y
para triptofano a 280 nm.
DESCRIPCIN DEL MTODO
Las muestras de los diferentes alimentos fueron puestas en los matraces, a los
cuales se les agregaron 20 mL de NaOH 0.1M, las suspensiones fueron
calentadas a reflujo por 30 min.
Transcurrido este tiempo, se enfran los matraces y su contenido se filtra o
centrfuga segn el caso, el sobrenadante obtenido se vaca cuantitativamente en
un matraz aforado de 25 mL, con la solucin de NaOH se lleva a un volumen final
de 25mL. De cada una de estas disoluciones se toma una alcuota en las celdas
de cuarzo de 1cm de paso de luz y se leen en el espectrofotmero a ambas
longitudes de onda.
Los valores obtenidos a esas longitudes de onda se substituyen directamente en
la ecuacin derivada por Beaven y Holliday (1), con lo cual se obtiene el contenido
de Try de las muestras de los alimentos.
Duracin del mtodo:

35 minutos

5. DISCUSIN Y ANLISIS DE RESULTADOS.


5.1. Presentar la curva tipo de triptofano obtenida, as como las determinaciones
de los alimentos problema.
5.2. Presentar en forma de tabla, con unidades, los resultados de las
determinaciones hechas a los alimentos, incluyendo en esta tabla los valores
establecidos en la bibliografa consultada.
5.3. Discutir, de manera integral, los resultados obtenidos, tomando en cuenta los
siguientes aspectos:
Prctica Nm. 3

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

El contenido de triptfano en los diferentes alimentos con respecto a lo


reportado para estos alimentos en la bibliografa.

Puntos crticos en las determinaciones.

Posibles fuentes de error en las determinaciones.

Importancia de conocer el contenido de aminocidos indispensables, como


el triptofano, en los alimentos.

6. CONCLUSIONES.
Elaborar sus conclusiones de la prctica en base al anlisis y discusin de
resultados y a los objetivos planteados.

7. BIBLIOGRAFA.
1. Beaven G.H. and Holliday E.R. Anlisis of the Absortion of Proteins in Term
of Tyrosine and Tryptophan Content. Adv. Protein Chem. 7, (1952), 369.
2. Bencze W.L. and Schimd Karl. Determination of Tyrosine and Tryptophan in
Protein. Anal. Chem. 29, (1957), 1193 1196.
3. Bender E. Arnold: Processing Damage to Protein Food. Pag. Bulletin 13,
Winter 1971, Vol. 2, No. 1, (1972), pg.10.
4. Black S. Burn. Aminoacids Determination, Method an Techniques, 1968,
20, 190-193.
5. Clarence E. May and Rose E.R. The Tryptophan Content some Proteins. L.
Biol. Chem. August 7, (1922), 213 216.
6. Dahl O. The inverse Relationship between Tryptophan and Hidroxiproline in
Animal Tissues. Acta Chem. Scad. 14, (1960), 227.
7. Dahl O. Zur Analytik der Eiweissqualitt von
Fleischwirtschaft 48, (1968), 444.

Prctica Nm. 3

Fleisch-Waren, Dic

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

8. Fischl Joseph. Quantitative Colorimetric Determination of Tryptophan. J.


Biol. Chem. Vol. 235, (1960), 999 1001.
9. Goodwin T.W. and Morton R.A. The Spectrophotometric Determination of
Tyrosine and Tryptophan in Proteins. Biochem Journal 40, (1946), 628.
10. Graham C.E., Smith E.P., Hier S.W. and Klein D.J. Biol. Chem. 168 (1947),
711.
11. Harper A. Harold. Manual de Qumica Fisiolgica 3. Ed. (1971), 392 397.
12. Howe Jean M., Yamura Y. And Clark E. Helen. American Asociation of
Cereal Chemist. Inc. Sept.-October (1972), 566 570.
13. Spies J.R. and Chambers anal. Chem. 21 (1949), 1249.

Prctica Nm. 3

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

PRCTICA NM. 3
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS INDISPENSABLES
( TRIPTFANO )

1. OBJETIVOS
1.3.

Evaluar la importancia de conocer el contenido de aminocidos


indispensables en los alimentos naturales y procesados.

1.4.

Determinar el contenido de triptfano en algunos alimentos naturales y


procesados.

2. INTRODUCCIN
Estrictamente hablando, todos los aminocidos son unidades esenciales para la
sntesis de la molcula de protena. Sin embargo, el cuerpo puede fabricar algunos
aminocidos si tiene una fuente adecuada de nitrgeno, pero no es capaz de
formar otros en cantidades suficientes para satisfacer sus necesidades.
Estos aminocidos que el cuerpo no puede sintetizar en cantidades adecuadas
son llamados indispensables o esenciales, por que deben ser suministrados
mediante la dieta ( los alimentos que ingerimos ) en proporciones adecuadas para
cubrir los requerimientos para el mantenimiento y crecimiento de los tejidos.
Un individuo est en equilibrio o balance nitrogenado cuando la ingesta de
nitrgeno proveniente de las protenas es casi igual a la perdida de nitrgeno en
las heces y la orina. Un adulto que consume una dieta que contiene cantidades
suficientes de aminocidos indispensables estar en balance o equilibrio de
nitrgeno. Si un aminocido indispensable es eliminado de la dieta el resultado es
un balance de nitrgeno negativo. Esto significa que ms nitrgeno esta siendo
perdido que l que es consumido, por que los tejidos que requieren los
aminocidos indispensables no pueden ser mantenidos y por lo tanto son
agotados y su nitrgeno excretado. El equilibrio de nitrgeno puede lograrse otra
vez cuando los aminocidos indispensables faltantes son suministrados en
cantidades adecuadas para mantener los tejidos.

Prctica Nm. 3

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

El adulto humano requiere de ocho aminocidos indispensables y los nios en


crecimiento necesitan nueve o quiz diez aminocidos. Estos son:
Isoleucina

Leucina

Lisina

Metionina

Fenilalanina

Treonina

Triptfano

Valina

Histidina (nios)

3. INVESTIGACIN PRELIMINAR.
3.1. Explicar los fundamentos en los que se basa la tcnica de Spies y Chamber
para la determinacin de triptfano.
3.2. Investigar el contenido de triptfano en los alimentos que se analizarn en la
prctica.
3.3. Investigar sobre la importancia de conocer el contenido de aminocidos
indispensables en los alimentos.

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
4.1. El profesor responsable de la prctica indicar los alimentos que se
analizarn.
4.2. Llevar a cabo cada una de las determinaciones que se indican a continuacin:
4.2.1. Determinacin de triptfano (mtodo de Spies y Chamber).

Prctica Nm. 3

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

MATERIAL
Tubos de ensaye de 16x150 mm
Matraces volumtricos de 50 Ml
Matraces volumtricos de 100 mL
Matraces Kjeldahl de 500 mL

EQUIPO
Balanza analtica
Espectrofotmetro
Celdas para espectrofotmetro
Equipo de digestin y destilacin
Kjeldahl

Pipetas volumtricas de 1 mL
Pipetas volumtricas de 5 mL
Matraces Erlenmeyer de 250 o 500 mL
Probetas de diferentes capacidades
Bureta de 50 mL
REACTIVOS
Solucin tipo de triptofano 0.01% en NaOH 1N
Solucin de nitrito de sodio 0.05% en agua destilada
Solucin de para-dimetilaminobenzaldehido 0.5% en HCl 1N
cido sulfrico al 60% (v/v) tener en cuenta la puereza
Reactivos necesarios para la determinacin de nitrgeno total (protenas) por el
mtodo de Kjeldahl.
PROCEDIMIENTO
1. Determinar el contenido de nitrgeno proteico de la muestra problema,
mediante el mtodo Kjeldhal.
2. Preparar una curva tipo a partir de la solucin patrn de triptofano que
incluya concentraciones de triptofano entre los limites de 10 g/mL. A cada
uno de los tubos que contienen la solucin patrn se les agregan 2.5 mL de
la solucin de para-dimetilaminobenzaldehido y se les adiciona la solucin
de H2SO4 al 60% hasta completar el volumen final de 14.5 mL.
Preparar tambin un testigo que no contenga solucin patrn de triptofano.
TUBO

Sol. de Triptofano
(mL)

PDAB
(mL)

Testigo
1
2
3
4
5
6

0.0
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1.0

2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5

Prctica Nm. 3

H2SO4 al
60%
(mL)
12.0
11.9
11.7
11.5
11.3
11.1
11.0

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

3. Agitar los tubos y colocarlos en la oscuridad durante 17 hrs., una vez


transcurrido este tiempo agregarles 0.1 mL de nitrito de sodio al 0.05%,
dejarlos en reposo durante 30 min. y leer absorbancia a 590 nm. La curva
tipo obtenida deber tener un coeficiente de correlacin mayor o igual a 0.9
para que pueda utilizarse.
4. Para cuantificar el triptofano en la protena problema, pesar 10 mg de
muestra y seguir el procedimiento descrito anteriormente.
5. Leer en la curva obtenida la cantidad de triptofano en la muestra (no olvidar
preparar un testigo para leer la muestra).
6. Informar los resultados en: g por 100g de protena y mg/g de nitrgeno.

5. DISCUSIN Y ANLISIS DE RESULTADOS.


5.1. Presentar la curva tipo de triptofano obtenida, as como las determinaciones
de los alimentos problema.
5.2. Presentar en forma de tabla, con unidades, los resultados de las
determinaciones hechas a los alimentos, incluyendo en esta tabla los valores
establecidos en la bibliografa consultada.
5.3. Discutir, de manera integral, los resultados obtenidos, tomando en cuenta los
siguientes aspectos:

El contenido de triptfano en los diferentes alimentos con respecto a lo


reportado para estos alimentos en la bibliografa.

Puntos crticos en las determinaciones.

Posibles fuentes de error en las determinaciones.

Importancia de conocer el contenido de aminocidos indispensables, como


el triptofano, en los alimentos.

Prctica Nm. 3

MANUAL DE PRCTICAS DE
FISIOLOGIA DE LA NUTRICIN

6. CONCLUSIONES.
Elaborar sus conclusiones de la prctica en base al anlisis y discusin de
resultados y a los objetivos planteados.
7. BIBLIOGRAFA.
1. Beaven G.H. and Holliday E.R. Anlisis of the Absortion of Proteins in Term
of Tyrosine and Tryptophan Content. Adv. Protein Chem. 7, (1952), 369.
2. Bencze W.L. and Schimd Karl. Determination of Tyrosine and Tryptophan in
Protein. Anal. Chem. 29, (1957), 1193 1196.
3. Bender E. Arnold: Processing Damage to Protein Food. Pag. Bulletin 13,
Winter 1971, Vol. 2, No. 1, (1972), pg.10.
4. Black S. Burn. Aminoacids Determination, Method an Techniques, 1968,
20, 190-193.
5. Clarence E. May and Rose E.R. The Tryptophan Content some Proteins. L.
Biol. Chem. August 7, (1922), 213 216.
6. Dahl O. The inverse Relationship between Tryptophan and Hidroxiproline in
Animal Tissues. Acta Chem. Scad. 14, (1960), 227.
7. Dahl O. Zur Analytik der Eiweissqualitt von
Fleischwirtschaft 48, (1968), 444.

Fleisch-Waren, Dic

8. Fischl Joseph. Quantitative Colorimetric Determination of Tryptophan. J.


Biol. Chem. Vol. 235, (1960), 999 1001.
9. Goodwin T.W. and Morton R.A. The Spectrophotometric Determination of
Tyrosine and Tryptophan in Proteins. Biochem Journal 40, (1946), 628.
10. Graham C.E., Smith E.P., Hier S.W. and Klein D.J. Biol. Chem. 168 (1947),
711.
11. Harper A. Harold. Manual de Qumica Fisiolgica 3. Ed. (1971), 392 397.
12. Howe Jean M., Yamura Y. And Clark E. Helen. American Asociation of
Cereal Chemist. Inc. Sept.-October (1972), 566 570.
13. Spies J.R. and Chambers anal. Chem. 21 (1949), 1249.

Prctica Nm. 3

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