> Investigacién Quimica Biosensores electroquimicos. Una herramienta util para el andlisis medioambiental, alimentario y clinico A. Julio Reviejo y José M. Pingarron Departamento de Quimica Analitica, Facultad de Quimicas, Universidad Complutense de Madrid, 28040-Madrid, Espana INTRODUCCION 12 utlizaci6n de sensores para resol- ver los problemas analiticos que la Socie- dad demanda hoy en dia es, sin lugar a dudas, una de las tendencias mas claras en la Quimica Analitica modema, Aun- que actualmente se dispone de un importante arsenal de técnicas analiticas de laboratorio, la gran mayoria implican un elevado consumo de tiempo dada la necesidad de realizar pretatamientos de la muestra costosos ¥ laboriosos. Ade- fs, estas técnicas no suelen ser ade- cuadas en Jos casos en que el pardme- tto analitco debe controlarse de manera continua y en tiempo real. La tecnologia de sensores es especialmente apropiada para abordar de un modo barato, rapi- do y fiable muchos de estos retos, Un grupo especialmente atractivo dentro de Jos sensores en general es el constituido por los denominados biosensores, en los que se emplean mecanismos 0 princi- pios biolSgicos para el reconocimiento Ge especies particulates. En un biosen- Sor, el sistema de reconocimiento biol6- ico, también llamado biorreceptor o receptor, debe inmovilzarse 0 retenerse sobre la superficie de un dispositive denominado tansductor que permita convert la velocidad de la reaccion bio- quimica que se produce en el proceso de reconocimiento biolégico en una sefial eléctrica que posteriormente es amplificada, procesada y convertida a la forma dese- ada, Cuando el elemento transductor esté fundamen- tado en procesos de natu- raleza electroquimica (en el sentido més amplio de la acepci6n), se est ante los denominados biosensores electroquimicos que son e! objeto de este artculo. GENERALIDADES SOBRE BIOSENSORES ELECTROQUIMICOS 1a utlzacién de dispositivos electro- quimicos como transductores para el desarrollo de biosensores es, probable- mente, la ms extendida de todas debi- do a una serie de importantes ventajas prictcas: a) las medidas electroquimicas pueden Ilevarse a cabo en voltimenes pequefios de muestra con relatva facili- dad, lo que se debe a la nanuraleza inter facial de la medida electroquimica; esto hace que estos dispositivas sean espe- cialmente adecuados para le monitor zaci6n ‘in vivo"; b) la seal obtenida es elétrica y por tanto es facible la trans- Gucci6n directa de la velocidad de reac- cin en a sefal de leetura; cos limites de deteccién que se obtienen son suf- cientes y adecuados para la deteccién A Julio Revgjo Jose M,Pingarron de muchos analitos de interés; d) la rela- tiva simplicidad y bajo coste de la ins- trumentacién electroquimica permite una fcil disponibilidad de estos dispositivos. Si bien entre los transductores elec- troquimicos se encuentran, de forma general, los de tipo conductimétrico, potenciométrico y amperométrico, son los dos itimos y en especial los ampe- rométticos los ms utlizados en la prc- tica, la metodologia de trabajo mas usual para la construccién de un biosensor electroquimico implica la inmovilizacion del sistema de reconocimiento biolégi- co (enzimas, teidos, microorganismos, anticuerpos) sobre la superficie del rans- ductor que es un electrodo, como se muestra en la Figura 1 El método de inmovilzacién de! sis- tema de reconocimiento biol6gico va a ee ‘Anales de la Reol Sociedad Espatiole deSegunda fpcca. Abtio 2000 Anoles dela Reo Sociedad Expat de Quimica > Investigacion Quimica eed Delco rmevizeder Figura 1: Esquema simplificado de un biosen sor clectroquimico. jugar un papel clave en ls caractersti- cas de funcionamiento del biosensor y construye un aspecto esencial en el pro- ceso de su desarrollo, De forma general ¥ no sélo para los biosensores electro- uimicos, la inmovilizacin puede real zarse bien por métodos fisicos o bien por métodos quimicos Entre los primeros pueden citarse como mas usuales los métodos que implican la adsorcién de las moléculas biol6gicas sobre un material adsorben- te, y los denominados métodos de atra- ‘pamiento que pueden llevarse a cabo mediante la inclusin de las biomolécu- tas dentro de una matriz de un polime- ro altamente entrecruzado 0 de un gel, mediante la inclusion en la propia matriz: de! transductor (es decir, del electrodo en el caso de los biosensores electro- quimicos), 0 por encapsulamiento den- tto de una membrana semipermeable. Por lo que respecta a los métodos qut micos de inmovilizacin, estos pueden ser por unién covalente que implica la reacci6n de grupos funcionales dela bio- molécula que no sean esenciales para su actividad bioldgica con un polimero que sea grupos activ (0 bien por copo- limerizaci6n con un monémero), © por entrecruzamiento intramolecular entre las biomoléculas y polimeros con gru- pos bi-0 multifuncionales (glutaraldehi- do, por ejemplo). La diferencia entre ambos métodos de inmovilizacion q mica radica en que en el primero la bio- molécula sélo est enlazada a un centro activo del polimero (con un solo punto de anclaje), mientras que en el entre- cruzamiento puede estar unida 2 dife- rentes centros activos del polimero y tos unidos entre si formando una red. Por otra parte, ya se ha dicho que el sistema de reconocimiento biolégico empleado para construir biosensores electroquimicos puede ser de muy dife- rentestipas, Sin embargo, hasta l Fecha son dos grupos los que se encuentran con mayor frecuencia en la bibliogratia especializada y se han aplicado con ‘mayor éxito: los electrodos enziméticos ¥ los inmunosensores. BIOSENSORES ENZIMATICOS En este tipo de biosensores cataliticos, una o vars enzimas son inmoviizadas en Ja supertcie del ransductorelecroquimi- co, La reacci6n analitica implica, en su ‘modbalidad mus simple, la catisis por par- te de la enzima de una reaccin en la que 1h molécula ransformada se denomina sus- trato y en Ie que usualmente se emplea ‘otro reactivo denominado cofactor. Por ejemplo, en la reaccién enzimatica: Glucose + 0,20 fcido ghucénico + #,0, Ja glucosa es el sustrato, el oxigeno es el cofactor y la glucosa oxidasa (GOD) Ja enzima que cataliza la reacci6n. Por otra parte, el desarrollo de biosen- sores enzimaticos en los que se empleen dos o ms enzimas permite la consecucion de importantes ventajas (Ver Esquema 1) a) Aumentar la sensbilidad utlizando ‘una enzima auxiliar que regenere el ana- lito, dando lugar por tanto a un recicla- do del sustrato, ) Obtener un producto de la reaccion que sea Ficilmente detectable, emplean- do una enzima auxiliar que actée catali- ticamente sobre alguno de los productos de la reacciOn enzimutica principal c) Eliminar interferencias. Puede ocu- rir que alguno de los productos de la reaccin enzimdtice principal actie sobre la actividad enzimatica inhibiéndota, 0 que existan ots inhibidores en disolu- ciGn o incluso que haya sustratos inter- ferentes; en estos casos, la enzima auni- liar puede catalizar una reaccién de dichas sustancias interferentes de mane- ra que no se vea afectada la reaccién enzimitica con el sustrato de interés. Seguidamente se comentardn algunos ejemplos escogidos de biosensores enzi- maticos tanto potenciométricos como amperométricos. EMPLEO DE REACCIONES ENZIMATICAS ACOPLADAS | = RECICLADO DEL SUSTRATO > AUMENTO DE SENSIBILIDAD | Sustrato Producto + REACCIONES ENZIMATICAS SECUENCIALES Sustrato Enziona, Enzima, Coenzima, Coenzima, Producto Sustrato, Producto Nuevo sustrato ‘+ ELIMINACION DE INTERFERENCIAS Interferente Enzima Sustrato Productos Coenzima Coenzima, Producto no interferente Producto no interferente> A. Julio Reviejo y José M. Pingarrén BIOSENSORES ENZIMATICOS POTENCIOMETRICOS H fundamento més comin del empleo de un transductor potenciométrico es el basado en la utlizacion de membranas selectivas de iones. Desde los primeros trabajos del grupo de Guibauit, se ha recorrido un largo camino en la sofist- cacién de los disefios electr6dicos. Un ejemplo clisico es el biosensor para la determinaci6n de urea basado en la reac- cion de hidrdlisis de este compuesto, catalizada por la enzima ureasa (1), en la que se genera ion amonio como pro- ducto el cual es sensorizado mediante un electrodo de membrana de vidrio selectivo 2 dicho ion. Recientemente se ha utiizado un sensor de urea con un fundamento muy similar al mencionado en sistemas de andlisis por inyeccién en flujo de canal simple y de canal doble Figura 2) Q). La buena esabilidad del electrodo enzimético permite la utiiza- ci6n del mismo biosensor en los siste- ‘mas en continuo durante dos meses. En las condiciones 6ptimas, es posible la determinacin de urea a nivees fsiol6- gicos y patologicos, habiéndose aplica- do al anilisis de muestras reales de sue- 10 humano, a modificacion enzimatica de elec- trodes selectivos de iones, mediante unién covalente de las correspondientes enzimas directamente ala superficie de Ja membrana, constituye hoy en dia un procedimiento generalizado que da lugar a biosensores con una elevada sensibi- lidad, estabilidad y con una répida res- puesta (3). Un ejemplo ilustrativo es la construccion de un biosensor para el control de la produccién bioteenol6gica de peniciina G utdizando un electrodo de membrana de pH con tridodecilami- na como ion6foro selectivo det ion hids6geno (4). Sin embargo, no todos los disefios modernos de biosensores enzimaticos potenciométricos estén basados en el empleo de membranas selectivas de ones. Asi, por ejemplo, Kubota y col. (6) han reportado recientemente un bio- sensor para L-Acido ascérbico en el que ia enzima ascorbato oxidase se inmovi- liza en un electrodo de grafito/resina epoxi por oclusién en una matriz de poli(etleno-co-vinilacetato) y copolime- 10 EVA. La variaci6n del potencial se ori- gina en a reduccién de Cu* a Cu" en la enzima, debida a la presencia de ion ascorbato, lo que cambia la densidad electrnica en la supericie del elecro- do, que es medida por el transductor. Otro enfoque interesante es el empleo de matrices biocompésitas consoidadas Estas matrices constituyen una impor- tante posibilidad de producir en masa biosensores electroquimicos con pro- piedades ventgjoss, entre las que mere- ce la pena desacar la capacidad de rege- neracién de su superficie. Un ejemplo de esta metodologia es la construccion de un biosensor para D-amigdalina (de interés en alimentos) mediante la con- solidacin de una mezcla de sales de pl- x iy aS? ‘Figura 2. Esquema FIA de los sistemas monocanal arriba) y de doble canal (abajo)-B,disolacion regu. ladora;P, bomba peristltica; , valvla de inyeccin; , c8lula,C, bce de mezcla, W, dsecho, WE, clectrodo de trabajo (biosensor); RE, electrodo de referencia; M, membrana sensors. ta (Ag, AgD con la enzima &-glucost- 1a presiOn aplicada durante la preparacin de la pastlla biocompésita determina el grado de inmovilizacion de [a enzima en la membrana. Las sales electroactivas que atrapan la enzima constituyen un medio protector para mis- ma, aleanzindose periodos de vida ope- racional pare el biosensor de mas de tras meses BIOSENSORES AMPEROMETRICOS Desde que en 1967 Updike y Hicks ppublicaron el primer electrodo enzimé- tico amperomésrico (7), se ha asistido a un extraordinaio interés por este tipo de biosensores, con los que ademas de 1a selectividad inherente al elemento de reconocimiento biol6gico puede conse- guise una buena sensibilidad. Los bio- sensores amperomeétricos monitorizan las ‘coments faradaicas resultantes de inter- cambios elecrdnioos entre el sistema bio- logico y un electrodo mantenido a un potencial constante apropiado. Nabural- mente, las “enzimas redox’ u oxido reductasas son de particular interés para Ta construcci6n de este tipo de biosen- sores ya que en la conversion enzimt- ca del sustrato tiene lugar una reaccién de transferencia de electrones. Con obje- to de una mejor compresin, se proce- dea continuacion a diferenciar entre los grupos mis importantes de estas enzi- mas utlizadas para la construccion de biosensores amperométricos. 4) Oxidasas Estas enzimas dependen de un cofac- tor fuertemente enlazado dentro de la estructura de la enzima, Ia estructura del cofactor redox eso bien del tipo flavina (FAD 0 FMN) o un grupo que contiene ion cobre. Todas las oxidasas utlizan coxigeno molecular como agente de reo- xidacion en el ciclo cataltco y, depen- diendo de la capacidad de la enzima para donar dos o cuatro electrones al oxigeno, el producto final es perdxido de hidrOgeno o agua (Esquema 2) Como se deduce del esquema 2, la reacci6n enzimética puede seguirse electroquimicamente bien por la dis-ene eran E en > Investigacién Quimica _ Sustrato Producto Enzima,,, Enzima, H,0, 6 H,O | squema 2, Secuencia de reacion para una reaccion de oxidacin caalizada por una oxidasa emple ando oxigeno molecular como aceptor de electrones-protones. ‘minuci6n del contenido de oxigeno en Ja disolucién o, si el perbxido de hidr6- geno es el producto final, por su oxi- dacién (0 reducci6n) electroquimica directa sobre el electrodo. Sin embar- 0, cualquiera de estos dos procedi- mientos tiene asociados importantes inconvenientes. La reduccién electro- quimica de oxigeno empleando un electrodo de Clark es poco sensible y necesita un potencial bastante negati- yo (~-0.6 V vs. Ag/AgCl) lo que da lugar a una comtiente de fondo eleva- da, 1a oxidaci6n electroquimica de H,0, ocurre a altos sobrepotenciales (06-07 Vvs. Ag/AgCl, pH 7.0) sobre electrodos metilicos e incluso a poten- ciales mayores sobre electrodos de car- bono (+0.9-1.15 V), lo que posibilita reacciones interferentes por parte de especies fécilmente oxidables como ascorbato, urato, paracetamol y neuro- transmisores, muy comunes en las muestras clinicas. Por lo tanto, una de las lineas de inves- tigacion mas actual es intentar disminuir el potencial aplicado para la detecci6n clectroquimica. Una forma es tratar de obtener una transferencia electronica directa entre las oxidasas y los electro- dos (8), lo que no es posible en muchos casos debido a que el centro activo esti profundamente siuado dentro de la enzi- ma, Sin embargo, muchas oxidasas reac- cionan fécilmente con mediadores arti- ficiales que pueden ser empleados para Janzar los electrones desde la forma reducida de la enzima hacia un electro- do tal y como se muestra en el esque ma 3. El empleo de estos mediadores art- ficiales hace que el potencial de tra- bajo del electrodo enzimatico esté fij- do ahora por el potencial formal det par mediador, lo que es muy ventajo- so si el mediador tiene un bajo valor de dicho potencial, ya que entonces se evitan interferencias debidas a otras especies electroactivas que reaccionen a potenciales més elevados. Ademés, sien la oxidacién de la forma reduci- da del mediador no estan implicados los protones, la respuesta del electro do enzimético no dependeri del pH. ‘Bequema 3- peo de modiadores redox enel desarrollo de un biosensor ampromético eazimitico Algunas de las moléculas que se han utilizado como mediadores enziméti- cos son el tetratiofluvaleno, el Meldo- la Blue y el ferroceno y sus deriva- dos (9). En la Tabla 1 se recogen algunos ejem- pilos elegidos de aplicaciones recientes de biosensores enzimticos amperomé- tricos basados en el empleo de enzimas oxidasas. 6) Peroxidasas las peroxidasas son enzimas amplia- mente utilizadas para la determinacion de peréxido de hidrogeno y de peque- los peréxidos orginicos. En la reacci6n con el per6xido la forma nativa de le enzima se oxida en una etapa de dos electrones para formar el denominado compuesto-I. La regeneracién de la for- sma rativa se leva a cabo mediante dos tapas individuales de reduccion de un electrén con una especie intermediaria llamada compuesto-I Peroxidasa nativa + H,O, + Com- puesto-l + H,O Compuesto I + HA > Compuesto TL +HA Compuesto II + H,A -> Peroxidasa nativa + HAY + H,0 Como especies donadoras de electro- nes puede utlizarse aminas aromticas, compuestos fendlicos, hexacianoferra- to(I), yoduro, ascorbato, etc, (2). os diseiios electrodicos més simples utilizan monitorizacién directa de la transferencia electronica de la peroxida- sa aun potencial més negativo de 06 V vs. ECS. La cortiente es debida a la reduccién electroquimica de los com- puestos -I y -II, cinéticamente lentas sobre la mayoria de los materiales elec- twédicos. Con objeto de evitar esta trans- ferencia electronica lenta, los compues- tos donadores de electrones ‘mencionados anteriormente se han uti lizado como mediadores, bien en diso- lucion o bien inmovlizados, que reac- cionan répidamente con la peroxidasa oxidada, El mecanismo se muestra en el esque ma 42),a oa SIONS Analito Caracteristicas Enzima @agestra) “Electrodo Mediador EV analitices POx Pinwato PGCE —_Polimero de Os 0.35-0.50 1Le0.02-0.3 mM » SOx Sulfitos (Vino) PGCE 050 ‘1-2-3000 pM 1-1 pM n Gox Glucosa GCE curred) 05 12-1000 pM 2 Defiuctosa : Delactosa Sucrosa chOx Colesterol Electrodo, 113-25 mM B (mantequil, de Clark ‘margatina) GOx Glucosa Fibra. Azul de Prusia 1-2-4 mM 4 de carbono 1D-01 mM AOx LyD Blectrodos Rh 04 H-O220mM * 5 -aminodcidos _fabricados para L-glicina spe leche, zumo, por estarcido orina) GOx Glucosa __Electrodos_-—_—“Perroceno Gangre) _fabricados por estarcido (Comercial) GOx Glucosa cee ir 1 T= hasta 8 mM (Suero) 1D=16 mM GOx Glucosa _—_Cristales de Tr 015, 192-50 ait TIE-TCNQ 10x Lisina (muestras Electrodo 10 TL = hasta farmacéuticas) _compésito L.6e104 M conductor rigido 1D = 825107 M : GOx Glucosa _Electrodos de Auy Pd 090 TL=1-10 g/L a (Procesos de —_grafito/ fermentacién) —_resina-epoxi dase THF = Tetratiofavaleno, TCNQ = bono vitrficado; IL» interval lineal; LD = limite de detecion. Ox = piruvato oxidasa; SOx » sulto oxidasa; GOx = ghucosa oxidasa; 1Ox = lsina oxidasa, ChOx= colesterol oxidasa; AOse aminodcido tie PGCE = electrodo de cabono virco platnizad; GCE = elearodos de ct. Cuanto menor sea la velocidad de reacci6n entre la peroxidasa y el media- or, mayor seri la concentracién de enzi- ma que habr de utilizarse para evita la dependencia de la seal de la concen- traci6n del mediador, asi como para obtener una elevada sensibilidad de los lectrodos. En consecuencia, 2 menudo se requieren concentraciones milimola- res de mediador para medir concentra- ciones micromolares de H,0,. En general, pueden distinguirse tres tipos de electrodos de peroxidasa para Ja monitorizacin de perdido de hidr- ‘geno: (a) electrodos cuya superficie ha ‘Arcs dela Reol Sociedad Esparola de GuiicaSeeyede Epa, Abiro 2000 ‘Anales do la Real Sociedad Espana de Guimica > Investigacién Quimica H,0 H,02 Compuesto-I *20,P° CeO. Feu Med. < Meda. Compuesto-IT +20) a ee Mal 120: Meda Peroxidasa Wative (Fe?) o0qoua.19313 ‘Esquema 4- Mecanismo de a peroxidasa empleando mediadores (Med). sido modificada con peroxidasa bien adsorbida o enlazada covalentemente, dando lugar 2 aproximadamente una rmonocapa de moléculas de enzima sobre el electrodo; (b) electrodos cuya super- ficie se modifica mediante el recubri- miento con un polimero (redox 0 con- ductor electrénico) en el cual las moléculas de peroxidasa estin fisica- mente o quimicamente atrapadas; (c) electrodos compésits en los que la enz- ma esti *homogéneamente” distibuida en la mezcla de materiales conductor y aislante. En la revision de Ruzgas y col. (22) se recogen las caracteristicas de varios electrodos de ests tipos. Ia determinacion de H,0, es impor- tante a nivel industial debido, por ejem- plo, a que muchos cremas decolorantes de cabello tienen en sw composicién un 21% de perbxido de hidrégeno; adem, es necesario determinarlo para el con- trol medioambiental relacionado con el -smog. Por otro lado, los perénidos org nicos aparecen como producto de la autooxidacién de lipidos insaturados, que son precursores de aldehidos y oeto- nas, los cuales son responsables del mal sabor en acetes y derivados, por lo que su determinaci6n es importante en el contol de calidad de estos alimentos. En la Tabla 2 se recogen algunos ejemplos de determinacién de peréxido de hideé- geno y de diferentes perbxidos orgini- cos empleando biosensores de peroxi- dasa PCO ASO LOAN an SER OO Cen | mma qittke | Hlectrodo Medindor EV Re | | upp HO, Pastadecarbono ofenilendiamina . -0.2 B ‘HRP H,0, P2B Grafito Ferroceno 401 m4 HRP Peréxidos. ... Pastade carbono _ o-fenilendiamina 02 25 ‘ARP. orginicos -Grafito/resina Transferencia port directa dee HRP Perdxios Pasta de carbono Ferroceno 02 6 onginicos HRP H,O,, P2B Grafito/Tefl6n Ferrocianuro: 0.0 ‘TL=0.5-100 uM 7 HRP Peroxidasa de rabano; AHP perosidasa de Arthromycesramasus;P2B= peréido de 2-butanona; I intervalo lineal> A. Julio Revieio y José Finalmente, ya se ha mencionado con anterioridad que una caracteristca ‘comin de muchas oxidasas es que pro- ducen H,0, en la oxidacién de los correspondientes sustratos. Por consi- guiente, lz utlizaci6n de biosensores bienzimaticos de peroxidasa y diferen- tes oxidasas se ha propuesto como ‘manera de solucionar los problemas 2s0- ciados con el elevado valor del poten- cial requerido para la monitorizacién electroquimica directa de H,0, M. Pingarrén En la Tabla 3 se recogen algunos eem- plos escogidas de aplicaciones recientes Ge biosensores enzimatioos amperomé- trcos basados en el empleo de peroxi- dasa junto a enzimas de la familia de las oxidases. ©) Deshidrogenasa las reacciones catalizadas por estas enzimas se caracterizan por no depen- der del oxigeno molecular. El esquema 5 muestra un ejemplo del ciclo de reac- cid global de oxidaci6n de un sustrato a un producto, La forma reducida del cofactor necesita la presencia de un aceptor de electrones y protones distin- to del oxigeno molecular para reciclar la enzima. Las deshidrogenasas pueden dife- renciarse entre aquellas que tienen cofactores enlazados y las que depen- den de un cofactor soluble que actéa como un cosustrato en el ciclo enzi- PRC TNO A On aco Toa PUM na Rn Nn Caracteristicas j Emim ) Electrodo Mediador EV Ref, | | LowHRP —Lelactato Grafito Polimero de Os +01 1L=0.02-5 pM B (auestra 1D+0,02 ut GOWHRP —Ghucosa Pasta Ferocianuro 0.0 L-00116pM 9 sangre) de catbono GOx/HRP Glucose (vinos, Grafito/Teflon Ferroceno 00 30 ‘mostos) AOD/HRP —Alcoholes Pasta de 0.05 31 catbono P2O/HRP Glucose. -«Pasta de carbono. = Ferroceno 0.05, 32 | Kilosa, Galactosa (Procesos de fermentacién XOxHRP —Hipoxantina —_Grafito/Teflon Ferroceno 00 1D=0.09 uM 3B (sardinas) LOx/HRP A. Lctico Electrodo Ferroceno 00 4 (leche. yogu) compo ChOWERP —Colesterol ——_Grafito/Tefllén Ferroceno 00 35 (mantequilla, ‘manteca, huevos) ‘AAOx/ARP — Aminodcidos Pasta de carbono 0.05 T=20-100 uM 36 BOwHRP — Bilisrubina Pasta de carbono —Ferrocianuro 0.2 T4100EmM 37 ‘Ox: lacato oxidas; GOx: Glucosa oxidss; AOD: alcohol oxidas; P2O: piranose oxidasa; KOx: nantina oxidase; ChOx: colesterol oxida;sacle al Sac ot de ne E sey pec, At 2000 > Investi: Sustrato ] Cofactoro, | ENZIMA Producto Cofactorpes| | Esquema 5. Secuencia de eaeciones para ura reaccon de oxidacion catalizada por una deshidroge imético. HI primer grupo puede a su vez set subdividido en flavoproteinas que tienen como cofactor a FAD o FMN y las deshidrogenasas dependientes de la quinone pirroloquinoleina (PPQ) (21). Aunque Ia transferencia electrd- nica directa entre deshidrogenasas y electrodos ha sido verificada por diver- sos autores, la mayor parte de las apli- caciones de estas enzimas para cons trait biosensores electroquimicos implica el uso de mediadores redox que ttansportan los electrones en la mayoria de los casos desde [a forma reducida de la encima al elecrodo (38). las deshidrogenasas dependientes de NAD” (hicotinamida adenina dinucle6- tico) 0 NADP* (nicotinamide adenina dinuclebtido fosfato) constituyen el mayor grupo de enzimas redox cono- cido. Sin embargo, su empleo para desarrollar biosensores amperomé cos esti limitado por tres inconvenien- tes importantes. En primer lugar, su actividad depende de un cofactor solu- ble que acttia como cosustrato y que, como tal, necesita ser afadido al siste- ma sensor, siendo ademés caro. Por otra parte, el potencial formal del par NAD(PY/NAD(PIE es bajo (-560 mV vs. ECS a pH 7.0), lo que significa que el NAD@Y' tiene un poder oxidante muy bajo en selaci6n con los potenciales de Ja mayoria de los sustratos para las des- hhidrogenasas. En la mayoria de los casos, el empleo analitico de una des- hidrogenasa dependiente del NAD(PY* es para oxidar un sustrato con la duccién de una cantidad estequiomé- trica de NAD@)H, la cual es entonces medida. Por lo tanto, para poder uti zar analiticamente estos sistemas, se necesita una segunda etapa de reacci6n aci6n Quim Aceptor de electronesieq | Aceptor de electrones.. que desplace el equilibrio hacia el pro- ducto. Esto puede hacerse acoplando luna segunda etapa puramente quimica © enzimatica en la que se consuma bien el NADH producido o bien el pro- pio producto de la reacciGn, Una mane- 1a de llevarlo a cabo es oxidar electro- quimicamente el NADH midiendo la costiente como una sefial proporcional a Ia concentraci6n de sustrato. Si embargo, y este es el tercer inconve- niente, esta reaccién electroquimica es muy irreversible y pata altas concen traciones de NADH (>0.1 mM) se pro- Gucen reacciones colaterales que enst cian la superficie del electrodo (39). Dado que para la fabricaci6n de bio- sensotes la oxidacién electroquimica del NADH es la via de mayor interés, se han realizado un gran némero de investiga- clones para encontrar buenos media- dores que catalicen dicha oxidacién electroquimica dentro del intervalo pt mo de potenciales para evitar posibles interferencias. Parece que los mejores resultados se han obtenido con 2c tes de dos electrones que también fun- cionan como aceptores de protones, 0 mediante el acoplamiento del sistema de deshidrogenasa dependiente de NAD(P)* con una segunda etapa enzi- itica basada en diaforasa, una enzima que oxida al NAD(P)H. Los electrodos compésitos y, en algunos casos, los elec- todos mocifcados con capas poliméri- cas son buenos candidatos para resol- ver los inconvenientes mencionados anteriormente, Estas configuraciones per- miten la inmovilizacion conjunta de la enzima, el cofactor y adicionalmente un mediador o una segunda enzima, de manera que estén muy prOximos los tunos a los otros para permitir el movi- miento de los electrones desde el sus- trato enzimético al cofactor, posterior mente al mediador y finalmente al elec- trodo. Una completa revision de los biosensores amperomeéticos basados en cenzimas deshidrogenasas dependientes del NAD(PY* es la realizada por Tusin y col, (40), recogiéndose en la Tabla 4 algunos ejemplos escogidos de aplica- ciones recientes. INMUNOSENSORES ELECTROQUIMICOS En general, los inmunosensores estén, basadlos en la reaccién bioguimica que implica el reconocimiento de la forma de! antigeno (Ag) por el anticuerpo (Ab), uniéndose por un punto concreto para formar el complejo antigeno-anticuerpo. 1a gran selectividad de los anticuerpos viene dada por la estereoespecificidad de los puntos de unién con el anigeno, lo que hace sumamente atractiva la uti- lizacion de estos sistemas para el desa- rrollo del biosensores. 1a medida de estas interacciones es frecuentemente dificil de realizar de manera directa, por Jo que muchos sistemas utilizan el deno- minado inmunoensayo enzimatico, basa- do en la uni6n de una enzima al anti- geno o al anticuerpo. Dicha enzima actiia sobre el sustrato, dando lugar a un pro- dlucto que si puede ser detectado por el transductor. Dos tipos de configuraciones se sue- Jen emplear en los inmunosensores enzi- smétioos (Figura 3). En la lamada confi- guracién sandwich, el antigeno se une al anticuerpo inmovilizado en el trans- ductor y,asu vez, a dicho antigeno (ana- lito) se une el anticuerpo marcado con vuna enzima. La monitorizacion de la reaccién enzimitica proporciona la infor macion analitca requerida. En le confi guraci6n denominada competitiva, el anticuerpo y el correspondiente antige- no, al que se ha unido la enzima, estin inmovilizados en la superficie del elec- trodo, La adicin de analito, es deci, de antigeno sin enzima, provoca una com petencia por los anticuerpos inmoviliza- dos en el transductor. La disminucion de la respuesta correspondiente a la reac- cién enzimatica proporciona la infor- macion analitca requerida> A. julio Revielo y José IV, jem M. Pingarrén ann COUN ros | ; Analito Caracteristicas | Bazimas — Gmuestray _‘Blectrodo Leman! analitices Ree | | GDH NH; "Screen printed” *Meldola's Blue” 1D=2 wM a | (agua de so) | G6PhDH Glucosa 6- Pasta 03 1D=50 pM. 2 fosfato (sangre) de earbono DDH Défructosa (miel, Electrodo 02 RSD*2.11% 8 leche, chocolate. compésito galletas, zumos) D-FDH D-Fructosa Pt Ferricianuro 0.25 RSD=0.68 % “a (prosiuetos dletéticos) ADE Ezanol Electrodo 098 5 (vino) compésito i DHDH fructose. Pasta, Polimero de Os 01V shasta 20uM 46 (ciel, zumos,~ de catbono bebidas de cola) | ADH Acetaldchido——-“Hlecrodo 06 " (bebidas compésito aleohdlicas) ADH Bano Pasta 05 1D=20 pM 8 (bebidas, de carbono RSD=3.4 uM alohélicas) D-FDH Fructosa AU ID <10 pM 49 Zumnos) FOH/GDH—Fructosa y R 1D=0.1 uM 50 slucose (mie) GIDE: gutamito deshidrogenasa: GAPhDH: glucosa 6fosfato deshidrogenase; D-FDH. D-ructosa deshicrogenass; ADH: alcohol deshidrogena- ‘AIDE: aldehido deshidrogenasa; GDH: glucosa deshidrogenasa; I: intervalo linea; LD: limite de detecién, | De acuerdo con el modo de trans- duccién de la sefal, pueden distingui- se dos categorias de iamunosensores electroquimicos. Los inmunosensores directos siguen la interacci6n antigeno anticuerpo normalmente de manera con- tinua y en tiempo real, mientras que los inmunosensores indirectos miden el resultado del proceso de unién, es decir Ja cantidad aumentada (o disminuida) del marcador unido (enzima, indicador electroactvo). También con este tipo de biosensores las técnicas basadas en membranas han resultado ser muy populares, por ejem- plo mediante la combinaci6n de un elec- trodo de oxigeno tipo Clark con anti- ccuerpos enlazados @ membranas. Asi, se ha empleado catalasa como marcador liberador de axigeno, por eemplo, para determinaci6n de a-fetoproteina (51) Sin embargo los enfoques més moder- nos parecen decantarse sobre la unién directa de las moléculas inmunoespect- ficas a la superficie sensora usendo adsorcion o unién covalente (52) 1a aplicacién de electrodos moxifcados con polimeros conductores parece ser bas- tante interesante para este fin, Por efem- plo, empleando anticuerpos anti-HSA incorporados durante la electropolimer- zaci6n en polipirrl, es posible la moni- torizacin directa y reversible del comres- pondiente HSA en disolucién utilizando deteccion amperométrica de impulsos (653), Adem, esta metodologia es lo bas- é ‘Anoles dee Reol Sociedad Fspatola de Guin> Investigacion Quimi eed aes tunteripida para ser incenporada a sse- mas FIA, no se requieren etapas de ree neraciny lt seal exe a cero sin anal. Enka Tabl 5 we recogen algunes ef plos de aplicaciones de inmunosensores eectroquimicos en matrices de muestas reales. Li mayor de estos disp than empleado part aniliss elnico 0 bien para componentes sanguineos © com- ppuestos farmaceurions, aunque kt capac Figua 3. Confguraclonesempleadas a ks métodos de inmunoensayoenzimitio. ca Tria ~ x eer ere] ree x>+G ey ane cer) dad de disenar equipos ponttiles es una gran venta para la monitorizacidn medlio- ambiental sobre todo para realizar un “cre ening” preliminar directumente en el lugar donde se torn la muestra. La mayoria de las aplicacions implica la utlizacién de solo una enzima marcadora, si bien, el empleo de sistemas de amplifcacion buss- dds en el uso de enzimas en cascuds per- mite conseguir limites de detecion varios a ee Cee’ A. Julio Revieic y José M. Pingarrén BIBLIOGRAFIA 1. G.G. Guilbaul,.G. Montalvo; J.Am.Chem. So. 92 (1970) 2533. 2. L Waleer, S. Gab, R. Koncki; Aral. 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