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Parte experimental
Extrao do DNA da cebola:
Resultados e discusso
Para que se retire o DNA do ncleo das clulas, deve-se, primeiramente, realizar a lise
da membrana celular. H diversos protocolos na literatura, alguns mais eficientes que outros,
entretanto, o nvel de complexidade elevado. A maneira mais simples e rpida para sua lise
propiciar um choque trmico na amostra, pois dessa forma existe a ruptura da membrana
celular e, posteriormente, a liberao do DNA. Esse um mtodo limitado a pequenas
quantidades de DNA [1].
Em seguida, a camada fosfolipdica da biomembrana eliminada pela presena de um
detergente, no presente caso o dodecil sulfato de sdio (SDS), o qual tambm auxilia na
inativao enzimtica e dissocia o DNA das protenas, mantendo seu enovelamento
[2]
Importante ressaltar que o sal cloreto de sdio tambm auxilia a dissociao do DNA das
protenas. O EDTA, por sua vez, responsvel por prevenir que o processo de apoptose
[3,4]
ocorra, uma vez que ons de clcio (Ca2+) e magnsio (Mg2+), os quais fazem parte e so
essenciais para tal processo, se encontram complexados em sua presena.
Usualmente, a precipitao do DNA realizada na presena de lcoois. No presente
caso, utilizou-se uma soluo de etanol 95%, a qual foi adicionada lentamente, de maneira a
no perturbar o sistema em grande extenso e, portanto, promover a precipitao do DNA de
maneira cuidadosa, uma vez que outas macromolculas como, por exemplo, RNA, protenas,
lipdeos, polifenis e polissacardeos, tambm podem ser precipitados
[5]
, contaminando a
Primeira soluo
Segunda soluo
Terceira soluo
Razo A260/280
1,30
1,32
1,21
Existe a necessidade da adio de um corante, uma vez que essa tcnica realizada de
maneira comparativa, na presena de diversos padres analticos de massas conhecidas, e a
soluo incolor. A Figura Y apresenta o resultado da eletroforese em gel de agarose,
mostrando a migrao da amostra de DNA considerada (evidenciada com uma seta) devido a
presena do campo eltrico. Comparando-se com a escala (migrao MM) presente no
equipamento, pode-se estimar a massa molar do DNA avaliando-se sua migrao no gel.
Sabendo que...
Figura Y: Eletroforese em gel de agarose, utilizando-se tampo TAE e o corante Blue Green
Loading Dye I, da amostra de DNA extrada da cebola.
Concluso
Notou-se que a tcnica de extrao do DNA, em geral, necessita de condies
especficas, alm de cautela experimental em especial na retirada do DNA da superfcie da
soluo, uma vez que ele se encontra gelatinoso . Na soluo extratora, a presena de uma
espcie solubilizadora das membranas celulares (dodecil sulfato de sdio) e tambm uma
espcie (cloreto de sdio) que promove a dissociao do DNA das protenas imprescindvel.
Em especial, o EDTA possui um papel bastante importante, considerando seu carter
complexante: preveno do incio da apoptose.
A caracterizao do DNA bastante relativa, considerando que outras
macromolculas tambm podem ser extradas juntamente com ele. Dentre essas
macromolculas, possvel citar protenas e RNA como exemplo. Dessa forma, a pureza do
DNA obtida pela razo da absorbncia da amostra na regio do ultravioleta, 260 nm e 280
nm ( A260/A280), sendo a primeira relacionada as bases nitrogenadas do DNA e a segunda dos
Questes
1 - Por que a presena de SDS, EDTA e NaCl nesta prtica?
O SDS, dodecil sulfato de sdio, responsvel por solubilizar as membranas celulares
e auxiliar na inativao de algumas enzimas, considerando seu carter de detergente, alm de,
assim como o cloreto de sdio, promover a dissociao do DNA das protenas, mantendo seu
enovelamento. Por sua vez, o EDTA um agente complexante, o qual previne a apoptose se
processar ao se ligar com ons magnsio e clcio.
2 - Explique o efeito observado pelo aquecimento da soluo aquosa do DNA.
Ao medir-se a absorbncia da soluo aquecida de DNA, notou-se que houve o
aumento da absorbncia no comprimento de onda em que o DNA absorve naturalmente (260
nm). Tal efeito pode ser explicado pelo fato do DNA ser sensvel a mudanas de temperatura,
pois com o aumento dela h seu desenovelamento e, consequentemente, as bases
nitrogenadas se tornam mais expostas ao meio, facilitando a absoro de luz UV.
Quando a soluo, que fora aquecida, foi resfriada lentamente, o DNA pde se
enovelar novamente de forma a reconstruir sua estrutura inicial, o que no foi observado
quando a soluo foi resfriada rapidamente.
3 - Por que o uso de luz UV para revelar as amostras de DNA presentes no gel de agarose?
Pois o gel utilizado foi corado com uma espcie que pode ser visualizada apenas em
luz ultravioleta.
4 - Como seria realizada a anlise do DNA, considerando-se um qumico forense?
Referncias Bibliogrficas
[1] - Rosa D.D., Mtodo rpido de extrao de DNA de bactrias Summa phytopathol (2008).
[2] Janine P., Jerson V. C. G., Deise C., Ivair V., Mirian B., Comparao de trs protocolos
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[3] Saraste A., Pulkki K., Morphologic and biochemicalhallmarks of apoptosis. (2000).
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