ao-b DW75 ts QODa9 Tye de ' oqzasa® ' 8101-4 op - H1As1 30008 4 UNIVERSIDAD DE NAVARRA DEPARTAMENTO DE GENETICA a, - 210 pe OBTENCION DE HAPLOIDES DE CEBADA (Hordeum vulgare L.) MEDIANTE CULTIVO "IN VITRO" DE OVARIOS NO. FECUNDADOS. Memoria presentada por Ana Ma Castillo Alonst para optar al grado de Doctor en Biologia (Biologia Celular). Trabajo realizado en la Unidad de Genética y Produccién Vegetal de la Estacién Experimental de Aula Dei (C.S.1.C), bajo la direccién del Dr. Luis Cistué sola. Zaragoza, Octubre de 1990 VO.BQ. Director Ponente i ile Luis Cistué $0l4 Marina Garcia Delgado Ana Ma Castillo AlonsoLUIS CISTUE SOLA, DOCTOR EN BIOLOGIA, COLABORADOR CIENTIFICO DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS, CERTIFICA Que la presente Memoria titulada "OBTENCION DE HAPLOIDES DE CEBADA (Hordeum vulgare L.) MEDIANTE CULTIVO "IN VITRO" DE OVARIOS NO FECUNDADOS", que para optar al grado de Doctor en Biologia (Biologia Celular) presenta la Licenciada ANA MARIA CASTILLO ALONSO, ha sido realizada en la Unidad de Genética y Produccién Vegetal de la Estacion Experimental de Aula De (CSIC de Zaragoza), bajo mi inmediata direccién. Que considera que representa trabajo de Tesis y autoriza su presentacién en la Facultad de Biologia de la Universidad de Navarra. ¥ para que conste, expido el presente certificado en Zaragoza a quince de Octubre de mil novecientos noventa a CheINDICE GENERAL..........-65 INDICE DE CUADROS.. INDICE DE FIGURAS.. ABREVIATURAS...-...-05--005 AGRADECIMIENTOS. ... I: 1. 2. SEN THODUCCLON sats -t-vtett-t-wfoce-tsfecd-tlatu-tate-t-bete-d-eteta-t tbat tala tefl tek ASPECTOS GENERALES... 06.00.00 ce eset eee e teen et eeereeeee 1.1. IMPORTANCIA ECONOMICA........ 1.2. TAXONOMIA Y¥ MORFOLOGIA DE LA PLANTA..........45 4.3, OBJETIVOS ¥ SISTEMAS DE MEJORA.... 1.3.1. Objetivos.... sees eee eee eee ee 1.3.2. Sistemas de mejora.......-...see sees eee eee PLANTAS HAPLOIDES... 2... 0c esc eee eee cree eee e eee e eee nee 2.1, UTILIDAD DE LOS HAPLOIDES 2.1.1. Programas de mejora 2.1.2. Analisis genéticos........... 2 -1.3. Seleccién de mutantes... 2.2. METODOS DE OBTENCION DE HAPLOIDES. 2.2.1. Haploidia espontanea......... 2.2. 2 Haploidia inducida............- 2. Haploidia mediante cultivo "in vitro" Balai a Androgénesis........ 2.2.3.2. Ginogénesis........ GINOGENESIS.. 0.0. cece cece e cette eee tee ete eee eens 3.1. FACTORES QUE AFECTAN LA RESPUESTA AL CULTIVO..... 3.1.1. Genotipo de las plantas madre.......... 3.1.2. Condiciones de crecimiento de las plantas FO 3. Estado de desarrollo del saco embrionario.... 4. Pretratamiento......ceee eee e eee rece ee eee e ee 5. Medio de cultivo........-...--.0+ 6. Condiciones de cultivo.. bs o weeuwn eure 14 14 16 16 18 18 233.1.7. Parte de la flor puesta en cultivo........... 24 3.2. EMBRIOLOGIA E HISTOLOGIA DE LA GINOGENESIS 3.2.1. Origen celular de las plantas ginogénicas.... 25 3.2.2. Caracteristicas del desarrollo ginogénico.... 27 3.3. CARACTERISTICAS DE LAS PLANTAS REGENERADAS........ 28 3.3.1, Nivel de ploidia.......... reese 28 3.3.2. Albinismo..............- ceeee 29 3.3.3. Variabilidad.................. seeees 30 4. OBTENCION DE HAPLOIDES EN CEBADA.............00eeeeee08 32 4.1. GEN HAPLOIDIZANTE (GEN "HAP").........0eseeeeeee. 32 4.2. CRUZAMIENTO INTERESPECIFICO H vulgare x H bulbosum 32 -2.1. Cruzamiento y tratamiento hormonal........... 33 4 4.2.2. Cultivo del embrién.................. Heeb e eg. 4 4 +2.3. Influencia del genotipo de los parentales -2.4. Control genético del mecanismo de eliminacién See sceeesceeteune.} de los cromosomas.. 4.3. ANDROGENESIS EN CEBADA. a hdaotstl- HS 6: 4.3.1. Cultivo de anteras en cebada ... seeeees 36 4.3.1.1. Factores que influyen en la androgénesis 36 4.3.1.2. Caracteristicas de las plantas regeneradas......... 6.6... e cece eee eee AL 4.3.2. Cultivo de polen aislado........csseeeeeeeees | 42 4.4. GINOGENESIS EN CEBADA....-.....0.00eeeeeeeceeesees 43 4.5. COMPARACION DE LOS DIFERENTES METODOS HAPLOIDIZANTES.. 10-002. ee cece cece eee cence en een ees 45 eee e cece eee ttteeeteeesensnes 46 II. OBJETIVOS TIL. MATERIAL Y¥ METODOS... 1... 2... 0.0 cc eeeceeeceeeceeees 48 + MATERIAL VEGETAL... 60-02 ces cece cece ees e eee eeneeneeee | 49 1.1. MATERIAL VEGETAL UTILIZADO........6-.00ceeeeeeeeee 49 Ir1.2. CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LAS PLANTAS MADRE... 2. METODOS. 2.1. ESTERILIZACION DEL MATERIAL VEGETAL..........- 2.2. MEDIOS DE CULTIVO.........-- 2.2.1. Composicién y preparacién de los medios de cultivo. 2.2.2. Composicién de los medios utilizados en los diferentes experimentos........6esseeeeeeeee I. Influencia de diferentes combinaciones hormonales en el proceso de induccién de ginogénesis............-.0eee eee II. Comparacion de las auxinas MCPA y 2,4-D. III. Efecto del calor en el proceso de Ginogénesis..........-- telactetlaetottelact alata IV. Influencia de diferentes tipos de soporte en el medio de cultivo...... V. Influencia de diferentes azicares...... VI. Estado de desarrollo del ovario en el momento de la puesta en cultivo...... VII. Efecto de diferentes compuestos OXGANICOS... se esse eee eee eee ees 2.2.3. Composicién del medio de enraizamiento....... 2.3. CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LOS CULTIVOS........ 2.4. CONDICIONES DE ACLIMATACION DE LAS PLANTULAS...... 2.5. CONTROLES CROMOSOMICOS........-. +e eee eee eee eee 2.6. ANALISIS ESTADISTICO IV.RESULTADOS 1.0.0.0 ee cee eee eee e eee teen eens 1. RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS.... I. Influencia de diferentes combinaciones hormonales en el proceso de induccién de ginogénesis......... II. Comparacién de las auxinas MCPA y 2,4-D.......- III. Efecto del calor en el proceso de ginogénesis.. IV. Influencia de diferentes tipos de soporte en el Il 49 50 50 50 50 56 56 57 87 58 58 59 60 61 61 61 61 62 64 66 67 18 82medio de cultivo...........-.e.e eee V. Influencia de diferentes azicares.. VI. Estado de desarrollo del ovario en el momento de puesta en cultivo........... eee eee eee ee VII. Efecto de diferentes compuestos organicos . 2, RELACION ENTRE ALARGAMIENTO DEL OVARIO Y¥ FRECUENCIA DE INDUCCION DE CALLOS GINOGENICOS... V. DISCUSION. 2.2.0... ce eee eee eee eee teen e ee ne ee 1. DISCUSION DE LOS EXPERIMENTOS...............0005 1.1. INFLUENCIA DE DIFERENTES COMBINACIONES HORMONALES EN EL PROCESO DE GINOGENESIS........0- 000 e0eeeeeee 1.2. EFECTO DEL CALOR EN EL PROCESO DE GINOGENESIS..... 1.3. INFLUENCIA DE DIFERENTES TIPOS DE SOPORTE EN EL MEDIO DE CULTIVO... 1.2.6... s cece eee e eee ence ene 1.4. INFLUENCIA DE DIFERENTES AZUCARES................5 1.5. ESTADO DE DESARROLLO DEL OVARIO EN EL MOMENTO DE LA PUESTA EN CULTIVO.....-.66. 0s se ceeeeeeeee cence 1.6. EFECTO DE DIFERENTES COMPUESTOS ORGANICOS......... 2. RELACION ENTRE ALARGAMIENTO DEL OVARIO Y¥ FRECUENCIA DE INDUCCION DE CALLOS GINOGENICOS... 3. DISCUSION CONJUNTA DE LOS RESULTADOS. . vi. CONCLUSIONES........ 84 89 95 102 107 qi 112 112 1i4 116 118 119 122 123 124 132 135INDICE DE CUADROS 10. il. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Produccién de cebada en Espafia en 1988.... Produccién de cebada en el mundo en 1988.. Especies en las que se ha inducido la ginogénesis.. Composicién de los medios utilizados para la ginogénesis en distintas especies Condiciones ambientales utilizadas para el cultivo de ovarios. Caracteristicas de las plantas obtenidas a partir del cultivo de ovarios........ Bee eee eee eee eee teens Ginogénesis en diferentes genotipos de cebada Composicién de los medios utilizados.......... Namero de tratamientos y ovarios sembrados por cada tratamiento y genotipo, en cada uno de los experimentos.........eeeeeeeeee eee Bete arch efsct alate tele Resultados obtenidos para niveles de MCPA de 0.0 mg/l y seis tratamientos hormonales.........++++++ Resultados obtenidos para niveles de MCPA de 0.125 mg/l y seis tratamientos hormonales..........++ Resultados obtenidos para niveles de MCPA de 0.5 mg/l y seis tratamientos hormonales... A. Analisis de varianza para las 18 combinaciones hormonales y los dos genotipoS........++++-++++0+ B. Separacién de medias de FCALLTOT para genotipos. C. Separacién de medias de FCALLTOT para niveles de MCPA. cee ee ee ee te etree rere tenes bee e eee e eens D. Separacién de medias de FCALLRG para tratamientos.. Resultados obtenidos en la comparacién entre MCPA y 2,4-D.....-- : . A. Analisis de varianza para las cuatro combinaciones hormonales y los dos genotipos.........++++ereeeeee B. Separacién de medias de FCALLTOT para genotipos.... C. Separacién de medias de FCALLTOT para MCPA y 2,4-D. ws. seeeeeee D. Separacién de medias de FCALLRG para presencia o ausencia de AIA y BAP en el medio de induccién..... Efecto del calor, 32 °C durante los diez primeros dias de cultivo, sobre el proceso de ginogénesis... A. Analisis de varianza para un tratamiento de calor B. Separacién de medias de FCALLTOT para los dos tratamientos...... Efecto de la utilizacién de diferentes tipos de soporte en el medio de cultivo sobre el proceso 22 23 31 44 54 62 67 68 69 18 15 15 75 79 81 81 81 81 82 83 8319. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. de ginogénesis... i. cece cece cece eect e teen cent ene Efecto de diferentes azucares en el proceso de la ginogénesis............000005 A. Analisis de varianza para diferentes fuentes de carbono. B. Separacién de medias de FCALLTOT para diferentes fuentes de carbono.... ee .se eee e eee s een ee eeeennee Resultados obtenidos con ovarios del genotipo DH en diferentes estados de desarrollo del saco @mbrionario... se. ee eee e cette tenet eee tence eens A. Analisis de varianza para los distintos estados de desarrollo...........4- B. Separaci6n de medias de FCALLTOT para los dife- rentes estados de desarrollo...... Efecto de diferentes compuestos organicos sobre la ginogénesis, en el genotipo DH...............00005 A. Analisis de varianza para los distintos regula- dores de crecimiento utilizados...............008 B. Separacién de medias de FCALLTOT de los diferentes reguladores de crecimiento ... A. Andlisis de varianza de longitudes absolutas y relativas para los dos genotipos y los cinco tra- Bead EOS Ise lela efect sheathed Eee eee eee B. Separaci6n de medias de longitudes absolutas Y relativas para los dos genotipos y los cinco tra- tamientos....... Analisis de varianza-covarianza del alargamiento del Ovario y PCALLTOT.. 0.6... 50 scce cece ese e eee e eee e eee ee VI 85 90 93 93 98 99 99 102 106 106 108 108 108INDICE DE FIGURAS 1. 10. ll. a. Espiga de cebada preparada para ser esterilizada... b. Flor de cebada c. Placa de 60 mm @ con 10 ovarios de una misma espiga a los 15 dias de puesta en cultivo.... FCALLTOT y FCALLRG obtenidas para el genotipo DH en PCALLTOT y FCALLRG obtenidas para el genotipo BE en los 18 medios de cultivo utilizados...... a. Callo saliendo del ovario a los 45 dias de su puesta en cultivo............2220-- facto eget laot aa b. Plantula haploide saliendo directamente del ovario a los 45 dias de su puesta en cultivo............5- ©. Callo ginogénico con dos puntos de induccién morfogénica a los 45 dias de su puesta en cultivo.. 4. El mismo callo de la fig. 4c, con dos plantulas haploides a los 55 dias de su puesta en cultivo.... a. Analisis de la interaccién genotipo * tratamiento. b. Analisis de la interaccién MCPA * tratamiento.. FCALLTOT y FCALLRG obtenidas para ambos genotipos en las cuatro combinaciones hormonales utilizadas..... Aspecto que presentaron los ovarios en los cinco soportes utilizados a los 40 dias de cultivo.......... Ovario sembrado en medio con almidén...... a. Aspecto que presentan los ovarios del genotipo DH en los cinco medios utilizados a los 21 dias de cultivo... b. Aspecto que presentan los ovarios del genotipo BE en los cinco medios utilizados a los 21 dias de cultivo.....- c. Plantula haploide de BE saliendo directamente del ovario, en medio con 50 g/l de sacarosa, a los 50 dias de su puesta en CULLIVO.....seee eee eeeee eens d. Aspecto poco viable de una plantula regenerada a partir de un callo ginogénico, obtenida en medio con melibiosa, a los 70 dias de su puesta en cultivo.. Analisis de la interaccién genotipo * tratamiento. a. Grano de polen de cebada en estado uninucleado..... b. Grano de polen de cebada en primera divisién.... c. Grano de polen de cebada en estado binucleado...... d. Grano de polen de cebada en estado trinucleado..... VII 52 52 52 71 13 1B 73 3 17 17 80 88 88 92 92 92 92 94 97 97 97 9714. 15. 16. 17. 18. a. Placas con ovarios sembrados en diferentes estados de desarrollo.. b. Ovarios en estado de polen uninucleado, con callo procedente de antera........ c. Ovarios en estado de polen trinucleado, con dos Callos ginogenicoS........ eee eee e cess eset ee ee eens d. Plantula haploide emergiendo de un ovario sembrado en estado de polen trinucleado.............. Callo embriogénico de la linea DH saliendo de un ovario en medio con leche de coco... b. Callo de la fig. 13a ampliado..... ¢. Callo embriogénico de la linea DH saliendo de un ovario en medio con jugo de patata.. Callos morfogénicos en medio de regeneracién: a la izquierda, callo procedente de medio con leche de coco; a la derecha, procedente de medio con arginina y prolina.............. fete faetetle fae delat Variacién de la longitud de los ovarios a lo largo del cultivo. a. Ovario recién sembrado. b. Ovario a los 10 dias de cultivo......... c. Ovario a los 21 dias de cultivo..... a. Ovario a los 80 dias de cultivo Frecuencias de induccién de callos totales de ovarios y anteras para el genotipo DH...........eceeee esse ee Representacién gr4fica de FCALLOT, FCALLRG y FCALLPLANT maximas obtenidas a lo largo de todos los experimentos, en el genotipo DH........ eee eee e eee e eee Secuencia del proceso de obtencién de plantas haploides mediante cultivo de ovarios. a. Puesta en cultivo del ovario....... b. Obtencién del callo embriogénico... ©. Regeneracién de plantula a partir del embrién...... Secuencia del proceso de obtencién de plantas haploides mediante cultivo de ovarios. a. Obtencién de plantulas directas del ovario. b. Cultivo en medio de enraizamiento... ©. Transplante a tierra... . ss... eee cece cece cece eee VIII 101 101 101 102 105 105 105 105 110 110 110 110 12. 127 129 129 129 131 131 131ABREVIATURAS AIA Acido indolacético ANA 4cido naftalenacético BAP 6-benzilaminopurina BE Berenice 2,4-D Acido 2,4-diclorofenoxiacético DH Dihaploide C001374 FCALLA frecuencia de callos que aparecen al abrir el ovario FCALLNRG = frecuencia de callos no regenerables FCALLPLANT frecuencia de callos que dieron lugar a plantulas FCALLRG frecuencia de callos regenerables FCALLTOT frecuencia de induccién de callos totales FCALLTOTA FCALLTOTA + FCALLA GA3 acido giberélico KIN 6-fur furilaminopurina MCPA Acido metilclorofenoxiacéticoAGRADECIMIENTOS Quiero expresar mi mas sincero agradecimiento al Dr. Luis Cistué, por el planteamiento, guia y discusién en la realizacién de este trabajo, y su contribucién como profesor y amigo a mi formacién. Asimismo, quiero agradecer al Dr José Manuel Lasa, por su apoyo recibido y asesoramiento. A mis compafieros de la Unidad de Genética y Producién Vegetal de la Estacién Experimental de Aula Dei, especialmente a M. P. Zanuy, B. Egafia, M. Sanz, M. P. Vallés, I. Ruiz de Galarreta, E. Igartua, A. Alvarez y A. Garcia, por su experta e inestimable ayuda. Al Dr. Ignacio Romagosa por el asesoramiento en el tratamiento estadistico del presente trabajo. A las Dras. Marina Garcia y Jone Aguirreolea por las sugerencias dadas e interés demostrado. A J. M. Garbayo, M. A. Moreno, F. Mestres, M. V. Lépez y a toda mi familia, por la gran ayuda prestada y la comprensién mostrada en todo momento.I. INTRODUCCION fco e S 1. ASPECTOS GENERALES 2% a % # 1.1. IMPORTANCIA ECONOMICA Ys La cebada ( Hordeum vulgare L.) es el cuarto cereal en importancia en el mundo, después de trigo, maiz y arroz (Poehlman, 1985; FAO, 1988). Se cultiva en un espectro de condiciones ambientales mucho m&s amplio que cualquier otro cereal. La cebada es un cultivo resistente a la sequia (Jasny 1940), tolerante al frio, y esta considerada como el cereal mas tolerante a suelos salinos o alcalinos (von Bothmer yy Jacobsen, 1985). En los cuadros 1 y 2 se recogen datos sobre la produccién de este cultivo. En el afio 1988 Espafia fué el segundo pais productor mundial después de la URSS. Cabria destacar que 1988 fue un afio de producciones muy altas como consecuencia de la gran cantidad de lluvias en la primavera y principios de verano. PRODUCTORES SUPERFICIE RENDIMIENTO PRODUCCION ha kg/ha t castilla-Leon 1429 3370 4816 Castilla-La Mancha 1052 2n6 2858 Aragén 667 3196 2132 Andalucia 318 2314 738 Catalufia 242 3256 788 ESPANA 4175, 2972 12409 Cuadro 1. Produccién de cebada en Espafia en 1988 (Boletin Mensual de Estadistica Agraria del M.A.P.A., 1988).PRODUCTORES SUPERFICIE RENDIMIENTO PRODUCCION 1000 ha kg/ha 1000 t Buropa 48368 2477 119833 Alemania Fed. 1841 5219 9609 Espafia 4175 2891 12070 Francia 1916 5263 10086 Reino Unido 1895 4625 8765 URSS 30000 1567 47000 Asia 12279 1749 21474 Turquia 3300 2273 7500 aAnérica N. 7452 2270 16916 Canada 4132 2450 10125 ‘EEUU 3049 2074 6325 Africa 4851 1149 5575 Oceania 2361 1557 3675 América 8. 650 1460 950 MUNDIAL 75961 2217 168423 L Cuadro 2. Produccién de cebada en el mundo en 1988 (FAO, 1988). 1.2. TAXONOMIA Y MORFOLOGIA DE LA PLANTA Todas las cebadas cultivadas pertenecen a la especie Hordeum vulgare L., que es un miembro de la tribu Triticeae de la familia Gramineae. Es una planta herbacea, anual, —herma- frodita y autégama. El numero cromosémico de la especie es 2n=2x=14. ba inflorescencia de la cebada es una espiga y esta formada por un eje articulado, el raquis, que est& compuesto de una serie de entrenudos, cada uno de los cuales porta una triada de espiguillas unifloras. Cada flor consta: de dos pequefias glumas en la parte exterior, de forma alargada y estrecha y termina- das en una arista; dos glumillas, la exterior o lemma y la interior o palea. La lemma se continua con un apéndice largo,llamado arista o "barba". En el receptaculo formado por las glumillas hay tres estambres, un ovario con un estigma bifurcado y plumoso, y dos érganos pequefios que se encuentran en relacién con la apertura de la flor, llamados lodiculas. Atendiendo a la fertilidad de las espiguillas laterales de la cebada, podemos distinguir dos grupos de variedades: - Variedades hex4sticas o de seis carreras: triada formada por tres flores hermafroditas completamente fértiles. - Variedades disticas o de dos carreras: triada formada por una flor central hermafrodita, completamente fértil y dos laterales, de menor tamafio, con estambres que pueden ser fértiles o no, y ovario rudimentario. 1.3. OBJETIVOS ¥ SISTEMAS DE MEJORA 1.3.1. Objetivos Los objetivos de mejora de la cebada se centran en: a. Mejora del rendimiento agricola y su estabilidad. El rendimiento es un cardcter complejo, en el que se pueden considerar tres componentes principales: nimero de espigas por planta, namero de granos por espiga y peso medio del grano. Se ha observado que existe una correlacién negativa entre estos tres caracteres. La estabilidad en los rendimientos se consigue actuando sobre la adaptacién ecolégica, resistencia a plagas y enferme- dades, accidentes y resistencia al encamado. b. Mejora de la calidad tanto cervecera como para pienso. Se busca calidad de malteo y calidad cervecera. Una varie- dad de cebada de buena calidad maltera debe germinar rapida y uniformemente y producir la mayor cantidad posible de malta por unidad de peso de cebada. Para una buena calidad cervecera, debera producir un elevado rendimiento de extracto y haberdesarrollado, durante la germinacién, la suficiente cantidad de enzimas aminoliticas (a y 8-amilasas) para degradar completa- mente el almidén. En calidad para alimentacién, interesa aumentar la frac- cion proteinica y mejorar las proporciones relativas de los aminodcidos esenciales lisina y treonina. 1.3.2. Sistemas de mejora Los sistemas de mejora clasica, basados en el cruzamiento simple y posterior seleccién de la descendencia, han limitado fuertemente la recombinacién génica y han disminuido la utili- zacién de la variabilidad genética Harlan en 1927 fue el primero en utilizar cxruzamientos compuestos. Este es un sistema de cruzamientos convergentes, basado en cruzamientos de pares de parentales y posterior cruzamiento de pares de Fl hasta que todos los padres entran a formar parte de una progenie comin. Este sistema trae consigo un manejo de mucha variabilidad y una rotura de los grupos de ligamiento. El anico inconveniente del sistema es que el numero de padres que se pueden incluir es relativamente pequefio (Harlan, 1959). El descubrimiento de un gen de androesterilidad génica (Suneson, 1940) hizo posible la utilizacién de poblaciones compuestas. Esto supone, por un lado, un aumento grande del numero de parentales que pueden intervenir en el cruzamiento y por otro, la utilizacién de las poblaciones como si fueran alégamas. La mejora de poblaciones segregantes para androesterilidad mediante seleccién recurrente fue propuesta por primera vez por Ramage (1978). Actualmente se utiliza en diferentes centros de investigacién, entre ellos en la Estacion Experimetal de Aula Dei. En este sistema, se parte de poblaciones segregantes para androesterilidad que han sido seleccionadas para determinados caracteres que interesa mejorar y que sirven de puente para la introduccién de nuevas variedades autéctonas y comerciales. Se les somete a ciclos de seleccién recurrente, permitiendo maximizar la recombinacién. Mediante seleccién se consigue un aumento de las frecuencias de genes y combinaciones genéticasdeseables. Conforme se realiza la mejora de la poblacién, mediante la seleccién recurrente, se realiza la fijacién de nuevos genotipos. Esto se hace mediante los métodos conven- cionales de obtencién de lineas puras en plantas autégamas (masal, genealégico, SSD), 0 bien, mediante la utilizacién de técnicas de haplo-diploidizacién (cruzamiento interespecifico con H. bulb: , androgénesis o ginogénesis) (Lasa y Romagosa, 1988). 2. PLANTAS HAPLOIDES En las plantas superiores, los haploides son los esporofi- tos que contienen un numero cromosémico gamético. Los haploides que derivan de especies diploides se llaman monohaploides, mientras que los que proceden de especies poliploides se llaman polihaploides. Los haploides son utilizados en forma de dihaploides después de su duplicacién cromosémica con colchicina. 2.1. UTILIDAD DE LOS HAPLOIDES Las principales aplicaciones de los haploides se centran en su utilidad en programas de mejora (Kasha y Reinbergs, 1981), su uso en analisis genéticos (Choo et al., 1985), y su aplica~ cién en la seleccién de mutantes (Zenk, 1974; Chaleff, 1983). 2.1.1. Programas de mejora Los haploides pueden ser utilizados de diferentes formas en un programa de mejora: a. Mediante la produccién de lineas homocigéticas a partir de Fl o de selecciones avanzadas, en e1 tiempo mds corto posible. Los dihaploides se pueden llegar a comercializar en un periodo de tiempo reducido como variedades, o utilizarse como lineas puras para la produccién de hibridos en especies alégamas. b. El uso de haploides permite evaluar el valor potencial de un cruzamiento, identificando cruzamientos superiores(Reinbergs et al., 1976; Choo, 1988). Park et al. (1976) demos- traron que con un minimo de veinte lineas se podia caracteri- zar un cruzamiento. c. La introduccién de dihaploides en programas de mejora de poblaciones, mediante seleccién recurrente, hace mas efectiva la seleccién (Griffing, 1975). Patel et al. (1985) han descrito la utilizacién de este sistema en cebada, y actualmente los dihaploides se est4n incorporando en programas de mejora de poblaciones. @. Los dihaploides permiten obtener en homocigosis algunos genes dificiles de obtener por otros métodos, como por ejemplo los alelos de incompatibilidad Para una utilizacién eficiente de un sistema de produccién de haploides en un programa de mejora, los métodos por los que se obtienen deben cumplir los siguientes requisitos: produ- cir haploides que representen una muestra al azar de los gametos de cualquier genotipo; sex eficientes en la produccién de haploides y en la duplicacién cromosémica; y dar lugar a lineas dihaploides estables, con buenas caracteristicas agronémicas (Kasha y Reinbergs, 1981). 2.1.2. Analisis genéticos Las principales aplicaciones de los dihaploides en an&lisis genéticos son las siguientes: a. Estudios de genes mayores. Las lineas dihaploides desarrolladas a partir de la Fl pueden usarse para detectar y estimar valores de ligamiento entre los genes mayores (Riggs y Snape, 1977; Caligari et al., 1986) y evaluar los efectos pleiotrépicos de tales genes sobre caracteres agronémicos (Snape y Simpson, 1981). Choo y Reinbergs (1987) describieron un método para detectar pleiotropia y ligamiento de genes que controlan dos caracteres. b. Estudios de caracteres cuantitativos. Los dihaploides obtenidos a partir de Fl, F2, y generaciones de retrocruzamien- to son utiles para realizar una particién de la varianza genética, en ausencia (Choo et al., 1979), y en presencia de ligamiento e interacciones génicas (Choo y Reinbergs, 1979).Choo et al. (1986) y Choo y Reinbergs (1987, 1988), utilizando lineas dihaploides en cebada, hicieron particiones de la varianza para los caracteres produccién de grano, altura de planta y fecha de espigado. Adem&s, permiten detectar el grado de ligamiento entre genes que controlan caracteres cuantitati- vos (Snape y Simpsom, 1981). c. Estimacion del numero de genes involucrados en un carac- ter cuantitativo. Choo y Reinbergs (1982) encontraron, en cebada, que el numero de genes que segregaban para los carac- teres de produccién de grano, fecha de espigado y altura de planta variaban de 5 a 11, de 6 a 9 y de 4a 13, respectiva- mente. a. Localizacién de poligenes que controlan caracteres cuan- titativos (Choo, 1983). 2.1.3. Seleccién de mutantes La seleccién sobre tejidos haploides ofrece la posibilidad de identificar inmediatamente el fenotipo de la mutacién, espe- cialmente para mutaciones recesivas (Zenk, 1974). Por otro lado, en las células dihaploides queda de manifiesto cualquier mutacién recesiva no deseada, que puede quedar enmascarada cuando se trabaja con diploides no homocigéticos. 2.2. METODOS DE OBTENCION DE HAPLOIDES Los haploides pueden aparecer espontaneamente en la natura- leza o pueden inducirse experimentalmente. 2.2.1. Haploidia espontanea La haploidia espontdnea se produce como resultado de parte- nogénesis o de apogamia. La célula huevo sin fecundar, células espermaticas o sinérgidas comienzan a dividirse espontdneamente para formar una planta haploide. Este fenémeno se ha observado en semillas monoembriénicas y poliembriénicas. Se han encontrado haploides monoembriénicos esponténeos en muchos géneros vegetales como Asparagus (Marks, 1973), Beta(Fisher, 1962), Brassica (Stringham y Downey, 1973), Hordeum (Tsuchiya, 1962), Triticum (Lacadena y Ramos, 1968). Chase (1969) sefialé la posibilidad de que la divisién de las células podria estar relacionada con la falta de una sustancia inhibidora de la divisién, que en circunstancias normales se encuentra en el citoplasma de la célula huevo, y que es desactivada durante la fertilizaci6n, por la liberacién de material del tubo de polen. Se han descrito procesos de poliembrionia asociados con haploidia en Gossypium hirsutum (Beasley, 1940), Helianthus annuus (Kurnik, 1962), Hordeum vulgare y Triticum aestivum (Aase, 1946), Zea mays (Chase, 1948), etc. La aparicién de una semilla con dos embriones, uno ny el otro 2n, puede deberse a la produccién de dos sacos embrio- narios dentro del mismo ovario, uno de los cuales es fecundado y el otro no, dando lugar a un embrién haploide (Ramiah, 1935), © al desarrollo de una sinérgida para dar lugar a un embri6én simaltdéneamente con desarrollo normal del zigoto diploide, como ocurre en algodén (Gore, 1932), 0 bien, al desarrollo parteno- genético de la célula huevo y fertilizacién de las sinérgidas, como se observé en trigo (Yamamoto, 1936). También podrian aparecer gemelos n-n, como resultado de una division de un "zigoto" haploide, o del desarrollo simultdneo de dos células del saco embrionario. 2.2.2. Haploidia inducida En a mayor parte de los casos, los haploides se obtienen como consecuencia de un proceso de induccién, mediante la esti- mulacién de la célula huevo, de las sinérgidas o del polen. Existen diferentes métodos: a. Agentes fisicos: los més comanmente utilizados para inducir haploidia han sido rayos X (Dulieu, 1964), rayos + (Turkov y Dubrov, 1968), radioisétopos (Person, 1955], rayos UV (Stadler, 1940) y cambios de temperatura (Randolph, 1932) Ovarios fecundados con polen irradiado y cultivados "in vitro" han dado lugar a haploides en petunia (Raquin, 1985) y en melon (Sauton y Dumas de Vaulx, 1987).b. Sustancias quimicas: se han probado algunas para inducir haploidia, sin que hasta el momento ninguna haya dado buenos resultados. Las mds utilizadas han sido los tratamientos de polen por sustancias antimitéticas, como Nj0 en Solanum phureia (Montezuma de Carvalho, 1967), azul de toluidina en Zea mays. (Al-Yasiri, 1967) y cloranfenicol en Hordeum vulgare (Yoshida y Yamaguchi, 1973). c. Semigamia: es un proceso de fertilizacién anormal, en el cual un nicleo espermatico entra en la célula huevo, pero no llega a fusionarse con ella. Al dividirse ambas células por separado, dan lugar a embriones haploides mosaico. Para el desarrollo de un embrién via semigamia se requiere la poliniza- cién. El uso de la semigamia ha permitido la obtencién de un gran nimero de haploides en algodén (Turcotte y Feaster, 1963). d. Seudogamia: es la formacién de un embrién después de la polinizacién, pero sin que el gameto masculino llegue a formar parte del nucleo definitivo del zigoto, sino que actta como un estimulante de la partenogénesis. Este proceso se produce usando polen abortivo o en casos de hibridacién interespecifica (Chase, 1969). Los cruzamientos Fragaria vesca x F. grandi- flora (Islam, 1961) y Solanum tuberosum x S. phureja (Rowe, 1974) dieron lugar a plantas haploides. e. Interacciones nicleo-citoplasma: pueden dar lugar a la formacién de haploides, como ocurre en los procesos de elimina- cién cromosémica selectiva. Este caso se da en el cruzamiento de especies no muy distantes. Los cromosomas de uno de los parentales son eliminados después de la fecundacién, durante las primeras divisiones que dan lugar a la formacién del embrién (Kasha, 1974). Este proceso de eliminacién cromosémica selectiva se encuentra en cruzamientos interespecificos de Hordeum (Jacobsen y von Bothmer, 1981), e intergenéricos de Aegilops, Secale y Triticum con H. bulbosum (Kasha, 1974; Bennet et al., 1976; Subrahmanyan, 1980). f£. Sistemas genéticos: que inducen haploidia, como ocurre en los siguientes casos: - factor iniciador de haploidia en cebada o gen hapt (Hagberg y Hagberg, 1980), del cual se tratara més adelante - gen "ig" del gametofito indeterminado en maiz (Kermicle, 101974). Al parecer los embriones haploides se originan a partir de un nacleo espermatico con el citoplasma de la célula materna. El .ntcleo de la célula materna es desplazado funcionalmente. - factores genéticos en presencia de citoplasmas “alien” (Kobayashi y Tsunewaki, 1980). Individuos homocigéticos para la translocacién 1B/1R pueden produciz, haploides con una frecuencia del 70% . 2.2.3. Haploidia mediante cultivo "in vitro" 2.2.3.1. Androgénesis a. Cultivo de anteras Esta técnica consiste en cultivar las anteras inmaduras en un medio que estimule la division celular de las microsporas, obteniéndose callos multicelulares. La transferencia de éstos a un medio de regeneracién adecuado induce la diferenciacién de plantulas haploides. También es posible la formacién directa de un embrién a partir de una microspora, dando lugar a una planta directa sin pasar por fase de callo. El cultivo de anteras para obtencién de plantas haploides se llevé a cabo por primera vez en Datura innoxia (Guha y Maheswhari, 1964). Desde entonces ha aumentado mucho el numero de especies en las que se han obtenido haploides por cultivo de anteras (Bajaj, 1983). Los factores mas importantes que afectan a la androgénesis son: - Genotipo. La frecuencia de induccién y la capacidad de regeneracién del callo o de los embriones formados a partir de la antera, varfan dependiendo del genotipo de los parentales (Maheswhari et al., 1980). Se ha demostrado que la capacidad “androgénica" esté bajo control genético (Foroughi-wehr et al., 1982; Charmet y Bernadt, 1984). Segun algunos autores este caracter esta regulado solamente por genes nucleares (Foroughi-Wehr y Friedt, 1984; Heberle-Bors y Odenbach, 1985), mientras que otros consideran que ademas existen genes cito- pldsmicos (Charmet y Betnard, 1984). at- Estado fisiolégico de las plantas. Las variaciones estacionales y los diferentes tratamientos fitosanitarios son factores que afectan a la respuesta de la antera al cultivo. Es necesario que el crecimiento de las plantas se dé bajo condi- ciones 6ptimas. Estas condiciones varian dependiendo de la especie (Foroughi-Wehr y Mix, 1979; Dunwel, 1985; Lyne et al., 1985). - Estado de desarrollo de la antera. Las anteras responden al cultivo solamente en un periodo muy limitado de su desarrollo, entre el estado de tétrada y el momento posterior a la primera mitosis polinica (Nitsch, 1974). No obstante existen diferencias entre las especies. Asi, en tabaco se obtienen los mejores resultados con polen en la primera mitosis polinica (Sunderland, 1984), mientras que en cereales los estados 6ptimos son estadios uninucleados tempranos (Wenzel y Foroughi-Wehr, 1984). - Pretratamiento. El tratamiento de las flores a bajas temperaturas, antes de su puesta en cultivo, ha sido efectivo en diferentes géneros como Datura (Nitsch y Norreel, 1973), Hordeum (Huang y Sunderland, 1982), Nicotiana (Bajaj y Reinert, 1975), Oxyza (Wang et al.,1974 ), y Triticale (Sun et al., 1980). Sin embargo, en otros géneros como en Triticum no ha dado buenos resultados (Ouyang, 1986). En cereales, se ha observado que con el pretratamiento se consigue una uniformidad en el estado de desarrollo de las anteras de toda la espiga (Sunderland y Dunwel, 1977). La serie de acontecimientos que normalmente comienza antes de la primera divisién mitética del polen, no tiene lugar en el frio, o bien queda interrumpida en un paso determinado, de modo que no puede continuar. El efecto beneficioso del pretratamiento frio parece estar relacionado con la degeneracién prematura del tapetum y de la matriz celular (Sunderland y Huang, 1985) = Medio de cultivo. Los medios de cultivo empleados son los m&s comunes en cultivo de tejidos: MS (Murashige y Skoog 1962), NN (Nitsch y Nitsch, 1969), o modificaciones de ellos. Los medios Ng modificado (Chu, 1978) y PM (Chuang et al., 1978 se han utilizado en cereales 12Las gramineas y cruciferas normalmente necesitan la adicién de hormonas al medio de cultivo, Dunwel (1986) dividio las especies segin sus requerimientos osméticos en dos categorias: especies que necesitan concentraciones bajas de sacarosa, en las que incluyé liliaceas y solanaceas, y especies que requieren altas concentraciones de sacarosa como cruciferas y gramineas. La incorporacién de carbono activo (Bajaj, 1983), glutami- na, inositol y prolina ( Sozinov et al., 1981; Xu y Sunderland, 1981) puede favorecer el desarrollo de la antera. b. Cultivo de polen El cultivo de polen aislado es una técnica compleja. Sin embargo, hay métodos que permiten reemplazar los tejidos de la antera por un medio de cultivo. Sharp et al. (1972) indujeron e1 crecimiento de polen aislado de tomate, haciéndolo crecer sobre papel de filtro, encima de anteras intactas. De la misma forma, Pelletier (1973) lo consiguié con microsporas de tabaco, utilizando callos de petunia para precondicionar el medio. Durante los altimos afios se ha avanzado mucho en esta técnica. Se han conseguido plantas haploides a partir de microsporas de maiz (Cho y Zapata, 1988; Pescitelli, 1989) y arroz (Datta et al., 1990a). Recientemente se ha hecho trans— formacién a nivel de protoplastos de granos de polen (Datta et al., 1990b). 2.2.3.2. Ginogénesis Se desarrolla en el punto 3 de la revisién. 13GINOGENESIS El téxmino ginogénesis fue adoptado por San Noeum (1979) para definir el desarrollo "in vitro" de una planta haploide a partir del gametofito femenino. San Noeum (1976) obtuvo los primeros haploides ginogénicos de cebada. Todas las plantas fueron haploides y verdes. Tres afios mas tarde, Zhu y Wu (1979) obtenian haploides a partir del cultivo de ovarios de trigo y de tabaco, y Asselin de Beauville (1980) y Zhou y Yang (1980) consiguieron plantas haploides de arroz. A partir de los afios 80 ha ido aumentando el numero de especies que han respondido con éxito al cultivo de ovarios (cuadro 3). 3.1. FACTORES QUE AFECTAN LA RESPUESTA AL CULTIVO 3.1.1. Genotipo de las plantas madre El genotipo de las plantas madre tiene una influencia muy marcada en los resultados, en cultivo de ovarios. Se han encon- trado diferencias significativas entre genotipos en el proceso de induccién de callos y/o embriones en Gerbera (Cagnet-Sitbon, 1980, citado por Yang y Zhou, 1982), tabaco (Wu y Cheng, 1982), arroz (Kuo, 1982; Zhou et al., 1983), maiz (Truong-André y Demarly, 1984), cebada (San Noeum, 1979), trigo (Zhu et al., 1981b), xremolacha (d'Halluin y Keimer, 1986). Sin embargo algunas veces se pueden reducir esas diferencias, cambiando la composicién de los medios de cultivo como ocurrié en remolacha (Doctrinal-et al., 1989). En girasol, no se encontraron grandes diferencias geno- tipicas en la frecuencia de induccién de callos y embriones ginogénicos, pero la regeneracién de éstos en plantas estaba fuertemente marcada por el genotipo (Gelebart y San, 1987) 14ESPECIE REFERENCIA Alium cepa Beta vulgaris Cucurbita pepo Gerbera jamesonii Helianthus annus Hordeum yulaare Nicotiana tabacum Picea abies Populus sp ‘Triticum aestivun Maren (1989) Campion y Alloni (1990) Hosemans y Bossoutrot (1983) Keimer y d'Halluin (1984) Goska (1985) Chambonet y Dumas de Vaulx (1985) sitbon (1981) Meynet y Sibi (1984) Ahmim y Vieth (1986) Gelebart y San (1987) San Noeum (1976, 1979) Wang y Kuang (1981) Huang et al. (1982) Zhu y Wu (1979) Ran (1980) zha et al. (1981a) Asselin de Bouville (1980) Zhou y Yang (1980) Kuo (1982) Huhtinen et al. (1981) wa y Xu (1984) Zhu y We (1979) Zhu et al. (1981b) Ahloowalia (1985) Bo et al. (1982) ‘Truong-André y Dermaly (1984) Cuadro 3. Especies en las que se ha inducido la ginogénesis. 1s3.1.2. Condiciones de crecimiento de las plantas madre Al. igual que ocurre en el cultivo de anteras, las condi- ciones de crecimiento de las plantas madre tienen una gran influencia en la respuesta al cultivo, tanto del 4vulo como del ovario. Las variaciones estacionales llevan consigo cambios de luz y temperatura, los cuales pueden afectar al estado fisiolégico de las plantas. Doctrinal et al. (1989) encontraron un efecto estacional muy pronunciado y significativo en remo~ lacha, obteniendo los mejores resultados con plantas crecidas en el mes de Junio (periodo de floracién natural), lo cual podria estar ligado a una maxima actividad fisiolégica para la floracién. Este mismo efecto se ha visto en maiz (Truong-André y Demarly, 1984). En Gerbera se encontraron diferencias en el proceso de induccién de callos en experimentos realizados entre finales de Agosto y Septiembre (Meynet y Sibi, 1984). Cappadocia et al. (1988) observaron que ovarios cultivados en otofio dieron lugar a mayor nimero de callos que los cultivados en primavera; sin embargo, estos tiltimos tenian mayor capacidad de regenera- cién que los inducidos en otofio. 3.1.3. Estado de desarrollo del saco embrionario La gametogénesis femenina varia notablemente de unas espe- cies a otras. Después de la meiosis se forma una tétrada que da lugar a cuatro megasporas. En la mayoria de los casos tres de ellas degeneran después de la meiosis, mientras que la cuarta forma el saco embrionario, Otras veces, sélo degeneran dos o ninguna megaspora, formandose entonces un saco embrionario biespérico o tetraespérico como en numerosas angiospermas (Maheswhari, 1950). La mayoria de las plantas en las que se ha inducido la ginogénesis tienen un saco embrionario monoespérico que, normalmente en la madurez esta formado por ocho células (3 an- tipodales, 2 nicleos polares, 1 célula huevo y 2 sinérgidas). En algunas especies se pueden dar variaciones de este nimero de células, desde no poseer ninguna célula antipodal (pata- ta y lechuga) hasta tener mas de cincuenta (en trigo). Por otra parte los nicleos polares pueden unirse antes de la fecundacién (lechuga o girasol) o durante la fecundacién (trigo y cebada). 16Debido a las dificultades técnicas que presenta el observar el estado de desarrollo del saco embrionario para su puesta en cultivo, se suelen utilizar rasgos morfolégicos £acilmente observables que estén correlacionados con dicho estado. En cereales, se utiliza el estado de desarrollo de los granos de polen. Huang et al. (1982), trabajando con cebada, observaron que existia la siguiente correlacién entre ambos desarrollos: ESTADO DE DESARROLLO Polen Saco embrionario Microspora no vacuolada Tétrada de megaspora Microspora vacuolada Saco embrionario con 1 a 4 nicleos Polen binucleado Saco embrionario con 8 nicleos Polen trinucleado Saco embrionario maduro En otras especies se han utilizado, como indicadores del grado de madurez del saco embrionario, caracteristicas de la flor como, color de la antera (cereales), forma y altura de la flor, (remolacha), posicién del estilo con relacién a la antera © a la corola, (girasol) y posicién del évulo en el ovario (Gerbera). A diferencia del cultivo de anteras, donde la androgénesis sélo puede inducirse en esporas uninucleadas, en ovarios un amplio espectro de estados de desarrollo del saco embrionario dan lugar a un desarrollo ginogénico, aunque en la mayoria de los casos los estados més tardios dan los mejores resultados. San Noeum (1976, 1979) y Huang et al. (1982), obtuvieron en cebada los mejores resultados con sacos embrionarios de ocho nacleos y sacos embrionarios maduros (polen bi y trinucleado). Ovarios mas jévenes no dieron resultado. Otros autores sembra- ron ovarios que contenian ocho nucleos, en arroz (Asselin de Beauville, 1980), en maiz (Truong-André y Demarly, 1984), en remolacha (Hosemans y Bossoutrot, 1985; Doctrinal et al., 1989), y en girasol (Gelebart y San, 1987). 17por otra parte, Zhou et al. (1983), trabajando con arro? encontraron que el estado éptimo para la inoculacién variaba desde saco embrionario uninucleado a tetranucleado, que 6 corresponde con estado de polen uninucleado tardio o binucleado temprano; sin embargo, a medida que el saco embrionario iba madurando la frecuencia de induccién de 1a ginogénesis dismi- nuia, Kuo (1982) obtuvo los mejores resultados con — sacos embrionarios de dos nucleos a sacos embrionarios maduros. En tabaco se obtuvieron resultados sembrando ovarios muy jovenes, desde célula madre de la megaspora (antes de la nelogis) hasta tétradas jévenes (Zhu y Wa, 1979 y Zhu et al-s woeia). Bn cebolla, sacos embrionarios en estado de célula jadre de 1a megaspora han dado mejores resultados que estadtos mas maduros. 3.1.4. Pretratamiento La introduccién de espigas de trigo a 3 °C, durante 5-10 aias antes de la puesta en cultivo, dio buenos resultados. Del mismo modo, en girasol, el tratamiento de toda la inflorescen- cia durante una semana a 10 °C, parece aumentar la frecuencia de induccién ginogénica (San y Gelebart, 1986). Sin embargo, diferentes tratamientos a bajas temperaturas en arroz (Zhou et al., 1986), Gerbera (Cagnet-Sitbon, 1980, citado por Yang y Zhoa 1982), xremolacha (d'Halluin y Keimer, 1986) y cebolla (Muren, 1989) no provocaron un aumento del numero de callos ni embriones respecto al control. En general, se ha estudiado muy poco el efecto de un trata~ miento de calor en la respuesta ginogénica. Tratamientos de calor aplicados a ovarios cebolla (Muren, 1989) después de la puesta en cultivo, no han dado resultados efectivos. 3.1.5. Medio de cultivo « Medio Basico En los primeros trabajos de los aflos 50 se utilizd el medio NI (Witsch, 1951) para cultivo de ovulos y de ovarios. Poste riormente, tanto el medio de MS, Miller (Miller, 1963), 0 N6 modificade han dado buenos resultados (cuadro 4) 18b. Hormonas exédgenas Normalmente se necesita incorporar una auxina al medio de cultivo para la inducci6n de callo a partir de un ovario. La utilizacién de una sola auxina como 2,4-D (Acido 2,4-diclorofe- noxiacético), MCPA (acido metilclorofenoxiacético) o ANA (Acido naftalenacético) ha sido suficiente para la induccién de callos. Otras veces se necesita aportar al medio alguna citoquinina como BAP = (6-benzilaminopurina) ° KIN (6-fur fur ilaminopurina). En el cuadro 4 se muestran las auxinas y citoquininas utilizadas hasta la fecha, para el cultivo de ovarios de distintas especies. El sulfato de adenina ha resultado efectivo en el cultivo de 6vulos de cebolla (Campion y Alloni, 1990). El callo o el embrién que se ha formado en el medio de induccién debe ser transferido a un segundo medio o medio de regeneracién, donde se pueden dar tres casos: ~ medio sin auxina. San Noeum (1979) utiliz6 un medio de regeneracién libre de hormonas y consiguié regenerar plantas de cebada. Kuo (1983) utilizd KIN (2 mg/l) para la diferencia- cién de callos de arroz. - medio con concentraciones de auxinas m&s bajas que el medio de induccién. En ocasiones pueden ir acompafiadas de alguna citoquinina. Zhou et al. (1986) disminuyeron la concen- tracién de MCPA de 0.125 mg/l en el medio de induccién a 0.033 mg/l en el medio de regeneracién. > medio con sélo citoquininas. Ahmim y Vieth (1986) trabajando con évulos de Gerbera, afiadieron 0.1 y 2 mg/l de AIA (Acido indolacético) y BAP respectivamente al medio de xegeneracién, cuando en el medio de induccién habfan utilizado 0.1 y 0.2 mg/l de AIA y BAP. En definitiva, se trata de aumen- tar la relacién citoquininas/auxinas. Otras veces se da la formacién del embrién y su poste- xiox desarrollo en medio de induccién, sin necesidad de subcultivar en medio de regeneracién. Goska (1985) obtuvo 19plantas haploides de remolacha a partir de 6vulos, usando un unico medio de induccién, c. Fuentes de carbono La sacarosa aportada al medio no solamente actaa como fuente de carbono, sino que contribuye en gran medida a la presién osmética final del medio. Por otra parte, la eficacia de los tones nitrato y amonio y el efecto de la citoquinina en la divisién celular dependen de la disponibilidad de azicar (Gamborg et al., 1974, citado en George y Sherrington, 1984). Los xequerimientos éptimos de sacarosa para la induccién y la posterior regeneracién, pueden ser diferentes. En remolacha (Hosemans y Bossoutrot, 1985; van Geyt et al., 1987), y en arroz (Zhou y Yang, 1981) mantuvieron la misma con- centracién de sacarosa en ambos medios. Sin embargo, San Noeum (1976, 1979) trabajando con cebada, Truong-André y Demarly (1984) con maiz, y Gelebart y San (1987) con girasol utilizaron concentraciones de sacarosa bajas del orden de 2% frente al aproximadamente 10% de las incorporadas en el medio de induccién. 4. Tipos de soporte El soporte mas ampliamente utilizado en ginogénesis ha sido el agar, en concentraciones que varian de 8 a 10 g/l. Estas cantidades se han utilizado en cebada (San Noeum, 1976; Huang et al., 1982), Gerbera (Meynet y Sibi, 1984; Ahmim y Vieth 1986), xemolacha (Goska, 1985) y girasol (Gelebart y San 1987). El cultivo en medio liquido ha dado muy buenos resultados en arroz (Zhou y Yang, 1981). Estudios comparativos sobre medio sélido y liquido realizados por Zhou et al. (1983) mos- traron que el crecimiento de los ovarios en medio liquido era superior al del medio sélido. Adem4s, el medio liquido inducia la formacién de mayor numero de callos ginogénicos, mientras que el medio sélido inducia mayor nimero de callos somaticos. Zhou et al. (1986) subcultivaron los callos ginogénicos en medios de diferenciacién sdélidos o bien liquidos, con ayuda de un soporte. De este modo consiguieron regenerar del 30 al 60% de los callos inducidos. E1 cultivo de évulos de girasol en medio liquido, también dio buenos resultados (Cai y Zhou 201984). No obstante, Yang et al. (1986) consiguieron frecuencias buenas de induccién en medio liquido, pero al pasar los embriones a medio sélido no consiguieron regenerar. e. Vitaminas Las vitaminas son necesarias en cultivo de tejidos. Sin embargo, se han hecho pocos estudios sobre diferentes combinaciones de vitaminas en cultivo de ovarios, salvo los xealizados por Wu y Cheng (1982) en tabaco, que mostraron que la frecuencia de induccién de embriones y callos embriogénicos aumentaba significativamente al aumentar las concentraciones de tiamina, piridoxina, Acido ascérbico, Acido nicotinico y Acido folico. £. Otros reguladores de crecimiento El jugo de azucena fue utilizado con éxito en cebada (Gu y Cheng, 1984), mientras que el “carbono activo inhibié el desarrollo ginogénico en Gerbera (Cappadocia et al., 1988). La utilizacién de medio precondicionado con ovarios maduros fecundados no fue efectivo en maiz (Truong-André y Demarly. 1984). Sin embargo, el condicionamiento del medio con espigas y ovarios de cebada dio mejores resultados que los medios sin condicionar (Jensen y Olesen, 1984). Otros reguladores utilizados han sido: caseina hidrolizada en arroz (Kuo, 1982), Acido glutémico en trigo (Ahloowalia, 1985) e inositol en remolacha (Goska, 1985). 21SPECIE MEDIO BASAL « Hoons # SCAROSA § REFERENCE Lion cepa 35 (3) 21,402) BRP (2) 2-15,10 wren (1983) eta valgaris, HS 0 My (L) 2,40(2) 0 BAP(L) 3-4 flosenans y tosseutrot (1983-1915) P08 2A0(0.3}42,(D(0.1}+4MA(0.2) 3-10 Heiner y d*Walluin (1944) Gerbera janesonii, HS AAA(0.5)¢840(2) eK10(2) 6 —sitbon (1981) Me WS HE MHC MILLBR (S$) ATA(O.1-1)+890(0.2-2) 1-6 bain y Vieth (1986) Helianthus anws 1, (1) wePA{0.5-21 6 Tang et al. (1986) aS ¥ (5) 1,40(2) y/o ALM(O.5) y/o MMA(2) y/o 8AB(2) y/o KIW(1-2} 6,10 Gelebart y San (1987) Tordeun vuloare MILLER (S) 2,010) 10 San Yoeua (1976) A (8) 2,40(0.5) 4A(1) BCL) 3 Wang y Kerang (1981) 1; (3) -2)¢AHA 0 ATA(I) Ti o BaP (1) 3,12 Hoang et al. (1982) Vicotiana tabacun 15 (3) AIA(O.5-1)4RUHT2-4), 2 tho y ia (1879) Qnyza sativa MILLER (S) aa(3) 6 Asselin de Heauville (1980) Ag) thon y Tang (1981) Xs 2,402) 4 Koo (1392) Miticun aestivon Hy (3) 5) KIB) 6 thoy we (1999) WS ¥ (1) #ATA(100)42,40(0.5) y/o 6 teat (2}42,40(0.5) 43 Miloowalia (1985) dea ays 1s 21,40(3)4K00(2)4TA1) 2 Wehiniya et al. (1971) WS 0; (3) 2,403) 12 froung-hndce y Denarly (1904) a $2 sélido; b= Liquido; 15 (Hoang et al., 1978). 8 Todas las concentraciones hornonales estén exptesadas en ag/1. 4 Concestracién de sacarosa expresada en tanto por ciento, aparecen en negrita las concentraciones que dieron aejores resultados en estudios comparativos. Cuadro 4. Composicién de los medios utilizados para la nesis en distintas especies. 22 ginogé-3.1.6. Condiciones de cultivo Las condiciones de intensidad de luz, fotoperiodo y tem- peratura del material vegetal, puesto en cultivo, son factores a tener en cuenta en el proceso de induccién. Estas condiciones difieren de unas especies a otras. A continuacién se presen- ta un resumen de las mas utilizadas (cuadro 5). ESPECIE opscuntoaD = LUE POYOPEETODO TEP REPERRECTA . 4 eta valoaris b 2000 Lor “ 25-28 Hosenans y Bossoutrot (1913-85) 1500 lox u 5 Goska (1985) 6 iG u Reiner y D'Haullin (1984) Gerbera janesonii 1000 lox 6 n Meynet y Sidi (1984) lor de dla i“ u floorescente 16 n Mania y Vieth (1986) Helianthus annaus 28-12 4 Gelebart y San (1987) L. valgare 3000 lox iy we San Hoeun (1976,1979) 1000 Lor 10-16 Wang y Kuang (1981) Licotiana tabacum lor 5-30 Tha y Wo (1973) dxyza sativa 1000-2000 Lax 5-08 Asselin de Beauville (1960) ebscuridad 3 hou y Yang (1980, 1941) 2000 or 25-28 Rao (1982) Tea nays ul 2500 lox 16 6 Ucbiniya et al. (1971) 0 1000 tox 16 rt Throung-Andr# y Denarly (1984 a = dias en oscoridad; § = horas; 4 = *C Cuadro 5. Condiciones amientales utilizadas para el cultivo de ovarios. 23En general, la temperatura oscila entre 21-30 °C. El fotoper{odo es de 16 horas y la luz no pasa de 3000 lux. No se han publicado hasta la fecha estudios comparativos sobre la influencia de las distintas condiciones de cultivo. 3.1.7. Parte de la flor puesta en cultivo Se pueden utilizar diferentes tejidos florales femeninos, dependiendo de la evolucién del gametofito femenino o de su facilidad de manejo, en las diferentes especies. Por otra parte, la eleccién se hace teniendo en cuenta el efecto de ese érgano en la nutricién del gametofito femenino. a. Plor entera Estudios realizados sobre cultivo de ovarios polinizados demostraron que las partes florales como el pedicelo, el caliz o las glumas juegan un papel importante en el crecimiento del fruto y desarrollo del embrién (Maheswhari y Rangaswamy. 1965). Al parecer ocurre lo mismo en el cultivo de ovarios sin fecundar. Zhou et al. (1983) estudiaron el efecto de diferentes partes de la flor, enel cultivo de varios de arroz Obtuvieron los mejores resultados cuando se sembré en el medio la flor entera, sin lemma ni palea, con estambres y pistilos unidos al receptaculo como una unidad. El hecho de que la pre- sencia de las anteras favorezca la ginogénesis puede deberse a la existencia de sustancias activas y nutritivas que son su- ministradas al medio y, por lo tanto, al ovario. b. Ovario El cultivo de ovarios aislados se ha utilizado en girasol (Gelebart y San, 1987) y lechuga (San y Gelebart, 1986). Cabria sefialar que en algunos casos se debe entender el cultivo de ovarios como cultivo de pistilos. Dependiendo de la morfologia de la especie a la que se refiera, resulta dificil y nocivo separar el estilo del ovario y por eso en algunos casos se siembra el pistilo en el medio, como en cebada y en trigo. Sin embargo, en maiz se pueden cultivar ovarios sin las sedas. 24c. Ovulo Solamente se puede utilizar el cultivo de évulos cuando estos son facilmente accesibles. Este sistema ha dado buenos resultados en tabaco (Ran, 1980), calabaza (Chambonnet y Dumas de vVaulx, 1985), remolacha (Hosemans y Bossoutrot, 1983; Galatowitsch y Smith, 1990) y Gerbera donde se han llegado a obtener 5.36% de plantas regeneradas/évulos sembrados (Ahmim y Vieth, 1986). Por el contrario, Van Geyt et al. (1987) indujeron la formacién de plantas haploides de remolacha a partir de dvulos y ovarios no fecundados, y encontraron que el porcentaje de callos formados fue casi siete veces mayor cuando se cultivé el ovario que cuando se cultivé el évulo. 3.2. EMBRIOLOGIA E HISTOLOGIA DE LA GINOGENESIS Se han realizado pocos estudios sobre la embriologia de la ginogénesis “in vitro". Esto se debe principalmente a que es una técnica que se ha aplicado recientemente y que ha dado baja frecuencia de induccién, por lo que supone un gran trabajo preparar las secciones microscépicas. 3.2.1. Origen celular de las plantas ginogénicas Las plantas ginogénicas pueden tener diferentes origenes celulares. En algunas especies, todas las células haploides del saco embrionario pueden sufrir mitosis y dar lugar a embriones © callos ginogénicos. a. Célula huevo La mayoria de los embriones ginogénicos derivan de la célula huevo. Esto se ha visto en cebada (San Noeum, 1976 Huang et al., 1982), trigo (citado por San y Gelebart, 1986), girasol (Yang et al., 1986) y remolacha (Bossoutrot y Hosemans, 1985). b. Sinérgidas Las sinérgidas pueden dar lugar también a la formacién de 25un embrién o callo. En cebada, San Noeum (1979) observ el desarrollo de una o dos sinérgidas, tanto en solitario como junto a otras células haploides del saco embrionario. La ginogénesis en arroz es, en la mayoria de los casos, una apo- gamia “in vitro" de las sinérgidas (Tian y Yang, 1983). otras veces no se ven signos de desarrollo de las sinérgi- das, como ocurre en girasol (Yang et al., 1986), o bien estas células degeneran, como en remolacha (Hosemans y Bossoutrot, 1985), por lo que no se pueden formar embriones. c. Células antipodales Se ha observado proliferacién de estas células en cebada (Huang et al., 1982), remolacha (Bossoutrot y Hosemans, 1985) girasol (San y Gelebart, 1986; Yang et al., 1986) y arroz (Zhou et al., 1986). Estas proliferaciones a veces han formado embriones y/o plantas en cebada; sin embargo, en girasol las células antipodales dan lugar a masas celulares que producen callos friables que no pueden sufrir organogénesis (San y Gelebart, 1986). d. Nucleos Polares La divisién de los nucleos polares sin fecundar, se descu~ brié por primera vez en cultivo de évulos de algodén (Jensen et al., 1977); posteriormente se vio en cultivo de évulos de arroz (Zhou y Yang, 1981) y cebada (Huang et al., 1982). Como resultado de esta divisién se forma una estructura parecida al endospermo; sin embargo, no se ha encontrado acumulacién de almidén. La divisién de los nacleos polares con frecuencia tiene lugar independientemente de la formacién del proembrién dentro del saco embrionario. La estructura que se forma no parece servir como tejido "nurse" para el desarrollo del embrién, ni pueden regenerarse plantulas a partir de ella. e. Proliferacién de tejidos somaticos un problema considerable en el cultivo de ovarios es la proliferacién de tejidos somaticos, dando lugar a un callo o a un embrién. El desarrollo de estos tejidos puede inhibir el desarrollo de las células haploides, y ademas hace dificil 26Stinguir los callos gametofiticos de los esporofiticos. gensen et al. (1977), trabajando con cultivo de dvulos y aries de algodén, s6lo consiguieron la proliferacién de jidos somaticos. Otras veces se dio la induccién de tejidos nloides y diploides al mismo tiempo, como en cebada (Huang et ", 1982) y arroz (Kuo, 1982). Bl aporte de hormonas exégenas dn factor importante. Ajustandolas a un determinado nivel se ede prevenir la proliferacién somatica sin impedir el desa~ ollo ginogénico (Zhou et al., 1986). 2.2. Caracteristicas del desarrollo ginogénico Las plantas ginogénicas normalmente se regeneran directa- inte a partir del embrién sin pasar por fase de callo, como ha observado en tabaco (Zhu et al., 1981a), cebada (Huang al., 1982), txigo (Zhu et al., 1983), girasol (Yang et , 1986), remolacha (Bossoutrot y Hosemans, 1985) y cebolla jaren, 1989; Campion y Alloni, 1990) otras veces, sin embargo, se induce la formacién de callos smo. en maiz (Truong-André y Demarly, 1984) y Gerbera (San y vlebart, 1986) y posterior organogénesis con un aporte de srmonas exégenas adecuado. cuando la célula huevo se divide, se produce una secuencia » desarrollo similar a la del zigoto (Huang et al., 1982). El asarrollo del huevo o del embrién puede bloquearse en iferentes estados, dependiendo de la especie y de las andiciones de cultivo. Algunas veces se llega hasta la forma~ son de plantula, incluso cuando el embrién se mantiene dentro e1 ovario en el medio de induccién, como ocurre en cebada (San ceum, 1979), trigo (Zhu et al., 1983) y remolacha (Hosemans ¥ ossoutrot, 1985). En estos casos, después de 40 a 60 dias en ultivo, la planta emerge directamente del ovario. otras veces es necesario sacar el embrién del interior del yario o del évulo, ya que el desarrollo de éste se detiene sin ar lugar a una planta. Esto ocurre en lechuga (San y Gelebart 986) y girasol (Yang et al., 1986). En este caso el embridn ‘© debe subcultivar en otro medio para que el desarrollo siga delante. 27Algunas veces se produce un desarrollo intermedio entre el embrién y el callo, como ocurre en arroz, de modo que en un principio el proembrién tiene forma y tamafio similar al del zigoto "in vitro". Después, crece y da lugar a masas celulares globulares o con forma de pera, se mantiene en un estado inde- terminado, y se forma un callo en una zona parcial o en todo el embrién. Solamente el 2% de los proembriones de arroz se desarrollan de forma que originan un embrién bien diferenciado. 3.3. CARACTERISTICAS DE LAS PLANTAS REGENERADAS En la mayor parte de los casos la ginogénesis produce plantas haploides y verdes. Sin embargo, bajo determinadas condiciones se obtienen plantas de diferentes nimeros cromosé- micos. 3.3.1. Nivel de ploidia Se han conseguido plantas haploides por ginogénesis "in vitro" en cebada, trigo, maiz y arroz. Variando las condiciones de cultivo se pueden obtener plantas de diferente ntimero cromo- sémico 0 incluso mixoploides, como ocurrié en maiz (Truong-André y Demarly, 1984). El nivel de ploidia de las plantas regeneradas varia en relacién con la secuencia de desarrollo seguida por la estructura ginogénica. Asselin de Beauville (1980), trabajando con arroz, obtuvo plantas haploides y mixoploides. Las haploides resultaron del desarrollo de embriones, mientras que las mixoploides se xegeneraron a partir de callo. En tabaco, Ran (1980) y Zhuet al. (1981a) obtuvieron embriones que dieron lugar a plantas haploides, mientras que las plantas obtenidas por Wu y Cheng (1982) fueron diploides mixoploides y muy pocas haploides, diferenciandose a partir de callo. En girasol, Gelebart y San (1987) observaron que la mayoria eran haploides, otras diploides e incluso mixoploides. En remolacha, determinando el nivel de ploidia por conteo del numero de cloroplastos, en las células guarda de los estomas, encontraron una proporcién de plantas haploides del 2880 al 90% (Bossoutrot y Hosemans, 1985; d'Halluin y Keimer 1986; van Geyt et al., 1987; Doctrinal et al., 1989). Sin em- bargo, conteos cromosémicos realizados en apices de raices daban nimeros diploides o mixoploides. Esto se debe a un proceso de endopoliploidia en las células diferenciadas de la raiz, mientras que el meristemo apical permanece haploide. Van Geyt y Jacobs (1986), asi como Ahmim y Vieth (1986) obtuvieron solamente plantas haploides en remolacha y Gerbera, respectiva- mente. En lechuga y girasol se han observado procesos de duplica- cién espontanea, que al parecer ocurren por endomitosis durante el desarrollo del embrién (San y Gelebart 1986). Este proceso de diploidizacion espontanea puede estar relacionado con ines- tabilidad de los tejidos haploides. Las lineas celulares haploides tienen una mayor tendencia a aumentar el nivel de ploidia y pasar a diploides que las diploides para pasar a tetraploides (Sacristan, 1971) Después de varios estudios con Nicotiana tabacum (Gupta y Carlson, 1972; Reinert y Bajaj, 1977), y Nicotiana silvestri (Dix y Street, 1974) se ha concluido que la parafluorofenilala- nina puede ayudar a prolongar la fase haploide en el cultivo de algunas especies, aunque no puede evitar el paso de las células haploides a diploides de forma rutinaria. 3.3.2. Albinismo En cultivo de ovarios, al contrario de lo que ocurre en cultivo de anteras, se han dado pocos casos de albinismo o deficiencia clorofilica. Kuo (1982) obtuvo plantas albinas a partir de callos ginogénicos en trigo (tres albinas frente a doce verdes). Yang y Zhou (1982), trabajando con arroz, encon- traron las siguientes proporciones: 87% de ovarios dieron plantas verdes, 9% albinas y 3.9% de los ovarios dieron lugar a plantas verdes y albinas. San y Gelebart (1986) encontraron alguna deficiencia clorofilica entre las plantas de girasol que se formaron a partir de estructuras ginogénicas de lento desarrollo. Los pocos casos de albinismo que se han dado han estado ligados a la regeneracién a partir de callo. 29En el cuadro 6 aparecen algunas caracteristicas de las plantas obtenidas a partir de cultivo de ovarios. 3.3.3. Variabilidad La estabilidad cromosémica de las plantas ginogénicas parece ser muy alta (San y Gelebart, 1986). Se han descrito muy pocas variaciones de ploidia o anormalidades cromosémicas. Truong-André y Demarly (1984) vieron que, en maiz, la variabi-~ lidad de las lineas parentales y la progenie ginogénica obtenida era homogénea para seis caracteres estudiados. Con la variedad de cebada "Berenice", se han realizado diferentes estudios comparativos de la variabilidad obtenida por los métodos de haploidizacién de cruzamiento interespe~ cifico con H. bulbosum, cultivo de anteras y cultivo de ovarios. Se vieron diferencias significativas entre los dihaploides conseguidos y la linea control, para caracteres agronémicos y morfolégicos. Las plantas androgénicas variaron mas de la linea original que lo que lo hicieron las ginogénicas 0 las procedentes del cruzamiento interespecifico (San Noeum y Ahmandi, 1982). Esta variabilidad la atribuyeron a la existencia de interacciones nucleo-citoplasma. Posterior- mente San y Demarly (1983) apuntaron el distinto origen de los haploides y el efecto del cultivo "in vitro" como posibles causas de las diferencias observadas. Estudios realizados en tabaco por Kumashiro y Oinuma (1985) mostraron una mayor variabilidad entre las plantas androgénicas y una productividad mas baja que los parentales Esta variacién la atribuyeron principalmente a las mutaciones inducidas durante el cultivo. No habia variabilidad entre los dihaploides ginogenicos y su estabilidad era igual a la de las lineas parentaies. Resultados similares fueron obtenidos por Wernsman et al. (1989). 30SPECIE DESARROLLO — CARACTERTSTICAS DE LAS PLANTAS REPEREXCIA Pignentacién Ploidta Alina cepa. exbriin verdes n (708) Koren (1983) feta volaaris, ——enbridn verdes a ossoutrot y Hosenans (1985) enbrién verdes a van Geyt y Jacobs (1986) : verdes n(90N),2n,4n "alin y Keiner (1986) eabrién verdes a van Geyt et al. (1987) Gerbera jamesonii calla verdes ata Sitbon (1981) calle verdes a Abnin y Vietb (1986) Uelianthas anagusenbrién verdes tno nixoploides San y Gelebart (1986) enbridn ginogénico — - a Yang et al. (1986) eabrido endotelial =~ mn enbrién ycallo ayia y aixoploides Gelebart y San (1987) Horde veloare —enbride verdes a San Hoean (1976, 1979) eabrién verdes . Wang y Koang (1981) Nicotiana tabacum exbrita verdes a Ban (1980) enbridn verdes, a Thu et al. (1982) callo o enbrién verdes. 2,20 y nizoploides Hu y Cheng (1947) Oryza sativa. enbridn, verdes a Asselin de Beauville (1980) allo verdes nade calle verdes © 2h, thoo y Yang (1880, 1981) albinas tabrién 6 callo verdes 0 a, Ia ao (1982) albinas Iriticun aestiven exbridn ¢ callo verdes a She et al. (1919, 1981) tea mys, calle o verdes adn ‘roung-André y Denarly (1584) eabrién, a,2a, 30 Cuadro 6. Caracteristicas de las plantas obtenidas a partir del cultivo de ovarios 31OBTENCION DE HAPLOIDES EN CEBADA 4.1. GEN HAPLOIDIZANTE (GEN "HAP") Gustafson y colaboradores encontraron un mutante de cebada que producia haploides esponténeos en su progenie (citado por Hagberg y Hagberg, 1980). Posteriormente, se comprobé que el caracter de induccién de haploidia estaba determinado por un solo gen, el gen hap* (Hagberg y Hagberg, 1981). La formacién de haploides est& causada por el desarrollo del 6vulo sin fertilizar después de la fecundacién normal del endospermo (Finch, 1983). El genotipo parental influye en la viabilidad y el vigor de los haploides. 4.2. CRUZAMIENTO INTERESPECIFICO H. vulgare x H. bulbosum El método bulbosum se basa en el cruzamiento de H. vulgare. L. (2x=14) x H. bulbosum L. (2x= 14) como parentales femenino y masculino, respectivamente. Después de la fecundacién se produce la eliminacién selectiva de los cromosomas de H. bulbosum durante las primeras divisiones del embrién y un colapso del endospermo, dando lugar a embriones haploides de H. vulgare (Kasha y Kao, 1970). El crecimiento lento del embrién haploide, junto con el colapso del endospermo, conduce a la muerte del embrién, salvo que se cultive "in vitro", con el fin de completar su desarrollo. Algunas veces se forma el embrién, pero no se produce ni la eliminacién cromosémica ni el colapso del endospermo, 1o que da lugar a embriones hibridos facilmente reconocibles por su mayor tamafio. Actualmente existen variedades obtenidas por este método, como por ejemplo, los cultivares "Mingo" (Ho y Jones, 1980), "Gwylan" (Kasha y Reinbergs, 1981) y "Rodeo" (Baezinger et al., 1984). Hordeum bulbosum es una especie silvestre perenne, alégama, que se encuentra en algunas zonas montafiosas de paises medi- terréneos como Tunez, Italia y Espafia. Es una planta autoestéril (Lein, 1948), pero se propaga facilmente a partir 32de los bulbos que se producen en la base del tallo. Presenta necesidades de vernalizacién para la floracién (Koller y Highkin, 1960). Las plantas producen de 10 a 40 tallos que florecen durante un tiempo de 1 a 4 semanas. Existen diversos aspectos que influyen en la obtencién de haploides por el método bulbosum, que se muestran a continuacién. 4.2.1. Cruzamiento y tratamiento hormonal. El cruzamiento de cebadas con H. bulbosum se puede hacer con espigas en planta o mediante tallos cortados, sumergidos en una disolucién mineral Hoagland modificada (Jensen, 1975) De esta forma se consigue un ambiente y nutricién controlados. Estudios comparativos de estos dos métodos mostraron que no existian grandes diferencias en la frecuencia de obtencién de haploides (Jensen, 1975). Recientemente, se ha visto que el cultivo in vitro de la flor, 24 horas después de la poliniza- cién, da mejores resultados que el método de tallos cortados (Hayes y Chen, 1989). Se emasculan las flores cuando éstas se encuentran casi maduras, uno o dos dias antes de la antesis, y se cubren con una bolsa de celofan para mantener la humedad y evitar polini- zaciones. Al dia siguiente, o dos dias después, se polinizan con polen fresco recogido a primera hora de la mafiana. Pickering (1982) comprobé que al cubrir las espigas polinizadas con bolsas de papel marrén, mejoraba la calidad y el peso de la semilla. La aplicacién de Acido giberélico (GA3) sobre el ovario, después de la polinizacién, aumenté el porcentaje de cuajado del fruto, asi como el numero de embriones obtenidos a partir de ellas (Subrahmanyan y Kasha, 1971) 4.2.2. Cultivo del embrién El estado éptimo para la separacién del embrién se alcanza a los 14 dias después de la polinizacién. Existe una variacién considerable, incluso dentro de la misma espiga, en el tiempo optimo de la cosecha debido a diferencias en la nutricién del 33embrién y a diferencias genotipicas. Los medios mas utilizados para el cultivo han sido: agar de orquideas, BS (Gamborg et al., 1968), BII (Norstog, 1973) y R-MI-S (Islam y Sparrow, 1974), como medios sdlidos; y C-21 (Jensen, 1974), C-17 (Jensen, 1977) y J 25-8 (Jensen, 1983) como medios liquidos. Estudios comparativos de los diferentes medios mostraron que el J 25-8, solidificado con agar, era el m&s adecuado para el cultivo del embrién (Jensen, 1983). Los tubos sembrados se colocan en la oscuridad, a 18 °C para que el embrién termine de formarse. A los 10 dias, se ponen bajo intensidades de luz baja, a 20 °C con un fotoperiodo de 12h. Cuando las plantulas estan ya establecidas, se trasla- dan a una cdmara de crecimiento con altas intensidades de luz (40000 a 50000 lux), a 20 °C y un fotoperiodo de 18 h (Jensen, 1977). La temperatura a la que crecen los parentales tiene gran influencia en el cuajado de la semilla y en el desarrollo del embrién. Se obtuvo mayor frecuencia de induccién de callos a 20 °C que a 26 °C (Jensen, 1983), Adem4s, las frecuencias de formacién de embriones hibridos H. vulgare x H. bulbosum (VB) aumentan normalmente a bajas temperaturas (Pickering y Morgan 1983; Pickering y Rennie, 1990). 4.2.3. Influencia del genotipo de los parentales. Pickering y Hayes (1976), Simpson et al. (1980) y Jensen (1983), encontraron que la cruzabilidad de H. vulgare, asi como la frecuencia de embriones haploides obtenidos a partir de @icho cruzamiento, dependia de los genotipos de ambos parentales. El cuajado del fruto y la diferenciacién del embrién estan influidos por ambos parentales. La calidad de la semillay la regeneracién a partir de embriones haploides diferenciados estén poco influidos por el polinizador. Sin embargo, el genotipo de H. vulaare afecta significativamente a la calidad de la semilla (Pickering, 1983a, 1984) El cuajado del fruto en los cruzamientos H. vulgare x H. bulbosum est& bajo control genético. Pickering (1983b) 34observé que la incompatibilidad parcial en la variedad "Vada" estaba controlada por un solo gen dominante localizado en el cromosoma 7 de H. vulgare; Biornstad (1986) comprobé que el cuajado del fruto en "Agneta" estaba controlado por varios genes (de uno a cuatro), con herencia dominante. Pickering (1961) observé que 1a incompatibilidad actua en el tejido del estilo, impidiendo el avance del tubo polinico. Como método para superar esta incompatibilidad, se ha utilizado en algunos casos una mezcla de polen de diferentes clones de bulbosum (Devaux, 1986; Hayes y Chen, 1989). 4.2.4. Control genético del mecanismo de eliminacién de los cromosomas El balance de los genomas parentales es un factor muy importante en la estabilidad cromosémica de los tejidos hibri- dos (Kasha y Kao, 1970). La eliminacién cromosémica depende de la relacién V/B en el hibrido, siendo V y B el namero de geno- mios de H. vulgare y H. bulbosum respectivamente (Barclay et al., 1972). Embriones con relaciones 1V/1B o 2V/2B dan lugar a plantas haploides, mientras que valores 1V/2B conducen a la formacién de un hibrido triploide estable. Sin embargo, el endospermo més estable resulté tener una relacién 1V/4B (Subrahmanyan y Kasha, 1973). Se ha visto que los factores que causan la eliminacién cromosémica est4n localizados en los cromosomas 2 y 3 de H. vulgare. Pero también existe algan gen en los cromosomas de H. bulbosum que, en dosis suficiente, puede neutralizar los efectos de los factores de H. yulgare o "proteger" a los cromo- somas de H. bulbosum de su eliminacién (Barclay et al., 1972; Ho y Kasha, 1975). Existen tres hipétesis que intentan explicar el mecanismo mediante el cual tiene lugar la eliminacién cromosémica: a.- Mecanismo analogo al sistema de modificacién por restriccién que ocurre en las bacterias. Determinados factores del genoma de H. vulgare reconocen y producen la degradacién de los cromosomas de H. bulbosum (Davies, 1974). 35b.- Capacidad limitada de los cromosomas de H. bulbosum para iniciar o completar la congresién en metafase o la migra- cién en anafase (Bennet et al., 1976). c.- Diferencias en el ritmo mitético de ambas especies, asi como en la duracién de la fase del ciclo celular (Subrahmanyan y Kasha, 1973). Sin embargo, Wheatley y Kasha (1982) observaron que las diferencias en el ciclo celular no influian en este proceso. Jacobsen y von Bothmer (1981) exponen que la eliminacién cromosémica puede ser una combinacién de varios mecanismos, principalmente la existencia de una asincronia en el tiempo del ciclo celular entre las dos especies parentales y una altera~ cién en el metabolismo de las proteinas. 4.3. ANDROGENESIS EN CEBADA 4.3.1. Cultivo de anteras en cebada El primero que obtuvo haploides de cebada a partir de cultivo de anteras fue Clapham (1973). Desde entonces hasta la fecha se han realizado numerosos estudios para incrementar los resultados. 4.3.1.1. Factores que influyen en la androgénesis. a. Genotipo. El genotipo de las plantas utilizadas para el cultivo es uno de los factores mAs importantes en la androgénesis. Se han hecho estudios con el fin de analizar el componente genético. Foroughi-Wehr et al. (1982) concluyeron que la respuesta de las anteras al cultivo es un cardcter complejo, en el cual estén implicados por lo menos dos mecanismos diferentes, que se heredan separadamente. El primero de ellos es la capacidad de las microsporas para dividirse y dar lugar a callos y el se- gundo es la capacidad de los callos para diferenciarse y dar lugar a plantas verdes y/o albinas. Sorvary (1986a), Vischi et al. (1989), Daniel (1987) y Datta y Wenzel (1988), han encontrado diferencias entre 36genotipos, tanto en 1a capacidad de induccién de callos o embriones como en la de regeneracién de plantulas. Foroughi- Wehr y Friedt (1984) observaron que el caracter "respuesta de la antera al cultivo" era dominante o parcialmente dominante sobre la no respuesta. Powell (1988a) encontré efectos — gené- ticos aditivos importantes para una serie de caracteres medidos, indicando que la respuesta al cultivo de anteras podria ser mejorada mediante la realizacién de cruzamientos adecuados. La variedad "Igri" es una de las que més respuesta ha dado en cultivo de anteras, llegando a dar 440 plantas verdes por 100 anteras sembradas (Olsen, 1987). Sin embargo, la mayoria de los genotipos dan menores o ningén resultado. b. Condiciones de crecimiento y edad de las plantas madre Trabajando con plantas crecidas en invernadero en diferentes estaciones del afio, se han encontrado diferencias en la respuesta al cultivo de anteras (Foroughi-Wehr y Mix, 1979) y en el numero de plantas verdes obtenidas por antera (Kuhlmann Y Foroughi-Wehr, 1989). Vischi et al. (1989) han descrito interacciones significativas entre genotipo de cebada y condi- ciones ambientales de las plantas madre, al igual que lo hicieron Jones y Petolino (1987) en trigo. ba aplicacién regular de tratamientos quimicos para combatir enfermedades puede causar dafio al polen, haciendo disminuir su viabilidad (Sunderland et al, 1981). Dunwel (1986) recomendé recoger las primeras espigas de las plantas en el comienzo del per{odo de floracién. c. Estado de desarrollo del polen Uno de los aspectos m&s importantes en el cultivo de anteras es el estado en el que debe encontrarse el grano de polen para su puesta en cultivo. Esté generalmente aceptado que las anteras més productivas son aquellas que se encuentran en un estado uninucleado, es decir, entre el estado de tétrada y justo antes de la primera mitosis polinica. Dentro de este rango de estad{os, los mejores resultados se consiguen cuando las esporas estan en la interfase Gl del ciclo celular (Sunder- land et al., 1981; Wheatly et al., 1986). En este momento, 1a espora ha aumentado de tamafio, el centro va siendo ocupado por 37una vacuola y el nucleo queda en la periferia de la microspora, adquiriendo posteriormente una situacién opuesta al poro germinativo. d. Pretratamiento frio El tratamiento de las espigas a 4 °C durante 21 a 28 dias, antes de la puesta en cultivo, result6 ser mas efectivo en la formacién de callos que los tratamientos a 7, 14 y 20 °C. Adem’s, se consiguieron regenerar mayor nimero de plantas a partir de anteras pretratadas a 4 °C que a 25 °C. (Huang y Sunderland 1982). Estudios realizados por Powell (1988b) sobre e1 tiempo de duracién del tratamiento a 4 °C mostraron que el periodo éptimo era de 21 dias, pero existiendo grandes interacciones genotipo x duracién del pretratamiento. e. Medio de cultivo En los primeros experimentos de cultivo de anteras de cebada, se utilizaron medios como MS, Miller y FW (Foroughi- Wehr et al., 1976), que habian sido desarrollados previamente para otros tipos de cultivo. Posteriormente, se desarrollaron dos tipos de medios especificos para el cultivo de anteras. Uno de ellos sintético Ng y el otro basado en el extracto de tubér— culos de patata, llamado medio de patata PM. Noxrmalmente se utiliza un medio con una fuente de auxina Erecuentemente el 2,4-D para la formacién de embriones y callos a partir de anteras de cebada. Sin embargo, en algunos casos se han obtenido en medio libre de hormonas y bajo deter- minadas condiciones de cultivo (Dunwell, 1985). También se ha utilizado el 2,4-D en combinacién con KIN (Sunderland et al., 1981; Huang y Sunderland, 1982; Hamachi et al., 1968a) 0 con Zeatina (Ye et al., 1985). Asimismo, combinaciones de AIA y BAP también han dado buenos resultados (Wenzel y Forouhgi-Wehr, 1984; Vischi et al., 1989). Niveles altos de auxinas favorecen las primeras divisiones de la microspora. Posteriormente se necesita disminuir la con- centracién de auxina para incrementar la supervivencia y el crecimiento del callo o embrién (Marsolais y Kasha, 1985). Altas concentraciones de sacarosa tales como 90 g/l favore- cen la formacién de embriones, mientras que concentraciones me- 38dias y bajas dan lugar a la formacién de callos. Por lo tanto, a bajas concentraciones de sacarosa la produccién de plantas verdes tiene lugar via organogénesis, mientras que en medio con altas concentraciones se da via embriogénesis (Sorvary y Schieder, 1987). Clapham (1973) observé que las concentraciones de sacarosa podian ser reemplazadas por manitol. Desde entonces, se han utilizado otras fuentes de carbono como melibiosa en medio con almidén de cebada (Sorvary y Schieder, 1987), maltosa (Hunter, 1987) y maltosa con almidén de cebada (Kuhlmann y Foroughi-Wehr, 1989), obteniéndose mayor numero de embriones y mayor proporcion de plantas verdes/blancas. El mioinositol fue especialmente efectivo en la formacién de callos de microsporas de cebada (Xu y Sunderland, 1981). Su efecto parece estar estrechamente relacionado con las densi- dades 6ptimas de cultivo y posibles factores condicionantes. La prolina aumenté ligeramente el namero de callos y la capacidad de regeneracién de los mismos (Huang, 1982, citado por Dunwell, 1985). La glutamina utilizada a concentraciones de 160 a 180 mg/l se mostré inefectiva o inhibitoria (xu, 1983) Sin embargo, Olsen (1987) observé que, al aumentar la concen- tracién de glutamina a 730 mg/l como fuente de N, reemplazando al NH4NO3, se producia mayor némero de plantas verdes. En los medios de induccién se han utilizado diferentes compuestos organicos de naturaleza quimica no bien definida, como por ejemplo, extracto de patata (Chuang et al., 1978) y extracto de hojas de tabaco (Vischi et al., 1989), con ello se obtuvo un aumento en la frecuencia de induccién de callos. Inicialmente, todos los medios de cultivo se solidificaban con agar. Posteriormente, se vio que se inducia mayor nimero de callos en medio liquido (Wilson, 1977). Kao (1981) superé el problema de anaerobiosis experimentado por las anteras, en me- dio liquido, utilizando ficoll; sin embargo, Huang et al. (1984) observaron que la capacidad de regeneracién en medio liquido era menor. La agarosa también ha dado buenos resultados en cultivo de anteras. Estudios realizados por Lyne et al. (1985) ‘sobre la influencia de agarosas de diferentes casas comerciales mostra- ron que con agarosa Sea Plaque se obtenia mayor numero de plantas verdes. 39Posteriormente, se observé la superioridad del almidén de cebada frente al agar, tanto en el nimero de embriones por callo como en el namero de plantas verdes regeneradas (Sorvary 1986a). Ademas, las anteras respondieron mejor al cultivo con almidén de cebada que con almidén de maiz, patata, arroz y trigo (Sorvary, 1986b). Los estudios més recientes realizados por Kuhlmann y Foroughi-Wehr (1989) mostraron que el numero de plantas verdes regeneradas en medio liquido (ficoll 20 g/1 y 80 mg de almidén de cebada por placa) era de cuatro a dieciséis veces mayor que en medio solidificado con 90 g/1 de almidén de cebada. Algunas veces, plantas que derivan de la microspora crecen directamente en el medio de induccién. Sin embargo, lo normal es que los callos de las microsporas, asi como los embriones sin diferenciar, sean subcultivados en un medio con concentra- ciones reducidas de auxinas y de sacarosa, con el fin de inducir la regeneracién. En la mayoria de los casos este medio de diferenciacién es sélido, incluso cuando los callos se han producido en medio liquido (Kao, 1981). Algunos de los factores que determinan la capacidad de xegeneracién son el tamafio de callo y el choque osmético sufrido al cambiar de medio. Solamente los callos de un deter- minado tamafio continaan su desarrollo y llegan a diferenciarse. Los callos muy pequefios son muy sensibles a la luz. Choques osméticos fuertes pueden producir la muerte del callo (Kao, 1981). Condiciones de cultivo El cultivo de anteras de cereales se realiza a temperaturas entre 20 y 26 °C. Durante el periodo de induccién, la oscuridad es mis efectiva que la luz (Hamachi et al., 1988b). El periodo de regeneracién se lleva a cabo con un fotoperiodo de 14h luz y 4000 a 6000 lux. Estudios realizados por Sunderland et al. (1981) mostraron que se necesitaban densidades de siembra muy altas para conse- guir gran cantidad de callos, lo cual podia estar relacionado con la existencia de algun factor condicionante en las anteras. El condicionamiento del medio con ovarios (Xu et al., 1981) © 40con anteras maduras (Xu, 1983) aumenté el nimero de callos obtenidos por antera. El cultivo de ovarios y anteras procedentes de la misma espiga también ha dado buenos resultados (Datta y Wenzel, 1988). 4.3.1.2. Caracteristicas de las plantas regeneradas a. Albinismo Uno de los principales problemas que presentaba el cultivo de anteras era la alta proporcién de plantas albinas que se producian. Poroughi-Wehr et al. (1982) obtuvieron una planta verde por cada cinco plantas albinas. Se describieron diferen- cias en la proporcién de plantas verdes/albinas segin los genotipos (Kao, 1981). Sin embargo, los ultimos estudios con nuevos compuestos para los medios de cultivo, parecen haber solventado en gran medida este problema. Por ejemplo, la utili- zacién de medio de almidén junto con melibiosa ha dado buenos resultados, consiguiéndose una planta verde por cada 1.5 plantas albinas (Sorvary y Schieder, 1987). La utilizacién de maltosa en el medio como fuente de carbono también ha sido efectiva (Hunter, 1987). Kuhlmann y Foroughi-Wehr (1989) obtuvieron una relacién de plantas verdes albinas de 2:1, al afiadix maltosa al medio con almidén. Estudios realizados en cebada sobre la genética del albinismo han puesto de manifiesto que éste es un caracter monogénico recesivo (Kosheleva y Zinatullina, 1987). Las causas que producen el albinismo en cereales no est4n muy claras. Los primeros experimentos que se hicieron revelaron la presencia de proplastidos en plantas albinas (Clapham, 1973), y posterior~ mente, la ausencia de la fraccién I de la proteina y de los ribosomas en los proplastidos (Sun et al., 1979). Mas reciente- mente, se ha visto que la mayoria, si no todas, las plantas albinas regeneradas presentan una deleccién en el genoma de los plastidos. Esta deleccién puede preexistir en la microspora inmadura o bien se puede dar una alteracién del genoma durante el cultivo. Sin embargo, estudios realizados en trigo por He y Ouyang (1983) revelaron que la mutacién no puede ser la unica causa del albinismo. Otros autores piensan que el albinismo est& relacionado con el pretratamiento de la espiga. Se ha visto que en cebada, 1a 41formacién de plantas verdes esté asociada con esporas que no han comenzado a dividirse al final del pretratamiento, es decix, con estados muy jévenes de la antera en el momento de la puesta en cultivo (Sunderland y Huang, 1985). En arroz (Chen, 1978; Genovesi y Magill, 1979), trigo (He y Ouyang, 1983) y Triticale (Sozinov et al., 1981) se observé que las anteras cultivadas en estados jovenes produjeron mas plantas verdes que aquellas cultivadas en estados maduros. Esto parece coincidir con la idea de que la desdiferenciacién del polen puede producir alguna interaccién irreversible del genoma del plastido. Estudios posteriores, con temperaturas que variaron de 26 a 35 °C revelaron que la fase sensible del desarrollo que afecta a la aparicion del albinismo es justo antes de la pri- mera mitosis del polen. b. Nivel de ploidia. Una gran proporcién de las plantas obtenidas a partir de anteras son diploides. Friedt y Foroughi-Wehr (1983) obtuvieron 70.5% de plantas diploides y 15% de plantas haploides. Resulta~ dos similares fueron obtenidos por Friedt (1984), Lyne et al. (1985) y Powell et al. (1986) Estudios realizados sobre las primeras divisiones de las microsporas cultivadas, mostraron que las plantas diploides regeneradas se obtienen a partir de microsporas que sufren un proceso de duplicacién espontanea (Wilson et al., 1978). Poste- riormente, sto se comprobé por observaciones en campo (Poroughi-Wehr et al., 1982). Chen et al. (1984), asi como Lee y Chen (1987) observaron también fusiones nucleares. La produccién espontaénea de dihaploides a partir del cultivo de microsporas supone un ahorro de tiempo al no tener que tratar las plantas con colchicina. 4.3.2. Cultivo de polen aislado El cultivo de microsporas aisladas es dificil de conseguir (Xu y Sunderland 1981, 1982). Se utilizan medios precondicio- nados que vienen a realizar el papel del tejido somatico de la antera. Kodhller y Wenzel (1985) consiguieron regenerar plantas a partir de microsporas aisladas, usando el medio precondicio~ nado con ovarios o con anteras. El cultivo de microsporas sobre 42hojas de Atropa belladona o callos de Dianthus caryophyllus dio lugar a plantas haploides de cebada (Zenkteler y Stefaniak, 1982). Fue muy efectivo el precultivo de granos de polen inmaduros en una solucién 0.3 M de manitol o en el medio Cl (Chen et al., 1980) junto con una concentracién de manitol de 0.3 M. La presencia de sacarosa no dio lugar a polen multi- celular ni a callos, lo que indica que una presién osmética adecuada y la ausencia de sacarosa permite que e polen culti- vado se mantenga vivo, pudiendo dar lugar a plantas (Wei et al., 1986). 4.4 GINOGENESIS EN CEBADA Hasta la fecha se ha publicado poco sobre ginogénesis en cebada. Los primeros resultados fueron obtenidos por San Noeum (1976) con la variedad "Berenice", utilizando ovarios en estado maduro. Llegé a obtener un 0.6% de ovarios que dieron lugar a plantas verdes y haploides. Estudios realizados posteriormente por el mismo autor mostraron frecuencias de 1.1% a partir de un dihaploide. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas entre genotipos, como muestra el cuadro 7. Las hormonas utilizadas hasta el momento han sido: 2 mg/1 de 2,4-D (San Noeum, 1979); 2 mg/l de 2,4-D con 1 mg/l de ANA (Wang y Kuang, 1981); y 0,5-1 mg/i de MCPA con 1 mg/l de ANA e AIA y 0,5-1 mg/l de KIN o BAP (Huang et al., 1982) Las concentraciones de sacarosa utilizadas han oscilado entre 3 y 12% . San Noeum (1979) obtuvo plantas con concentra- ciones de sacarosa de 8 y 12% . Sin embargo, Huang et al. (1982) observaron que la frecuencia de induccién de embriones exa mayor en un medio con 3% de sacarosa que en un medio con 10% del carbohidrato. No obstante, estas diferencias podian deberse en parte a que la concentracién de la auxina MCPA fue el doble en el medio con 3% de sacarosa. No se ha descrito hasta la fecha la utilizacién de otras fuentes de carbono diferentes. Gu y Cheng (1984) consiguieron frecuencias de induccién de callo del orden del 27%, pero sin llegar a regenerar embriones. Bl aporte de jugo de azucena redujo cuatro veces la frecuencia de induccién de callos, pero dio lugar a una frecuencia de formacién de embriones de 5.7% . 43Un precondicionamiento del medio de cultivo, con espigas y ovarios, aumenté la Erecuencia de desarrollo de embriones desde el 1%, obtenido en medio sin condicionar, hasta un 5% (Jensen y Olesen, 1984). Genorieo ag OVARTOS 49 ovatios 4s oaRTOS PLANTAS PLANTAS wpe OMES a b "0 ‘ n ‘ wm 8 Berenice 1103 - 6 45 ; ; woos yoo 300 - - OS 20 syapa 198 > M46 : - B13 seo 580 : . m5 6 Le Samaie ste 1 02 - - ne) ae tout - oe wot Cuadro 7. Ginogénesis en diferentes genotipos de cebada (San Noeum, 1979). El cultivo de ovarios (con o sin anteras) en posicién vertical dio lugar a la formacién de mayor namero de embriones que el cultivo horizontal (Huang et al., 1982). Se ha visto que los embriones procedentes de la célula huevo o de las células antipodales dan lugar a plantas, mientras que aquéllos que proceden de las sinérgidas producen proliferaciones de tipo callo (San Noeum, 1979). Resultados similares fueron obtenidos por Huang et al. (1982), quienes observaron que los embriones se localizaban principalmente en la zona micropilar. 444.5. COMPARACION DE LOS DIFERENTES METODOS HAPLOIDIZANTES Uno de los problemas que presenta la obtencién de plantas haploides, con el método de bulbosum, es el poder disponer de clones de H. bulbosum que sean compatibles con los genotipos a eruzar (B3grnstad, 1986). Por otra parte, es un proceso largo y laborioso, y se necesita personal técnico especializado (Jensen, 1983). El cultivo de anteras ha presentado el problema del albinismo aunque, en estos altimos afios, ha sido parcialmente superado (Kuhlmann y Foroughi-Wehr, 1989). No obstante, los éxitos se han reducido a unos pocos genotipos como "Igri" o "Dissa". Existe muy poca informacién sobre el cultivo de ovarios en cebada (capitulo 4.4 de la introduccién). Aunque utilizando diferentes combinaciones hormonales y concentraciones de saca- rosa se han obtenido plantas haploides de cebada, no existe ningan estudio comparativo del efecto individual de cada uno de estos factores sobre la induccién de la ginogénesis. Asimismo, son necesarios mas estudios sobre la influencia en este proceso del soporte fisico del medio, del pretratamiento del material vegetal y de diferentes reguladores del crecimiento, etc, ya que hasta el momento no se han conseguido frecuencias de induc- cién suficientemente altas. Sin embargo, el cultivo de ovarios frente al cultivo de anteras presenta la ventaja de dar lugar a plantas haploides verdes. Hasta la fecha, el cultivo de anteras y el método bulbosum Parecen ser los métodos m4s eficientes para la obtencién de haploides en cebada (Jensen, 1986) y estan empezando a utili- zarse ampliamente en programas de mejora (Devaux, 1986 Ellis, 1986; Rossnagel et al., 1986). Snape et al. (1986) sefialaron varios criterios para la eleccién entre sistemas de haplo-diploidizacién, siendo el porcentaje de éxito el mas importante. En otros casos se propone la utilizacién de varios métodos complementarios (Devaux, 1987). No se han descrito estudios recientes sobre frecuencias de obtencién de haploides de cebada, por los cuatro métodos sefialados. 45OBJETIVOS cas isupitae: Spb legit labile lamasCon el fin de obtener plantas haploides verdes de cebada a partir del cultivo “in vitro" de ovarios no fecundados, se han planteado los siguientes objetivos: Determinar una combinacién hormonal con alta capacidad para inducir la ginogénesis. Estudiar el efecto del calor durante los primeros dias de la puesta en cultivo de los ovarios. Comparar la efectividad de diferentes soportes en el proceso de ginogénesis. Estudiar el efecto de diferentes azucares. Ensayar diferentes compuestos organicos en el medio de cultivo. Encontrar el estado éptimo de desarrollo del ovario para la induccién de la ginogénesis. 47III. MATERIAL Y METODOSMATERIAL VEGETAL 1.1. MATERIAL VEGETAL UTILIZADO Se han utilizado los dos genotipos de cebada siguientes: = ©001374: linea dihaploide obtenida mediante e1 cruzamiento interespecififco con H. bulbosum (cedida por el Prof. Bosemark, Hilleshég AB, Suecia). Espiga de dos carreras, densa y de ciclo corto. - Berenice: variedad comercial de origen francés. Espiga de dos carreras, semilaxa y de ciclo corto. 1.2. CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LAS PLANTAS MADRE Las variedades se sembraron en "paper-pots" que contentan una mezcla de turba, arena, perlita y humin en proporciones 4:5:1:1. Se realizaron siembras cada 20 dias desde primeros de Septiembre hasta finales de Diciembre. Se mantuvieron en camara fria a 5 °C, con un fotoperiodo de 8 h de luz, durante cuatro semanas. Posteriormente, se transplantaron a macetas y se tras- ladaron a invernadero, donde permanecieron a lo largo de todo el ciclo. La temperatura de los invernaderos se mantuvo a 12 #2 °C y un fotoperiodo de 8 h de luz durante el primer mes, pasado el cual se aumenté a 20 +2 °C ya 16h de luz para favorecer el espigado. También se utilizaron plantas crecidas en semilleros, sembrandose las variedades a finales de Diciembre. Las condi- ciones de cultivo fueron las normales de campo, salvo en riegos y abonados regulares. Las plantas se regaron cada tres dias. Al sustrato se incorporé abono complejo 15:15:15 de N:P:K, y Fertilug 20:20:20 (Lugsa) como abono foliar cada 15 dias, y se les aplicé los tratamientos insecticidas y fungicidas necesarios para asegurar buenas condiciones sanitarias. 492. METODOS 2.1. ESTERILIZACION DEL MATERIAL VEGETAL Las espigas se cortaron de la planta cuando las barbas sobresalian 3 6 4 cm por encima de la hoja bandera. Se sacaron de la vaina, y se eliminaron las flores de los extremos de la espiga (fig. la) La esterilizacién se llevé a cabo con una disolucién de NaClO al 2.8%, durante 5 min y tres lavados con agua destilada estéril de 1, 5 y 15 min, respectivamente. Se sembraron 10 flores de cada espiga por placa Petri. Se utilizaron placas Petri de 6 cm con 8 ml de medio (figs. 1b yc). 2.2. MEDIOS DE CULTIVO 2.2.1. Composicién y preparacién de los medios de cultivo a. Medio basico Se han utilizado como medios basicos: - Medio Ng (Chu, 1978) en el proceso de induccién y regenera- cion de plantulas. ~ Medio MS (Murashige y Skoog, 1962), en el proceso de enraiza- miento. La composicién de estos medios viene detallada en el cuadro 8, Se prepararon soluciones stock de cada una de las sales de los macronutrientes por separado; los micronutrientes se disolvieron en conjunto, Asimismo, se preparé una disolucién stock 100% con el agente quelante. il 50Espiga de cebada preparada para ser esterilizada. Flor de cebada. Placa de 60 mm @ con 10 ovarios de una misma espiga a los 15 dias de puesta en cultivo.b. Hormonas exégenas Las auxinas utilizadas han sido - Acido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). - Acido metilclorofenoxiacético (MCPA). - Acido indolacético (AIA). - Acido naftalenacético (ANA). Las citoquininas empleadas han sido: - 6-Benzilaminopurina (BAP). ~ 6-Furfurilaminopurina (KIN). Todas las hormonas se prepararon en disolucién stock 0.1 mg/ml. Para la preparacién de las disoluciones de 2,4-D, MCPA, AIA, ANA y BAP se afiadié NaOH 0.5 N. La disolucién de la KIN se realizé utilizando ClH 0.5 .N. Las disoluciones se mantuvieron en nevera a 4 °C durante menos de 20 dias. La BAP se preparé cada dia. En algunos casos se ha utilizado dcido giberélico (GA3). El Acido se disolvié afiadiendo etanol al 30% . c. Fuentes de carbono. Se ha utilizado sacarosa como principal fuente de carbono. Otros azucares utilizados han sido melibiosa y maltosa. d. Tipos de soporte. Los soportes utilizados fueron ~ Agar Difco purificado - Agar Merck Ref. 1614 - Agarosa Sea Plaque FMC 50102 - Almid6én de trigo Sigma no $ 2760 - Ficoll Sigma nQ F 9378 ~ Gerlite Kelko, Division of Merck 53NH,NO3 - 1650 (NH 4) 9804 463 a N03 2830 1900 Mq804.7H20 185 370 KHPO, 400 170 CaCl 2.270 166 440 MSO 4.10 4.4 16.9 ‘ZnSO4.7H20 1.5 8.6 H5P03 1.6 6.2 KI 0.8 0.83 NaMoO,. 2Hy0 _ 0.25 (CuSO 4.510 cH 0.025 CoCl 2.6170 a 0.025 Naz_EDTA 37.3 37.3 FeS04.7H70 27.8 27.8 ‘Tiamina_ClH 1.0 0.1 Piridoxina_ClH 0.5 0.5 2c. Nicotinico 0.5 0.5 Glicina 2.0 2.0 MioInositol 100 100 Sacarosa (a) 20000 Glucosa 5000 = agar cr) 7500 * concentraciones variables dependiendo de los exper imentos Cuadro 8. Composicién de los medios utilizados (concentraciones dadas en mg/l, pH = 5.8). 54e. Vitaminas. La composicién vitaminica de los medios viene detallada en el cuadro 8. También se utilizé acido ascérbico, en solucién fresca y disuelto en agua. £. Otros reguladores de crecimiento. Se afiadié glicina en todos los medios, tanto en los de induccién y de regeneracién como en los de enraizamiento. En todos los casos se preparé en disolucién stock 200%, junto con las vitaminas. En algunos casos se emplearon los aminodcidos arginina y prolina. Entre los complejos orgdnicos utilizados en el presente trabajo se pueden citar: - Caseina hidrolizada y extracto de malta. Se preparé disolu- cién fresca cada dia, ajustando el pH a 5.8. - Leche de coco. La leche se extrajo de cocos que se encontra- ban en buenas condiciones, y se filtré a través de varias capas de gasa. El filtrado se llevé a ebullicién durante 10 min y a continuacién se filtré a través de papel de filtro ALBET 305. - Extracto de patata. Para la preparacién del extracto se tomd patata troceada en pedazos pequefios y se llevé a ebullicién con agua destilada, durante 30 min. £1 liquido se filtré a través de varias capas de gasa, volviendo a llevar el sedimento a ebullicién otros 30 min. El liquido se volvio a filtrar a través de varias capas de gasa y se mezclé con el anterior. Se ajusté el pH a 5.8 y se esterilizé en autoclave ~ Extracto de ovarios. Se tomaron espigas maduras de diferentes variedades de cebada. Se separaron los ovarios y se homogenei- zaron con 40 ml de medio de cultivo, con un Omni-mixer 17106, seis pulsos de 30 s a velocidad maxima. Bl homogeneizado se centrifugé en RCSC (Sorvall Instrument) durante 5 min a 5000 rpm con un rotor $934. Se separé el sobrenadante y se filtré a través de un filtro de 5 Um de 9. A continuacién se esterilizé, haciéndolo pasar por un filtro de 0.22 pm de @. Todo el proceso de extraccién se hizé a 0-4 °C, El extracto se afiadié al medio de cultivo cuando éste se encontraba lo mas cerca posible del punto de solidificacién. 55Para la preparacién de las disoluciones y de los medios de cultivo y se utilizé agua destilada y desionizada con objeto de asegurar su pureza. El pH del medio se ajusté a 5.8 con NaOH o C1H 1N antes de afiadir el Agar. El medio Ng se ha solidificado con Agar Difco purificado 6.5 g/l (excepto en el experimento de soportes), mientras que el MS se solifificé con Agar Merck 7.5 g/l. Macronutrientes, micronutrientes, sacarosa, agar y otros soportes se esterilizarén en autoclave a 1.05 kg/cm? y 121 °c, durante 20 min. El resto de las sustancias se esterilizaron por filtraci6n, utilizando un filtro de 0.22 um de » de poro. 2.2.2. Composicién de los medios utilizados en los diferentes experimentos I. Influencia de diferentes combinaciones hormonales en el Proceso de induccién de ginogénesis Se utilizé como medio basal el Ng solidificado con Agar Difco purificado. La concentracién de sacarosa fue de 80 g/l. Al medio se le afiadié MCPA en concentraciones de 0.0 mg/l, 0.125 mg/l y 0.5 mg/l, cada una de las cuales fue acompafiada por los siguientes tratamientos: 1.- Sin hormonas (control) 2.- AIA 1 mg/l 3.- BAP 1 mg/l 4.- KIN 1 mg/l 5.- AIA 1 mg/l + BAP 1 mg/l 6.- AIA 1 mg/l + KIN 1 mg/i Se sembraron 20 placas por cada genotipo y cada una de las 18 combinaciones hormonales. 56II. Comparacién de las auxinas MCPA y 2,4-D La concentracién de sacarosa utilizada fue de 80 g/l. Las combinaciones hormonales ensayadas fueron: 1.- MCPA 0.5 mg/l 2.- MCPA 0.125 mg/l + ATA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/1 3.- 2,4-D 0.5 mg/l 4.- 2,4-D 0,125 mg/l + AIA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/l Los ovarios se mantuvieron en estos medios durante 21 dias, al cabo de los cuales, se subcultivaron en otro medio con la misma composicién basal e igual concentracién de sacarosa, pero con las hormonas AIA 0.5 mg/l y BAP 1 mg/l (medio de induccién 2). Los ovarios en los cuales se indujo la formacién de callo pasaron aun medio de regeneracién con la misma composicién que el anterior, pero con concentraciones de sacarosa de 30 g/l. Se sembraron 40 placas por cada genotipo y cada tratamien~ to. III. Efecto del calor en el proceso de ginogénesis Los medios de cultivo utilizados han sido: - Medio de induccién 1: Ng + MCPA 0.125 mg/l + AIA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/l, y 80 g/l de sacarosa = Medio de induccién 2: Ng + AIA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/l, y 80 g/l de sacarosa. - Medio de regeneracién: Ng + AIA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/l y 30 g/l de sacarosa. Se han ensayado los siguientes tratamientos: l.- Ovarios colocados a 24 °C durante 21 dias en el medio de induccién 1. 2.- Ovarios colocados a 32 °C durante 10 dias y después 57durante 11 dias a 24 °C en el medio de induccién 1. Después de los 21 dias en dicho medio, todos los ovarios pasaron al medio de induccién 2. Solamente los ovarios en los que se formé callo pasaron a medio de regeneracién Se sembraron 20 espigas por cada variedad en cada uno de los tratamientos. IV. Influencia de diferentes tipos de soporte en el medio de cultivo Se han ensayado los siguientes tipos de soporte: 1.- Agar Difco purificado 6.5 g/1 2.- Agar Difco purificado 9 g/l 3.- Agarosa 60 g/l 4.- Gelrite 3 g/l 5.- Almidén 80 g/1 Los medios de cultivo utilizados fueron los mismos que en el experimento III. Se sembraron 20 placas por cada genotipo y cada soporte. V. Influencia de diferentes azicares Con el fin de comparar el efecto de distintos azucares, asi como de diferentes concentraciones en el proceso de induccién de ginogénesis, se han probado los siguientes tratamientos: 1.- Sacarosa 90 g/l 2.- Sacarosa 50 g/l 3.- Sacarosa 10 g/l 4.- Melibiosa 80 g/l + Sacarosa 10 g/1 5.- Maltosa 10 9/1 La combinacién hormonal utilizada fue: MCPA 0.125 mg/l + AIA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/l. Los ovarios se mantuvieron en estos medios durante 21 dias. Después, se pasaron a un segundo medio de induccién, con 58composicién igual que el anterior pero sin MCPA. Los ovarios en los que se indujo la formacién de callo pasaron a medio de regeneracién. En los medios de regeneracién utilizados se mantuvieron las mismos azicares, pero las concen- traciones se redujeron en el caso de concentraciones altas y se mantuvieron en el caso de concentraciones bajas. De este modo, los callos inducidos en medios con 50 6 90 g/l de sacaro- sa pasaron a medio de regeneracién con 30 g/l. Callos inducidos en el tratamiento 4 se subcultivaron en medios con 30 g/l de melibiosa y 10 g/l de sacarosa. Sin embargo, los callos inducidos en medios con 10 g/l de sacarosa o de maltosa se subcultivaron en el mismo medio. Se sembraron 20 placas por cada genotipo y cada tratamiento. Estado de desarrollo del ovario en el momento de la puesta en cultivo Se utilizé el estado de desarrollo de los granos de polen como indicador de la madurez del saco embrionario. Se separé una antera de una flor de la zona central de la espiga, se tif con carmin-acético al 1% y se observé en el microscopio éptico. Se definieron tres estadios diferentes: 1.- Estado uninucleado, el 90% de los granos de polen tienen un s6lo nucleo. 2.- Estado binucleado, e1 90% de los granos de polen tienen dos nucleos. 3.- Estado trinucleado, e1 90% de los granos de polen tienen tres nucleos Por otra parte, se tomaron espigas maduras y se emascularon en condiciones estériles en una camara de flujo laminar. Se mantuvieron durante dos dias en solucién Hoagland (Jensen, 1975), al cabo de los cuales se separé el ovario de cada flor y se sembr6 en el medio de cultivo. Se sembraron 20 placas de cada genotipo, en cada uno de los estados de desarrollo citados anteriormente. 59Los medios de cultivo utilizados fueron: - Medio de induccién 1: Ng + MCPA 0.125 mg/l] + AIA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/l, sacarosa 90 g/l, durante 21 dias. - Medio de induccién 2: semejante al anterior, pero sin incluir el MCPA. - Medio de regeneracién: Ng + AIA 0.5 mg/l + BAP 1 mg/l, saca- rosa 30 g/l. VII. Efecto de diferentes compuestos orgdnicos Se estudié el efecto de sustancias de composicién quimica compleja, en el proceso de induccién de la ginogénesis. Los tratamientos ensayados fueron: 1.- Control 2.- Caseina hidrolizada (500 mg/l) + Extracto de malta (100 mg/1) 3.- Leche de coco (10% v/v) 4.- Extracto de patata (10% p/v) 5.- Extracto de ovarios (10 ovarios/8 ml de medio) 6.- GA3 (2 mg/l) + Acido ascérbico (50 mg/1) 7.- Arginina (500 mg/l) + Prolina (500 mg/1) Los medios de cultivo utilizados fueron los mismos que en el experimento III, pero con una concentracién de sacarosa de 90 g/l en los medios de induccién. Todos los ovarios permane- cieron durante 21 dias en el medio de induccién 1. A continuacién se subcultivaron en el medio de induccién 2, manteniendo el correspondiente regulador de crecimiento. Al cabo de 30 dias todos los ovarios se cultivaron en medio de regeneracién. Se sembraron 15 placas por cada genotipo y cada uno de los siete tratamientos. 602.2.3. Composicién del medio de enraizamiento Todas las plantulas obtenidas en los diferentes experimen- tos pasaron a medio MS con los macronutrientes reducidos a la mitad, 20 g/1 de sacarosa, 100 mg/l de mioinositol, 1 mg/l de ANA y 7.5 g/l de agar Merck. Las plantulas permanecieron en este medio hasta que tuvo lugar la formacién de raices. 2.3. CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LOS CULTIVOS El material se mantuvo en una cémara de cultivo con una iluminacién de 2000 lux, aportada por tubos fluorescentes Philipps Tld 58w/33, con un fotoperiodo de 16 h de luz temperatura de 24 #1 °C y una humedad del 80% . Durante todo el proceso de induccién de callo o plantula directa, las placas se mantuvieron en oscuridad. Una vez tuvo lugar la aparicién de callo o plantula, se colocaron a la luz. 2.4. CONDICIONES DE ACLIMATACION DE LAS PLANTULAS Las plantas enraizadas en tubo, pasaron a macetas con vermiculita humedecida en medio Hoagland modificado, y se mantuvieron en camara de cultivo a 24 + 2 °C, fotoperiodo de 16 h de luz. Las primeras semanas se colocé un vaso transpa- rente encima de la maceta para mantener la humedad. Al cabo de un mes, las plantulas se transplantaron a una mezcla — turba~ arena-perlita-humin en proporciones 4:5:1:1, manteniéndose las mismas condiciones de temperatura y fotoperiodo. Posterior- mente, pasaron a las condiciones de invernadero. 2.5. CONTROLES CROMOSOMICOS Se realizaron controles cromosémicos de callos y plantulas. Se tomaron callos en crecimiento y se pusieron en agua destilada a 0 °C durante 24 horas. La fijacién se realizé en etanol (99%)-acético glacial (3:1) durante 24h, La hidrélisis se llevé a cabo en ClH IN durante 12 min, a 60 °C. La tincién se realizé con reactivo de Schiff. 61Apices de raices jévenes fueron tratadas con una disolu- cién saturada de a-bromonaftaleno durante 5h a temperatura ambiente. La fijacién y la hidrélisis del material se realizé igual que en el caso anterior. La tincién se realiz6é con orceina lactopropiénica (Dyer, 1963). 2.6. ANALISIS ESTADISTICO En el presente cuadro se presenta el numero de tratamientos y numero de ovarios por cada tratamiento y genotipo en cada uno de los experimentos realizados. EXPERIMENTO | TRATAMIENTO|GENOTIPO/ — OVARIOS/ OvARIOS ‘TRAT/GENOT TOTAL CPA 18 2 200 7,200 MCPA - 2,4~D 4 2 400 3.200 TRAT. CALOR 2 2 200 800 SOPORTES 5 2 200 2.000 AZUCARES 5 2 200 2.000 EST. DESARROLLO 4 2 200 1.600 COMP. ORGANICOS 7 2 150 2.100 TOTAL 45 2 - 18.900 Cuadro 9. Numero de tratamientos y ovarios sembrados por cada tratamiento y genotipo, en cada uno de los experimentos. En todos los experimentos se midié el porcentaje de induc- cién de callos totales (FCALLTOT) y callos regenerables (FCALLRG). Dado que los resultados se expresan en términos de porcentajes, se realiz6 la transformacién de los datos con arcosen x1/2, para conseguir de este modo la normalizacién de las variables. Teniendo en cuenta la gran variabilidad que se 62normalmente incluso después de realizar la transformacién, se utilizé el analisis de la varianza debido a su gran robusticidad (Steel y Torrie, 1981). Se usé el procedimiento GLM (General Linear Model) que es v&lido para disefios dese- quilibrados. Se consideraron los 10 ovarios procedentes de una misma espiga como unidad experimental. Las comparaciones maltiples entre medias se han realizado mediante el criterio "minima diferencia significativa de Bayes" (Waller y Duncan, 1969), para un valor de k=100, que equivale a un error de significacién a de 0.05. Se realizé un analisis de varianza-covarianza en un caso en el que se pretendia estudiar, ademas del efecto de una variable discreta, el efecto de una variable continua. El soporte informAtico ha consistido en ordenadores de tipo PC-AT, con la aplicacién de los programas DBase III+, SAS versi6n 6.03 y Harvard Graphics. 63IV. RESULTADOSLos resultados vienen dados en frecuencias de induccién de callos ginogénicos; sin embargo, se hace una distincién entre callos regenerables y no regenerables puesto que el fin «ltimo del trabajo es la obtencién de plantas y no la obtencién de callos. De acuerdo a la experiencia adquirida en los trabajos del departamento sobre cultivo de anteras y embriogénesis somatica en cebada se consideraron callos regenerables aquéllos que fueron compactos, blanco-amarillentos, con tendencia embrio- génica o morfogénica. Por el contrario, se consideraron callos no _regenerables aquéllos que fueron friables translacidos, con tendencia a volverse pardos, que si bien conservaron su capacidad de crecimiento, no fueron capaces de regenerar plantulas. 651. RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS I. Influencia de diferentes combinaciones hormonales en el proceso de induccién de ginogénesis. Se ensayaron 18 medios de cultivo diferentes, xresultantes de la combinacién de tres niveles de MCPA (0.0 mg/l, 0.125 mg/l y 0.5 mg/l) con seis tratamientos hormonales. En los cuadros 10, 11 y 12 se muestra un resumen de los resultados obtenidos para los dos genotipos. En ellos aparecen las frecuencias de callos totales (FCALLTOT), callos regenerables (FCALLRG) y no regenerables (FCALLNRG), asi como el nimero de plantas verdes y albinas obtenidas. Aunque se intenté sembrar 20 espigas por combinacién hormonal y genotipo, el diferente namero final de ovarios sembrados se debe bien a la disponibilidad del material vegetal, o bien a problemas de contaminacién, En las figs. 2 y 3 se muestra una representacién grafica de los datos para los genotipos DH y BE, respectivamente. Para e1 genotipo DH se observa que al aumentar la concentracién de MCPA aumenta la FCALLTOT, excepto para el tratamiento AIA con KIN, en 61 que se da una disminucién de esa frecuencia para las concentraciones mas altas de MCPA ensayadas. Los mayores Porcentajes de callos regenerables se dieron en medios que contenian BAP. Para el genotipo BE se aprecia que las combina- ciones hormonales con KIN no han dado resultado en la induccioén de 1a ginogénesis. Casi todas las combinaciones hormonales dieron callos ginogénicos que aparecieron a los 30, 60 e incluso 90 dias siendo 45 dias el periodo més frecuente para visualizarlos (£ig. 4a). Sélamente en unas pocas combinaciones hormonales se regeneraron plantulas. Algunas de las plantas haploides fueron obtenidas directamente del ovario en el medio de induccién (fig. 4b), sin pasar por la fase de callo ni ser cultivadas en medio de regeneracién. Las otras se regeneraron a partir del callo obtenido (figs. 4c y a). 66‘TRATANTENTOS | GEAOT | HO OVARTOS | FCALLYOE | FCALLNRG | PCALIRG | 40 PLANTS ‘SEABRADOS — voal mn 200 0.00 0.00 0.00 - ‘ n 30 1.05 105 O00 eee mn 10 0.53 0.53 0.00 7 an n Mo on an 0.00 - Ty 0 0.38 0.00 0.95 oe mp 130 0.53 0.53 0 ects om 10 0.53 0.00 soe 1m oy m0 6.00 0,00 7 D] 190 0.53 0.00 0.53 14 a+ Be ny Fr) 4.00 2.50 1.50 toe fn] a0 3.5 3.45 0.00 - - ane t 00 1.00 1.00 0.00 - - v= plantas verdes; al plantas albinas Cuadro 10. Resultados obtenidos para niveles de MCPA de 0.0 mg/l y seis tratamientos hormonales. 67‘TaaTAMIENTOS | cHuOT | 19 oVARIOS | FeAMLYoT | PCALLARG | FeaLLRG | Wo PLAITAS ‘SEABRADOS a rooal mu 0 6.00 4.00 4.00 ‘ a tT) 056 0.56 0.00 1 160 163 0.63 0.00 - am BE 190 2.10 Lad 6.00 - - mn no 1.30 0.41 1 - a mp m nO 0.87 0.00 - mn 190 158 1.58 0.00 - m x m0 0.59 0,59 6.00 : - 190 1st 0.53 1.05 3 - A+ BP n 250 uw 1.60 oe 1 : 1 5.18 5.06 0.53 - - M+ KU no 6.00 0.00 0.00 - - v= plantas verdes; al= plantas albinas Cuadro 11. Resultados obtenidos para niveles de MCPA de y seis tratamientos hormonales. 0.125 mg/l 68‘reATaMiEnTOS | GBHOT | HO ovaRTOS | PcaLLtoY | PeALLARG | FCaLLRG | #9 PLANTAS SEABRADOS —. val mn i 3.89 3.88 6.00 - oe a B 0 3.0 2.80 out 1: mb no 409 2.86 13 - an ny 1st 1.05 1.05 0.00 7 mL 190 2.63 2.63 0.00 eee mp ny 200 5,50 4.00 1.50 ao: on 190 3.6t 3S 0.53 Seer 1 oy 160 0.00 0.00 moo on cu) un 12 7 Ana + BAP at 200 0.50 0.50 0.00 eee o mm 2.35 2.35 7 ane a no 0.00 0.00 0.00 7 v= plantas verdes; als plantas albinas Cuadro 12. Resultados obtenidos para niveles de MCPA de 0.5 mg/l y seis tratamientos hormonales. 69SOPBZI]1IN OAI}|ND ap so|paw gt so] Ue Hd Odjjouab je eed sepjuaiqo HY TTVOd A LOLTIVOd ‘O14 oulivos MB = toinivoa (1/6 4) sowarwoypay NDEVIV dva-VIV dva vIV ° 1/Bw 00 vdoW gm | | aT 4 175 $70 WOW tT] 76u ¢'0 vdOW splouansasy“SOpeZ][I}N OA}}]NO ep BOo]pew gl so] Ue ag Odjouab ja vied sepjuayqo OYTIVOd A LOLTIV94 “e914 oulivos tortivo4 [_] (1/6u 4) soquajwoypay NIM*VLV dV aeVIV NUM dva viv 0 bu 00) vdoW 1/Bul S20 WdOW vbw sO WdoW LT (%) spiquansaiyFig. 4. a. Callo saliendo del ovario a los 45 dias de su puesta en cultivo. Plantula haploide saliendo directamente del ovario a los 45 dias de su puesta en cultivo. Callo ginogénico con dos puntos de induccién morfogé- nica a los 45 dias de su puesta en cultivo. El mismo callo de la fig. 4c, con dos plantulas haploides a los 55 dias de su puesta en cultivo.En el cuadro 13 se muestran los resultados de los andlisis de varianza para la FCALLTOT y FCALLRG con las diferentes combinaciones hormonales (cuadro 13A), asi como la separacién de medias de los factores significativos (cuadros 13B, Cy D). Existen diferencias significativas entre genotipos, obtenién- dose en el genotipo DH una FCALLTOT de 2.07 y en el BE 1.38. Asimismo se han encontrado diferencias significativas entre niveles de MCPA, dandose las mayores frecuencias de induccién con niveles de MCPA de 0.5 mg/l. Ademas, existen interacciones significativas genotipo x tratamiento y MCPA x tratamiento, que aparecen representadas en las figs. Sa yb, respectivamente. En la fig. 5a se aprecia que para el genotipo BE los tratamientos con KIN son perju- diciales, consiguiéndose la mayor frecuencia de induccién con AIA y BAP. Para el genotipo DH el tratamiento AIA con KIN dio lugar al mayor nimero de callos inducidos en todo el experi- mento. En la figura 5b se observa que a niveles altos de HCPA la frecuencia de induccién de callo disminuye en los tratamien- tos con KIN, AIA con BAP, y AIA con KIN, mientras que en ausencia de MCPA o a bajas concentraciones la frecuencia de induccién de callo aumenta con los tratamientos AIA con BAP y AIA con KIN. El analisis de varianza de la FCALLRG, que aparece en la segunda columna del cuadro 13A, muestra que existen diferencias significativas entre los tratamientos para la regeneracién, dandose las mayores frecuencias de regeneracién con BAP, y AIA con BAP (cuadro 13D); ademas existe una triple interaccién genotipo x MCPA x tratamiento. Se obtuvieron plantas haploides y verdes de los dos genotipos con las combinaciones: - AIA 1 mg/l con BAP 1 mg/1 - MCPA 0,125 mg/l con AIA 1 mg/l y BAP 1 mg/1 Ademas, se han obtenido plantas verdes haploides del genotipo BE con las combinaciones hormonales': - NCPA 0.5 mg/1 - MCPA 0.5 con BAP 1 mg/L 74Fte. variacién cL CM FCALLTOT CM FCALLRG REPETICION 28 48.54 ns 9.88 ns GENOTIPO 1 225.24 * 23.11 ns HCPA 2 202.00 * 0.02 ns GENOT x HCPA 2 107.14 ns 9.43 ns TRATAMIENTO 5 48.34 ns 24.56 * GENOT x TRAT 5 201.52 ** 6.11 ns MCPA x TRAT 10 124.48 #* 13.61 ns GENOTXTRATXMCPA 10 73.51 ns 22.12 * ERROR 643 47.98 10.03 **, * y ns : P<0.01, P<0.05 y P>0.05, respectivamente B D GENOTIPOS FCALLTOT TRATAMIENTO FCALLRG DH 2,07 a BAP 0,65 a BE 1,38 b ALA + BAP 0,58 ba c AIA 0,28 ba NIVEL MCPA = FCALLTOT KIN 0,19 ba NCPA 0,5 2,49 a ° 0,08 b MCPA 0,125 1,47 b AIA + KIN 0,08 b MCPA 0,0 1,23 b Valores seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P>0.05). Cuadro 13. A. Analisis de varianza hormonales B. Separacién C. Separacién MCPA. D. Separacién para las 18 combinaciones y los dos genotipos. de medias FCALLTOT para genotipos. de medias FCALLTOT para niveles de de medias FCALLRG para tratamientos. 15Se han obtenido plantas albinas de DH con: ~ AIA 1 y BAP 1mg/1 - MCPA 0.125 mg/l con BAP 1 mg/1 16GENOT*TRAT 7 FCALLTOT (%) 3 2 1 oO oO AIA BAP KIN AIA*BAP_ AIA*KIN TRAT (1 mg/l) FI@Sa. Anéllels de la Interaccién genotipo-tratamiento MCPA+TRAT 2 FCALLTOT (%) ° AIA BAP KIN. AIA*BAP- AIASKIN TRAT (1 mg/l) FI@Sb. Analisis de la Interaccién MGPAstratamientoII. Comparaci6n de las auxinas MCPA y 2,4-D Se han utilizado cuatro tratamientos para realizar la comparacién de la efectividad de las hormonas MCPA y 2,4-D en el proceso de induccién de ginogénesis. En el cuadro 14 se muestra un resumen de los resultados obtenidos para las cuatro combinaciones hormonales ensayadas y los dos genotipos. Asimismo, en la fig. 6 aparece una representacién grafica de los resultados. Se obtuvo una mayor frecuencia de induccién de callos en el genotipo DH que en el BE. De mismo modo, el MCPA dio lugar a mayor nimero de callos que la hormona 2,4-D. No se obtuvieron callos regenerables del genotipo BE en ausencia de AIA y BAP en el medio de induccion. En el cuadro 15A se muestran los resultados de los andlisis de varianza para FCALLTOT y FCALLRG. Se han encontrado diferencias significativas entre genotipos y tratamientos para FCALLTOT. En el cuadro 15B se muestra la separacién de medias para los dos genotipos, siendo la FCALLTOT de DH el doble que la de BE. Se realizaron contrastes ortogonales entre MCPA y 2,4-D, y presencia o ausencia de AIA y BAP en el primer medio de induccién, segin quedan reflejados en el cuadro 15A. Se han encontrado diferencias significativas entre 2,4-D y MCPA en FCALLTOT. ademas, el contraste presencia o ausencia de AIA y BAP en el medio de induccién 1 esta préximo al nivel de significacén (P<0.08), viéndose la FCALLTOT favorecida por la presencia de AIA y BAP (cuadro 15D). 78seamaientos 9 ovantos | reaustor | gcautues | eatuec | ¥o PLATS sMBRADOS SEEeeee abs rel 4 0 ais | 263 | oss | 2 088 ‘MCPA 0.5 Ly 120 LM LM 0.00 p F Ty 4100 41.00 1.00 1.00 2 050 Hoon 8.125, aa 0.56000 1 u 400 nso | 200 | oso fos tE 100 150 1.50 1.00 4 1 R 100 ao | 00 - o% 400 am} ono | no fee 24-0 0,125, ATA 0,500 1 : u 380 105 0.53 0.52 - - abs = valores absolatos; rel = valores relatives Cuadro 14, Resultados obtenidos en la comparacién entre MCPA y 2,4-D. 79“SBpPeZjI]IN SajBUOWIOY BaUuojoeujqwiod oujyeNd eB] ue Sodjjouab soque vied sepjueyqo DYTTVO4 A LOLTIVO4 “9'DId oulivos loivivo4 [_] (1/6w ) soyuampyosy Ol dva+s0 VIV Ol dva-s‘0 VIV Sto d-72 gO a-77 SzV0 WdOW G0 VdoW 3a Vay Ha ) sppuansai4| Fte. variacién CL CM FCALLTOT CM FCALLRG . REPETICION 41 59.98 ns 16.51 ns GENOTIPO 1 674.59 ** 66.80 ns(t) TRATAMIENTO 3 200.37 * 27,97 ns MCPA - 2,4-D 1 467.20 ** 0.00 ns 0 - ATA+BAP 1 124.18 ns 66.80 ns(t) GENOTXTRAT 3 43.36 ns 11.34 ns ERROR 269 59.97 20.47 **, *, ns(t) y ns : P0.1, respectivamente. B D GENOTIPOS FCALLTOT TRATAMIENTOS FCALLRG DH 3.16 a AIA + BAP 0.89 a BE 1,50 b 0 0.37 a c MCPA ~ 2,4-D FCALLTOT MCPA 2,4-D 3.00 a 1.65 b Valores seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P>0.05). Cuadro 15. A. Analisis de varianza para las cuatro combina- ciones hormonales y los Separacién de medias de Separacién de medias de 2,4-D. Separacién de medias de © ausencia de AIA y BAP a1 dos genotipos. FCALLTOT para genotipos. FCALLTOT para MCPA y FCALLRG para presencia en el medio de induccién.III. Efecto del calor en el proceso de ginogénesis. Se cultivaron ovarios a 32 °C durante los 10 primeros dias de la puesta en cultivo y los resultados se compararon con los de ovarios cultivados a temperatura control. En el cuadro 16 se muestra un resumen de los datos obtenidos. &1 tratamiento térmico inhibié la ginogénesis en el genotipo DH, mientras que en el genotipo BE dio lugar a frecuencias de induccién de callo m&s bajas que el control, pero ninguno de los callos fue regenerable. TEATAMIENTOS | GKNOT | Wo OVARIOS | FeALLTOT | FCALLARG | PoALLRG | ¥o PLANTAS SBNARADOS a abs rel oR 00 450 4.00 0.50 1 0.50 conrRoL wie Be 200 1.00 1.50 0.50 7 oe mn 200 6.00 0.00 9.00 SEH caLoR itd 22 *¢ a 00 1st 1.50 0.00 7: abs = valores absolutes; rel: valores telativos, Cuadro 16. Efecto del calor, 32 °C durante los diez primeros dias de cultivo, sobre el proceso de ginogénesis. 82MEE Re ee re Los andlisis de varianza muestran que existen diferencias significativas entre tratamientos para la FCALLTOT (cuadro 17A). La FCALLTOT del tratamiento de calor fue cuatro veces menor que la del control para el conjunto de los dos genotipos (cuadro 17B). Asimismo, la interaccién genotipo x tratamiento esta préxima a la significacién (P<0.09) (cuadro 17A). Sin embargo, no existen diferencias entre tratamientos para la FCALLRG. A Fte. Variacion GL CM FCALLTOT CM FCALLRG REPETICION 19 52,48 ns 8,05 ns GENOTIPO 1 8,82 ns 0,00 ns “TRATAMIENTO 1 378,80 * 17,01 ns GENOT x TRAT 1 169,83 ns (t) 0,00 ns ERROR 79 54,21 8,65 *, ns (t) y ns: P<0.05, P<0.1 y P>0.1, respectivamente. TRATAMIENTO FCALLTOT CONTROL, 3,2a CALOR 0,7 b Cuadro 17. A. Andlisis de varianza para un tratamiento de calor. B. Separacién de medias de FCALLTOT para los dos tratamientos. 83IV. Influencia de diferentes tipos de soportes en el medio de cultivo. Se utilizaron diferentes soportes como agarosa, gelrite almidén y agar, éste Gltimo a dos concentraciones distintas, con el fin de comparar la efectividad de todos ellos en el Proceso de ginogenesis. En el cuadro 18 se muestra un resumen de los resultados obtenidos para los dos genotipos. Debido a que el soporte utilizado puede influir en la fuerza y viabilidad del callo inducido, se procedié a abrir los ovarios a los 80 dias de su puesta en cultivo y a extraer los callos ginogénicos de su interior. En el cuadro 18 aparece la frecuen- cia de callos que rompen el ovario por si mismos (FCALLTOT), frecuencia de callos que aparecieron al abrir el ovario (FCALLA) y frecuencia de callos totales, suma de los anteriores (FCALLTOTA) . Al no hacer la distincién entre FCALLRG y FCALLNRG no se procedié a hacer el analisis estadistico. En el cuadro 18 se observa que el gelrite y el almidén no dieron lugar a callos con capacidad de romper el ovario, en ninguno de los dos genotipos. Sin embargo, al abrir los ovarios se encontré una pequefia proporcién de callos inducidos. La agarosa dio lugar a la mayor proporcién de callos para el genotipo DH, si bien casi el 80% de estos callos no habian conseguido salir al exterior. Este soporte mostré un comporta- miento diferente para el genotipo BE, dando lugar a la menor FCALLTOTA de todos los tratamientos, y quedando la mitad de los callos dentro del ovario. Concentraciones de agar de 9 g/l dieron lugar a una mayor FCALLTOTA que concentraciones de 6.5 g/l. Sin embargo, la FCALLTOT fue muy similar en las dos concentraciones para los dos genotipos. 84tuaramittos | cenor | mo ovarros | reatutor | reatia | rcat.rora ‘SRMBRADOS. iy 10 ay | 1.05 ao aca 6.5 g/l Oy 10 aan} dat un o 3) ase | oe 43 asa Sf a 10 wa} an oF uw at aD 50 acanosi ogi ny 10 Oss | 0.56 Lil oH a) | tse 0.61 CURIE ig iy 180 ose | 1m an om Mo 13 1 AntDor wal n 160 on | 135 12s FCALLTOT = Frecuencia de callos qae ronpen el ovario PCALLA = Frecuencia de callos que aparecen al abrir el ovario FCALLYOYA = Precuencia de calles totales, suaa de las anteriores Cuadro 18. Efecto de la utilizacién de diferentes tipos de soporte en el medio de cultivo, sobre el proceso de ginogénesis. 85Todos los callos que salieron al abrir el ovario, fueron de pequefio tamafio y presentaron color marrén y aspecto no regenerable. En la fig. 7 aparecen ovarios sembrados en los diferentes tipos de soporte. Los ovarios sembrados en medio solidificado con concentraciones de agar de 9 g/l (b), mostraban una turgencia menor que los sembrados en 6.5 g/l (a). Los que fueron sembrados en medio con agarosa (c) y gelrite (d) presentaron buen aspecto y experimentaron un alto crecimiento Sin embargo, el medio con almidén presenté problemas de anaerobiosis, como se aprecia en la fig. 8. 867. Aspecto que presentaron los ovarios en los cinco soportes utilizados a los 40 dias de cultivo. Fig. Fig. 8. Ovario sembrado en medio con almidén.v. Influencia de diferentes azcares. Se han realizado cinco tratamientos, cuatro de ellos con sacarosa a diferentes concentraciones, y el otro con maltosa Los resultados obtenidos se muestran en el cuadro 19. Las altas concentraciones de azicares parecen resultar mas efectivas en la induccién de callos ginogénicos que las bajas. En el medio con una concentracién de sacarosa de 90 g/l se obtuvieron las proporciones mas altas de callos inducidos, y se consiguieron regenerar plantulas de los dos genotipos utilizados. Cuando la concentracién de sacarosa se redujo a 50 g/1 disminuyé el néme- xo de callos inducidos. Aunque se regeneraron cuatro plantas verdes haploides del genotipo BE, se debe hacer constar que tres de ellas pertenecian al mismo callo. Concentraciones de azicares de 10 g/l reducen mucho la frecuencia de induccién de callos, si bien la maltosa aumenta la viabilidad de regenera- cién de dichos callos, principalmente del genotipo DH. Sin embargo, al igual que enel caso anterior, de las cinco plantulas regeneradas, cuatro lo fueron a partir del mismo callo. £1 tratamiento con melibiosa favorece la induccién de callos ginogénicos, sobre todo en el genotipo DH. Estos callos tienen alta capacidad de regeneracién en un principio, pero no liegan a dar plantas haploides viables. En las figs. 9a y b se presenta un aspecto general de los ovarios de los genotipos DH y BE, respectivamente, para los cinco tratamientos a los 21 dias de cultivo. El andlisis de varianza de FCALLTOT y FCALLRG se presenta en el cuadro 20A. Se han encontrado diferencias altamente significativas entre tratamientos (P<0.01), siendo las concen- traciones altas de azicar las que dan lugar a la mayor frecuencia de induccién de callo, 5.12 para sacarosa 90 g/l, y 4.75 para melibiosa (cuadro 208). Las diferencias entre genotipos y tratamientos para la capacidad de regeneracién estan préximas al nivel de significa cién (P<0.07 y 0.08), respectivamente. Ademas, la interaccién genotipo x tratamiento resulté significativa. En la fig. 10 se muestra el andlisis de esta interacci6n. La FCALLRG del genotipo BE bajé al disminuir las concentraciones de sacarosa, haciéndose nula con la minima concentracién ensayada. Sin embargo, en el genotipo DH, concen- 89TRATAMIEETOS GERNOT | HQ OVARIOS | PCALLYOT | PCALLIK PCALLRG | 19 PLANTAS seaneanos ee abs rel " 20 suo] am | ua | oss SHCMUOSA 30 g/1 a 10 5.0 | 350 | uso] 1 0.50 Ly 200 3.00 3.00 0.00 - SHCAROSA 50 g/) a 00 aso aso | ao | 4 2.00 ” 200 | 050 | 1.50 - ‘SACAROSA 18 g/1 a 200 iso | aso | 9.00 - WMLIDIONI 19 g/l] OE 100 he er + Sacanosa 10 g/t | aR 100 20 | 150 | 050 - ry no 1.8 518 maLtosa 18 g/t a 110 a - abs = valores absolutos; rel = valores relatives. Cuadro 19. Efecto de diferentes azicares en el proceso de ginogénesis. 90Fig. 9. Aspecto que presentan los ovarios del genotipo DH en los cinco medios utilizados a los 21 dias de cultivo. Aspecto que presentan los ovarios del genotipo BE en los cinco medios utilizados a los 21 dias de cultivo. Plaéntula haploide de BE saliendo directamente del ovario, en medio con 50 g/l de sacarosa, a los 50 dias de su puesta en cultivo. Aspecto poco viable de una plantula regenerada a partir de un callo ginogénico, obtenida en medio con melibiosa, a los 70 dias de su puesta en cultivo.traciones medias de sacarosa no dieron lugar a callos regenera- ples y se obtuvieron frecuencias similares para concentraciones altas y bajas de este azicar. aA Fte. variacion GL cM FCALLTOT CM FCALLRG REPETICION 20 78.23 ns 51.23 ns : GENOTIPO 1 128.26 ns 115.63 ns(t) : TRATAMIENTO 4 332.30 ** 68.61 ns(t) GENOT x TRAT 4 138.26 ns 88.69 * ERROR 169 78.12 31.65 **, *, ns(t) y ns: P<0.01, P<0.05, P<0.1 y p>0.1, respec- tivamente. B TRATAMIENTO FCALLRG SACAROSA 90 5.12 a MELIBIOSA 80 SACAROSA 10 4.75 a SACAROSA 50 3.25 ab SACAROSA 10 1.75 b MALTOSA 10 1.05 b Valores seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P>0.05). Cuadro 20. A. Andlisis de varianza para diferentes fuentes de carbono. B. Separacién de medias de FCALLTOT para diferentes fuentes de carbono. 93