1. Por qu se extrajo RNA del tejido pancretico?

R= Porque en las clulas beta se sintetiza la insulina, dichas clulas son

encontradas en el pncreas, por ende, el RNA se extrajo del tejido pancretico.
2. Cmo preparara 100mL de agua libre de RNAsas?
R= Segn el procedimiento: *Agua libre de RNasas: es agua tratada con
dietilpirocarbonato (DEPC): agua destilada estril se le aade 1ml de dietil
pirocarbonato por cada litro de agua a tratar, se deja en agitacin por 16-18
horas y se esterilizar para inactivar el DEPC. Se hacen alcuotas segn el uso.
Para este caso se efecta la siguiente operacin:
1mL
DEP

1000mL por cada

litro de agua a
= Por regla de 3 se multiplica 1 x 100 y se divide entre 1000 da
tratar

Como
100mL de
aguaresultado 0.1mL de DEPC por cada 100mL de agua a
tratar.
libre RNAasas

3. Comentar sobre la pureza de las dos preparaciones de RNA.

R=La frmula para calcular el grado de pureza es
Absorbancia
a esto se aplica para las dos muestras:
Absorbancia
260
280

Quedaras as:

en base

Absorbancia 260 (0.324)

=
Absorbancia 280 (0.160)
2.025

Absorbancia 260 (0.306)

=
Absorbancia 280 (0.132)
2.318

Muestra 1

Muestra 2

Por lo tanto, en base a los resultados y diapos de viader, se puede comentar

que la muestra 1 presenta mayor pureza, ya que, esta menos alejado del rango
de relacin DO, aunque, en calidad ninguna muestra es pura, presentan
valores mayores, quiere decir contaminacin de fenol.

4. Calcular la concentracin de RNA en las dos preparaciones de RNA.

R= Se aplica esta frmula : (Valor de Absorbancia a 260nm)(Factor dilucin)(
Coef. absorcin depende del pH y tipo de cidos nucleicos)
En este caso, ya se conocen los valores de absorbancia y el coeficiente de
absorcin es 40. En la sig se muestra debido a que manejos RNA

Para obtener el factor de dilucin se hace lo siguiente:

Volumen Final (200L)
=
Volumen Inicial (2L)
100L
Al final se obtendrn dos frmulas una para cada absorbancia a 260nm:
Muestra 1
1,296 g/mL

(Absorbancia 260 [0.324])(Factor de dilucin [100])(Coeficiente RNA [40]) =

Muestra 2
1,224 g/mL

(Absorbancia 260 [0.306])(Factor de dilucin [100])(Coeficiente RNA [40]) =

5. Qu cantidad de RNA se ha obtenido en cada muestra?

R=

Muestra 1
1296 g/mL 1,000 L
= 64.8
6. Qu?volumen de cadapreparacin
deg/mL
RNA se aplicara en el gel de agarosa?
50 L
R=Se divide 1g sobre la concentracin de cada muestra:

Muestra 2
Muestra 1
Muestra 2
1 g = 0.82
1 g
= 0.77
1224 1,296
g/mL
1,000 L
1,224
=
61.2
?
50 L
g/mL

7. Qu problema se tendra y como se podra resolver?

R= Que no se podra tomar menor cantidad a 1 L debido a que no hay pipetas
que tomen ese volumen de muestra, la posible solucin es realizar una dilucin
1:10.

8. Si el RNA obtenido no est degradado (est integro), Cmo se esperara ver

el resultado del gel de agarosa? Proponga la imagen.

Fig. 1 Se muestran las bandas obtenidas de la muestra de RNA. En el carril 1

se muestra el RNA degradado, el cual se representa de esta manera, debido
a que ninguna banda es visible y aparece como una mancha de menor peso
molecular. En cuanto al carril 3 se muestran dos bandas claramente,
provenientes del RNA ribosomal la cual la primera banda (de arriba hacia
abajo) corresponde al RNA ribosomal 28s y la segunda corresponde a la 18s,
esto es posible de observarse debido a que el RNA est integro.

9. Indique la fuente de origen de la secuencia, Cul regin debe de sintetizar y

cul es el tamao del fragmento amplificado, cuantas bandas y de qu tamao
(pb) se esperaran obtener despus del corte en un gel de electroforesis de
agarosa al 2% en el carril de la muestra digerida y cuantas bandas y de qu
tamao habr, y como se resolvern el carril del testigo negativo de corte?
GenBank: JQ951950.1
45..377 regin
333 bp
Se obtendrn dos bandas con tamaos de 168 y 165 pb
En el testigo negativo debido a que no fue sometido a ninguna
enzima de restriccin no se realiz corte por lo tanto el tamao de la
banda fue 333 pb.

10.

. Limpiar el rea de trabajo

Identificar los reactivos necesarios para la reaccin:

o Buffer H, BSA, Agua libre de nucleasas,
o enzima de restriccin Xho I 10 U/ L
o DNA muestra (pTOPOGlu obtenido en la prctica 2)
Estimar los volmenes de los reactivos necesarios para realizar
una reaccin en un volumen de 20 L
Estimar los volmenes de los reactivos necesarios para preparar
un coctel para dos reacciones, la muestra y un control negativo
(todos los reactivos sin enzima).
Estimar el volumen de la muestra para la reaccin enzimtica
para obtener el DNA o RNA total aplicado en el gel, considerando
que se aplicar un respectivo volumen en el gel de agarosa.

Buffer H
BSA
Muestra (DNA o
RNA)
Agua libre de
nucleasas
MspI
Volumen Final

Concentracin
del reactivo

Concentracin,
vol. o cantidad en
la Rxn.

Volumen para
1 Reaccin en
L

Volumen para el
coctel en L
2 Reacciones

10X
100X
------------------

1X
1X
Calcular Volumen y
Concentracin
Calcular Volumen

2 L
0.2 L
2 L

4 L
0.4 L
4 L

14.8 L

29.6 L

------------------1U

1U
1 L
20 L
20 L
38 L
Etiquetar los tubos, para el coctel, muestra y control.
Repartir el coctel en el tubo muestra y tubo control.
Aadir la enzima.
Incubar de acuerdo a recomendacin del proveedor.
Desactivar la reaccin de acuerdo al proveedor.
Analizar por electroforesis en gel de agarosa
Comparar los resultados experimentales con los obtenidos con
la digestin en slico del mismo plsmido