Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas

ALEXANDRE MELO KARAM

OZONIOTERAPIA NA REPARAO TECIDUAL DE FERIDAS

INDUZIDAS EM PELE DE RATOS

BARRETOS
2012

Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas

OZONIOTERAPIA NA REPARAO TECIDUAL DE FERIDAS

INDUZIDAS EM PELE DE RATOS

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado

em

Cincias

Universitrio

Odontolgicas
da

Fundao

do

Centro

Educacional

de

Barretos, como parte dos requisitos para obteno

do Ttulo de Mestre em Cincias Odontolgicas,
na rea de Implantodontia
Orientadora: Profa. Dra. Juliana Rico Pires
Co-Orientadores: Prof. Dr. Valdir Gouveia Garcia
Profa. Dra. Elizngela Partata Zuza

BARRETOS
2012

Karam, Alexandre Melo.

Ozonioterapia na reparao tecidual de feridas induzidas em
pele de ratos / Alexandre Melo Karam. Barretos: [s.n.], 2012.
59 f.; 30 cm.
Dissertao (Mestrado)
Educacional de Barretos,
Odontolgicas

Centro Universitrio da Fundao

Curso de Mestrado em Cincias

Orientadora: Profa. Dra. Juliana Rico Pires

1. Ozonioterapia 2. Terapia bio-oxidativa 3. Oznio 4. Ratos
5. Reparao tecidual 6. Pele de ratos
I. Ttulo.

DADOS CURRICULARES
ALEXANDRE MELO KARAM

Nascimento

15 de outubro de 1974, em Salvador/BA - Brasil

Filiao

Alfredo Augusto Karam

Maria Jos Melo Karam

1993/1999

Curso de Odontologia da Universidade Estadual de Feira de Santana BA.

2007/2009

Curso de especializao em Periodontia do Centro Baiano de Estudos

Odontolgicos - CEBEO BA.

2010/2012

Curso de Mestrado em Cincias Odontolgicas do Centro

Universitrio da Fundao Educacional de Barretos, rea de
concentrao - Implantodontia.

DEDICATRIA
A Deus,
Sobre todas as coisas, sobre todos ns, dedico este trabalho. Que ele possa de alguma
forma, ajudar a odontologia e a medicina a desvendar um pouco dos mistrios que
guarda para a humanidade em sua infinita sabedoria e bondade.

Aos meus pais,

Maria Jos e Alfredo Karam que me deram o dom da vida e a oportunidade de estudo,
fazendo possvel minha realizao profissional com dignidade e honestidade.

A minha esposa,
Luciana Karam, amor da minha vida.
Com admirao, agradeo por sua compreenso, carinho, presena e incondicional
apoio ao longo do perodo da elaborao deste trabalho, sendo fundamental para sua
concluso.

Ao meu filho,
Arthur Karam pelos dias de renncia e compreenso, quando das minhas ausncias nas
viagens a Barretos, das horas dedicadas pesquisa em dentrimento das nossas
brincadeiras e lutas pueris, sendo sempre a alegria e a razo do meu viver.
Ao meus sogros,
Vera e Luciano, que muito nos apoiaram e continuam nos apoiando no nosso regresso de
Portugal.

"A todos Aqueles que atravancam o meu caminho... Eles passaro. Eu passarinho!"
Mrio Quintana (Adaptado)

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
"Se de cada minuto, os sessenta segundos, tu puderes tornar com o teu suor

fecundos... A Terra ento ser tua, e os bens que se no somem, e o que melhor,
meu filho, ento sers Homem!".
Rudyard Kipling
minha orientadora,
Prof. Dr Juliana Rico Pires, que com sua brilhante capacidade profissional,
inteligncia e conhecimentos profundos transformou meu rude e tosco projeto numa obra
laboriasamente vicejante. Com sua infinita afabilidade sempre agradecia minha
colaborao, quando na verdade a gratido era toda minha.

Ao coordenador do Mestrado em Barretos,

Prof. Dr. Benedicto Eghbert Corra de Toledo, que com sua compreenso ateno e
apoio, tornou possvel a realizao de mais uma etapa acadmica. Muito Obrigado!

coordenadora do Mestrado em Salvador,

Prof. Dr Letcia Helena Theodoro, que com sua experincia nos orientou, com sua
pacincia e cordialidade soube habilidosamente nos conduzir no caminho do saber e nos
deu ferramentas valiosssimas para nossa atual conquista, ferramentas essas que
nortearo tantos outros passos que viro.

Ao Mestre querido e amigo,

Prof. Dr. Valdir Gouveia Garcia, pela dedicao e sabedoria, pelos incentivos
pesquisa, pelos conhecimentos profundos e experincia em tcnicas de laboratrio e pela
inestimvel contribuio no experimento desse trabalho que, sem o mesmo, ao final no
chegaramos.

 Mestre querida e amiga,

Prof. Dr. Ana Emlia Faria Pontes, pela expressiva e marcante contribuio em nossa
formao, pela inestimvel contribuio nas anlises estatsticas desse trabalho.

Ao Mestre querido e amigo,

Prof. Dr. Celso Eduardo Sakakura, pelas exaustivas viagens a Salvador; por muitas
vezes pegar na mo nos momentos mais difceis das cirurgias nos ambulatrios.

Ao Mestre querido e mais novo amigo,

Prof. Dr. Cleverton Roberto de Andrade pela sua inestimvel contribuio para o
desenvolvimento deste trabalho, junto s anlises histopatlgicas, cujo conhecimento
muito enriqueceu nossos resultados.

secretria do Departamento de Coordenao de Ps-Graduao do UNIFEB

Sr Snia Augusto que com sua dedicao e pacincia nos acolheu em Barretos e de
tudo fez para que o transcorrer do curso fosse o mais proveitoso possvel.

Ao comandante do biotrio do UNIFEB,

Senhor Darcy, que com a benevolncia de um pai me acolheu em seu recinto e tratou
com a mxima ateno a prole do nosso estudo.

AGRADECIMENTOS

Ao Reitor do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos Prof.

Dr. Reginaldo da Silva, Pr-Reitora de Graduao Profa. Dra. Sissi Kawai
Marcos e Pr-Reitora de Ps-Graduao e Pesquisa Profa. Dra. Fernanda
Scarmato de Rosa.

A todos os demais Professores do Programa de Ps-Graduao em Cincias

Odontolgicas: Elcio Marcantonio Jr., Elizangela Partata Zuza, Fernando
Salimon Ribeiro, Alex Tadeu Martins.

A todos os colegas da ps- graduao, pelo apoio que demos uns aos outros,
durante todo perodo que estivemos juntos, tornando essa jornada muito mais
agradvel. Sucesso e felicidades a todos!

A todos os Funcionrios da Clnica de Odontologia do CEBEO-BA, que por

estarem sempre presentes e disposio, proporcionaram na clnica um
aprendizado muito mais eficiente.

A todos,
Que de alguma maneira, contriburam para o resultado final deste trabalho.

SUMRIO

RESUMO ................................................................................................................ 8
ABSTRACT............................................................................................................ 9
1 INTRODUO ................................................................................................. 10
2 OBJETIVO......................................................................................................... 13
3 METODOLOGIA .............................................................................................. 14
4 RESULTADOS.................................................................................................. 23
5 DISCUSSO ..................................................................................................... 35
6 CONCLUSO ................................................................................................... 40
7 REFERNCIAS................................................................................................. 41
8 ANEXOS ........................................................................................................... 46

RESUMO
Karam, A. M. Ozonioterapia na reparao tecidual de feridas induzidas em pele de
ratos. [Dissertao de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Cincias
Odontolgicas do UNIFEB; 2012.
A literatura tem destacado a utilizao da oxignio-ozonioterapia como terapia
coadjuvante em situaes mdicas de necroses isqumicas, spticas e
avasculares. At o momento, em revista da literatura, no foi encontrado algum
trabalho que avaliasse os efeitos sistmicos da utilizao desta terapia em
reparao tecidual. Dessa forma, o presente estudo indito teve por finalidade
avaliar os efeitos da terapia bio-oxidativa com gs oznio, na cicatrizao de
ferida de pele em ratos. Para tanto, 30 ratos Wistar machos foram submetidos
leso tecidual (1,0cm) na pele do dorso (baseline). Logo aps a induo da
ferida, os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos de 15 animais,
sendo o grupo I constitudo de animais que receberam simulao da aplicao
do gs oznio (controle) e o grupo II- constitudo de animais que receberam
tratamento com gs oznio (teste). Os animais foram eutanasiados aos 7 e 15
dias aps baseline, amostras da regio lesionada foram removidas, fixadas em
formol e submetidas analise macroscpica, histomorfolgica e histomtrica.
Os resultados deste ensaio randomizado mostraram que os grupos tratados com
oznio (grupo II) apresentaram inflamao mista aos 7 dias, transladando para
ausncia de inflamao no 15 dia, enquanto o grupo controle (grupo I) exibiu
inflamao aguda no 7 dia, transladando para inflamao crnica que aumentou
significativamente do 7 para o 15 dia. No 7. dia, o grupo II apresentou
contrao da ferida de forma estatisticamente maior, se comparado ao grupo I
(ANOVA- Bonferroni). O grupo II apresentou maior grau de neo-vascularizao
que o grupo I (Kruskal-Wallis). No 15 dia, os dois grupos (I e II) apresentaram
re-epitelizao completa, entretanto, o grupo II apresentou completa
regenerao muscular e alta proliferao de anexos cutneos. Concluiu-se que a
terapia bio-oxidativa com gs oznio apresentou efeito bio-estimulador,
aumentando a reparao e regenerao tecidual em pele de ratos.

Palavras-chave: ozonioterapia; terapia bio-oxidativa; oznio; ratos; reparao

tecidual; pele de ratos.

10

ABSTRACT
Karam, A. M. Ozone therapy in the healing of wounds induced in rat skin
[Dissertao de Mestrado]. Barretos: Curso de Mestrado em Cincias
Odontolgicas do UNIFEB; 2012.
Literature has emphasized oxygen-ozone therapy as adjuvant treatment in medical
situations of ischemic, septic and avascular necrosis. The literature review hasnt
found any study about the sistemic effects of this therapy in tecidual reparation
yet. The object of this inedited study was evaluate the effects of bio-oxidative
therapy with ozone gas in cutaneous wounds made in rat skin. Therefore, 30 male
Wistar rats were subjected to tissue injury (1.0 cm) in the dorsum skin (baseline).
Immediately after wound induction, animals were randomly divided into two
groups of 15, group I consisting of those which received sham application of
ozone gas (control) and the group II consisting of rats that were treated with ozone
gas. The animals were euthanized at 7 and 15 days after baseline, samples of the
injured area were removed, fixed in formalin and submitted to macroscopic,
histologic and histometric analysis.The results of this randomized trial showed
that the group treated with ozone (group II) showed mixed inflammation at 7
days, moving to absence of inflammation at day 15, while the control group
(group I) exhibited acute inflammation on day 7, moving to chronic inflammation
that significantly increased from 7th to 15th day. On the 7th day, group II had
statistically higher wound contraction when compared to group I (ANOVABonferroni). Group II had a higher neo-vascularization degree than group I
(Kruskal-Wallis). On day 15, the two groups (I and II) showed complete reepithelialization, however, group II showed complete muscle regeneration and
higher proliferation of skin appendages. The study concluded that bio-oxidation
treatment with ozone gas provided bio-stimulator effect, enhancing tissue repair
and regeneration in rat skin.
Key-words: ozonetherapy, bio-oxidative therapy, ozone, rats, tissue repair, rats
skin.

11

PREFCIO
O presente estudo parte de um projeto inserido na linha de pesquisa
Teraputica da Doena Periodontal, a qual objetiva o desenvolvimento e/ou
avaliao de modalidades teraputicas empregadas no tratamento da doena
periodontal ou peri-implantar. Dessa forma, estudos preliminares, incluindo
estudo das tcnicas, dosagens e efeito reparador tecidual do gs oznio so
imprescindveis para possibilitar a aplicao desta terapia na odontologia,
particularmente na periodontia e implantodontia, em cujas temticas esto
inseridas no programa de mestrado do UNIFEB.

12

1 INTRODUO
A Oxignio-ozonioterapia uma terapia bio-oxidativa que tem como
base a utilizao da mistura gasosa de oxignio e oznio medicinais (Bocci,
2006). Dentre os seus efeitos teraputicos, tem sido associado com melhora do
metabolismo e da oxigenao tecidual perifrica (Bocci, 2006). Sua primeira
aplicao em medicina, que se tem notcia, foi a utilizao do oznio gasoso
para tratamento de gangrena ps-traumtica em soldados alemes, durante a
primeira grande guerra mundial (Bocci 2004). A aplicao do oznio foi
reconhecida como modalidade teraputica no tratamento de patologias oculares,
ortopdicas, dermatolgicas, pulmonares, renais, hematolgicas (Bocci, 2004;
Baysan, Lynch, 2005) e no tratamento de infeces virais (Emerson et al., 1982;
Wells et al., 1991), fngicas (Shargawi et al., 1999; Lpez et al., 2003) e
bacterianas agudas e crnicas (Velano et al., 2001; Estrela et al., 2006; Cardoso
et al., 2008).
Estudos (Guerra et al., 1997; Bocci, 2006) relatam algumas vias de
administrao do oznio, tais como auto-hemoterapia, insuflao retal, bolsa
hermtica de oznio (bagging) e aplicaes tpicas por meio de gua e do leo
ozonizados. A ozonioterapia, realizada por meio de insuflao retal de mistura
gasosa de oxignio-oznio, diferentemente do que acontece com a mucosa
respiratria, que possui uma fina camada de fluidos ricos em cidos graxos

13

poliinsaturados, encontra na mucosa intestinal o glicoclix e uma espessa

cobertura de gua contendo mucoprotenas e outras secrees com alta
capacidade anti-oxidante. Alm desta mucosa, h uma grande variedade de
contedo fecal que pode minimizar a atividade oxidante do oznio (Bocci,
2006).
Existem duas vias de metabolizao do oznio, a primeira consiste na
reduo do oznio pelos sistemas anti-oxidantes do organismo (cido ascrbico,
catalase, glutationa peroxidase, vitaminas A e E) levando produo de espcies
reativas de oxignio (ROS), as quais desencadeiam vias metablicas no sangue
(Bocci, Aldinucci, 2006). Na segunda via, os compostos hidrofbicos presentes
no sangue (cido aracdnico, quilomcrons) reagem com o oznio, produzindo
produtos de oxidao lipdica (LOPS), os quais desencadearo reaes em
cascata, ativando fatores angiognicos, imunolgicos, sanguneos e neurolgicos
(Bocci, Aldinucci, 2006). ROS e LOPS levam o plasma a evento de pico de
estresse oxidativo, ocasionando dissociao da oxi-hemoglobina e aumentando a
distribuio de oxignio para os tecidos isqumicos (Bocci, 2006),
provavelmente pelo aumento da expresso do 2,3-DPG (2,3 difosfoglicetaro) ou
por efeito Bohr, alm de acelerar eventos de gliclise, com aumento da
biodisponibilidade de ATPs no organismo.
Algumas teorias sugerem que a oxidao do gs sobre as cadeias cidolipdicas da parede bacteriana leva morte dos microrganismos (Dahnhardt et
al., 2006). Aps sua difuso no interior da clula, o gs oznio oxida
aminocidos e cidos nuclicos (Velano et al., 2001), impedindo replicao

14

celular e levando desnaturao e morte do microrganismo (Emerson et al.,

1981; Wells et al., 1991).
Estudos tm mostrado que a terapia bio-oxidativa com gs oznio
biocompatvel, atua no processo de metabolismo mediado por oxignio, no
processo de clcio, fsforo e metabolismo frreo (Bocci, 1999; Baysan et al,
2000; Vannucchi et al., 2005), alm de apresentar ao germicida, analgsica
(Agrillo et al., 2007) e reparativa (Huth et al., 2006; Agrillo et al., 2007).
Adicionalmente, estudos (Agrillo et al., 2006; Agrillo et al., 2007) tem
demonstrado a utilizao de ozonioterapia em associao com procedimentos
cirrgicos em pacientes que fazem uso de bifosfonatos, com intuito de prevenir
e/ ou evitar o surgimento de osteonecrose. Alm disso, a ozonioterapia tem sido
indicada para tratamento de osteorradionecrose (Stubinger et al., 2006) e
reparao de defeitos sseos (Agrillo et al., 2006).
Estudos tm demonstrado que o oznio veiculado atravs do azeite de
oliva possui propriedades reparadoras (Kim et al., 2009), com aumento de
expresso de mediadores inflamatrios, tais como fator de crescimendo derivado
de plaquetas (PDGF), fator transformador de crescimento beta (TGF-) e fator de
crescimento vascular (GVF). Outros estudos, realizados in vitro, atravs de
exposies de culturas de clulas epiteliais demonstraram que exposies curtas e
repetidas ao estresse oxidativo com oznio melhoram a plasticidade celular
atravs da induo de vias anti-apoptticas como resposta adaptativa celular ao
estresse sofrido (Brink et al., 2008).

15

Apesar de Oliveira (2007), em uma reviso sistemtica sobre a utilizao

teraputica do gs oznio em feridas concluir que no h na literatura estudos
controlados e randomizados de qualidade sobre o assunto, todos os estudos
analisados apontaram resultados favorveis utilizao do gs oznio em feridas.
Dessa forma, acredita-se que a terapia bio-oxidativa com gs oznio pode
favorecer e acelerar o processo de angiognese e de reparao tecidual.
Este trabalho inicial indito foi realizado com o objetivo principal de
avaliar os efeitos da terapia com oznio, por insuflao retal, portanto com o uso
do gs para efeitos sistmicos sobre o processo de reparao tecidual.

16

2 OBJETIVO
O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da terapia biooxidativa com gs oznio, na reparao tecidual de ferida induzida em pele de
ratos.

17

3 METODOLOGIA
O presente estudo foi desenvolvido no laboratrio experimental do
Departamento de Mestrado em Cincias Odontolgicas rea de Periodontia e
Implantodontia do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos
UNIFEB, aps aprovao da Comisso de tica no Uso de Animal (CEUA) da
Faculdade de Odontologia de Araatuba UNESP (02048/2011) Anexo 1.

3.1 Animais
No presente trabalho foram utilizados 24 ratos Wistar machos, pesando
entre 250 e 275g. Os animais foram mantidos em gaiolas plsticas, separados de
acordo com o grupo experimental, contendo cinco ratos em cada caixa, em sala
com temperatura ambiente controlada entre 20-22C, e com umidade relativa entre
50-52%, com ciclos de luz-escuro de 12 horas e, alimentados com rao normal
de origem industrial (Purina Labina) e gua ad libitum.

3.2. Desenho experimental

Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos com 12
animais cada: I Simulao da ozonioterapia (Grupo Controle) e II Tratamento
com ozonioterapia (Grupo Teste). Cada grupo sofreu no dia zero (baseline) do
estudo, uma inciso circular de 1,0cm de dimetro no dorso do animal, por meio
de utilizao do punch metlico cortante. Os animais do grupo II iniciaram o

18

processo de terapia bio-oxidativa com oznio, imediatamente aps a leso da pele.

Para o grupo I foram realizadas simulaes dos procedimentos necessrios
aplicao do oznio. Durante os demais perodos do experimento, nas semanas
subseqentes, foi mantida a terapia bio-oxidativa, sempre realizada 2 vezes por
semana. Seis animais de cada grupo foram sacrificados por meio de eutansia nos
perodos experimentais de 7 e 15 dias. Logo aps a eutansia, foi realizada anlise
macroscpica do tamanho e caractersticas clnicas da ferida. Posteriormente, a
pele dos animais foi removida, as quais foram fixadas em formol tamponado a
4%, para posterior anlise histolgica dos espcimes de cada animal.

3.3. Induo da ferida

Os animais tiveram a rao suspensa por quatro horas antes dos
procedimentos cirrgicos, porm permaneceram com acesso gua ad libitum. Os
procedimentos anestsicos foram realizados em todos os animais da mesma
forma, colocando-os em campnula de plstico fechada com algodo hidrfilo
umedecido com ter etlico, at atingir o nvel de anestesia, com nenhum
movimento da cabea, extremidades ou tronco, desaparecimento dos reflexos
palpebrais e ritmo respiratrio constante. Aps anestesiados, todos submeteram-se
ao mesmo procedimento operatrio que consistiu inicialmente na epilao por
trao manual dos plos do dorso com extenso de 6cm no comprimento e 4cm na
largura, caudalmente a uma linha imaginria que passasse na borda inferior das
orelhas. A seguir foi realizada inciso circular de 1cm de dimetro no centro da

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rea epilada, com um punch metlico cortante, restringindo-se derme e epiderme

(Figura 1).

3.4. Ozonioterapia
A dose de oznio utilizada foi representada pela concentrao de O3
(expressada por mg/L) pelo volume(L) de gs (O2-O3), sendo considerada a
concentrao de 3%. Dessa forma, uma mistura gasosa O2-O3 na concentrao de
50g de oznio, foi obtida de gerador de oznio medicinal Philozon, que produz
oznio apartir de oxignio medicinal, com fluxo constante de 1L/min. A
concentrao do oznio foi medida com preciso por meio de um
espectofotmetro com 254nm.
Imediatamente aps obteno da mistura gasosa, que foi colhida por
intermdio de seringa plstica tipo Luer siliconizada, esta foi administrada por
insuflao retal, por meio de utilizao de catter de Nelaton n 8, o qual foi
inserido 6,0cm no reto do animal, seguindo a metodologia de Fernndez et al
(2008). O protocolo com Ozonioterapia foi constitudo de insuflao retal de
uma mistura gasosa de O2-O3 na concentrao de 50g/mL, totalizando o
volume de 4,0-5,0mL por sesso (Figura 2).

20

Figura 1. Ferida de pele induzida (1cm ou 10mm)

Figura 2. Tcnica de insuflao retal de uma mistura gasosa de O2-O3

21

3.5. Eutansia
Os perodos de eutansia dos animais foram de 7 e 15 dias aps o
baseline, perodos estes em que 6 animais de cada grupo foram eutanasiados por
meio de superdosagem anestsica (Tiopental 150 mg/Kg) (Cristalia, produtos
qumicos Farmacuticos LTDA, Itapira, So Paulo, Brasil).
3.6. Avaliao macroscpica
Aps a morte, os animais foram fixados prancha cirrgica, do mesmo
modo que no ato operatrio, e tiveram as feridas examinadas com auxlio de lupa
com 2,5 vezes de aumento para verificao de crostas, secrees, cicatrizes
hipertrficas e o tamanho da ferida residual no maior eixo, medidas com sonda
periodontal milimetrada (PCPN115BR, Hu-Friedy, Chicago, IL). Nesse tempo, os
achados foram anotados em ficha e foi feito o registro fotogrfico com cmera
digital com zoom de 1,3 de aproximao fixada em trip. A medida do maior
dimetro foi determinada usando uma sonda periodontal milimetrada. Aps este
procedimento, a rea da pesquisa foi retirada com margem de 1cm de pele em
torno da leso. Todos os espcimes foram fixados em soluo de paraformaldedo
a 4% por 48 horas e encaminhados para processamento laboratorial.

3.7. Avaliao histolgica

Todos os espcimes foram fixados em soluo de paraformaldedo a 4%
por 48 horas. Em seguida, os espcimes foram embebidos em parafina. A partir de
ento, o bloco obtido foi cortado com intuito de obter vrios espcimes com 4 m
em espessura. Os cortes histolgicos escolhidos foram da parte central e

22

representativa da leso que foram corados com hematoxilina eosina (H.E.) e

Tricmico de Masson (T.M.); este ltimo usado para colorao especfica de
colgeno. Os espcimes foram destinados para anlise histolgica descritiva por
meio de microscopia de luz convencional e anlise histomtrica.
De cada ferida foram obtidas seis lminas que foram avaliadas quanto
presena de vasos sanguneos na rea de cicatrizao, bem como, re-epitelizao,
proliferao de colgeno, presena de fibroblastos, leuccitos mono e
polimorfonucleares.
A anlise histolgica foi realizada por dois examinados previamente
treinados e calibrados, cegos para os grupos de estudo, em dois momentos
distintos cada. Foi realizada anlise qualitativa e quantitativa segundo os escores
descritos abaixo:
Contrao da Ferida (CO): 0 ausente; 1 incio (1/3 do tamanho
inicial); 2 metade (2/3 do tamanho inicial); 3 completa (3/3 do
tamanho fechamento absoluto), considerando o fechamento da
ferida pelo tecido conjuntivo.
Re-epitelizao (RE): 0 ausente; 1 incio (1/3 do tamanho inicial);
2 metade (2/3 do tamanho inicial); 3 completa (3/3 do tamanho
fechamento absoluto), considerando o fechamento da ferida pelo
tecido epitelial.
Inflamao Aguda (IA): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3
intensa, considerando o tipo celular predominante.

23

Inflamao Crnica (IC): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3

intensa, considerando o tipo celular predominante.
Inflamao Mista (IM): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3
intensa, considerando o tipo celular predominante.
Edema (E): 0 ausente; 1 leve; 2 moderada; 3 intenso,
considerando a presena de lquido eosinoflico entre as clulas.
Hemorragia (H): 0 ausente; 1 pouca; 2 moderada; 3 intensa,
considerando a presena de extravasamento sanguneo no tecido
conjuntivo.
Vasos (V): 0 ausente; 1 pouco; 2 moderado; 3 intenso,
considerando o nmero de vasos.
Membrana fibrino purulenta (MFP): 0 ausente; 1 fina; 2 mdia;
3 larga, considerando a espessura da membrana.
Anexos Cutneos (AC): 0 ausente; 1 pouco; 2 moderado; 3
intenso, considerando o nmero de anexos, na regio superior e
inferior do tecido conjuntivo.

3.8. Avaliao Histomtrica

Esta anlise foi realizada com auxlio do programa Leica Application
Suite 3.8.0 (Leica Microsystems LTD, Heerburg, Alemanha). As medidas foram
realizadas na regio de tecido conjuntivo, considerando a rea de contrao da
ferida. Para determinao desta rea de interesse, inicialmente foi estabelecido um
traado linear estendendo-se do tecido epitelial ao tecido muscular, na direo das

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fibras musculares incisadas, por meio do punch. A partir desta delimitao foi
realizada a mensurao das reas de contrao do tecido conjuntivo em direo ao
centro da ferida. A mensurao das reas de contrao da ferida foi realizada em
triplicata, com intervalo de uma semana de cada avaliao e por dois
examinadores previamente treinados e cegos para o grupo de anlise (Figuras 3 e
4).
Para obteno das imagens panormicas das leses, foram tiradas 4 a 8
fotos da amostra com aumento de 4x, sendo que cada foto apresentava em sua
extremidade, reas coincidentes s imagens contguas. Utilizando um programa
analisador de imagens foi possvel unir as imagens atravs de costura digital,
por intermdio de sobreposio dos pixels coincidentes.

3.9. Anlise Estatstica

A anlise estatstica foi desenvolvida por meio de um programa
especfico (BioEstat 5.0, Sociedade Civil Mamirau / MCT CNPq, Belm,
Brasil), considerando a hiptese nula baseada na ausncia de diferena entre as
modalidades de tratamento ( = 5%). A unidade de anlise foi o animal. A anlise
conjunta dos efeitos do dia (7 e 15) e do grupo (controle e teste) de varivel
numrica (rea cirrgica) foi feita pelo teste de ANOVA, seguida pelo teste
Bonferroni. As variveis da avaliao histolgica dos dados categricos foram
analisadas pelo teste Kruskal-Wallis. O nvel de significncia, utilizado para se
rejeitar a hiptese de nulidade foi de 5% (p<0,05).

25

Figura 3. Delimitao da rea de contrao do tecido conjuntivo das bordas da

ferida, colorao T.M. (Foto panormica 4x)

Figura 4. Mensurao da rea de contrao do tecido conjuntivo, colorao T.M.

(20x)

26

4 RESULTADOS

4.1. Anlise Macroscpica

Desconsiderando a presena de pelos, na anlise do tamanho da ferida
residual, pode-se observar que os animais do grupo controle (I) apresentavam aos
7 dias de reparao, um tamanho mdio de 9 (0,5) mm, enquanto o grupo teste
(II), o tamanho mdio foi de 7 (0,5) mm (Figuras 5 e 6). Analisando a ferida
residual em 15 dias de reparao tecidual, pode-se observar que o grupo controle
(I) apresentava tamanho mdio de 3 (0,5) mm e o grupo teste (II) apresentava
completa reparao tecidual (Figuras 7 e 8).
Nenhum dos grupos apresentou cicatrizes hipertrficas, nem secrees
purulentas, entretanto, no 3. dia, os animais do grupo controle apresentaram
ferida com aspecto cruento enquanto os animais do grupo teste, apresentaram
crostas

cicatriciais

maiores

se

comparadas

aos

do

grupo

controle.

27

Figura 5: Medio da ferida residual no dia 7 do grupo I

Figura 6: Medio da ferida residual no dia 7 do grupo II

Figura 7: Medio da ferida residual no dia 15 do grupo I

Figura 8: Medio da ferida residual no dia 15 do grupo II

28

Figura 9: Corte histolgico da ferida aps 7 dias de reparao tecidual no grupo I

(controle), colorao T.M. (Foto Panormica 4x)

Figura 10: Corte histolgico da ferida aps 15 dias de reparao tecidual no grupo
I (controle), colorao T.M.

Figura 11: Corte histolgico da ferida aps 7 dias de reparao tecidual no grupo
II (teste), colorao T.M.

Figura 12: Corte histolgico da ferida aps 15 dias de reparao tecidual no grupo
II (teste), colorao T.M.

29

Nos animais do grupo I (controle) no 7 dia de reparao da ferida, o

tecido conjuntivo apresentava poucos vasos, pouca hemorragia e edema
intersticial moderado. O processo inflamatrio apresentava carter agudo intenso
na poro mais coronal da leso, com predomnio de neutrfilos, enquanto na
poro inferior, apresentava caracterstica de inflamao mista moderada com
predomnio de macrfagos e linfcitos. A membrana fibrino-purulenta
apresentava-se com espessura larga e contaminada (Figuras 13, 14, 15 e 16).
No 15. dia, o grupo I (controle) apresentava um processo inflamatrio
misto na poro inferior do tecido em grau leve, com predomnio de linfcitos.
(Figuras 17 e 18).
No grupo II (teste) no 7. dia de cicatrizao, o tecido conjuntivo
apresentava vasos em quantidade moderada, pouca hemorragia e edema
intersticial moderado. O processo inflamatrio apresentava carter agudo
moderado na poro mais coronal da leso, com predomnio de neutrfilos,
enquanto na poro inferior, apresentava caracterstica de inflamao mista
moderada com predomnio de macrfagos e linfcitos (Figuras 19, 20 e 21).
No 15. dia, o grupo II (teste) apresentava ausncia de processo
inflamatrio, regenerao muscular completa, intensa formao de folculos
pilosos e tecido conjuntivo denso (Figuras 22, 23 e 24).

30

15

14

Figura 13: Grupo I no 7. dia, interface do corte, membrana fibrino-purulenta espessa,

colorao H.E. (4,0x)

Figura 14: Grupo I no 7. dia, infiltrado inflamatrio intenso, colorao H.E. (20x)

Figura 15: Grupo I no 7. dia, membrana fibrino-purulenta, intenso infiltrado de

neutrfilos, colorao H.E. (40x)

31

Figura 16: Grupo I no 7. dia, processo inflamatrio misto moderado, contendo

macrfagos, linfcitos, vasos e edema, colorao H.E. (40x)

Figura 17: Grupo I no 15. dia, interface do corte, colorao H.E. (3,2x)

Figura 18: Grupo I no 15. dia, re-epitelizao completa, processo inflamatrio misto
leve, colorao H.E. (20x)

32

Figura 19: Grupo II no 7. dia, interface do corte, membrana fibrino-purulenta fina,

colorao H.E. (3,2x)

Figura 20: Grupo II no 7. dia, processo inflamatrio misto moderado, contendo

predomnio de macrfagos e linfcitos, colorao H.E. (20x)

Figura 21: Grupo II no 7. dia, processo inflamatrio misto moderado e novos vasos,
colorao H.E. (40x)

33

Figura 22: Grupo II no 15. dia, interface do corte, re-epitelizao completa, colorao
H.E. (3,2x)

Figura 23: Grupo II no 15. dia, regenerao muscular completa, colorao H.E. (20x)

Figura 25: Grupo II no 15. dia, folculos pilosos formados, tecido conjuntivo denso,
colorao H.E. (40x)

34

Anlise Quantitativa
Conforme os dados da tabela 1, ambos os grupos (I e II) apresentaram
aumento significantemente dos escores de contrao da ferida (p<0,0001) e de reepitelizao (p=0,0001) com o passar do tempo (7 dias versus 15 dias).
No perodo de 7 dias, a hemorragia no Grupo I foi significantemente
maior, que no Grupo II (p=0,01), enquanto, o grupo II apresentou maior escore de
vasos, em comparao com o grupo I (p=0,002).
Com o passar do tempo de reparao tecidual (7 dias versus 15 dias), o
grupo II apresentou aumento significante quanto regenerao muscular
(p=0,0006) e quanto presena de folculos pilosos (p=0,0002).
O grupo I (controle) apresentou reduo significante da inflamao
aguda (p=0,01) e aumento significante da inflamao crnica (p=0,002) ao longo
do perodo experimental (7 dias versus 15 dias). O grupo II apresentou inflamao
significativamente mista no 7 dia que reduziu significantemente ao longo do
perodo experimental (7 dias versus 15 dias) (p=0,01) para total ausncia de
inflamao.
A inflamao aguda no Grupo I foi estatisticamente maior que no
Grupo II ao incio do perodo experimental (aos 7 dias) (p = 0,01). Ao final do
perodo experimental (15 dias), a inflamao crnica foi significantemente maior
no grupo I em comparao com o grupo II (p = 0,01).
Nos perodos iniciais do processo de reparao tecidual (7 dias), o
grupo I apresentou uma tendncia maior em apresentar membrana fibrinopurulenta mais espessa (escore 3), se comparada ao grupo II (Tabela 1).

35

Tabela 1: Frequncia de escores nos grupos experimentais (n=6).

Escore
Diferena
Valor p*
significante
0
1
2
3
a
I
6
7 dias
b
II
1
5
<0,0001
Contrao da ferida
a
I
6
15 dias
b
II
6
c
I
6
7 dias
d
II
3
3
0,0001
Re-epitelizao
c
I
1
5
15 dias
d
II
6
I
2
4
7 dias
II
3
3
ns
Edema
I
3
3
15 dias
II
6
e
I
3
3
7 dias
e
II
3
3
0,01
Hemorragia
I
6
15 dias
II
6
f
I
3
3
7 dias
f
II
1
5
0,002
Vasos
I
5
1
15 dias
II
4
2
I
1
2
3
7 dias
Membrana fibrinoII
3
2
1
ns
purulenta
I
4
2
15 dias
II
6
I
1
4
1
7 dias
Regenerao
g
II
4
2
0,0006
muscular
I
1
5
15 dias
g
II
6
I
7 dias
i
II
0,0002
Folculos pilosos
I
1
4
1
15 dias
i
II
6
j, k
I
3
7 dias
k
II
0,01
Inflamao Aguda
I
15 dias
j
II
l
I
7 dias
II
0,01
Inflamao Crnica
l
I
6
15 dias
II
m
I
7 dias
m, n
II
6
0,01
Inflamao Mista
I
15 dias
n
II
Escore 0 = ausente; Escore 1 = incio / leve; Escore 2 = metade/ moderado; Escore 3 = completo/ intenso/
forte. Letras idnticas representam diferena estatisticamente significante entre grupos (I e II). ns = No
significante. * Teste Kruskal-Wallis (=5%).
Parmetro

Perodo

Grupo

36

4.3. Avaliao Histomtrica

Como no perodo de 15 dias, o fechamento da ferida apresentava-se
completo nos dois grupos (I e II), a mensurao das reas de contrao da ferida
foi realizada somente no perodo de 7 dias de reparo tecidual. Neste contexto,
pode-se observar que os animais do grupo II (teste) apresentavam mdia de rea
de contrao do tecido conjuntivo, estatisticamente maior que o grupo I (controle)
(Tabela 2).

Tabela 2: Mdia da rea de Contrao de Ferida no perodo de 7 dias

rea (m2)

Grupo I

Grupo II

Mdia (DP)

Mdia (DP)

3514,89 (1303,13)

6558,93 (2413,3)*

Valor de p
0,029

* Diferena estatsticamente significante entre grupos, pelo teste ANOVA

(Bonferroni), para p0,05.

37

5 DISCUSSO

A retirada de fragmento de pele induz a formao de soluo de

continuidade que preenchida por fibrina, cogulo e exsudado inflamatrio,
formando a crosta que recobre a ferida (Simes et al., 1985 Simes et al., 1986).
Segundo Nitz et al. (2006), o processo de reparao de leses de pele por
segunda inteno, em casos quando os bordos no esto perfeitamente coaptados e
que a leso se encontra extensa e infectada, com grande destruio tecidual,
inicia-se com a formao do cogulo, seguida de liberao de mediadores prinflamatrios, desenvolvendo reao inflamatria aguda (Kim et al., 2009). No
incio da fase inflamatria do processo de cicatrizao h aumento da
permeabilidade vascular, extravasamento de plasma, hemcias, plaquetas e
leuccitos, destacando-se os neutrfilos, moncitos e macrfagos (Simes et al.,
1986).
No presente estudo apontamos diferenas interessantes em relao ao
curso do processo reparativo. Enquanto que no grupo I (controle), ao 7o. dia, foi
observado resposta inflamatria aguda intensa, tecido de coagulao necrtico e
reas infectadas, no grupo II (teste), o processo inflamatrio encontrado
caracterizou-se por estgio mais avanado (misto), sem infeco. Nossos achados
esto em concordncia com os resultados de Rodrigues et al. (2004), os quais
verificaram que as feridas em dorso de ratos tratadas com leo de girassol
ozonizado, ao stimo dia, apresentavam tecido epitelial de granulao maduro e,
comparado com o controle negativo (leo de girassol sem oznio), que ainda

38

apresentavam reas de coagulao necrticas e infiltrado inflamatrio agudo e

comparado tambm com o controle positivo (associao de clostebol e
neomicina), que ainda possua intensa neovascularizao e processo inflamatrio
ativo, com reas ulceradas. Adicionalmente est em concordncia com os achados
de Valacchi et al. (2011), que constataram diminuio do tempo de cicatrizao ao
utilizar leo de ssamo ozonizado sobre feridas induzidas em ratos ao stimo dia
de avaliao.
O aumento de fibras colgenas at o 7 dia promove diminuio do fluxo
sanguneo, diminuindo consequentemente, os constituintes do tecido de
granulao, fazendo com que este mude sua estrutura, passando a constituir um
tecido conjuntivo tpico. Adicionalmente, neste perodo, os miofibroblastos por
meio de capacidade contrctil, promovem a retrao da ferida, que pode chegar
de 50 a 70% do tamanho inicial (Nitz et al, 2006). Fato este que justifica os
achados macroscpicos e histomtricos do presente estudo. Entretanto, ressaltase que a contrao no grupo II (teste) mostrou-se mais evidente no perodo de 7
dias. Alguns estudos relatam que este fato seja devido a ozonioterapia estimular
a neovascularizao tecidual e consequentemente, induzir a um aumento da
oxigenao dos tecidos e estimular a diferenciao celular e funcional dos
miofibroblastos, auxiliando, assim, a reparao tecidual (Clavo et al., 2003;
Modarresi et al., 2010). Reforando, desta forma, a justificativa para a
ocorrncia de completa regenerao muscular no 15 dia, observada no grupo
tratado com ozonioterapia (teste).

39

Considerando estudos com o uso do oznio, acredita-se que sob

diferentes formas de aplicao, o oznio, tem possibilitado maior aumento da
quantidade de leuccitos polimorfonucleares, maior sntese de protenas
(Gracer, Bocci, 2005), maior liberao de fatores de crescimento para a
construo da matriz extracelular, tais como, fator transformador de crescimento
1 (TGF1) (Bocci et al., 1994) e fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) (Kwon et al., 2006), auxiliando no processo de reparao tecidual de
feridas drmicas (Traina, 2008). Adicionalmente, o estudo de Bocci (2004)
relata que o oznio atua na circulao sangunea, aumentando a concentrao de
clulas vermelhas e as taxas de hemoglobina, melhorando a reologia tecidual,
aumentando a circulao e oxigenao dos tecidos perifricos, aumentando
tambm a diapedese e fagocitose. Tais fatos podem explicar a acelerao do
processo de reparao tecidual observado no grupo II (teste), no perodo de 7
dias, caracterizado por maior contrao da ferida, infiltrado inflamatrio misto e
intensa neovascularizao.
Segundo Valacchi et al. (2011), os possveis mecanismos do leo
ozonizado podem ser sumarizados em: (i) oxidao dos agentes infecciosos; (ii)
citotoxicidade ocasionada pela atuao dos produtos derivados da peroxidao
lipdica (LOPs); e (iii) liberao de fatores de crescimento e consequente
ativao de sistemas imunomoduladores devido o estresse oxidativo, tais como,
NFKappa-B.
A justificativa para acesso via insuflao retal indicada por ser uma
tcnica incua, sem qualquer efeito colateral ou dano ao animal ou ser humano,

40

comprovada pelos estudos de Bocci (1996); Lon et al. (1998); Batista et al.
(2001); Eliakim et al. (2001); Calunga et al. (2005) e Fernndez et al. (2008).
Segundo Bocci (1996) apesar da via retal para aplicao da mistrura de gs oznio
ser emprica, considerada uma tcnica fcil, prtica, atxica e apresentando
atuao no fgado via circulao porta. Lon et al. (1998), relataram qua a
administrao da mistura de gs composto por oznio por via retal induz a
tolerncia tecidual e do fgado, aos radicais livres liberados. Adicionalmente,
Fernndez et al. (2008), relataram que doses de gs oznio por meio da tcnica de
insuflao retal, promove um pr-condicionamento oxidativo rpido e transitrio,
capaz de desenvolver um efeito protetor no fgado, preservando a funo
mitocondrial das clulas, controlando a liberao de mediadores inflamatrios,
impedindo danos celulares e teciduais maiores.
Observou-se que o gs oznio, aplicado por insuflao retal em ratos,
dentro do protocolo utilizado neste estudo, demonstrou ter propriedades
imunomoduladoras, alterando a resposta inflamatria, bem como propriedades
reparadoras e regenerativas, pois foi constatada maior contrao da ferida ao
stimo dia de avaliao, sugerindo diminuio no tempo de reparo da leso de
pele e maior qualidade tecidual com tecido conjuntivo denso e maduro, ao 15
dia, juntamente com completa regenerao do tecido muscular lesionado do grupo
teste.
Dessa forma, a realizao de um estudo bem delineado e de qualidade que
avaliasse a utilizao do oznio como nica interveno no tratamento de feridas,
sem a adio de vis, era imprescindvel para comprovar a hiptese de que a

41

terapia bio-oxidativa com gs oznio oferece benefcios adicionais processos

reparativos em tecido. Sugerindo indicao da aplicao clnica desta terapia
como opo de tratamento a pacientes com problemas de imunidade, coagulao,
reparo e cicatrizao, ocasionando resultados satisfatrios em menor tempo e
menos gastos com medicaes e hospitalizaes.

42

6 CONCLUSO
Dentro do atual desenho Experimental a terapia bio-oxidativa com gs
oznio mostrou possuir:
Efeito imuno-modulador, pois alterou os padres celulares da resposta
inflamatria;
Efeito reparador, pois acelerou o processo de reparao;
Efeito angiognico, pois aumentou o nmero de novos vasos formados;
Efeito proliferativo, pois aumentou a expresso de anexos cutneos;
Efeito regenerador, pois regenerou o tecido muscular lesionado;

Dessa forma, concluiu-se que a terapia bio-oxidativa com gs oznio

apresentou efeito bio-estimulador, aumentando a reparao e regenerao tecidual
em pele de ratos.

43

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49

8 ANEXOS

50

ANEXO 1. Comisso de tica no Uso de Animal (CEUA)

51

ANEXO 2. Artigo de Reviso da Literatura aceito para publicao na

Revista Cincia e Cultura.
Publicao prevista para maio de 2012.

52

Modulao do estresse oxidativo com ozonioterapia e suas implicaes em

periodontopatias
Modulation of oxidative stress with ozone-therapy and its implications in
periodontal disease
Ozonioterapia em periodontopatias
rea de Conhecimento: Cincias da Sade Odontologia
Alexandre Melo KARAM1; Teresinha Costa de SANTANA2; Elizangela Partata
ZUZA3; Juliana Rico PIRES3*.
1. Aluno do Curso de Ps-Graduao, nvel Mestrado, em Cincias Odontolgicas
do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos - UNIFEB,
Barretos, SP
2. Professora Doutora Assistente do curso de graduao em odontologia da
Universidade Estadual de Feira de Santana UEFS, Coordenadora do curso de
especializao em periodontia do Centro Baiano de estudos OdontolgicosCEBEO, Salvador, BA.
3. Professora Doutora Assistente do Programa de Ps-Graduao em Cincias
Odontolgicas do Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos UNIFEB, Barretos, SP

* Correspondncia para:
Prof. Dr. Juliana Rico Pires
Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos UNIFEB. Programa
Mestrado em Cincias Odontolgicas.
Avenida Professor Roberto Frade Monte, 389. CEP: 14080-530. Aeroporto,
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RESUMO
A doena periodontal, por seu carter intrnseco, uma enfermidade que produz
estresse oxidativo crnico. capaz de influenciar o status oxidativo do plasma e
sofrer interferncias do mesmo conforme o status oxidativo geral do organismo e
sua capacidade antioxidante. A ozonioterapia uma terapia bio-oxidativa, como a
oxigenao hiperbrica, que utiliza o oznio medicinal como princpio ativo,
capaz de promover aumento dos nveis de enzimas antioxidantes como as
glutationas, superxido dismutase e catalase. Estudos comprovam o efeito
preventivo de danos celulares mediados por radicais livres de oxignio quando do
advento do precondicionamento oxidativo com ozonioterapia. Procurou-se neste
trabalho avaliar, atravs de uma reviso de literatura, os possveis benefcios da
ozonioterapia aos portadores de doena periodontal. Concluiu-se que h
plausibilidade nas conjecturas dos efeitos benficos da ozonioterapia em
periodontia e que mais estudos so necessrios.
Palavras-chave: Oznio; Estresse oxidativo; Periodontia.
ABSTRACT
Periodontal disease, for its intrinsic character, is an enfermity that produces
chronic oxidative stress. It is capable to influence the oxidative status of the
plasma and undergo interferences from it, according to the general oxidative
status of the organism and its antioxidant capacity. The ozone-therapy is a biooxidative therapy, such as hyperbaric oxigenation, which uses medicinal ozone as
active principle, capable of promoting the increase of the antioxidant enzimes'
levels, such as glutathiones, dismutase superoxide and catalase. Studies prove the
preventive effect of cellular damage mediated by free oxygen radicals when there
is an oxidative pre-conditioning with ozone-therapy. In this work, we sought to
evaluate the possible benefits of ozone-therapy to carriers of periodontal disease,
through the review of the literature. The conclusion was that the conjectures
regarding the beneficial effects of ozone-therapy in periodontal treatment are
plausible, however further studies are necessary.
Key-words: Ozone; Oxidative Stress; Periodontology.
INTRODUO
Estresse oxidativo definido como um desequilbrio na relao entre oxidantes e
antioxidantes, em favor dos pr-oxidantes como o nion superxido, o radical
hidroxil, o perxido de hidrognio, em detrimento das enzimas antioxidantes
(BARREIROS e DAVID, 2006). As doenas periodontais tm sido implicadas no
desenvolvimento de estresse oxidativo crnico. Vrios estudos (CANAKCI et
al.,2007; SAWAMOTO et al.2005; AKALIN et al., 2007; PRADEEP et al., 2007;
MOTOHIRA et al., 2007; TAMAKI et al., 2009; HAIXIANG et al., 2009)

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apontam a presena de malonildialdedo e outros produtos de peroxidao

lipdica, bem como produtos derivados de hidroxilao de bases de DNA em
bolsas periodontais e fluido crevicular como consequncia de dano celular por
radicais livres e estresse oxidativo crnico.
O precondicionamento oxidativo com oznio vem sendo estudado e os
seus efeitos benficos conseguem prevenir os danos celulares causados por
radicais ativos de oxignio atravs da promoo de aumentos dos nveis de
antioxidantes intracelulares como as glutationas, catalase (CAT), peroxidases,
superxido dismutase (SOD) (HAIXIANG et al., 2009; LEN et al., 1998;
FORMAN et al., 1998; AJAMIEH et al, 2004; BOCCI, 2004).
Diante destes fatos, o objetivo deste estudo avaliar em uma reviso de
literatura os possveis efeitos benficos do precondicionamento oxidativo com
ozonioterapia sobre o curso da doena periodontal.
REVISO DE LITERATURA
Estresse oxidativo do plasma e em periodontopatias
A doena periodontal uma enfermidade que gera estresse oxidativo
crnico, podendo influenciar e ser influenciada pelo status oxidativo geral do
plasma. O achado de 8-Hidroxi-2-deoxiguanosina (8-OHdG) nos fluidos
corporais, especialmente em periodontite, no fluido crevicular, resultado de
danos ao DNA, pelo estresse oxidativo que causa hidroxilao de bases de DNA
(BARREIROS e DAVID, 2006; SAWAMOTO et al., 2005). Foi encontrada
estreita relao entre 8-OHdG e agentes patgenos periodontais, ratificando o
estresse oxidativo crnico existente em periodontopatias (SAWAMOTO et
al.2005).
Os nveis de malonildialdedo (MDA) e, portanto, de produtos de
peroxidao lipdica, esto aumentados localmente no ambiente da bolsa
periodontal em periodontites crnicas. O status oxidativo total, tanto sistmico
quanto local, tambm est aumentado. Seus achados sugerem que aumentos dos
produtos de peroxidao lipdica e do status oxidativo total do soro podem ter
um importante papel na patologia da periodontite e estar estreitamente
relacionados com o status clnico periodontal (AKALIN et al., 2007).
Estudos mostram estreita relao entre a presena de neopterina no
fluido crevicular gengival e periodontopatias. Seu aumento est relacionado com
a progresso da doena periodontal, havendo sua diminuio quando do
tratamento periodontal convencional por raspagem e alisamento radicular.
Relatam tambm estreita relao da neopterina com situao de estresse
oxidativo, por ser um fator ativador de moncito/macrfago, relacionados com a
produo de espcies reativas de oxignio e nitrognio que, em sinergia,
amplificam potenciais citotxicos diretamente contra periodontopatgenos e,
indiretamente, favorecendo destruio periodontal (PRADEEP et al., 2007).
Antioxidantes locais e sistmicos, bem como a total capacidade
antioxidante do organismo so afetadas pela doena periodontal, ainda mais em

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adio condio de pr-eclmpsia. Estes achados poderiam limitar a

ozonioterapia em gestantes (CANAKCI et al.,2007).
FORMAN et al. (1998), num estudo controlado, avaliaram os efeitos de
hipxia e reperfuso em crebros de ratos. Relataram que em isquemia e
reperfuso h um aumento dos nveis de ROS nos hemisfrios cerebrais e que a
produo de peroxinitrito dependente da disponibilidade de xido ntrico
(NO).
MOTOHIRA et al. (2007), relacionam hipxia e reoxigenao com
trauma oclusal, tabagismo e periodontite, concluindo que em periodontopatias
h hipxia tecidual favorecendo produo de fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF), IL-6 e IL-1, reconhecidos como fatores de reabsoro ssea
alveolar. Quando acontece reoxigenao logo aps eventos de hipoxia, levaria a
um aumento dos nveis de nion superxido e outras espcies ativas de oxignio,
que por sua vez induzem a degradao do inibidor de NF-kB e sua ativao, que
resultaria em concentraes desses mediadores a nveis mais elevados que em
situao de hipoxia, acarretando em leso por reperfuso. Portanto a doena
periodontal associada a outras condicionais como tabagismo e trauma oclusal,
levam o tecido periodontal a eventos constantes de hipxia e reoxigenao,
situao que hipoteticamente aumentaria a morbidade da patologia periodontal,
em vista da gerao de mediadores pr-inflamatrios e estimuladores de
reabsoro ssea alveolar, tais como a IL1-, IL6 e VEGF. Verifica-se, pois, que
h uma produo muito mais acentuada destes mediadores em situao de
reoxigenao que nos momentos de hipxia. Isto ocorre, provavelmente, devido
ao aumento de radicais livres de oxignio em excesso produzidos pela
reperfuso e pelo despreparo tecidual quanto ao teor de enzimas anti-oxidantes
suficientes para combater o estresse oxidativo gerado.
TAMAKI et al. (2008), alegam uma relao positiva entre condio
periodontal e o status oxidativo do plasma, podendo este afetar a taxa de
progresso da doena periodontal. TAMAKI et al. (2009) concluram que, em
pacientes com periodontite crnica, os nveis de metablitos reativos de
oxignio esto elevados, em comparao com indivduos sem periodontite e que
o tratamento periodontal convencional no-cirrgico consegue, alm de
melhorar os parmetros clnicos periodontais, reduzir os nveis de espcies
reativas de oxignio (ROS) no plasma.
HAIXIANG et al. (2009) relatam que h um aumento da capacidade
total antioxidante da saliva em doentes com periodontopatias, podendo
significar uma resposta adaptativa do organismo ao extresse oxidativo gerado
pelas ROS produzidas nas periodontites, principalmente nas periodontites
agressivas.
Modulao do estresse oxidativo com ozonioterapia
LEN et al. (1998), num estudo controlado randomizado com ratos,
constataram que a administrao prvia controlada de oznio via retal consegue
promover um precondicionamento oxidativo, prevenindo danos hepatocelulares
mediados por radicais livres. ALVES et al. (2004), em trabalho experimental

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com eqinos, relatam atenuao nas leses de reperfuso do jejuno em animais

submetidos obstruo vascular quando tratados pela ozonioterapia.
AJAMIEH et al. (2004), num estudo experimental controlado com ratos,
avaliaram o efeito do precondicionamento oxidativo com oznio sobre a gerao
de xido ntrico e o balano de oxireduo celular. Foram mensuradas como
parmetros as transaminases plasmticas (aspartato aminotransferase e alanina
aminotransferase), como indicadoras de danos hepatocelulares; nitritos e
nitratos, como indicadores da produo de xido ntrico; nveis de superxido
dismutase, catalase e glutationa, como marcadores do sistema antioxidante
endgeno; malonildialdedo, 4-hidroxialcenos e hidroperxidos totais, como
indicadores de estresse oxidativo. Os resultados mostraram que o
precondicionamento oxidativo com oznio protege o fgado contra a injria
promovida pela isquemia e reperfuso atravs de mecanismos que promovem a
regulao das concentraes de xido ntrico endgeno e a manuteno do
equilbrio de oxireduo celular.
BOCCI (2004), em experimento para avaliar a exposio de clulas
mononucleares isoladas do sangue perifrico a concentraes de oznio na
mistura gasosa de oxignio-oznio de 1,0 a 80g/ml (variao de 0,02mM a
1,68mM), relata que o status antioxidante total (TAS) do organismo humano,
que varia normalmente de 1.3-1.8mM, diminui no mais que 20% nos primeiros
5 minutos e retorna a valores originais dentro de 30 minutos. Salienta tambm
que baixas concentraes de oznio estimulam a produo de IFN- e TNF-;
concentraes superiores a 40g/ml, por outro lado, inibem a produo de
citocinas.
MAJED et al. (2007), em estudo controlado sobre choque sptico
quimicamente induzido atravs de inoculao de LPS de Eschecrichia coli em
ratos, analisou as alteraes enzimticas que ocorrem em mitocndrias e
lisossomos sobre lactato desidrogenase (LDH), succinato desidrogenase (SDH),
adenosina trifosfatase (ATPase), fosfatase cida (AcPase) e -glucuronidase
(BG) na intimidade tecidual do fgado, rins, pulmo e corao. Alguns animais
receberam aplicao intraperitonial prvia da mistura gasosa de O2-O3. Os
resultados demonstraram que a LPS suprimiu a atividade de todas as enzimas,
excetuando LDH que aumentou quatro vezes sua atividade. A infuso
intraperitonial de O2-O3 causou pelo menos uma normalizao parcial das
reaes enzimticas.
FERNNDEZ et al. (2008), avaliaram o efeito do precondicionamento
oxidativo com oznio sobre danos ao fgado de ratos, em processos de isquemia e
reperfuso, atravs da utilizao de um agonista e antagonista do receptor de
adenosina subtipo A1, CCPA (2-cloro N6 ciclopentiladenosina) e DPCPX (8ciclopentil-1,3-dipropilxantina), respectivamente. Avaliaram a gerao de xido
ntrico, a atividade de adenisina deaminase e a preservao do balano de
oxireduo celular. Estabeleceram anlise imunohistoqumica do NF-B, TNF-,
protena de choque trmico 70 (HSP-70). Obtiveram como resultados que o
CCPA mostrou um efeito similar ao precondicionamento oxidativo com oznio e
o DPCPX bloqueou o efeito protetor do mesmo. Constataram tambm que o

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precondicionamento oxidativo com oznio reduziu bastante a expresso do p65,

diminuiu a produo de TNF- e promoveu uma reduo na imunoreatividade de
HSP-70.
DISCUSSO
Uma vez que, atravs de pr-condicionamento oxidativo do plasma com
oznio, consegue-se minimizar os danos provocados por radicais livres de
oxignio em injrias hepticas em eventos de hipxia e reperfuso (LEN et al.,
1998; ALVES et al., 2004; FERNNDEZ et al., 2008 ) e h evidncias que o
status oxidativo do plasma e o status oxidativo da doena periodontal so
mutuamente influenciados um pelo outro (PRADEEP et al., 2007; TAMAKI et
al., 2008 ), levando-se tambm em considerao que o prprio organismo humano
j busca uma regulao positiva da capacidade antioxidante da saliva frente s
injrias das periodontopatias (HAIXIANG et al., 2009), bastante plausvel
conjecturar que a modulao do status oxidativo do plasma e da sua capacidade
antioxidante, atravs do pr-condicionamento oxidativo com oznio, possa
exercer algum efeito sobre a progresso da doena periodontal.
CONCLUSO
O pr-condicionamento oxidativo com oznio, pode exercer efeito sobre a
progresso da doena periodontal, uma vez que esta progresso se d, em parte, s
custas da ao de mediadores inflamatrios gerados a partir da produo de
radicais livres reativos de oxignio. Por meio de modulao do status oxidativo do
plasma e da sua capacidade antioxidante atravs de estmulos repetitivos e
controlados, pr-oxidantes com a ozonioterapia, em que se alcanam nveis
melhorados do sistema antioxidante enzimtico intracelular, bastante plausvel
que esta vertente seja bastante til em situaes de periodontite, onde os fatores
imunolgicos do enfermo tm grande influncia sobre a progresso da doena.
A literatura atual ainda bastante carente de pesquisas que utilizem ensais
clnicos e laboratoriais controlados, necessitando que mais estudos sobre o tema
sejam desenvolvidos.
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