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COMUNICAO CIENTFICA

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DETERMINAO POR CROMATOGRAFIA GASOSA DE ACARES EM FRUTFERAS


DE CLIMA TEMPERADO1
ALEXANDRE COUTO RODRIGUES2 , FLVIO GILBERTO HERTER3 , VALTAIR VERSSIMO4 ,
GERALDO CHAVARRIA5 , JOO PETERSON PEREIRA GARDIN6 , NGELA DINIZ CAMPOS7
RESUMO - As frutferas de clima temperado apresentam o fenmeno da dormncia. Na sada da dormncia, h a converso do amido para acares
solveis, como substrato para a retomada de crescimento na primavera. Visando maior compreenso da fisiologia das plantas em respostas a
eventos, como as variaes climticas, estresses e problemas de adaptao, desenvolveu-se este trabalho, no Laboratrio de Fisiologia Vegetal da
Embrapa Clima Temperado, com o objetivo de descrever uma metodologia para a determinao das concentraes dos acares solveis (frutose,
sorbitol, -glicose, -glicose e sacarose), em tecidos vegetais de frutferas, via cromatografia gasosa. O cromatgrafo utilizado para as anlises dos
acares por essa metodologia o GAS CHROMATOGRAPH e a coluna do tipo Packed Column J. K. de 3,2mm de dimetro por 2m de comprimento,
empacotada com Silicone SE-52 Uniport HP 80/100 mesh. Atravs da cromatografia gasosa, obtm-se eficincia e resoluo cromatogrfica, para
anlises de acares solveis, sendo, desta forma, vantajoso e executvel esse tipo de anlise pelo mtodo descrito.
Termos para indexao: carboidratos, pomceas, metabolismo.

GAS CHROMATOGRAPHY DETERMINATION OF SUGARS IN TEMPERATE-ZONE FRUIT TREES


ABSTRACT - The temperate-zone deciduous fruit trees present the phenomenon of dormancy. In that period, there is the conversion of the starch in
soluble sugars, as substratum for the resumption of growth in the spring. Seeking to better understanding the physiology of the plants in answers to
events as the climatic variations, stresses and adaptation problems, this study was done in the Laboratory of Crop Physiology of Embrapa Temperate
Climate, with the objective of describing a methodology for determination of concentrations of the soluble sugars (fructose, sorbitol, -glucose, glucose and sucrose), in tissues of fruit tree, through gaseous chromatography. The chromatograph used for the analyses of the sugars was the GAS
CHROMATOGRAPH with the column of the type Packed Column J. K. of 3,2mm of diameter for 2m of length packed with Silicon IF-52 Uniport HP 80/100
mesh. Through the gaseous chromatography it is obtained efficiency and chromatographic resolution to soluble sugars determination, being this way,
advantageous to use this methodology.
Index terms: carbohydrates, pomefruits and metabolism.
A mobilizao dos acares solveis, ligada a eventos climticos,
como a temperatura, tem grande importncia nos estudos de adaptao de
frutferas de clima temperado. No Brasil, est sendo utilizada a determinao
de acares em frutferas para estudar os problemas advindos da falta de
frio hibernal (Herter et al., 2001). Devido importncia da determinao
desses acares, algumas metodologias tm sido estudadas, dentre as
quais, as fundamentadas nas tcnicas cromatogrficas.
Tais tcnicas de separao permitem determinar a composio
de misturas complexas de diversas substncias qumicas, com grande
eficincia e reprodutividade. Pode ser conceituada como um mtodo fsicoqumico de separao, no qual os constituintes da amostra so separados
por partio em duas fases, uma mvel e outra estacionria. Na
cromatografia gasosa, a fase mvel um gs quimicamente inerte em
relao fase estacionria e aos componentes da mistura a ser analisada.
Esta tcnica possibilita a anlise de inmeros compostos, dentre os quais,
os carboidratos.
Outros mtodos so usados para a determinao de acares
no-redutores, pela diferena entre os acares redutores (conforme
metodologia de Nelson, 1944, e Somogy, 1952) e os acares solveis
totais, determinados pela reao com antrona (Hodge & Hodfreiter, 1962),
embora os resultados sejam menos precisos do que os obtidos por
cromatografia.
Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de descrever uma
metodologia para determinao de acares solveis em tecidos vegetais,
especialmente de frutferas de clima temperado, via cromatografia gasosa.
A partir de 2000, iniciou-se a anlise de carboidratos em tecido
vegetal de pomceas, por cromatografia a gs, no Laboratrio de Fisiologia
Vegetal da Embrapa, em Pelotas-RS. Isto foi possvel graas vinda ao
Brasil do perito japons, Professor Hiroshi Gemma (Institute of Agriculture
And Forestry, Tsukuba-Japo), dentro do Projeto JICA, bem como a
treinamentos de curta durao, realizados no Japo por pesquisadores da

Embrapa Clima Temperado. As anlises das concentraes em mg g-1MS,


dos acares solveis (frutose, glicose, sacarose e sorbitol), foram
padronizadas para as condies brasileiras com base neste treinamento e
nas metodologias adotadas por Rakngan (1995) e Kobashi et al. (2000).
O cromatgrafo a gs utilizado foi um Shimadzu GC-14B, com
coluna (Packed Column J. K.) de 3,2mm de dimetro por 2m de comprimento,
empacotada com silicone (SE-52 Uniport HP 80/100 mesh) e com detector
de ionizao de chama. A temperatura do injetor foi de 200C e velocidade
do gs de arraste (nitrognio) de 5mm/min. A temperatura inicial foi de
160C, subindo a 250C nos primeiros 18 minutos, finalizando aos 32
minutos.
Os padres utilizados e respectivos tempo de reteno foram:
padro interno de pentaerythritol 548, frutose 1095, -glicose 1249,
sorbitol 1350, -glicose 1411 e sacarose 2994.
O material vegetal utilizado para a determinao de acares
solveis foram gemas florais de pomceas. Na preparao das amostras,
as gemas foram coletadas, rapidamente congeladas em N lquido,
armazenadas em ultrafreezer, posteriormente liofilizadas e modas.
Para a extrao dos acares, subamostras de 500 a 1.000 mg de
tecido foram incubadas a 80-85 C, por 5 min, com 5mL de etanol a 80%,
centrifugadas por 10min a 6.000 rpm e separadas do sobrenadante. O
precipitado foi novamente centrifugado com 10ml de etanol 80%. A partir
da mistura dos dois sobrenadantes, foram determinados os acares
solveis. O precipitado foi armazenado para anlises de amido.
Posteriormente, foi evaporado o sobrenadante a 45C, em
rotavapor R-114, at no conter mais lcool. Aps, transferido para um
bquer e completado com aproximadamente 20ml de gua deionizada.
Esses volumes foram primeiramente filtrados em colunas
contendo a resina IR 120 (catinica H+) para eliminar aminocidos e, a
seguir, em resina IR 400 (aninica OH-) para eliminar cidos orgnicos.
No processo de filtragem por resinas, as amostras foram recebidas

(Trabalho 126/2004). Recebido:07/10/2004. Aceito para publicao: 08/04/2005.


Eng.Agr Dr. Pesquisador RD/CNPq Embrapa Clima Temperado, Br 392, Km 78, Cx. Postal 403, 96001-970, Pelotas-RS, Correio eletrnico: rcale@ufpel.edu.br
3
Eng.Agr Dr. Pesquisador Embrapa Clima Temperado, Br 392, Km 78, Cx. Postal 403, 96001-970, Pelotas-RS, Correio eletrnico: herter@cpact.embrapa.br
4
Eng.Agr MSc. Doutorando UFPEL/ FAEM, Dpto. Fitotecnia, Cx. Postal 354, CEP 96001-015, Pelotas-RS
5
Eng.Agr Mestrando em Fruticultura, UFPel/FAEM Pelotas-RS Correio eletrnico: geraldochavarria@hotmail.com
6
Eng.Agr MSc. Doutorando Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG.
7
Eng.Agr Dra. Pesquisadora Embrapa Clima Temperado, Br 392, Km 78, Cx. Postal 403, 96001-970, Pelotas-RS, Correio eletrnico: angela@cpact.embrapa.br
2

Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 27, n. 1, p. 173-174, Abril 2005

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DETERMINAO POR CROMATOGRAFIA GASOSA DE ACARES EM FRUTFERAS DE CLIMA TEMPERADO

em balo volumtrico at completar o volume de 50ml, com gua deionizada,


adicionada superiormente coluna. Nos 50ml eludos de cada coluna,
foram adicionados 5ml de ZnSO4 0,5N (5%) e 5ml de Ba(OH)2 0,33N (5%),
para a precipitao e remoo das protenas por decantao, e posterior
filtrao com papel filtro qualitativo.
Do filtrado, 20mL foram transferidos para um cadinho de porcelana
e mantidos a 240-270C, at secar. Uma pequena quantidade foi passada
para vidros de injeo, com adio de 1ml de pentaerythritol (1mg/ml,
acar-padro interno), e novamente submetido ao aquecimento (200C),
at a completa secagem, tendo-se o cuidado de no promover a queima
dos acares. As amostras foram transferidas para um dessecador at
serem utilizadas.
Na preparao para a injeo, as amostras foram submetidas ao
aquecimento em chapa quente (200C), em capela, com 1ml de pyridine,
para solubilizao, 200l de hexamethyldisilazane (HMDS) e 100l de
trimethylchlorosilane (TMCS), para a metilao. Aps comear a emisso
de bolhas, foram deixadas por aproximadamente 1 min, para a formao de
um precipitado branco. Aps resfriamento e decantao por 30 min, 2l da
amostra foi injetado no aparelho.
A concentrao de cada acar (Fig.1) foi determinada por
comparao rea correspondente ao acar-padro interno
(pentaerythritol), registrada pelo integrador. As concentraes foram
ajustadas ao peso e ao volume de diluio de cada amostra, de acordo com
a seguinte frmula: [Ca]=(2,5[Cc] / M)1.000, onde [Ca] a concentrao do
acar em mg.g-1 MS, 2,5 o fator de diluio usado no preparo da amostra,

[Cc] a concentrao do acar calculada pelo cromatgrafo, em mg, M a


massa da mostra em mg e 1.000, o fator de correo.
Os resultados de acares solveis, em gemas florais de
pomceas, so apresentados no cromatograma (Fig.1), onde esto
registrados o nmero da amostra, o tempo de reteno de cada acar, a
rea e altura correspondentes ao pico de cada composto e a concentrao
do acar que foi utilizada na frmula, para fins de clculos.
De acordo com Ciola (1998), a cromatografia a gs tem enorme
potencialidade devido sua eficincia, facilidade, baixo custo e
possibilidade de analisar misturas volteis de alta complexidade, como:
acares, gorduras, leos essenciais, inseticidas residuais, etc.
Anlises de acares solveis tambm podem ser realizadas
atravs da cromatografia lquida de alta performance (HPLC), obtendo-se
alta preciso, porm especialistas da rea de anlise instrumental sabem
que os custos das anlises e do equipamento de cromatografia lquida so
mais elevados em comparao cromatografia gasosa. Portanto, a
cromatografia gasosa, neste tipo de anlise em tecido de frutferas, a
mais indicada.
A metodologia descrita, atravs da cromatografia gasosa,
mostrou-se adequada para anlises de acares solveis em tecidos de
frutferas, sendo tcnica e economicamente vivel.
Conclui-se que, atravs da cromatografia gasosa, obtm-se
eficincia e resoluo cromatogrfica, para anlises de acares solveis,
sendo, desta forma, vantajoso e executvel esse tipo de anlise pelo mtodo
descrito.

FIGURA 1 - Cromatograma de anlise de acares solveis por cromatografia gasosa, em gemas florais de pomcea. Embrapa Clima Temperado.
Pelotas-RS, 2004.
REFERNCIAS
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