Técnicas rapidas de laboratorio para el diagnéstico de infecciones viricas Informe de un Grupo ifico de la OMS Organizacion Mundial de a Salud Serie de Informes Técnicos 661 @ Organizacién Mundial de la Salud. Ginebra, 1981ISBN 92.4 320661 3 © Organizacién Mundial de la Salud 1980 Las publicaciones de la Organizacion Mundial de la Salud estan acogidas ala proteccién prevista por las disposiciones sobre reproduccién de origina- les del Protocolo 2 de la Convencién Universal sobre Derecho de Autor. Las entidades interesadas en reproducir o traducir en todo o en parte alguna publicacion de la OMS debersin solicitar la oportuna autorizacion de la Ofi- tina de Publicaciones, Organizacion Mundial de la Salud, Ginebra, Suiza. La Organizacién Mundial de la Salud dard a esas solicitudes consideracion muy favorable, Las denominaciones empleadas en esta publicacién y Ia forma en que aparecen presentadas los datos que contiene no implican, de parte de la Secretaria de la Organizacién Mundial de la Salud, juicio alguno sobre la condicisn juridica de paises, territorios. ciudades o Zonas, o de sus autori- dades, ni respecto del trazado de sus fronteras.o limites La mencidn de determinadas sociedades mercantiles © de nombres co- imerciales de ciertos productos no implica que la Organizacién Mundial de la Salud los apruebe o recomiende con preferencia a otros andlogos. Salvo error u omisién, las marcas registradas de articulos 0 productos de esta na- turaleza se distinguen en las publicaciones de la OMS por tna letra inicial mayéscula.INDICE, Pagina 1. Introduecisn ao : 5 2, Inventario y caracteristicns técnicas de las tésnicas ripidas 6 Dil. Técnica de anticuerpos flicescentes (TAF) =... 6 22 Pracbs de inmunoabsorbenca Tigada & fa enaima (ELISA) vo... 10 23. Prueba radioinmunolggica de fase sOlida (SPRIA) wsvecsssesse- UL 2.4. Microseopia electronica : a 2:5, Heemaglutinacion inversa pasiva (RPHA) ann on 216. Hemoliss radial simple (SRH) “ 2.7 Prt inmunolgca en capa dead iy oe 28. Otras prucbas E 16 3. Aplieacion al diagnostico : cr 16 3.1. Enfermedades respiratoriss 16 3.2. Enfermedades diarreicas 2 » 33. Hepatitis virica : 20 3i4. Finfermedades de tansmisign sexual vs... 2 435. Enfermedades del sistema nervioso central 23 3.6. Enfermedades de Ia piel y de los ojos : ae 3.7. Enfermedades arboviFcas y virosis afines EI a 38. Deteccion de IgM especitica : 30 4. Reactivos: patrones ¢ inspeccién de la calidad ...... 31 4.1. Inspecciin de Ta calidad de los reactivos . : 2 42. Reactivos de referencia . 3 43. Normalizacion de téenicas 2 44. Conjuntos de muestras ‘ 32 45. Inspeccidn adicional de la calidad 3 5, Técnicas répidas de laboratorio para el diagnéstco de infeciones vircas un programa de la OMS oe 3 6. Tendencias fuuras 2 coe 7. Recomendaciones... 5 3s TAL. Recomendaciones penerales ca 36 7.2. Recomendaciones espesificas . 37 Referencias a Anexo 1, Inmunofluorescencia... “8 Anexo 2. Mieroscopia electsnica 5 Anexo 3, Hemaglutinacin inversa pasiva coceseteentsees 59 [Anexo 4. Inmunoensayo en capa delgads . o Anexo 5, Radioinmunoensayo de fase s6lida - ce 8 [Anexo 6, Apregacion en fase solida de eritrocitos recubiertos (SPACE) . 61 Anexo 7, ‘Téenicas de Ja cadena anti we 6GRUPO CIENTIFICO DE LA OMS SOBRE TECNICAS RAPIDAS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCIONES VIRICAS Ginebra, 29 de septiembre - 3 de octubre de 1980 Miembros* Dr. M. A. Chemesky, Director and Associate Professor of Pediatrics and Patho- logy. MeMaster University Regional Virology Laboratory, Hamilton, Ontario, ‘Canada. Dr. M. Grandien, Profesor Asoviado de Virologia, Departamento de Virotosi, Laboratorio Bacteriolégico Nacional, Fstocolmo, Suecia Dr. Imam Zaghlovl Imam, Presidente, Organizacion Egipcia de Productos Biol6- sicos y Vacunas, Agoura, Cairo, Egipto. Dr. Lam Sai Kit, Profesor Asociado. Departamento de Microbiologia Médica, Universidad de Malaya, Kuala Lumpur, Malasia (Relator) Dr. Daw Mi Mi Khin, Jefe, Division de Investigaciones Vicologicas, Departa- ‘mento de Investigaciones Médicas, Ministerio de Sanidad, Rangin, Birmania, Dr. J. E. Maynard, Director, Hepatitis Laboratories Division, Bureau of Labora- tories, Center for Disease Control, Phoenix, AZ, EUA. Dr. L. Muyembe Tamfum, Departamento de Microbiologia, Facultad de Medi- sina, Universidad Nacional de Zaire, Kinshasa, Zaire Dr. Zhang Quan-yi, Instituto de Sueros y Vacunas, Changchun, China. Secretaria Dr. J. D, Almeida, Virology Research Development, The Weileome Research La- oratories, Beckenham, Inglaterra (Asesor temporer} Dr. P. Brés, Médico Jefe, Virosis, OMS, Ginebra, Suiza Dr. 8. Ya. Gaidamovich, Departamento de Arbovieus, Instituto Ivanovsky de Vie rologis, Moscd, URSS (Asesor temporero) De. P. 8. Gardner, Director, Division of Microbiological Reagents and Quality Control, Central Public Health Laboratory, Londres, Inglaterra (Asesor tem porero, Presidente) Dr. R. Najera Marrondo, Virosis, OMS, Ginebra, Suiza (Secretar. Dr. 0, Sobéslavsky, Director General. Instituto de Sueras y Vacunas, Praga, Checoslovaguia (Asesor temporero} * No mudo asisti: Dr. R. H. Yolken, Assistant Professor of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, EUATECNICAS RAPIDAS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCIONES VIRICAS Informe de un Grupo Cientifico Un Grupo Cientifico de la OMS sobre «Técnicas répidas de la- oratorio para el diagnéstico de infecciones viricas» se reunié en Ginebra del 29 de septiembre al 3 de octubre de 1980. El Dr. P. Brés, Jefe del Servicio de Enfermedades Viricas, inauguré la reunién en nombre del Director General. 1, INTRODUCCION El diagnéstico de laboratorio rapido y preciso de las enfermeda- des infecciosas es indispensable tanto para prestar atencién inme- diata al paciente como para introducir las medidas de salud pablica que sean necesarias. Las técnicas clisicas de laboratorio que hab tualmente se emplean en virologia con fines de diagnéstico, si bien especificas y sensibles. suelen ser tediosas, dificiles 0, en algunos laboratorios, de ejecucién imposible. En afos recientes se han ideado nuevos métodos. sencillos y répidos, para el diagnéstico de infecciones viticas. El Grupo Cientifico definié el diagnostico rapido de esas infecciones como un método que puede proporcionar resul- tados aceptables en menos tiempo que los métodos clisicos y per- mnite asf intervenir con acierto al tratar a los enfermos y sus contac- tos 0 combatir la enfermedad en las comunidades. Hace cuatro afios la OMS comenzé a formular un programa para promover el diagndstico rapido de infecciones viticas en los labora. torios de salud publica de los Estados miembros como medio de mejorar la atencin primaria de salud. Tres reuniones anteriores de la OMS sobre este tema han destacado la importancia del diagnés- tico rapido de la hepatitis virica, la gastroenteritis por rotavirus, las infecciones viricas de la piel, los Srganos genitales y las vias respira. asi como la rabia (I-3). El diagndstico ripido de las virosis ofrece muchas ventajas sobre Jos métodos convencionales de sislamiento del virus y de serologia virica. Su rapidez y sencillez facilitan la practica de encuestas sobre 5‘enfermedades infecciosas en una zona, y la informacién obtenida puede conducir al desarrollo de actividades individuales o de salud pablica. El diagndstico precoz de las infecciones viricas contribui & prevenir infecciones cruzadas en los hospitales y su difusién a con- tactos, especialmente en casos que presenten sintomas atipicos. El empleo de medicamentos antiviricos, tanto profilictica como tera- péuticamente, va en aumento, aunque es todavia muy limitado, Su aplicacion satisfactoria dependera del diagnéstico virico especifico y oportuno. La planificacién y la vigilancia de programas preventivos requieren datos seroepidemiolégicos, que deben obtenerse rapida- mente y a bajo costo cuando hay grandes cantidades de muestras que tratar. Otra ventaja de las técnicas ripidas de diagnéstico es que los antigenos viricos pueden detectarse en un laboratorio central u lizando muestras recogidas en localidades alefadas de un laboratorio de virus. Estos métodos no dependen de la multiplicacién de los Virus y ni siquiera requieren la presencia de virus vivos La falta de reactivos para inspeccién de la calidad, equipo indi Pensable y personal preparado ha obstaculizado la aplicacién satis- factoria y la amplia difusién de estos nuevos métodos. Por tanto, el Grupo Ciemtfico examiné los medios de resolver esos problemas Aungue se reconoce que las técnicas rpidas no pueden sustituir totalmente a las clisicas, en cambio contribuirin al conocimiento de las infecciones viticas como causa de morbilidad y mortalidad, y servirdn para mejorar la atencién primaria de salud y la lucha contra enfermedades viticas de importancia para la salud pablica 2. INVENTARIO Y CARACTERISTICAS TECNICAS DE LAS TECNICAS RAPIDAS Como la mayoria de los laboratorios dedicados al diagnéstico vi rico conoce bien las técnicas clisicas, no se describiran éstas aunque todavia pueden ser necesarias. Las aplicaciones y limitaciones de las técnicas més recientemente perfeccionadas 0 adaptadas al diagnés- tico rapido de virosis mediante la deteccin del antigeno y los prime- ros anticuerpos son objeto de examen en las secciones siguientes. 2.1, Técnica de anticuerpos fluorescentes (TAF) (4) Este método (véase la Fig. 1) revela la presencia de antigenos viricos en el interior de las células adhiriéndoles un anticuerpo fluo- 67 ot —— worm cobb eae SRE ar oc comes SSS af ean es [ANTICUERPO + ANTICUERPO Filan ena FRACCION ight | o wane con = erat Herescente marcado. Esto puede hacerse’por el método directo, en el cual el propio anticuerpo antivirico lleva el marcador fluorescente, 0 por el método indirecto, en el que se requieren dos tiempos. Pri- mero, se deja que el anticuerpo virico especifico se fije en el anti- geno de la muestra; luego se deja que un segundo anticuerpo contra Ia globutina de especie y con el marcador fluorescente se fije en el anticuerpo primario, formando un complejo con el antigeno. Los factorés que influyen sobre la eleccién del método directo 0 ¢lindirecto son: a) el nimero de antigenos que busca el laboratorio, verbigracia, s610 un antigeno, como en los centros antirrabicos, para lo cual conviene més un método directo; b) la necesidad de marcar milti- ples antisueros en el método directo, con una disminucién sub: zuiente del titulo; ¢) pueden emplearse antisueros no marcados para mas de un fin; v.g., ELISA; d) la coloracién final de preparaciones con Ia técnica indirecta es '5 a 10 veces mas brillante que con la técnica directa; e) la técnica directa tiene s6lo un tiempo, y f) la preferencia personal. Ventajas técnicas 1, La ventaja principal de la TAF es que permite detectar anti- genos viricos mientras estén todavia en la célula; por tanto, se nece- sitan relativamente pocas células. 2. Tras la fijacién, las muestras son estables y pueden enviarse sin limitaciones de tiempo. Desventajas téenicas 1. Son indispensables los antisueros altamente especificos y ‘buenos conjugados, que no siempre. son asequibles. 2. Se necesita un microscopio de fluorescencia, que es costoso. 3. Es necesario tener amplia experiencia. 4, Algunas muestras —v.g., mucosidad en los esputos, costras cen lesiones cutzneas— dan altos grados de reacciones no especificas La TAF es también adecuada para detectar IgM especifica. El antigeno especifico se fija en un portaobjetos, luego se aplica el suero de prueba y se detecta la IgM aplicando una globulina IgM antihumana marcada con fluorescein. Es necesario suprimir de las muestras que se analizan el exceso de IgG especifica y el factor reumatoide. 82.2, Prueba de inmunoabsorbencia ligada a la enzima (ELISA) (5, 6) En el método ELISA més comiinmente empleado para la detec- cién de antigenos (véase la Fig. 2) se utiliza una capa de anticuerpo de «captura» sobre una fase sOlida para fijar el antigeno. Se detecta luego ¢l antigeno mediante un anticuerpo especifico marcado con enzima 0 se utiliza aquél para absorber el anticuerpo especifico, que a su vez es detectado mediante una globulina antiespecie marcada con enzima. Después que el anticuerpo marcado con enzima y no combinado ha sido eliminado por medio de lavado, se agrega el sus- trato apropiado para la reacci6n enzimatica. Se obtienen productos del desdoblamiento enzimatico y aparece el color que puede eva- luarse a simple vista 0 cuantificarse con un espectrofot6metro. Cuando se emplea la ELISA para la deteccién de la IgM, el mé- todo consiste en utilizar la anti-lgM como «capa de captura» a la cual se agrega el suero de prueba y el antigeno especifico, y, finalmen- te, el sistema de deteccién (antiglobulina marcada con enzima y sus- trato). Esta técnica resuelve el problema del exceso de IgG especi- fica pero no elimina completamente la reaccién positiva falsa cau- sada por el factor reumatoide. Este tiltimo problema puede superarse utilizando un antigeno especifico marcado con la enzima. Los anti- ‘cuerpos especificos IgG son detectados empleando el antigeno como scapa de capturay Ventajas técnicas 1. Los reactivos son relativamente estables. 2. Bl color producido en la reaccién puede leerse a simple vista cuando no se dispone de equipo complicado. 3. Pueden examinarse grandes cantidades de muestras al mismo tiempo. Desventajas técnicas 1. EI procedimiento es relativamente complicado y consume mucho tiempo. 2. Las placas de plistico pueden ser inadecuadas por producir efectos estaticos, 3. Los sustratos cromégenos pueden ser carcindgenos 0 mutd- genos. 104. Se necesita un espectrofotémetro para aumentar la sensibili- dad de la prueba. 2.3. Prueba radioinmunolégica de fase sélida (SPRIA) (7) ‘Como en otras prucbas de fase sélida, el método (véase la Fig. 2) comprende un sustrato, sea la superficie de una celdilla de placa de microtitulacién, sea una perla de plastico a la que se adhiere el anti- cuerpo de «captura». La muestra para prueba se agrega y el antigeno absorbido a esta capa se detecta, habitualmente por medio de un anticuerpo marcado con Ventajas téenicas 1, SPRIA es la mas sensible de las pruebas examinadas en esta seecién. método parece ser mas complicado que otros, pero no es dificil si se presta atencién a los detalles. Desventajas técnicas 1. Se necesitan equipo y reactivos costosos. 2. Los reactivos duran poco en el laboratorio y ofrecen un riesgo biolégico por la radiactividad. 2.4. Microscopia electrénica (8) Solo el método de coloracién negativa es dtil para el diagndstico ripido de virosis. El procedimiento consiste en mezclar la suspen- sign que contiene el virus con un colorante denso en clectrones, ha- bitualmente ef acido fosfottngstico, y dejar que una gota de esta mezcla se seque en una rejila. La técnica puede practicarse en unas cuantas horas o incluso en minutos segin que el virus requiera ono concentracién. E] uso de la microscopia inmunoelectrénica (MIE) ‘aumenta la sensibilidad del método y permite la identificacién sero- Jogica de un virus. Este método se funda en la agregacién de particu- las viricas con anticuerpos especificos, 1o que da por resultado una deteccién més fécil y mas clara mediante la microscopia electronica. rrVentajas téenicas 1, La muestra se examina directamente sin tiempos preparato- ios complicados. 2. La sensibilidad y la rapidez son buenas. Desventajas técnicas 1. Se requiere equipo costoso y un operador experimentado. 2. Solo puede examinarse un niimero limitado de muestras en cada vez. 2.8, Hemaglutinaci inversa pi ra (RPHA) (9, 10) Puede lograrse que los virus que no hemaglutinan de manera na- tural produzcan modalidades hemaglutinantes si los hematies utiliza- dos se recubren con anticuerpo especifico para el virus. Este método (véase la Fig. 3) requicre que el anticuerpo unido a eritrocitos fres. Cos 0 el anticuerpo unido a eritrocitos fijados puedan ser liofilizados. La prueba suele practicarse mezclando muestras y eritrocitos recu- biertos con anticuerpo y dejindolos reposar durante algin tiempo. Los resultados se interpretan exactamente de la misma manera que en una prueba clisica de hemaglutinacién. También se ha utilizado una variante de la RPHA, la agregacién en fase solida (/0) de eritro- citos acoplados (SPACE). Este método (véase la Fig. 3) permite aplicar la hemaglutinacién pasiva en muestras sucias que no serfan adecuadas para la prueba ordinaria. Ventajas técnicas 1. La prueba es ripida y de facil ejecucién. 2. Los reactivos son de bajo costo 3. No hay riesgos biolbgicos que acompafien a ninguno de los reactivos. 4. No se necesita equipo costoso. Desventajas téenicas 1. Los hematies frescos duran poco en el laboratorio, 2. Los antisueros deben ser de titulo alto,Fig. 3. Homaglutinasion EMAGLUTINACION INVERSA PRSIVA on de etitracites en fase {EGACION DE ERITAOCITOS EN FASE SOLIDA aeHA sence soronre artnociTos corenre ‘cunmibos" treason th aymcuenro Et ere ony ww aerate) | | enrrnociros _, SOPORTE RECURIERTO RECUBIERTOS CON, Mi SCG ct cuemeos ANTIGUERPOS " ivestra ctinica g Qo Unies sus a © © Senantacion aveeeiin © B3. Las desventajas son semejantes a las de In ELISA, pues el plistico de la fase s6lida puede introducir problemas de absorcién estitica 2.6. Hemélisis radial simple (SRH) (/I, 12) La prueba (véuse In Fig. 4) se utiliza principalmente para la de- teceién ripida de anticuerpos. El antigeno virico se absorbe a los eritrocitos de manera natural (mezclando e incubando) o mediante enlace quimico (con adicion de CrCl,). Se suspenden luego esos eri- trocitos en gel de agar y se vierten en placas de Petri o en portaobje- tos y se dejan asentar. Las placas estén listas para usarse cuando se hha cortado una serie de celdillas de unos 2 mm de didmetro. Se in. corpora en el gel o se agrega ulteriormente el complemento de suero completo de cobayo en dilucién de 1:4. Se colocan los sueros de prueba en las celdillas y se dejan difundir dentro del gel. Los sueros Positives producen zonas claras alrededor de las celdillas Ventajas técnicas 1. No se necesita equipo complicado. 2. Pueden obtenerse resultados cuantitativos precisos en una sola dilucién de suero midiendo e! didmetro o la superficie de la zona de hemélisis. 3. Noes necesario eliminar del suero los inhibidores no espec ficos. 4. Para la prueba se necesita una pequefia cantidad (unos 5 kl) de suero, Desventajas téenicas 1. Se necesita una cantidad considerable de antigeno de alto ti- tulo para unir los eritrocitos. 2. Los reactivos son de dificil normalizacién. 27. Prueba inmunolégica en capa delgada (TIA) (13) Esta prueba es una técnica elaborada recientemente para detectar la reaccion antigeno-anticuerpo (véase la Fig, 5). Se funda en que las 4Fig. 4. Herhsis cacial simple. © trot arate a Antigen conocido GELDEAGAR 0 aca de prueba con clillas ecotades Ee u sueRo AkapI00 + ALASceLOICLAS wa AvTicuERros DEL suERO | oirusion o& La | MUESTRA Se SUERO | eaceron maunoroaica y i incusacion ‘aa FLIACION DE COMPLEMENTO. Z A EACCION PosiTiva ZONA DE HEMOLISIS ALREDEDOR DE LACELDILLA so ssa ctrouisis con MEDIACION DEL COMPLEMENTOglobulinas pueden absorberse en capa delgada sobre una superficie de poliestireno. Esa superficie revestida de antigeno tiene las carac- teristicas de un inmunoabsorbente que es capaz de fijar antigenos La interaccién antigeno-anticuerpo se hace visible cuando se expone Ja superficie al vapor de agua. Una superficie sobre la que ha tenido lugar una reaccién antigeno-anticuerpo es hidrofilica (grandes gotas de agua) en contraste con el fondo, que es hidrofdbico (gotas de agua diminutas). A simple vista se reconoce ficilmente la diferencia de tipos de condensacién y para ello no se necesita un equipo refinado de laboratorio. Sin embargo, la sensibilidad del método parece ser baja y esté por demostrarse su utilidad. 2.8, Otras pruebas: inmunodifusién (ID), inmunoelectro-osmofore- sis! (EOP) y cromatografia gaseosa La ventaja especial de la IEOP es la velocidad, en tanto que la de la ID es su propiedad de establecer la especificidad mediante lineas de identidad. Estas pruebas son de sensibilidad relativamente baja, pero son baratas, dan una respuesta répida y pueden usarse (para la deteccién de subtipos de antigenos periféricos de la hepatitis, por ejemplo) cuando no se dispone de otros métodos La cromatografia gaseosa y Ia fluidez en membrana son dos mé- todos nuevos, pero son complicados y su aplicacién parece dema- siado lejana para examinarla en detail. * El Grupo Cientifico propugna el empleo de técnicas répidas, s, para el diagnéstico de infecciones viricas. No obstante, en ciertos casos todavia se requieren las antiguas técnicas clisicas, como los cultivos celulares y la inhibicién de la hemagluti- nacién. 3.1. Enfermedades respiratori Las infecciones respiratorias agudas son cauisas importantes de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Se calcula que se regis- * Conocida también con el nombre de «inmuncelecrofaresis a contracorriente» 16ls esteosién de sntigeno y ant DETECCION DEL ANTIGENO DETECCION DEL ANTICUERPO PLACA OE Z 7 vastics Z 7 ANTICUERPO ggg ANTIGENO ESPECIFICO © puniricapo | [ADSORCION | PLACA mam recusicara, —_f __ + + MUESTRA ANTICUERPO unica, PR be surno tare lie! | Ambiente ridrofico apy Lal Fa vm TILT ANTICUERPOS ANTI Igy HUMANAS | | varon bread 7tran unos 2,2 millones de defunciones por enfermedades respirato- rias agudas en el mundo cada afio. En los nitios, especialmente en los menores de un afio de edad, la causa mas importante de defuncién es la infecci6n de las vias respiratorias bajas. Esta puede ser de etiolo- fa virica 0 bacterianay adn no se ha determinado la importancia Felativa de los dos tipos de agentes en diversas partes del mundo. Durante los dos decenios pasados se ha demostrado que muchos virus producen infecciones respiratorias. Algunos, como los virus del resfriado comtin, suelen asociarse con enfermedades leves, en tanto que otros, como los de la influenza, la parainfluenza y el sa rampién, pueden producir enfermedades graves. El virus respirato- rio sincicial es sin duda et patdgeno mas importante de las vias respi ratorias bajas en los lactantes muy pequefios En el pasado, el diagnéstico de laboratorio de las infecciones respiratorias viricas se basaba en métodos clisicos, como el aisla- miento del virus y Ia deteccién de anticuerpos, procedimientos pro- longados. En afios recientes se elaboraron técnicas fundadas en ta demostracién de antigenos viricos especificos unas cuantas horas después de la toma de la muestra. Son ellas la técnica de anticuerpos fluorescentes (TAF) (4) y la prueba de inmunoabsorbencia ligada ala enzima (ELISA) (/4, 15). La TAF es el método de eleccién para el diagndstico répido de laboratorio de las infecciones viricas respiratorias. Es un método sensible, especifico y relativamente econémico, cuyos reactivos se conservan largo tiempo en el gabinete, La prueba misma no plantea muchas dificultades técnicas. Sin embargo, para obtener resultados confiables tiene gran importancia la seleccién y Ia preparacién de muestras para la prueba. Las secreciones nasofaringeas ofrecen el mejor material, y la toma adecuada de estas muestras debe producit células intactas que contengan el antigeno virico, En los enfermos de mayor edad pueden utilizarse lavados nasales 0 faringeos ¢ incluso esputos; en cambio han resultado inconvenientes las muestras obte- nidas frotando la garganta con torundas. La elucién de torundas con secteciones nasales y de tos producen células intactas idéneas, pero la Sensibilidad es inferior a la de las secreciones nasofaringeas. Se lavan las células eluidas y se preparan puntos para la muestra en portaobjetos fijados y tefidos como se describe en el Anexo | La interpretacién de reacciones especificas mediante Ia inmuno- fluorescencia requiere reactivos buenos, de calidad comprobada. Si se detectan antigenos viricos especificos en las vias respiratorias puede determinarse el agente etioldgico de la enfermedad. En el caso 18de los adenovirus, la deteccién con la TAF de sts antigenos en se- creciones nasofaringeas comprueba su cardcter de pat6genos, en tanto que el aislamiento de virus con una TAF negativa suele indicar que el adenovirus no tenia relacién con la enfermedad presente. No obstante, en caso de sospechar influenza, se necesita aislar el virus mediante inoculacién de huevos con el objeto de practicar andlisis antigénicos. Esto es importante para la vigilancia de la influenza. 3.2, Enfermedades diarreicas ‘Aunque pueden identificarse varios virus en las heces, apenas recientemente se han asociado virus especificos con las enfermeda- des diarreicas. En estos dltimos afios se han identificado rotavirus, agentes de Norwalk y afines, calicivirus, astrovirus, coronavirus y adenovirus no cultivables directamente en muestras fecales. La ma- yoria de estos virus son dificiles de propagar en cultivos celulares y el Ginico método asequible en la actualidad para detectarlos es la mi croscopia electrénica. Unicamente los dos primeros grupos son re- conocidos ampliamente como agentes etiolégicos de enfermedades diarreicas Los rotavirus son probablemente los agentes ctiologicos mas im- portantes de la gastroenteritis humana, que produce grave deshidra- tacion en nifios de todas las edades. Aunque puede cultivarse in vitro tuna serie de rotavirus de los animales, los rotavirus humanos no proliferan cuando se emplean métodos ordinarios en los actuales sis- temas de cultivo celular. Por eso Ia infeccién humana por rotavirus debe diagnosticarse mediante técnicas que puedan detectar el anti- geno rotavirus directamente en muestras de excremento 0 la res- puesta serolégica al agente. Las deyecciones diarreicas contienen grandes cantidades de rus, lo que permite detectarlos durante varios dias. En estudios ini- ciales se empleé la microscopia electronica para la deteccién directa de particulas de rotavirus en muestras fecales, y éste sigue siendo un método sencillo y directo. No obstante, es de limitada aplicacion porque con é1 sélo pueden manejarse unas cuantas mucstras y se necesita un equipo complicado. Por ello sc ha ideado una serie de técnicas inmunol6gicas, en particular las conocidas con sus siglas inglesas: IEM, ELISA, RIA, SPACE, IEOP. En una serie de mues- tras fecales examinadas bajo clave, estas nuevas técnicas dieron muy buenos resultados en comparacién con la técnica de anticuer- pos fluorescentes y la microscopia electronica. No obstante, Ia 19RPHA es inconveniente a causa de la contaminacién de las muestras fecales, que ocasiona la agregacién inespecifica de hematies. ‘Aunque todas las pruebas antes mencionadas tienen un lugar en el diagndstico rapido de las infecciones por rotavirus, las de mayor sensibitidad para detectar el virus en las heces son ELISA y RIA. Pero los inconvenientes de esta iiltima —es decir, la necesidad de equipo refinado y de material radiactivo, y la poca duracién de los reactivos de RIA en el Iaboratorio— hacen preferible a ELISA para €l diagnéstico rapido. ELISA puede emplearse como prueba directa © indirecta para detectar rotavirus en muestras clinicas: La prueba directa tiene las ventajas de ser mas sencilla de ejecutar y de reque- rir un solo reactivo. Por otra parte, la prueba indirecta es mis sensi- ble que la ELISA directa. Esta es la prueba mas cOmoda para detec tar particulas de rotavirus en nifios con gastroenteritis aguda en quienes la cantidad de particulas probablemente sea alta, en ta que la ELISA indirecta es mds adecuada para estudios epidemiol6 Cos en gran escala, en los cuales a menudo se necesita mayor sen: bilidad Si se necesita medir los anticuerpos para el rotavirus, puede rea- lizarse esto con la ELISA utilizando antigeno de rotavirus sobre Ta fase solida. Tras la adicin de Ia muestra de prueba, se cuantifica la inmunoglobulina fijada mediante una antiinmunoglobulina marcada con la enzima apropiada. Con antiinmunoglobulinas IgG, IgM ¢ IgA, especificas de subclase, puede cuantificarse especificamente. 3.3. Hepatitis viriea El diagnéstico répido de laboratorio de la hepatitis aguda debida a infeccién por virus A y B de la hepatitis ha llegado a ser posible con el perfeccionamiento de pruebas sensibles y especificas para marcadores viricos apropiados. Todos los procedimientos actual- mente asequibles pueden practicarse en menos de 48 horas en una sola muestra recogida durante el periodo.agudo de la enfermedad. Hepatitis B.A causa de la complejidad inmunol6gica del virus de Ia hepatitis B (HBV), existen pruebas para una variedad de mar- cadores inmunolégicos, en particular el antigeno periférico de la he- atitis B (AgpHB), el anticuerpo periférico de la hepatitis B (anti- HBp), el anticuerpo central de la hepatitis B (anti-HBe) y el antigeno y el anticuerpo de la hepatitis Be (AgHBe-y anti-HBe). No obs- tante, para fines précticos, el diagndstico generalmente solo se esta- blece con la deteccién del AgpHB en el suero. 20Las pruebas para la deteccién del AgpHB pueden clasificarse como de «primera», «segunda» o «tercera» generacion, segin su sensibilidad (baja, media o alta). Las pruebas de primera generacién comprenden una serie de procedimientos de difusién en gel de agar ‘que ya no se utilizan extensamente por su baja sensibilidad. La TEOP es una prueba de segunda generacién difundida todavia por su sencille2, bajo costo y brevedad de tiempo para practicarla (60.90 minutos) y porque no requicre un antisuero sumamente potente. Sin ‘embargo, esta técnica es menos sensible que los métodos de tercera goneracién, que comprenden la RIA, la ELISA y la RPHA. De és- tas, la RIA es Ja mas sensible y actualmente es el cia frente al cual deben medirse todas las dems para comparar sen- sibilidad y especificidad. Le siguen muy de cerca la ELISA y la RPHA en orden decreciente de sensibilidad. ‘Aunque Jas pruebas radioinmunolégicas comerciales existentes tienen las ventajas de su alta sensibilidad, facilidad de ejecucién y excelente reproducibilidad, requieren un equipo costoso y reactivos de poca duracién. La ELISA tiene las ventajas de ser casi tan sensi- ble como la RIA, practicarse con reactivos estables y no necesitar equipo costoso, Pero los reactivos comerciales son todavia relativa mente caros y puede haber problemas por variaciones en la adheren- cia a la superficie plastica de las placas de microtitulacién usadas. La RPHA se utiliza ampliamente porque es facil de practicar, re- quiere reactivos baratos y no necesita equipo costoso. Pero es algo menos sensible que Ia RIA y la ELISA, y exige que los hematies empleados sean de calidad debidamente comprobada para asegurar la reproducibilidad, Hepatitis A. Aunque la hepatitis A puede diagnosticarse locali- zando el virus (HAV) en las heces durante la fase aguda de la enfer- medad mediante la TEM, la RIA o la ELISA, la eficiencia de estos imétodos es relativamente escasa por la répida disminucion de exere- cién virica durante el final del periodo de incubacién de la enferme- dad, El hallazgo de anti-HAV-igM en el suero de los enfermos agu- dos generalmente establece el diagndstico de hepatitis A reciente La RIA y la ELISA son las pruebas més facilmente adaptables para Ja deteccisn de anti-HAV-IgM y dan los resultados en el curso de 24 horas. Recientemente se ha introducido una RIA comercial para ka deteccién especifica de IgM por medio de una técnica de anticuerpos en «capturar de cadena pesada (anti) anti-lgM. Pero el alto costo de la prucbu y la relativa escasez. de los antigenos reactivos pueden impedir su difusién. El anticuerpo IgM. puede sustituirse ampli 2‘mente con anticuerpos de la clase IgG en la convalecencia (anti HAV-IgG). Los anticuerpos especificos IgG no tienen valor para el diagndstico clinico pero pueden emplearse como indicadores para encuestas de prevalencia, Hepatitis no Aino B. Actualmente no hay antigenos ni anticuer- os asociados con pruebas para la hepatitis no A/no B. Aunque va- rios grupos de investigadores han consignado la realizacién de prue- bas seroldgicas especificas para antigenos y anticuerpos asociados con la hepatitis no A/no B, han sido infructuosos los intentos de otros laboratorios por verificar esas afirmaciones. Actualmente, la hepatitis no A/no B se caracteriza por la exclusion de marcadores seroldgicos de infeccién aguda con HAV, HBV, citomegalovirus (CMY) y virus de Epstein-Barr (EBV). 3.4. Enfermedades de transmision sexual En los érganos genitales se encuentran los tipos 1 y (mds fre- cuentemente) 2 del herpesvirus humano (alfa) (16) (herpes simplex virus, HSV). Esos dos virus proliferan ripidamente en cultives celu- lares y, tras una incubaci6n de toda la noche, puede demostrarse el antigeno por inmunofluorescencia. Si se necesita un diagnéstico mas répido, pueden aplicarse directamente la microscopia electrénica y la técnica de anticuerpos fluorescentes a las muestras clinicas. La primera, con coloracién negativa de material vesicular 0 pustuloso sin concentracién, permite identificar el virus de tipo herpes. La se- gunda es adecuada para raspados de material vesicular 0 biopsias por puncién desde la fase maculopapular, pero puede dar resulta dos variables en fases ulteriores. Se ha hecho un intento de usar la ELISA para detectar el HSV tipo 1, pero no se han tenido més in- formes de ello. El diagnéstico rapido es sumamente importante en a embarazada cerca del término, pues un diagnéstico de HSV deter- minard la via del parto. El herpesvirus hhumano (beta) (16) (citomegalovirus humano, CMV) puede transmitirse por via sexual y encontrarse en la gar- ganta, la orina y los érganos genitales femeninos, y algunas veces en el semen. El virus suele proliferar lentamente en cultivos de células diploides de embriones humanos. En general la citopatologia slo se observa tempranamente en cultivos celulares inoculados con mues- tras de orina de lactantes infectados al nacer donde la carga antigena 8 considerable. Las técnicas de anticuerpos fluorescentes para de- tectar antigenos nucleares especificos del CMV que pronto se pro- 2ducen, aplicadas a mas tardar al dfa siguiente de inocular orina en el cultivo celular, han proporcionado un diagndstico rapido (77). Puede usarse el microscopio electrdnico en muestras de orina, pero gene- ralmente se necesita alguna forma de concentracién. v.g., la centri- fugacion. Puede ser importante la deteccin de IgM especifica en sueros de casos agudos 0 al principio de la convalecencia de enfer- mos infectados (véase Ia secci6n 3.8). Actualmente se sabe que el virus de la hepatitis B puede transmi: tirse por via sexual. El virus 0 el antigeno virico se encuentran por lo general en el suero, pero la saliva, Ia orina y las excreciones genita- les de enfermos infectados aguda o cronicamente pueden contener antigeno. Aunque las clamidias no son virus, estos microorganismos alta- mente especializados han pasado a ser, en muchas partes del mundo, agentes que los virdlogos tienen que diagnosticar en sus laborato- ios. Hay dos especies de clamidias: Chlamydia psittaci y C. tra- chomatis. Varias cepas de C. trachomatis han sido sefaladas como agentes etioldgicos de infecciones genitales (v.g., uretritis, proctitis, salpingitis y cervicitis no gonocécicas). Varios autores han compro- bado la funcién de las clamidias en enfermedades neonatales de los ojos y las vias respiratorias. Las técnicas serolégicas actuales (micro-TAF y fijacién del complemento) solo dan informacion re- trospectiva, én tanto que la coloracién de Giemsa permite detectar microorganismos en frotis de ojos infectados. E] examen de frotis no es suficientemente sensible para detectar gérmenes en muestras faringeas o genitales. Los microorganismos se afslan facilmente de muestras clinicas por inoculacién y coloracin de cultivos celulares. Los mejores resultados se obtienen en muestras cervicales 0 vagina les y del fondo de la uretra. El método de laboratorio més répido consignado hasta la fecha comprende la centrifugacién de la muestra en células de McCoy tratadas con cicloheximida y coloracién de AF 21 horas después (/8). En la mayoria de los laboratorios se em- plea la técnica de anticuerpos fluorescentes sola 0 junto con colora- cién de Giemsa 0 yodo 24-72 horas después de la inoculacién, Esas técnicas son eficaces y sensibles. pero requieren operaciones inten- sas y costosas. 3.5. Enfermedades del sistema nervioso central Cada vez tiene mayor importancia el diagnéstico precoz y espect- fico de infecciones viricas agudas del sistema nervioso central (SNC), 2Bpues actualmente se cuenta con medicamentos antiviricos espe cos para tratar algunas infecciones. Ciertos virus —v.g., los de la rabia, el herpes, el sarampi6n y los arbovirus— pueden producir en- cefalitis, mientras que otros, como los de la parotiditis y los entero- virus, pueden producir meningoencefalitis, con el virus localizado en el liquido cefalorraquideo (LCR). Rabia. Debe hacerse todo lo que sea posible por obtener un diagndstico répido de la rabia en animales sospechosos de haber es- tado en contacto con seres humanos. Se ha comprobado que la téc- nica de inmunofluorescencia es el mejor método para detectar el vi- rus 0 antigenos viricos. Los procedimientos de esta técnica se des- criben en otra parte (19). El diagnéstico de rabia humana es atil en tun caso individual para excluir otras infecciones del SNC y para adoptar las medidas de salud piblica apropiadas. El diagndstico puede hacerse en un paciente detectando virus o antigeno Virico en células obtenidas por frotis de impresién corneal 20) 0 de biop- sias (2/). Aunque requiere mucho tiempo, debe intentarse simulti neamente el aislamiento del virus. La rabia también puede diagnosti carse detectando anticuerpos especificos en enfermos, siempre que éstos no estén vacunados. Sarampidn. En la mayoria de los casos de encefalitis sarampio- nosa aguda, los sintomas de la enfermedad precedente han sido sufi- cientemente caracteristicos para permitir que se haga el diagndstico, La encefalitis que aparece tras e! sarampién atipico puede ser dificil de diagnosticar clinicamente y, por tanto, se necesita entonces un diagnéstico de laboratorio. En esta situacién el método de eleccién es la deteccién de la IgM especifica En pacientes inmunizados con encefalitis sarampionosa, Ia persis- tencia del virus permitird el diagndstico mediante la deteccion de antigenos viricos por inmuinofluorescencia. En la panencefilitis es- clerosante subaguda, el diagnéstico puede hacerse para fines dife- renciales detectando altas concentraciones de anticuerpos en la san- gre y el liquido cefalorraquideo (22) Herpesvirus humanos (alfa) o. virus herpes simplex (AVS). Las manifestaciones de infeccién por estos virus en el SNC comprenden la encefalitis aguda necrosante asociada al HSV-1 y la meningiti benigna que stele acompafiar a las infecciones por HSV-2. Actual- mente existen medicamentos para tratar las infecciones. por HSV. Por tanto, son indispensables las técnicas seguras y sensibles para diagnosticar la encefalitis herpética con el objeto de instituir el tra- tamiento medicamentoso tan pronto como sea posible pySi se cuenta con muestras de biopsia encefilica, deben usarse para detectar el antigeno virico mediante la TAF 0 el microscopio electronico e inocularse las muestras en cultivos celulares para aislar el virus. También puede hacerse el diagnéstico detectando varios tipos de anticuerpo especifico producido localmente dentro del sis- tema nervioso central, que pueden aparecer al final de la primera semana (23). El simple hallazgo de anticuerpos especificos en el SNC no indica que se hayan producido all: un alto titulo de ant euerpos en el suero y la lesion de la barrera hematoencefilica pu den explicar ese hallazgo. La relacién entre suero y liquide céfalo- rraquideo por lo que respecta a anticuerpos especificos de IgG es normalmente de 300-600:1. Una disminueién de razén 4 en esta pro- porcién indica la produccién local de anticuerpos siempre que con nie normal la relacién correspondiente a otras proteinas del liquide cefalorraquideo. Normalmente no se detectan virus en el LCR en la encefalitis herpética. No debe utilizarse la inmunofluorescencia para detectar antigenos especificos en los linfocitos por el riesgo de obtener reac- ciones inespecificas. Se han sugerido otros métodos para el diagn6s- tivo, como la deteccién de antigenos viricos especificos o de enzimas ¢ interfer6n (o uno de esos dos) en el LCR. Se necesita ampliar tos estudios para demostrar Ia utilidad de estos métodos. Parotiditis epidémica. El diagnéstico diferencial de 1a meni goencefalitis tras una infeccidn asintomatica o atipica puede obte- nerse detectando en el suero anticuerpos IgM especificos. Aunque el virus de la parotiditis epidémica con frecuencia puede tomarse del LCR y cultivarse, no se han comunicado métodos de detectarlo r: pidamente alli, Deben impulsarse nuevos estudios al respecto. Otros virus. Aunque puede haber virus en el LCR durante la meningoencefalitis por enterovirus, hasta la fecha no se han ideado métodos répidos para detectarlos. Las infecciones por arbovirus se tratan en la seccién 3.7. 3.6. Enfermedades de la piel y de los ojos 3.6.1. Virus que producen lesiones cutdneas localizadas Los virus de este grupo son los que se asocian a nédulos 0 lesio- nes verrugosas de la epidermis, S6lo se conocen cinco: el virus de la verruga humana vulgar y su variante, que se encuentra en verrugas genitales; el virus Orf; el virus del molusco contagioso y, mucho 25menos comiinmente, los virus que producen la vacuna y los nédulos de los ordenadores. El virus verrugoso es un virus «papova»; los otros cuatro'son virus «pox». El diagndstico rapido de las lesiones producidas por estos virus puede hacerse triturando y licuando te- ido solido y examinando el producto homogeneizado bajo el micros- copio electronico (véase el Anexo 2). Hasta la fecha no se ha des- crito otro método de deteccién para estos virus 3.6.2. Virus que producen infecciones generales con vesiculas cuténeas Uno de los diagndsticos diferenciales mas importantes jamds he- chos fue el de la viruela con la varicela y el zoster. Los virus que causan estas enfermedades producen lesiones vesiculares, y el me dio mas rapido y sensible de diagndstico es el examen del liquido vesicular bajo el microscopio electrénico. El agente causal de la vi ucla es un virus «pox», en tanto que el de la varicela y el zoster es un virus herpes (véase el Anexo 2). Si existe alguna sospecha de que Jas lesiones observadas puedan ser de viruela, se recomienda adop- tar precauciones de seguridad y pedir el asesoramiento de la OMS para atender el caso. Si se encuentra un virus «pox», debe envasarse el material infectado siguiendo las recomendaciones de la OMS (24) y enviarlo a un laboratorio de referencia para su mis amplia caracte- Tizacion. Inmediatamente debe piblica y ala OMS. El material clinico que pueda contener herpesvi tus debe inocularse en cultivos celulares. Tras incubarlo toda la no- che, puede detectarse el antigeno virico por medio de la TAF. Esta puede emplearse también para la deteccién directa del antigeno del herpes simple en células obtenidas de la base de las lesiones Cuando se han formado costras, éstas todavia pueden usarse para microscopia electronica, pero este procedimiento es menos sensible que la TAF 0 el aislamiento de virus para el herpes simple. En el caso de la viruela, el método que recomienda la OMS es la micros- copia electréinica, 3.6.3. Infecciones viricas generales con exantema Desde el punto de vista del diagndstico virolégico rapido, el mas importante de estos virus es el de la rubéola, pues la comprobacién de la infeccién puede ocasionar la interrupcisn del embarazo. El mé- 26todo mais practice y sensible de diagndstico es la deteccién de IgM sspecificas en el suero. En la seccién 3.8 se examinan ampliamente Jos métodos de deteccién de la IgM. Si es necesario determinar la IgG para la rubéola. tanto la inhibicién de la hemaglutinacién como Ja hemélisis radial simple son técnicas comodas y sensibles En las fiebres hemorragicas se presentan lesiones del tipo de la pirpura. En la seccién 3.7 se trata de esas fiebres 3.6.4. Gérmenes vinculados a infecciones oculares Chlamydia trachomatis, HSV y adenovirus son los microor nismos que se encuentran con mas frecuencia. HSV y C. trachoma- tis se examinan en detalle en la secci6n 3.4. La TAF ha sido til para detectar adenovirus y HSV en raspados oculares, pero el cultivo ce- lular también debe inocularse siempre que sea posible y detectar el antigeno virico por medo de la TAF. Puede emplearse el microsco- pio electronico, pero generalmente esto requiere una concentracién previa. Otras pruebas, como la ELISA (25), que puede detectar pe- quefias cantidades de antigeno, tal vez sean ditiles, pero requieren mis evaluacion. 3:7. Enfermedades arbovirieas y virosis afines Actualmente, los virus transmitidos por artrépodos (arbovirus) se clasifican segin sus propiedades bioguimicas y biofisicas y estén comprendidos entre las familias Togaviridae. Bunyaviridae, Reoviri- dae, Arenaviridae, Picornaviridae y Rhabdoviridae. La mayoria de los arbovirus patogenos para el hombre pertenecen a dos géneros distintos de la familia Togaviridae: los alfavirus (ani guamente grupo A) y los flavivirus (antiguamente grupo B). Los miembros de cada género estan relacionados seroldgicamente entre ellos. Los alfavirus comprenden los gérmenes de la encefalitis equina (occidental, oriental y venezolana), de Ross River y de Chi- Kungunya; los principales flavivirus son los de Ja fiebre amarilla, de Ta encefalitis japonesa, de la encefalitis transmitida por garrapat de la encefalitis del Valle Murray y los virus 1-4 del dengue. Las enfermedades producidas por los arbovirus pueden dividirse cen tres sindromes clinicos: 1) fiebres de un tipo no diferenciado, fre- cuentemente lamadas «de tipo dengue», con o sin erupcién maculo- papular y por lo general relativamente benignas; 2) encefalitis, a me- anudo con alta mortalidad, y 3) fiebres hemorrégicas, también fre- cuentemente graves y a menudo mortales. Algunos arbovirus, v.g.. Jos que producen la encefalitis transmitida por garrapatas, el dengue y la encefalitis japonesa, pueden estar asociados con mas de un sin- drome clinico. EI método clisico para diagnosticar una infeccién por arbovirus comprende el aislamiento del virus en ratones recién nacidos o en cultivos de células de vertebrados, seguidos de su identificacién por tuna de las técnicas seroldgicas clasicas (inhibicidn de la aglutinacion, fijacién del complemento y neutralizacién). Este procedimiento en general requiere mucho tiempo. Actualmente se hacen cultives celu- fares mas sensibles, especialmente los derivados de mosquitos, y tras la inoculacién con muestras, puede detectarse precozmente el antigeno virico mediante la TAF (26). La inoculacién intratordcica de muestras clinicas en mosquitos y la coloracién de anticuerpos fluorescentes de células de glindulas salivales infectadas obtenidas de cabezas trituradas pueden dar un resultado en 10-14 dias 27), Este método es relativamente lento pero muy sensible. Otros méto- dos nuevos, como la RPHA, pueden igualmente emplearse para de- tectar los virus en el liquido de cultivo o en la suspensién de encé- falo de ratén después de aislar los agentes causales. Esos:métodos tienen la ventaja de proporcionar pruebas de la infeccién antes que aparezcan sintomas en los ratones y antes del efecto citopatico en cultivos celulares. En algunas circunstancias es posible la detecci6n directa de virus en lesiones de enfermos. El virus de la encefalitis japonesa se de- tecta fécilmente por medio de la TAF en cortes 0 frotis de encéfalo tomados post mortem (28). Los virus de la fiebre del Colorado transmitida por garrapatas y la fiebre del Valle del Rift, mediante la TAF, se han encontrado asociados con eritrocitos. Desgraciada- mente, esta técnica s6lo puede emplearse con éxito en unas cuantas enfermedades. La deteccién de antigeno virico en material clinico como el suero, la orina, el LCR y lavados faringeos, mediante la ELISA y la RPHA, parece ser promisoria; ademas, el método de la RPHA ha resultado stil en algunos laboratorios para diagnosticar la fiebre hemorrdgica de Crimea y la fiebre del Nilo occidental, asi como para detectar viremias en crias de aves (29). La prueba inmu- noldgica en capa delgada es otro método que requiere més evaluua- cin. Se ha utilizado la inmunoelectro-osmoforesis para detectar el virus del dengue en sueros de enfermos, pero es una prueba relati- vamente insensible (30). El buen éxito de todas estas pruebas de- 28pende de una cantidad suficiente de virus en las muestras. Si los resultados son negativos, debe intentarse aislar el virus por métodos clasicos. También puede requerirse el aislamiento del virus por ra- zones epidemiolégicas y con fines de investigaci6n. Cuando no se ve ai enfermo al comenzar la enfermedad y no puede detectarse el virus, puede buscarse el anticuerpo especifico IgM para probar una infeccién reciente. Se sabe que, en la encefali- tis transmitida por garrapatas, la IgM especifica puede circular hasta durante 4 semanas (30). Ademas, este método puede aplicarse al diagnéstico de la infeccién primaria de dengue. La deteccién de IgM se practica actualmente comparando los resultados de la inhibicion de la hemaglutinacién antes y después del tratamiento de sueros me diante el 2-mercaptoetanol, con la ELISA y por medio de la TAF indirecta El diagnéstico serolégico depende todavia de métodos clésicos como la inhibicion de la hemaglutinacién, la fijacién del comple- mento y Ia neutralizacién. Se ha introducido Ia hemolisis radial sim- ple para detectar anticuerpos IgG-y se informa que es tan sensible como la inhibicién de la hemaglutinacién en casos de dengue, ence- falitis transmitida por garrapatas, ficbre amarilla, fiebre del Nilo oc- cidental y encefalitis equina venezolana (/2). La ventaja de la hemé- lisis radial simple es que no requiere la supresién de inhibidores s del suero y que puede obtenerse un resultado cuantita- tivo sin ninguna dilucién. El método parece prometedor, pero se ne- cesitan mds estudios comparativos para evaluar su utilidad en rela- cin con diferentes virus, Las muestras tomadas de enfermos con infecciones causadas por virus como los Lassa, Marbur y Ebola deben manipularse con cui- dado y enviarse a laboratorios de referencia de alta seguridad, con- forme lo recomienda la OMS (24). Esos virus pueden encontrarse en ‘material de autopsia del higado con la TAF 0 con microscopio elec- tronico. Los anticuerpos especificos contra ellas pueden detectarse mediante TAF indirecta utilizando portaobjetos con zonas circuns- ctitas preparados con células infectadas por virus (31). Este método también se emplea para detectar anticuerpos contra la fiebre hemo- rrdgica de la Crimea y el Congo, la encefalitis transmitida por garra- patas, la fiebre del Valle del Rift y la fiebre hemorrdgica coreana. Se ha intentado preparar portaobjetos polivalentes con una seleccién de alfavirus y flavivirus en las diversas zonas.3.8. Deteceién de IgM especifica En muchas infecciones viticas, la aparicin de los sintomas coi cide con la produccién de anticuerpos. Esto ha hecho sugerir que esas enfermedades viricas son de base inmunitaria y que, en el mo- mento de la enfermedad, ya no existen virus libres. La hepatitis A es un ejemplo excelente de este tipo de infeccién. Desde un punto de Vista prictico, esto a menudo significa que ya no puede detectarse el virus 0 el antigeno virico en el momento en que el enfermo ingresa fen el hospital. Ahora bien, en esos casos la deteccién de los prime- 10s anticuerpos especificos, IgM, ofrece un método satisfactorio de diagnéstico, pues no se necesita mis que una sola muestra de suero (2). Actualmente se sabe que, en la mayorfa de las infeeciones viricas, la IgM especifica aparece desde el segundo o tercer dia des- pués de iniciada la enfermedad y que, con métodos sensibles, puede observarse su persistencia hasta bien entrada la convalecencia. La presencia de IgM acompafia a la fase aguda de la enfermedad y puede considerarse como diagndstica de infeccién en curso. Pero la eficacia de la deteccién varia con la técnica empleada. Por medio de ‘métodos muy sensibles puede detectarse la IgM especifica durante varios meses. Esto plantea la cuestiOn de evaluar y adaptar la téc- nica utilizada segin su sensiblidad. Para detectar la IgM se ha empleado una amplia gama de técni cas. Pero,a excepcién de una, todas comprenden la deteccién de IgM en ausencia tanto de IgG como de factores reumatoides. Esta condicién es indispensable, pues la IgG compite con la IgM y es capaz también de fijar factores reumatoides, anticuerpos antiinmu- noglobulinas de la clase IgM. Esta competencia de la IgG con la IgM provoca resultados negativos falsos, en tanto que la fijacién por fac- tores reumatoides da lugar a resultados positivos falsos. Hay dos procedimientos distintos para resolver el problema de obtener IgM sin la intervencién de IgG ni de factores reumatoides. Primero, los sueros pueden separarse en fracciones que contengan IgG e IgM por medio de ultracentrifugacién con gradiente de densidad de la saca- rosa, cromatografia en gel u otros métodos aceptados. Segundo, con métodos de absorcién simple, como fijacién de la IgG al litex 0 a la proteina A del estafilococo, que pueden aplicarse para eliminar tanto Jos factores reumatoides como la IgG. Después de haber tratado los sueros, puede detectarse la IgM especifica mediante Ia TAF, la ELISA y la RIA, asi como por otros métodos, como la inhibicién de la hemaglutinacion 30Una prueba que no requiere la supresién de la IgG ni de los fac- tores reumatoides se funda en una técnica de anticuerpos de «cap- tura» en fase soiits con globulina antixi como primera capa, La muestra de suero por analizar se aplica entonces y toda IgM que all exista se absorbe, Se agrega el antigeno especifico como la capa si- guiente y s6lo se detectard la proporcién de Ia IgM dirigida contra este antigeno. Finalmente, se revelard la presencia o ausencia de una reaccién con trazadores radiactivos 0 enzimaticos. Estos trazadores pueden fijarse al antigeno afiadido o a un anticuerpo secundario diri- gido contra ese antigeno. Una variante reciente de la técnica, para detectar la IgM de la rubéola, es la técnica de inmunoabsorbencia en fase sélida (SPIT). La prueba se inicia como antes se indicé con la anti4i de «captura», en seguida el suero de prueba y luego la adicién del antigeno de la rubéola. En esta prueba se detecta el antigeno de rubgola absorbido mediante la adicidn de eritrocitos y la placa se lee como para una prueba de hemaglutinacién. Sin embargo, mientras la RIA y Ia ELISA estan actualmente bien comprobadas respecto a la IgM, la SPIT necesita mayor evaluacién antes que pueda s mendada Por iiltimo, los métodos anteriores de mostrar variaciones en el titulo de un antisuero antes y después de tratarlo con 2-mercaptoetanol, que degrada especificamente la IgM, pueden tener todavia utilidad préctica para infecciones especificas como la encefa- litis transmitida por garrapatas o el sarampidn, cuando no se dispone de métodos més. modernos (32) 4. REACTIVOS: PATRONES E INSPECCION DE LA CALIDAD Todas las téenicas descritas en el presente informe dependen del ‘suministro de reactivos debidamente probados Los problemas varfan desde los mas sencillos hasta los més com- plicados. El tipo mas sencillo de problema es el que plantean los reac tivos con escasa especificidad y bajos titulos. Los problemas mas suti- les son los que plantean los reactivos que funcionan bien en una prue. ba pero que, [por razones oscuras, son menos satisfactorios en otra prueba. Mayores problemas son la disponibitidad y la distribucién y, en los paises tropicales, la poca estabilidad de muchos reactivos. ‘Otros problemas estan relacionados con la necesidad de reactivos de referencia, conjuntos de muestras y técnicas uniformes. 314.1. Inspeceién de la calidad de los reactivos Los reactivos de mala calidad que han estado sometidos a poca inspeccién 0 no han tenido ésta pueden dar resultados que hagan du- dar de la seguridad del diagnéstico virol6gico répido. Ya se han esta- blecido centros de referencia de la OMS para el diagndstico virolégico rapido, y una de sus funciones es la inspeccién de Ia calidad de los eactivos. Donde no existan reactivos idéneos, esos centros deben ayudar a los que haya.en el lugar a producir y distribuir sus propios reactivos. Lo ideal seria que en todo el mundo pudieran obtenerse reac- tivos probados por laboratorios de la OMS. Los datos sobre inspe ci6n de la calidad deben proporcionarse con todos los reactivos sumi nistrados. 4.2. Reactivos de referencia Siempre serd necesario normalizar nuevos lotes de reactivos de trabajo antes de utilizarlos. Es lo que se hace comparando el nuevo reactivo con un patrén de referencia empleando una técnica de nor- ‘malizacién. Es0s reactivos normales deben ser producidos por centros de referencia de la OMS 0 por otras instituciones de alta investiga- cin. Deben ser producidos en tal forma, v.g., liofilizados, que puc- dan distribuirse facilmente por todo el mundo y conservar su activi dad original. Ademas, un reactivo de referencia debe producirse en cantidad suficiente para atender las necesidades por un perfodo pro- Tongado. 4.3. Normalizacién de técnicas Las caracteristicas de un reactivo patrén o de un nuevo reactivo de trabajo deben ser evaluadas por'una técnica uniforme. Los reactivos de origen comercial u otro deben surtirse.con una descripcién de una ‘técnica normal para su uso. Solo después de haber valorado su activi- dad con esta técnica deben emplearse otros métodos si asi se desea. 4.4. Conjuntos de muestras Se trata, en este contexto, de muestras (de suero u otro material clinico) de actividad conocida, utilizadas:para determinar la sensibili- dad y la especificidad de un método y que sirven como referencias 2ormales. Los conjuntos de muestras para algunos procedimientos, verbigracia, relacionados con Ia hepatitis B. pueden obtenerse por me- dio de la OMS. Es necesario integrarlos para otros sistemas, lo que puede ser dificil en algunos casos. Por tanto, se recomienda que todo laboratorio que trabaje sobre el terreno y tenga acceso a sustancias cli- nicas o de prueba idéneas considere la conveniencia de remitir esas sustancias para la constitucion de los conjuntos de muestras. Como los reactivos. Lo ideal seria que en todo ef mundo pudieran obtenerse reac- cantidad tan grande como sea posible, y distribuirse por medio de los eentros de referencia de la OMS. 4.5. Inspeceién adicional de Ia calidad ‘También pueden plantearse problemas con la normalizacién det equipo. Las placas de microtitulacién de plastico w otros objetos por- tadores usados para pruebas de fase sélida pueden vatiar en cuanto a sus caracteristicas de absorcién. Los lotes nuevos deben probarse siempre. Los microscopios de fluorescencia deben revisarse periddice mente, pues puede cambiar su capacidad de producir fluorescencia al envejecer las limparas. 5, TECNICAS RAPIDAS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCIONES VIRICAS: UN PROGRAMA DE LA OMS. La OMS ha mostrado especial interés en et perfeccionamiento de técnicas répidas de laboratorio para diagnosticar virosis y ha formula~ do un programa con el propdsito de introducir y fomentar el mayor uso posible de esta nueva tecnologfa en los laboratorios de salud pi blica de los Estados miembros. Una parte importante del programa de la OMS en el diagnéstico rapido de laboratorio de las virosis la constituyen Ia formacién para esta modeina tecnologia y su enseftanza, En aiios recientes se ha or- ganizado una serie de reuniones para grupos ¢ individuos, Para esa formaci6n se ha preparado un manual de la OMS sobre diagnéstico rapido de virus en el laboratorio (33). De todas estas actividades ha surgido una serie de principios itiles. Los alumnos deben ser personas que realmente practiquen las pruebas. Deben ser de alta competen- cia, de manera que, si es posible, puedan establecerse programas sa- télites de ensenanza, La formacién debe efectuarse sobre bases regio- 33rales. A fin de ayudar a establecer el diagnéstico rpido de virus en el laboratorio, Ia OMS se ha encargado de suministrar reactivos para inmunofluorescencia a laboratorios colaboradores durante un periodo limitado, hasta que los laboratorios locales lleguen a ser autosuficien- tes. Cuando se disponga de otros reactivos para diagnéstico rapido, podrén proporcionarse de igual manera, Una importante actividad complementaria de esta formacién seria el procurar que el equipo minimo esencial empleado durante el curso lo puedan obtener los la- boratorios que participan en el programa de formacién, En general se acepta que un programa de ensefianza y formacién en tecnologia de laboratorio virol6gico, realizado en estrecha colaboracién con las ofi- cinas regionales de la OMS, los centros colaboradores de la OMS para referencia ¢ investigaciones virol6gicas y otras instituciones inte- resadas, constituye uno de los instrumentos mas eficaces para robus- tecer y perfeccionar los servicios de diagnéstico de los laboratorios de salud piiblica. Otro modo importante de difundir el conocimiento especializado cen tecnologia rapida de laboratorio es el sistema de estudios compara- tivos internacionales organizados por la OMS. Esta comprobado que estos estudios pueden contribuir considerablemente no solo a evaluar técnicas recientemente elaboradas y a uniformar y efectuar la inspec- cidn de calidad de los reactivos, sino también a aprender més acerca de la ecologia de diversos virus y de su epidemiologia en diferentes partes del mundo. Con el propésito de obtener la participacién de laboratorios de los paises en desarrollo en los estudios comparativos internacionales organizados por la OMS_ se han establecido enlaces entre estos laboratorios y los centros colaboradores de la OMS para referencia ¢ investigaciones sobre diagndstico rapido de virus en el laboratorio, dentro del sistema de cooperaciGn técnica. Los estudios deben concentrarse en la rapida deteccion de agentes viricos de mues- tras clinicas, combinada con Ia aplicacién de medidas de atencién pri- maria de salud a la asistencia y el tratamiento de los enfermos. Es importante que esas actividades se coordinen con trabajos and- logos de otros programas de la OMS 0 de programas de otras organi- zaciones internacionales. 6. TENDENCIAS FUTURAS En el decenio pasado se ha efectuado un progreso de Ia virologia desde una disciplina de interés académico hasta otra de considerable 34utilidad practica. Por ejemplo, el diagndstico de laboratorio de la he- patitis virica y de Ja rubéola ha producido por si solo grandes cambios fen la atencién de la salud en todo el mundo. También dentro de este mismo lapso las técnicas apiicadas en virologia han cambiado radical- mente sobre todo por Io que respecta a la asistencia y el tratamiento de los enfermos y a la epidemiologia. Las técnicas rapidas de diagnos- tico virolégico han sido esenciales para este cambio, lo que ha induci- do al Grupo Cientifico a tomar en consideracisn los diversos métodos de detectar la presencia de virus o de antigenos viricos en todos los tipos de muestras elinicas. Los trazadores radiactivos y las reacciones de base enzimatica dan un grado de sensibilidad que permite detectar ‘componentes viricos sin el paso intermedio det cultivo eclular. Puede predecirse que, como estas pruebas sélo se han empleado durante un tiempo relativamente breve, se modificarén para proporcionar atin mayores sensibilidad y especificidad dentro de pocos afios. Ademés, debe esperarse que habra otros progresos, como mejores ststratos plastieos para las pruchas de fase sélida y mejores medios de conser- var y almacenar antigenos inestables. Las técnicas genéticas, entre eilas la modificacién de genes y la tecnologia de clonacién e hibridacién, nos permitiran en to futuro producir antigenos y anticuerpos de diagndstico «bien definidos», «a la medida», de especificidad y homogeneidad absolutamente conoc das, y en tales cantidades que sera posible abastecer a la mayoria de Ios laboratorios del mundo con reactivos de! mismo lote durante mu- cho tiempo. Simultaneamente con estos progresos del diagndstico se produciran yacunas nuevas y perfeccionadas, interferdn y sustancias antiviricas. Estos adelantos destacan més atin ja importancia del diag- néstico rapido, que permitiré tratar de manera practica un niimero cada vez mayor de virosis y beneticiar con ello tanto a individuos ‘como a comunidades. El diagnéstico virol6gico rapido es indispensable en Ia medicina clinica. Como apenas se inicia, ofrece brillantes perspectivas aunque sea imposible predecir con precisién los adelantos que tendré en el porvenir. 7. RECOMENDACIONES I diagndstico rapido de infecciones viticas en el Laboratorio pue~ de lograrse mediante una serie de técnicas, como se describe en las siguientes recomendaciones generales y espei 357.1, Recomendaciones generales TAL. Deteccion de ta IgM 1) La deteccién de la IgM especttic ho se dispone facilmente de virus o antigeno virico. La rubéola, la cencefalitis transmitida por garrapatas y la hepatitis A son ejemplos en los que ha resultado de considerable utilidad, aunque la deteccién de la IgM también ha sido valiosa en otras infecciones viricas. 2) Los métodos fundados en la técnica del anticuerpo anti- de «captura» parecen scr titles, pues soslayan la necesidad de separar las IgM, IgG y los factores reumatoides, pero tienen que ser evaluados més ampliamente respecto a ciertas infecciones viticas. 3) No pueden recomendarse otros métodos de deteccién de la IgM si no se han eliminado la IgG especifica y los factores reuma- toides. es el método de eleccién si 7.1.2. Reactivos: patrones ¢ inspeccién de la calidad 1) Debe fomentarse la produccién de reactivos sometidos a muy stricta inspeceion de la calidad y deben establecerse centros de refe- encia para probarlos. 2) Debe suministrarse reactivos de referencia a los laboratorios que produzcan reactivos de trabajo, de manera que éstos puedan ser normalizados, 3) Debe facilitarse la informacién sobre las técnicas uniformes que se han empleado para establecer las caracteristicas de los reacti- vos de trabajo, 4) Siempre que se necesiten, deben suministrarse los conjuntos de muestras que permitan evaluar la sensibilidad y la especificidad de los reactivos y los procedimientos de prueba. 5) Debe prestarse asistencia internacional, en. todo el mundo, para la distribucién de reactivos de trabajo. 7.1.3. Programa de la OMS sobre el diagnéstico rapido de infeccio- nes viricas en et laboratorio 1) Debe continuar la colaboracién entre la OMS y los servicios gubernamentales de salud a fin de poner en prictica el programa de 36fomento de las téenieas répidas de diagndstico en los laboratorios de salud pablica de los Estados miembros, especialmente en los paises cen desarrollo. 2) En todas las regiones de la OMS deben continuar los progra- ‘mas de ensevianza y formacisn eficaces sobre técnieas ripidas de labo~ ratorio para grupos ¢ individuos. La organizaciGn de cursos de forma- cién en el uso practico de esas técnicas debe coordinarse con otros ‘grupos de expertos interesados. 3) ‘Deben fomentarse y organizarse proyectos colaborativos de investigacion sobre diagnéstico rapido de virus en el laboratorio, en paises desarrollados y en desarrollo, Es necesario hacer estudios com- parativos de técnicas clasicas y de las nuevas técnicas, répidas y senci- Tas. '4) Seria conveniente contar con un centro colaborador para fines de referencia ¢ investigaciones sobre diagndstico rapido de virus en el laboratorio en cada una de las regiones de la OMS. Ademis de servi cios de referencia ¢ investigacin, esos centros podrian proporcionar asesoramiento y formacién en materia de aplicacién de téenicas para el diagnéstico rapido de virus en el laboratorio. 7.2. Recomendaciones especificas 7.2.1, Enfermedades respiratorias 1) El método de eleccién para detectar antigenos viricos en las secreciones nasofaringeas es Ia técnica de anticuerpos fluorescentes. 2) Otros métodos de deteccién de antfgenos viricos, como la prucba inmunoabsorbente ligada a la enzima (ELISA), requicren mayor evaluacién. 3) Por sus dficultades técnicas. no se recomienda la deteccién de virus ni antigenos viricos mediante la técnica histol6gica de la inmu- noperoxidasa ni la’ mieroscopia electrénica 7.2.2. Enfermedades diarreicas 1) Se recomienda Ia ELISA para la deteccién de rotavirus. Siem- ppre que sea posible, debe emplearse la microscopia electrénica para detectar rotavirus y virus no cultivables. 2) La agregacién de eritrocitos recubiertos en fase s6lida es una 37técnica prometedora para detectar rotavirus y debe someterse a mayor evaluacién, 3) _Deben perfeccionarse métodos para detectar virus no cultiva- bles y aplicar esos métodos en estudios comparativos a fin de estable cer su importancia para las enfermedades diarreicas en el ser humano. 7.2.3. Hepatitis virica 1) Para diagnosticar la hepatitis B el método de eleccién debe ser una técnica por lo menos tan sensible como la hemaglutinacién inversa pasiva (RPHA) 2) El método de eleecién para diagnosticar la hepatitis A actual- mente es la deteccién de la IgM anti-HAV en cl suero en la fase aguda 7.24. Enfermedades de transmisién sexual 1) _ Por los virus 1 y 2 del herpes simple: ef método de elecci6n en las lesiones herpéticas genitales es la detecciGn del virus o del antige- no virico mediante la microscopia electrénica o la técnica de anticuer- os fluorescentes (TAF) y la inoculacién de esas muestras en cultivos Celulares susceptibles para lograr la deteccidn del antigeno vitico tras la incubacién de un dia para el siguiente 2). Por citomegalovirus: puede detectarse el antigeno en la orina mediante microscopia electrGnica o Ia ELISA en lactantes infectados congénitamente. En algunos casos puede ser util el aislamiento del virus en cultivo tisular. Es necesario evaluar mas la utilidad de la deteccién de la IgM especifica en recién nacidos y embarazadas. 3) Por Chlamydia: debe practicarse e! diagndstico por aislamien- to en cultivo tisular y deteccidn del agente mediante la TAF, la colo- racién de Giemsa 0 ambas cosas. Sin embargo, es necesario explorar técnicas rapidas, como la ELISA, para detectar ant no gonocécicas. 4) Por virus de la hepatitis B; ya se recomendaron pruebas en la secei6n 3.3 7.2.5. Enfermedades del sistema nervioso central 1) Rabia: el mejor método de diagnosticar rapidamente esta en- fermedad en animales sospechosos de transmitirla es la deteccién del 38“antigeno en el sistema nervioso central mediante la TAF. En el hom- bore, el diagndstico se hace por deteccién dei antigeno virico mediante la TAF en muestras asequibles o por deteccién de anticuerpos espect- ficos en los no vacunados. 2) Sarampi6n: en la encetaltis sarampinosa aguda, el diagnéstico puede fundarse a menudo en sintomas clinicos. Sin embargo, en en- fermos inmunizados que presentan signos de encetalitis. el método de ‘elecciGn es la deteccién del antigeno virico en secreciones nasofarin- eas mediante la TAF. Se recomienda Ia detecci6n de la IgM especifi ca en casos de encefalitis después de sarampién atipico. 3). Herpes simple por virus 1 y 2: detecci6n del virus del antige- no virico mediante la TAF 0 a microscopia electrSnica cuando pueda ‘contarse con materiales de biopsia encefélica, Esas muestras deben inocularse también en cultivos celulares susceptibles en los cuales, tras incubacién de toda la noche, puede detectarse el antigeno virico ‘mediante la TAF. En periodos ulteriores de la enfermedad puede ser ‘wil para el diagnéstico la deteccién de anticuerpos especificos produ- cidos en el sistema nervioso central 4) Parotiditis epidémica: en caso de duda clinica, se recomienda Ja deteccién del anticuerpo IgM especifico en sueto y la inoculacién dde muestras en cultivos celulares, seguida de la deteccién del antigeno vitico mediante la TAF. 5) En general: se necesitan més investigaciones colaborativas pa~ ra Ja deteecion de antigenos viricos en el liquido cefalorraquideo me- diante métodos como la ELISA. En ningiin caso deben emplearse eélulas del liquido cefalorraquideo para deteccién de antigenos me- diante la TAF en infecciones del sistema nervioso central. 7.2.6. Enfermedades de ta piel y de los ojos 1) La microscopia electrSnica es el método de elecci6n para de- tectar virus en lesiones sélidas y vesiculares de Ia picl. 2) Em infecciones que se sospeche sean herpéticas, deben exami- narse muestras del ojo o de la piel directamente mediante la TAF o la microscopia electrénica siempre que sea posible, y esas muestras de= ben inocularse en cultivos celulares susceptibles y tefirse por TAF, con lo cual se identificardn virus herpéticos humanos tras incubacién de toda la noche. 3) Para detectar adenovirus deben examinarse raspados oculares mediante la TAF o la microscopia electrénica. EI empleo de la ELI- SA para ese fin requiere mayor evaluacién, 394) En la rubéola, las técnicas elisicas actuales, como la inhibi- cin de la hemaglutinacién y la fijacién del complemento para detec- tar anticuerpos pueden dat a menudo un diagnéstico de la infeccién. Cuando Ios resultados de estos métodos sean equivacos, se recomien- da la deteccién de la-IgM especifica, 5)__El mejor método de diagnosticar el sarampién es la deteccién del antigeno en secreciones nasofaringeas con técnicas inmunofluores- centes. 7.2.7. Enfermedades producidas por arbovirus y virus afines 1) Mientras no se disponga de téenicas mas répidas y sensibles, deben diagnosticarse estas enfermedades aislando el virus en ratones recién nacidos 0 en cultivos celulares y mediante la inoculacién intra- tordcica de mosquitos, seguidas de la deteccién del antigeno por Ja TAF. 2) La deteccién de IgM especifica ha resultado itil en el diagnés- tico precoz de ciertas infecciones por arbovirus, y la utilidad de este método para otras infecciones requiere mayor evaluacién 3) En etapas avanzadas de la enfermedad y durante la convale- cencia puede hacerse el diagndstico seroldgico por métodos clisicos, como la inhibicién de la hemaglutinacién y la fijacién del complemen to. Los nuevos métodos serol6gicos, como a TAF indirecta y la he- mélisis radial simple, requieren: mas evaluacién. 4) Es necesario hacer estudios comparativos de métodos y téeni- «2s rapidas con que se cienta actualmente, como la prueba inmunol6- gica en capa delgada y la ELISA, para la deteccién de antigenos viri- 5) Deben organizarse estudios colaborativos” para probar la RPHA con el objeto de determinar su utilidad para el diagnéstico rapido del dengue, la encefalitis transmitida por garrapatas y tal vez otras infecciones por arbovirus. 6) Cuando se sospeche la existencia de infecciones por virus Ebola, Marburg y Lassa, deben enviarse muestras a los laboratorios de referencia de la OMS aplicando los procedimientos de seguridad que recomienda la OMS, 40