Metodologa para el control de

patgenos en la industria crnica

CAROLINA PREZ LANCHO
Grupo Navidul

e todos es sabido la necesidad de evitar cualquier foco de toxiinfeccin alimentaria ya que

sus consecuencias sanitarias y econmicas son ciertamente importantes. En esta premisa se fundamenta el desarrollo de una metodologa en el control de microorganismos patgenos en la industria crnica que incide sobre
todos los puntos o focos considerados como posibles vas
de contaminacin.

Introduccin
Cuando se habla de control de patgenos en la industria crnica
existe una tendencia clara a pensar en un anlisis microbiolgico
del producto o productos que una
determinada industria produce. Indudablemente este es un punto
tremendamente importante ya que
nos permite conocer qu estamos
ofreciendo al consumidor y bajo
qu condiciones microbiolgicas
se encuentra. Sin embargo, de po-

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co sirve conocer cmo est el producto final si desconocemos su

proceso de fabricacin, qu mtodo de trabajo se ha seguido para su elaboracin y si ste ha sido
acertado o no; en definitiva, necesitamos conocer y controlar el
proceso productivo para confiar en
la salubridad del producto final.
Para que esto ocurra son necesarios unos apoyos y recursos que
surgen tras una evolucin continua de la propia industria pareja
a la propia evolucin y desarrollo
de un departamento de gestin de calidad.
En sus inicios,
nuestra empresa se
dedica a vender
aquello que produce; cuando esta produccin es elevada
comienzan a apreciarse costes por
No Calidad y as se
plantea crear el departamento de gestin de calidad (ao
86) cuyo nombre no
es un capricho, sino que lleva implcito el compromiso
claro que aquellos
datos obtenidos en
un control analtico
nos sirvan o ayuden
a gestionar, planificar y asegurar la calidad de nuestros
productos.

La figura del inspector de

calidad
El departamento de gestin de
calidad continua su camino y en
un determinado momento de su
evolucin (enero 1991) incorpora
la citada figura. Como su propio
nombre indica, se dedica a inspeccionar pero, comenzando por
un punto del proceso que consideramos muy importante y necesario cuidar para no llegar a ser

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problemtico: la materia prima. El

inspector comprobar si su envo y
recepcin se realiza en el transporte y condiciones (temperatura,
pH, humedad ....) conforme a las
especificaciones del departamento citado. Por supuesto, su cometido y control se extender a otros
puntos del proceso (agua, sal, salas de procesado y transformacin...) y a una colaboracin muy
estrecha con el laboratorio, pero,
lo ms importante es tener ms
seguridad en ese punto tan con-

flictivo y trascendental ya mencionado: la materia prima.

Formacin de operarios
En la bsqueda constante de posibles vas de contaminacin, encontramos una laguna en el comportamiento de ciertos operarios
de zonas ms o menos conflictivas del proceso productivo. En definitiva, hay manipuladores que necesitan conocer que ellos pueden
ser un vehculo de contaminacin

pero que sta es evitable. Aparece

as la formacin de manipuladores (1991) y el control higinico
de unos operarios especficos: personal de transformacin de producto (1994). Este control higinico se realizaba antes de
comenzar la manipulacin del producto, tomando muestras de las
manos del manipulador con laminocultivos de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa (V.R.B.D.) para la deteccin de Enterobacterias.

Control de
superficies:
sistema
H.A.C.C.P.
Pensando en otras
posibles vas de contaminacin, aparecen como tales las
superficies de trabajo y los utensilios utilizados durante el
proceso productivo.
As, a partir del ao
1992 se empieza a
tomar muestras al
azar (recuento de
mesfilos aerobios
por cm2) y en el ao
1994 ya se establece un control rutinario de superficies
que ms tarde se
denomin H.A.C.C.P.
(Anlisis de Riesgos
y Control de Puntos
Crticos).
Ya en Agosto de
1996 se implementa el control de
superficies de Listeria spp. como
punto muy importante en el control de patgenos.
En la actualidad, este sistema
H.A.C.C.P. se est automatizando
con la incorporacin de un equipo
que nos ofrece una lectura rpida
de L.R.U. (Unidades Relativas de
Luz) de la superficie analizada, medida directamente proporcional a
la cantidad de microorganismos
presentes en esa superficie. La

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rapidez de esta informacin es

esencial en las reas de transformacin, autorizndonos o no al comienzo del trabajo en la zona citada.

Control analtico
microbiolgico
La evolucin de nuestra empresa:
- Aumento de la produccin.
- Certificacin UNE-EN-ISO 9002
(25.07.95).
- Nuevas vas de exportacin (includo E.E.U.U., ao 1996)...nos
obliga tambin a una evolucin en
la analtica microbiolgica. Los
clientes son cada vez ms exigentes con las caractersticas microbiolgicas de los artculos que
desean adquirir, quieren confianza en los mismos y que esta confianza est avalada por una serie
de determinaciones cuyos resultados no pueden demorarse demasiado en el tiempo; por ello,
hay que marcarse un objetivo claro: producir datos analticos de
precisin y fiabilidad suficientes
en un plazo aceptable y a un coste admisible.
En este objetivo se fundamenta
la bsqueda y la investigacin de
nuevas tcnicas analticas para la
deteccin de microorganismos patgenos de inters en la industria
crnica, como son:
- Escherichia coli
- Staphylococcus aureus
- Clostridium sulfito reductores
- Listeria monocytogenes
- Salmonella spp.
- Escherichia coli O157:H7
Comenzaremos por aquellos microorganismos cuya deteccin no
precisa de un instrumental suplementario al comnmente encontrado en un laboratorio de microbiologa:
* Escherichia coli (no E.coli
O157:H7):
Bacilo gram negativo de la familia Enterobacteriaceae (Bergeys

9 edicin).
Crece en lmites de temperatura
comprendidos entre 15C y 45C
destruyndose a temperatura de
congelacin y pasteurizacin.
Es husped constante del intestino del hombre y mamferos.
Por su especificidad, est considerado como un buen ndice de
contaminacin fecal y al vivir poco tiempo en ambiente extraentrico, su presencia en los alimentos indica que esta contaminacin
es reciente.
Existen cepas patgenas para
el hombre causantes de manifestaciones gastroentricas de mayor o menor magnitud.
Deteccin: Se realiza siembra
en placa en un medio especfico,
como el Agar Coli ID, incubndose 24-48 h a 37C. Este medio
contiene dos substratos cromgenos: uno que pone de manifiesto la enzima - galactosidasa y tie los coliformes de color
azul y otro que pone de manifiesto la - glucuronidasa y tie
las colonias de E. coli en color
rosa.
* Staphylococcus aureus
Coco gram positivo perteneciente a la familia Micrococcaceae (Bergeys, 9 edicin). Sus temperaturas extremas de crecimiento
estn entre los 6C de mnima y
los 46C de mxima pero puede
sobrevivir a la desecacin y a la
congelacin, destruyndose en general a la temperatura de pasteurizacin.
Es un germen ubicuitario, encontrndose en el hombre (nasofaringe, piel, folculos pilosos, ...)
y en numerosas especies animales as como en aire, polvo, leche.
Su contaminacin a los alimentos
se produce habitualmente a travs de manipuladores con heridas,
abscesos y por locales y utensilios poco higinicos.
Algunas cepas de esta especie
tienen la capacidad de elaborar

toxinas extremadamente activas

que son la causa de intoxicaciones alimentarias: gastroenteritis
de aparicin brusca de distinta
gravedad.
Deteccin: Medio Baird Parker en placa. Incubacin 48 h
a 37 C. Este medio contiene
cloruro de litio y telurito que inhiben la flora acompaante y piruvato y glicocola que favorecen su crecimiento. St aureus
reduce telurito a teluro de ah
que sus colonias aparezcan de
color negro y, su accin proteoltica y lipoltica se manifiesta con halos alrededor de la colonia. Tras su recuento, se
pueden hacer otras pruebas de
confirmacin:
Coagulasa (positiva)
DNAsa (positiva)
Aglutinacin en porta en presencia de anticuerpos.
* Clostridium sulfito reductores
Bacilos gram positivos, pertenecientes al gnero Clostridium
(Bergeys, 9 edicin)
Su capacidad para esporular
les confiere gran resistencia ya
que stas sobreviven a la accin del calor.
Se pueden encontrar en el suelo, polvo, intestino humano y de
algunos animales y en alimentos
crudos o cocinados.
Su patogenia tiene relacin con
la produccin de enterotoxinas que
se liberan en el intestino delgado
pudiendo producir diarreas, nauseas, gangrena y toxemia mortal
en algunos casos.
Deteccin: Medio Sulfito Polimixina Sulfadiazina (S.P.S.) en tubo.
Se incuba en anaerobiosis 48 h a
37C. Estos microorganismos reducen el sulfito a sulfuro que reacciona con el citrato de hierro del
medio y tie las colonias de color
negro.
Para el anlisis e identificacin
de los siguientes microorganismos, necesitamos una instru-

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A la izquierda: crecimiento de coliformes (color azul) y de Escherichia coli (color rosa) en Agar Coli ID.
A la derecha: crecimiento de Listeria monocytogenes en placa de Palcam.

mentacin extra: Equipo VIDAS

(Biomrieux). Este equipo a travs de la tcnica ELFA (Enzime
Linked Fluorescent Assay) permite
una deteccin especfica del antgeno en estudio. Para cada test
realiza dos lecturas de fluorescencia: la primera tiene en cuenta
el ruido de fondo debido a la cubeta y el sustrato y la segunda hace una lectura final. La diferencia
entre ambas lecturas nos da el
RFV (Valor Relativo de Fluorescencia). El RFV obtenido para cada muestra es interpretado por el
Sistema VIDAS segn el siguiente
procedimiento:
Valor del test = RFV muestra /
RFV standar

Un resultado con un valor de

test inferior al umbral indica una
muestra con antgenos indetectables de la especie en cuestin, un valor de test superior al
umbral, indica una muestra contaminada con el microorganismo.
As obtendremos, ausencia o presencia por 25 g de muestra del
microorganismo objeto de estudio.
* Listeria monocytogenes
Bacilo gram positivo perteneciente al gnero Listeria (Bergeys,
9 edicin) aislado por vez primera en conejo (1911).
Sus lmites de crecimiento estn entre 1C y 45C, creciendo a

El departamento de gestin de calidad debe

obtener datos mediante controles analticos que
sirvan o ayuden a gestionar, planificar y asegurar
la calidad de los productos
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4-5C y sobreviviendo a temperatura de pasteurizacin (Doyle,1987).

Es un microorganismo altamente ubicuitario: ensilados, suelo,
plantas, abonos, leche, quesos,
vegetales, productos crnicos e
intestino del hombre, animales,
aves, peces, crustceos e insectos.
Generalmente son sensibles a
su accin patgena personas inmunodeprimidas (ancianos, mujeres embarazadas, nios, enfermos
crnicos,...) y las manifestaciones
de su contagio son diversas: meningitis, aborto, septicemia perinatal,... La tasa de mortalidad es
alta (20%), superior en nios y ancianos, existiendo una relacin
cuantitativa entre el nivel de produccin de hemolisina y la severidad de la enfermedad.
Deteccin: Desde el ao 1992
hasta la incorporacin en abril de
1997 del Sistema VIDAS, se pusieron a punto y desarrollaron diversas tcnicas analticas.

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Para la puesta a punto del protocolo actual se analizaron simultneamente 90 muestras procedentes del mismo producto crnico
y tras definir el protocolo idneo
se utiliz ste en paralelo junto a
la tcnica utilizada hasta entonces hasta completar un total de
150 muestras.
Como, se observa en el anexo
1 se utilizaron 25 gramos de
muestra con 2 caldos de preenriquecimiento diferentes: Caldo Fraser y Caldo UVM-1. Para cada protocolo de trabajo (6 diferentes) se
analizaron 15 muestras:
- 5 para A (muestra sin ningn
tipo de adicin).
- 5 para B (adicin de cepa de
L. monocytogenes).
- 5 para C (adicin de L. innocua)
Tras la etapa de preenriquecimiento se realizaron las etapas
que se indican en el anexo, confirmndose que el protocolo ms
eficaz para la deteccin de
(L.monocytogenes) era el siguiente:
- Preenriquecimiento en Caldo
Fraser, 24 h a 30C.
- Enriquecimiento en tubo de Caldo fraser. 24 h a 30 C.
- Deteccin por Sistema VIDAS.
Test positivo >=0.05.
Se pueden realizar diferentes
pruebas confirmativas:
- Siembra en Agar Palcam a partir del tubo Fraser.
- API Listeria (diferentes pruebas
bioqumicas).
- Catalasa (es positiva).
- Gram (positivo).
- - hemlisis en presencia de
hemates (positiva).
* Salmonella spp.
Bacilo gram negativo de la familia Enterobacteriaceae (Bergey
s, 9 edicin).
Puede crecer entre lmites de 5y
47C y normalmente se destruye
tras la pasteurizacin, sin embargo, puede sobrevivir largo tiempo
en alimentos congelados.

Anexo 1
L. monocytogenes

A: sin adicin
B: ms L. monocytogenes
C: ms L. innocua

25 g + 225 ml Caldo Fraser

24h./30C

Sistemas Vidas

24h./30C

Placas Palcam

24h./30C

Tubo Fraser

24h./30C
Resultado: A B C
(-) (+) (-)

24h./30C
Vidas

A B C

A B C
(+) (+) (-)

25 g + 225 ml UVM-1

24h./37C

Sistemas Vidas

24h./37C

Placas Palcam

24h./37C

Tubo UVM - 1

24h./30C
Resultado: A B C
(-) (+) (-)

24h./30C
Vidas

A B C
(-) (+) (-)

A B C
(-) (+) (-)

Protocolo ms efectivo

Su reservorio primario es el tracto intestinal de vertebrados de

sangre caliente y fra, as como insectos y, su transmisin es sobre
todo, por contaminacin fecal o
contaminacin cruzada de los productos alimentarios.
Las Salmonellas forman un grupo antignico complejo con ms
de 2.200 serovariedades diferentes por antgenos somticos (O) y

flagelares (H).
Para el hombre podemos hablar
de dos grandes tipos de infeccin:
- Fiebres tifoidea y paratifoidea y
gastroenteritis.
Deteccin: Normalmente su investigacin implica la realizacin
de complejos protocolos que pueden durar varios das. Actualmente, hemos optimizado una tcnica

La formacin de los operarios permitir a estos

conocer que pueden ser un vehculo de
contaminacin pero que sta es evitable
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Anexo 2
Salmonella spp
25 g + 225 ml Peptona Tamponada

16-18h./37C
Inmunoconcentracin sistemas vidas

Placa SMID

24h./37C

Confirmacin colonias
rosa "chicle"
-

Test oxidasa
Latex-test
Mucap-test
Api 20E

en la cual empleamos 48 horas

(anexo 2).
Tomamos aspticamente 25 gramos de alimento y lo agitamos junto a 225 ml. de agua de peptona
tamponada. Incubamos 16-18 horas a 37C. Pasado este tiempo
se realiza una inmunoconcentracin en el sistema VIDAS (tira ICS)
y tras sta, se sumerge con precaucin un bastoncillo estril en
el pocillo 1 de la tira ICS, sembrando con l una placa de un medio selectivo para Salmonella (en
nuestro caso medio SM ID) y tras
incubar 24 horas a 37C confirmaremos las colonias de color rosa chicle. Para ello, lo ms aconsejable es hacer un -test oxidasa y

descartar as todos los microorganismos oxidasa positivo (Salmonella es oxidasa negativo) y tras
esta prueba podemos optar por realizar una batera de pruebas bioqumicas (API 20E 24 horas
a 37C) o bien optar por otros recursos:
- Latex-test: reaccin antgenoanticuerpo. No existen falsos negativos pero s puede haber falsos positivos (algunos oxidasa
positivo como Pseudomonas o algunas enterobacterias de cultivos
viejos como Serratia).
- Mucap-test: solvente orgnico
que contiene metylumbeliferona
que por accin de la C8 esterasa
libera umbeliferona que es fluorescente a 366 nm. Existen falsos
positivos como Pseudomonas y Aeromonas.
* Escherichia coli O157:H7
Bacilo gram negativo de la familia Enterobacteriaceae (Bergeys, 9 edicin).
Su temperatura ptima de crecimiento es a 37C y posee ciertas particularidades con respecto al resto de serotipos de su
especie:
- No posee la enzima b-glucuronidasa por lo que no se tie en
medios con sustratos cromgenos ni da fluorescencia en los medios con MUG (4 metil umbeliferil
-D glucurnico).
- No crece bien a 44C.
- No utiliza sorbitol.
Reside en el intestino de hombres y mamferos y su patogenicidad se reconoci en 1982, siendo el agente productor de
diferentes enfermedades: colitis
hemorrgicas con severo dolor abdominal, agudo fallo renal. La en-

Hay que marcarse un objetivo claro: producir datos

analticos de precisin y fiabilidad suficientes
en un plazo aceptable y a un coste admisible
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Anexo 3
E. Coli 0157: H7

25 g + 225 ml de mTSB
6h./42C

1 ml.
Caldo MacConkey +
Cefexime - Telurito

18 1h. / 37C
1 ml. terminar 15' 100C

500 l
Vidas

fermedad puede progresar hasta

el sistema nerviosos central causando la muerte.
Los casos de enfermedades y
mortalidad estudiados hasta la
fecha son debidos a la ingesta
de productos crudos o poco cocinados y de leche no pasteurizada.
Deteccin: El esquema del protocolo aparece en el anexo 3. Se
toman 25 gramos de la muestra
problema y se agita junto a 225 ml
de mTSB (Caldo Trypcase de Soja
modificado con Sales biliares,
Na2HPO4, Peptona clorhidrato de
casena y novobiocina). Se incuba
6 horas a 42C y tras este tiempo, 1 ml de esta solucin madre
se transfiere a un tubo de caldo
MacConkey + Cefexime-Telurito (Cefexime inhibe crecimiento de Proteus y telurito inhibe a otros no fermentadores
de
sorbitol:
Aeromonas, Hafnia alvei...)

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Se incuba 18 1 hora a 37C y

se termiza 1 ml durante 15 minutos a 100C. Se dispensan
500 ml en una tira Vidas para
E.coli O157 y esperamos resultados. Ser positivo si el test Vidas >= 0,10. Realizaremos la
confirmacin realizando una siembra a partir del tubo de caldo MacConkey en Agar MacConkey Sorbitol + Cefexime-telurito. Incubar
24 horas a 37C y confirmar las
colonias incoloras:
- Latex E.coli O157
- Antisuero E.coli H7

Nota
El artculo est elaborado a partir
de la conferencia impartida por Carolina Prez en el V Simposio bioMrieux de anlisis microbiolgico industrial, celebrado durante la feria
Alimentaria 98.

Bibliografa
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