9/15/2016

Tizn tardo de la papa

Phytophthora infestans

AGROBIOTECNOLOGA2016
Marchitez del Laurel
Raffaelea lauricola

Roya del tallo del trigo

Resistenciaahongosyoomicetesfitopatgenos
medianteingenieragentica
MaraEugeniaSegretin

DepartamentodeFisiologa,BiologaMolecularyCelular
FacultaddeCienciasExactasyNaturales
UniversidaddeBuenosAires

36,5%deloscultivos anivel mundial

afectados por enfermedades
(Agrios,2005)

Puccinia graminis f. sp. tritici

Greening
de los ctricos

Escoba de bruja
y monilia (o vaina escarchada)

Candidatus liberibacter

Moniliophthora sp.

Mildis (downy y powdery mildew)

Peronosporaceae y Erysiphales

Enfermedad de Panam
Fusarium oxysporum

Roya del caf

Downy mildew
(mildi lanoso):
quinoa

Hemileia vastatrix

Peronosporaceae

Hongosy
oomicetes:
parecidos
pero
diferentes

Relacinfilogenticaentrehongosyoomicetes

Pared celularconcelulosaybeta
glucanos (muypocaquitina)

Pared celularconquitina
(raramentehaycelulosa)

Agrios, 2005

9/15/2016

Muchoshongosyoomicetesdesarrollanestructurasespecializadasparapenetrar
ycolonizarlostejidosdelaplanta

Loshaustoriosaumentanelintercambio
desustanciasentreelhongoylasclulasdel
husped.

Hongosyoomicetesdeimportanciaagronmica
Losapresoriossonestructuras
especializadasenatravesarlacutcula.

GentilezaDr.A.Vojnov

MiceliodePeronsporaparasitica
desarrollando haustoriosenclulas
deArabidopsisthaliana (40x)

Top10
Hongosyoomicetes
fitopatgenos

Deanetal.,MolPlantPathol.2012
Kamounetal.,MolPlantPathol2015

MC Fisher et al. Nature 484, 186-194 (2012) doi:10.1038/nature10947

9/15/2016

Reportesde
alertaspor
enfermedades
causadas
porhongos

Daoscausadosporhongosfitopatgenos

Arribaizquierda:InfeccinporPuccinia
polysora enhojasdemaz(roya)
Arribaderecha:Sntomasprovocadospor
Ustilagomaydis enmazorcasdemaz(carbn
delmaz)
Abajoizquierda:InfeccinconGibberellazeae
(Fusariumgraminearum)enespigasde
cebadayengranosdemaz(inserto)

MC Fisher et al. Nature 484, 186-194 (2012) doi:10.1038/nature10947

P. infestans es un patgeno devastador que afecta la produccin del

cultivo de papa

Phytophthora (destructordeplantas en
griego)incluyealospatgenosms
importantesqueafectanplantas
dicotiledneas,causandoprdidasde
billonesdedlares anivelmundial

Phytophthorainfestansocasionaeltizntardo
delapapaydeltomate,ydentrodelgnero,es
laespeciequemsperdidasocasionaenlos
cultivos

P.infestansfueelpatgeno causantedelaGran
hambrunairlandesa(18451851)

P.infestanspuededestruiruncampodepapas
enunasemanasinoescontrolado

Esunadelasprincipalesenfermedadesque
afectaalcultivodepapaenArgentina

9/15/2016

P. infestans es un patgeno devastador que afecta la produccin del cultivo

de papa

DaoscausadosporPhytophthorasp.

P.parasitica
Kamounetal.,MolPlantPathol,2015

Daoscausadosporoomicetesfitopatgenos

DaoscausadosporPhytophthorasp.

P.capsici
P.sojae
http://www.fieldcroppathology.msu.edu/

Kamounetal.,MolPlantPathol,2015

PrdidasencultivosdepimientosporPhytophthoracapsici

9/15/2016

Muerte sbitaderoblecausadaporeloomicete
Phytophthoraramorum

Daoscausadosporhongosfitopatgenos

Lesiones concntricas causadas por Colletotrichum gloeosporioides

(izquierda arriba) y manchas causadas por Podosphaera leucotricha
(izquierda abajo) en frutos de durazno. Centro: pudricin en pepinos
causada por Rhizoctonia solani. Derecha Arriba: Manchas necrticas en
papaya causadas por Stemphylium lycopersici. Derecha abajo: infeccin
por Botrytis cinerea en frambuesas.

Daoscausadosporhongosfitopatgenos

Daoscausadosporhongosfitopatgenosentrigo

EnfermedadresultantedelainfeccindearrozytrigoconMagnaportheoryzae.

Deanetal.,MolPlantPathol.2012

Izq:trigoinfectadoconPucciniagraminis
f.sp.tritici (royanegradeltallo).Der.
arriba:trigoinfectadocon Puccinia
striiformisf.sp.tritici (royaestriada
amarilladelahoja);derechaabajo:tizn
ocasionadoporFusariumgraminearum
Deanetal.,MolPlantPathol.2012

9/15/2016

Elmanejode
enfermedades
fngicasse
basaenlas
prcticas
preventivas
yenla
aplicacinde
fungicidas

Prcticastradicionalesdeprevencin
Seleccindevariedadesnaturalmenteresistentes
Empleodetcnicasdemejoramientotradicional
(introduccindegenesderesistencia)

Lasenfermedades
deorigenfngico
ocasionan
fuertesprdidas
productivasy
grandesgastos
enfitosanitarios

Rotacindecultivos ymanejoderastrojos
Usodecondicionesdealmacenamientocontroladas
Usointensivodefungicidas:
Introducecostosdeproduccin.
Afectaelmedioambiente.
Esriesgosoparalosoperarios.
Puedeserneutralizadoporelriegoolalluvia.
Puedeoriginarfungoresistencia.

Tomadode:Smarter PestControl,Special Issue Science 2013

Lainteraccin
plantapatgeno
nosiempre
determinael
desarrollode
unaenfermedad

EventosdesencadenadosduranteelprocesodeInteraccin
Noseproduceenfermedad cuando:
Laplanta atacada nopuede proveer losrequerimientos
necesarios para lamultiplicacin delpatgeno (resistencia de
nohospedante)
Laplanta posee defensas estructurales obioqumicas
preformadas.Slo lospatgenos especializados
completan una infeccin exitosa
Segatillan losmecanismos defensivos inducibles delaplanta
yelpatgeno resulta restringido enlazona inicial dela
infeccin (resistencia especfica)
Lascondiciones externas cambian yelpatgeno muere antes
dellegar auna etapa enque lainfeccin es irreversible

Seproduceenfermedad cuando:
Lascondiciones externas sondesfavorables
Lasdefensas preformadas soninadecuadas
Laplanta nodetecta alpatgeno ypor ende noseproducen
respuestas defensivas inducidas (oseproducen tardamente)

9/15/2016

Losproductos delos
genesR yAvr
desencadenan las
respuestas defensivas
delas plantas

Modelosimplificadodelainteraccin entreproductos
degenesR yAvr

Los genes Avr codifican factores (elicitores especficos)

queinteraccionan directaoindirectamentecon los productos
delos genes R.

Elmodelogenpor
genexplicalos
casosde
compatibilidade
incompatibilidad
plantapatgeno

Elmodeloderesistenciagenporgen (Flor,ca.1940)

Modificado de:Keen,Ann.Rev.ofGen.,1990.

Paraque exista resistencia (incompatibilidad)serequiere ungenAvr

delpatgeno yungenR delaplanta,ambosdominantes.Enpresencia
delosalelos recesivos ocurre laenfermedad (compatibilidad)

Laplantaysusistemadefensivo

RespuestaHipersensible(HR) yResistenciaSistmicaAdquirida(SAR) enelsistema

degenesRPS2avrRPt2/RPM1avrRPM1

Sielpatgenoinfectaycumplesuciclovital,sedicequees
virulentoylaplantasusceptible (husped).Lainteraccin
sedenominaCOMPATIBLE

Sielpatgenoesreconocidoylainfeccinnoprospera,se
dicequeesavirulentoylaplantaresistente(nohusped).
LainteraccinsedenominaINCOMPATIBLE

Adaptadode:Mackeyetal.,Cell,2003.

9/15/2016

Estrategiasdepatogenia

Estrategiasdepatogenia:hemibiotrofa

Patgenosbiotrficos:
Parsitosobligadosquesenutrendeclulasvivas.Crecenen
elespaciointercelular,invadiendoslounaspocasclulas
medianteestructurasdeabsorcinllamadashaustorios.

Patgenos hemibiotrficos:
Secomportancomoparsitosbiotrficos
durantelosprimerosestadiosdela
infeccin.Alavanzarlacolonizacin,el
tejidomuereycontinansuciclocomo
necrotrficos.

Infeccindetrigo porErysiphe graminis

Patgenos necrotrficos:
Invaden agresivamente los tejidos de la planta y matan a las
clulas para obtener nutrientes mediante toxinas o enzimas.

Infeccinpor
Phytophthorainfestans.
InfeccindeSolanum
tuberosum por
Alternaria spp.

P.Infestans Td tomato

Enlainteraccinconlaplantalosmicroorganismossecretanefectores

van Damme et al.,

Effectors in Plant-Microbe Interactions, 2011

Enlainteraccinconlaplantalosmicroorganismossecretanefectores

Mimetismo floralocasionado por elhongo Puccinia monoica

Cano LM, Raffaele S, Haugen RH, Saunders DGO, et al. (2013) Major Transcriptome Reprogramming Underlies Floral Mimicry
Induced by the Rust Fungus Puccinia monoica in Boechera stricta. PLoS ONE 8(9): e75293. doi:10.1371/journal.pone.0075293
http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0075293

Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013

9/15/2016

Enlainteraccinconlaplantalosmicroorganismossecretanefectores

Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013

Enlainteraccinconlaplantalosmicroorganismossecretanefectores

Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013

Enlainteraccinconlaplantalosmicroorganismossecretanefectores

Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013

Enlainteraccinconlaplantalosmicroorganismossecretanefectores

Win et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, 2013

9/15/2016

Interaccinplantapatgeno:modeloZIGZAGZIG

PRR

Tomadode:Smarter PestControl,Special Issue Science 2013

PAMPS:microbial/pathogenassociated molecularpatterns
PRR:Pattern recognition receptor
PTI:PAMPtriggered immunity
ETS:effectortriggered susceptibility
ETI:effectortriggered immunity (desencadenaHR)

Seleccinnatural:favorecequeel
patgenopierdaocambie,o
adquiera.Porsuparte,la
seleccinnaturalfavorecer
nuevosNBLRRquereconozcan
Jones and Dangl, Nature 2006
Witek ycol.,Nat.Biotech.,2016

Dependiendodequinganelabatalla

Interaccin compatible:
Susceptibilidad

Interaccin incompatible:
Resistencia(muerte celular)

Patosistema:N.benthamiana P.Infestans transgnica Tdtom 2d.p.i.

Carreraarmamentista

10

9/15/2016

Enlainteraccin
conlaplantalos
microorganismos
secretanefectores
(sistemasecrecin
TipoIII)

EjemplodesupresindelainmunidadporAlbugolaibachii:A.thalianaCol0esresistentea
HyaloperonosporaarabidopsidisEmoy2viaRPP1(genR)pero,cuandoespreinfectadacon
A.laibachii,permiteahoraelcrecimientodeambospatgenos
KayyBonas,Curr.Op.Microb.,2009

Wirthmueller etal. NatureRev.Microbiol.,,2013

Genesinvolucradosenresistencialocalapatgenos

Kamounetal.,MolPlantPathol,2015

Estrategias
paraobtener
resistencia
mediante
ingeniera
gentica

ExpresindegenesdeReceptoresdePAMPs(PRRs)
heterlogos
ExpresindegenesR(NBLRR)
ExpresindegenesS(susceptibilidad)
Expresindeprotenasdedefensadeorigenvegetal
Expresindeprotenasantimicrobianasdeotrosorganismos
Sobreexpresindegenesqueregulanrespuestasdefensivas
Induccinderespuestasdefensivas
Modulacindelarespuestaoxidativa
Interferenciaconelprocesodepatognesis
Detoxificacin detoxinasfngicas/bacterianas

Adaptadode:HammondKosackandParker,Curr.Opin.inBiotechnol.,2003.

Silenciamientodegenesdelpatgeno

11

9/15/2016

Interaccin efectores-protenas R

Hiptesis:
1) Interaccin
directa

Estrategiasparaobtenerresistencia
Transformacincongenesderesistencia(NBLRRs)

Efector
(patgeno)

Protena R

ElusocontinuadodecultivosportadoresdegenesR puede
originarlaaparicindepatgenosresistentes

Molcula
blanco
del efector
Molcula
seuelo

2) Hiptesis
del guardin

3) Hiptesis
del seuelo

Cmoevitarlaaparicinderesistencia?

Elciclotildeungenderesistenciaduraentre8y12aos

Buchanan et al., Plant Molecular Biology and Biochemistry, 2001

12

9/15/2016

Rpivnt1.1(deSolanumventurii)confiere resistencia aPhytophthorainfestans

mediante transformacin gentica decultivares susceptibles depapaytomate

Papastransgnicas que expresan elgenRpivnt1.1(deSolanumventurii)son

resistentes aPhytophthorainfestansenensayos acampo

Fosteretal.,MPMI2009

PlantasdepapatransgnicasexpresandoRpivnt1.1(izq.)ynotransgnicasDesiree(der.)en
ensayosacampo.Lafotografasetomalmesdelosprimerossntomasdeinfeccin.

Jonesretal.,PhilTransRoySoc2015

LaduplaR3a/AVR3a

LaduplaR3a/AVR3a

R3apertenecealaclaseCCNBSLRRdegenesderesistenciaidentificadoen
Solanumdemissum

Enlapoblacin,existendosalelosmayoritarios:AVR3a80K/103I yAVR3a80E/103M

R3apuededesencadenarunaRespuesta
Hipersensible(HR)comoconsecuenciadel
reconocimientodeAVR3a
AVR3aesunefectordeP.infestans,dela
categoraRxLR.
Seexpresadurantelafasebiotrfica,yes
esencialparalavirulencia

Huang et al., Plant J., 2005, Haas et al., Nature 2009; Bos et al., PNAS 2010; Pais et al., Genome Biology 2013

Armstrong et al., PNAS, 2005; Bos et al., Plant J., 2006; Bos et al., PNAS 2010;
Schornack et al., 2010

13

9/15/2016

AVR3aKI,peronoAVR3aEM,puededesencadenarHRcuando
R3aestpresente

LaduplaR3a/AVR3a

CoexpresindeAVR3aKIoEMcon
R3aenNicotianabenthamiana
AVR3aKI

Enlapoblacin,existendosalelosmayoritarios:AVR3a80K/103I yAVR3a80E/103M

AVR3aEM

UnaversinmutantedeR3a
quereconozcaambosalelos
AVR3aKI yAVR3aEM
deberaserefectiva
contratodoslosaislados
deP.infestans

R3a

R3a
Armstrong et al., PNAS, 2005

Evolucinartificialdegenesderesistencia

ConstruccindelabibliotecadeR3a*yestrategiadescreening

AVR3aEM

AVR3aKI

Yoshidaetal.,eLife2013

AVR3aKI

R3a

R3a+

HR

HR

Mutagnesisalazar
1>mut/1000bp>2
7580%clones+

14

9/15/2016

ConstruccindelabibliotecadeR3a*yestrategiadescreening

ConstruccindelabibliotecadeR3a*yestrategiadescreening
pGR106-AVR3aEM

UV

0
4
9
8
7

d.p.i.

7 d.p.i.

8 d.p.i.

Co-infiltracin de los clones candidatos con

pGR106-AVR3aEM, pGR106-GFP o pGR106-AVR3aKI.
Analizar el fenotipo da por da (comenzando 2 d.p.i.). 12 spots por clon.
Establecer un ndice HR desde 0 (nada visible) hasta 10 (necrosis confluente)

17clonesR3a+ puedenreconocerAVR3aEM

AlgunosmutantesR3a+muestranunaintensidadderespuestaincrementada:

a variantesartificialesdeAVR3a

a AVR3aKI

Segretin, Pais et al., MPMI 2014

a PcAVR3a4,un
homlogodeAVR3a
delpatgeno
Phytophthoracapsici

Segretin, Pais et al., MPMI 2014

15

9/15/2016

Parapensar

Nextsteps

UnanuevageneracindegenesRpodradesarrollarseapartirdelos
siguientespasos:

Identificar/modificarprotenasRconunpatrndereconocimientode
efectoresexpandido,

Introducirla(s)mutacin(es)identificadaenloscultivosdeintersva
transgnesisy/omutagnesisdirigida(ZFN,TALEn,CASCRISPR)

Estrategiasparaobtenerresistencia
Genesdesusceptibilidad

Esesencialtenerconocimientobsicodelpatgenoysurepertoriode
efectores

GenesdeSusceptibilidad(S)

GenesdeSusceptibilidad(S)

Genesdelaplantaquefacilitanlainfeccinyposibilitanlacompatibilidad
LasmutacionesoprdidasdegenesSlimitanlahabilidaddelpatgenodecausar
enfermedad
GenesR:tpicamente dominantes
GenesS:resistenciaconferidapormutacinoprdidaes
generalmenterecesiva
ungenSmutadopuedecausarresistenciaespecficaaunpatgenocuando:
*interfiereconlapreinvasin(ej:reconocimientodelhusped)
*interfiereconmantenimientopostinvasin(ej:disponibilidadde
nutrientes)
ungenSmutadopuedecausarresistenciadeamplioespectrocuando:
*posibilitadefensasprolongadasoconstitutivas,aunquepuedentraer
asociadosproblemasdeautoinmunidad conpenalidadparaelfitnessdela
planta

Figure1.Thehostplantpromotessusceptibilitytopathogen
infectionatseveralkeysteps:(i)attractingpathogensby
plantderivedmoleculesandstimulatingtheirattachment
anddevelopmentonthehostsurface,(ii)accommodating
pathogeninfectionstructures,forexample,haustoria,and
(iii)feedingtheuninvitedguests.
LapinandVandenAckerveken,TrendsinPlantScience2013

Figure2.Changesinplantphysiologyduringinfectionbybiotrophicand
hemibiotrophicpathogens.Leavesinfectedwithoomycete,fungal,
bacterial,andprotistpathogensshowelevatedexpressionofSWEETsugar
transportersandcellwallboundandvacuolarinvertasesthatfacilitate
phloemunloadingandthefluxofsugarstotheinfectionsite.Green
islandsareknowntosurroundrustsandpowderymildewinfectionsites
andmaintainphotosynthesisintheotherwisesenescinghosttissues.
Powderymildewinfectionactivateshostalcoholdehydrogenases(ADHs)
thatmightplayaroleinthesynthesisofspecificmetabolitesbeneficialfor
thefungusandinducesincreasedDNAploidylevelsinmesophyllcells
underneaththeinfectedepidermalcellsthatcouldcontributetoincreased
metaboliteproduction.Successfulinfectioncanalsoleadtosystemic
changesinplantphysiology,forexample,bystimulatingphotoassimilation
inuninfectedleaves.

16

9/15/2016

Genescontribuyendoalasusceptibilidad:MLO

Genescontribuyendoalasusceptibilidad:MLO

http://www.bio1.rwthaachen.de/PlantMolCellBiology/research.html

Barleymlomutantsarebroadspectrumresistantto
powderymildew.Phenotypeofasusceptible(Mlo,left)and
amloresistant(right)barleygenotypeinoculatedwith
Blumeriagraminisf.sp.hordeiK1conidiaandphotographed
atsixdaysafterinoculation.

Reinstdleretal.BMCPlantBiology2010,

vanSchieandTakken,Annu.Rev.Phytopathol.2014

GenesSyefectospleiotrpicosasociadosasusalteraciones

vanSchieandTakken,Annu.Rev.Phytopathol.2014

EsquemaclasificatorioparadeterminarutilidaddegenesSenmejoramiento

First,recessiveresistanceisobserved(mutant
withreducedsusceptibility).Second,pleiotropic
effectsshouldbemonitored(growth,yield,
fertility,senescence,andabioticstress
tolerance).Ifadeleteriousphenotypeis
present,itisimportanttotestwhetheritcanbe
alleviatedinadifferentgeneticbackground.
Third,theplantresponsetopathogenswitha
differentlifestyle(biotrophversusnecrotroph)
shouldbeevaluated.Lastly,plantperformance
shouldbetestedinfieldconditions,as
interactionswithbeneficialmicrobes,suchas
rhizobiaandmycorrhiza,maybeaffected.

Hckelhovenetal.,PlantPathology2013

vanSchieandTakken,Annu.Rev.Phytopathol.2014

17

9/15/2016

Estrategiasparaobtenerresistencia
Expresindeprotenasdedefensa
deorigenvegetal

Compuestos
que
participan
delas
respuestas
defensivas
delas
plantas

Protenasrelacionadasapatognesis(protenasPR):
Protenasqueseinducenfrentealataquedeunpatgeno.
Expresadasindividualmente,proveenresistenciaparcial.
Muestranefectossinrgicosexpresadasencombinacin.
Defensinas:Pptidospequeos( 5kDa),ricosencistena.
Muestranactividadantifngica invitro.Extracelulares(PR12).
Tioninas:Pptidospequeos( 5kDa),ricosencistena.
Antifngicos yantibacterianos.Sonsecretadasavacuolas,
cuerposproteicosyparedcelular(PR13).
Fitoalexinas:Compuestosdebajopesomolecular(no
proteicos)conactividadantibacterianay/oantifngica.
Sesintetizanrpidamenteenrespuestaalainfeccin
conpatgenosoaltratamientoconelicitores.Ej:capsidiol

RIPs:Protenasinactivadoras deribosomas,actan
depurinando elARNr 28S.Clasificadasendostipos(IyII).
ElTipoIsueleserelmenostxico.

Expresin
deprotenas
dedefensa
deorigen
vegetal

Familiasdeprotenasrelacionadas
conlapatognesis(protenasPR)

Expresin
delgende
glucanasa
Gns1
enarroz

ElgenGns1dearrozes
anlogoagenesdeglucanasa
deotrosorganismos.
Susobrexpresinacelera
laaparicindeRespuesta
Hipersensiblefrente
aMagnaporthegrisea.

Sinembargo,
lasobrexpresin
noreguladaafectalafisiologa
delaplantayprovoca
laaparicinespontnea
depuntosnecrticos
(fenotipolessionmimic)

Tomadode:Nishizawaetal. PlantMol.Biol., 2003.

18

9/15/2016

Expresincombinadadegenesantifngicos

Reduccindelndicedeenfermedad(DI) esperadaymedidaparalneas
transgnicasqueexpresanGLU/CHI yRIP/CHI

CotransformacindeNicotianatabacum congenes
dequitinasa,glucanasayRIPdecebada

Tomadode:Jachetal. ThePlantJournal,1995.

Tomadode:Jachetal. ThePlantJournal,1995.

RIP+CHIinoculado

Wt inoculado

Wt noinoculado
a

AparienciadeplantastransgnicasycontrolquecoexpresanaltosnivelesdeRIPy
quitinasa (CHI)alos18ddedesarrolloenunensayodeinfeccinconRhizoctonia solani

Lospptidosantimicrobianosposeenunaestructurasimilarenmoluscos,
insectos,plantasymamferos
s

b
c

%deprotenadefluidoapoplstico.
Basadosendatosdeplantastransgnicasportandoconstruccionesparaunsologen.
%deprotenafoliartotal.

Lasdefensinassesintetizanabundantementedurantela
germinacindelassemillas
Lasdefensinassonpptidospequeosricosencistenaqueseacumulandurantela
germinacindelassemillasyeneltranscursodereaccionesdefensivasdeplantasen
crecimiento.Constituyenlaversinvegetaldelospptidoslticosinvolucradosenla
respuestainnataenanimales.

Lamayoradelasdefensinasvegetalespresentanactividadantifngica.
Suactividadestaradadaporlaformacindeporosenlasmembranas
oporlaalteracindeladistribucindecargas.
Otrasdefensinassoncapacesdeinhibiramilasas,sugiriendounrol
enladefensafrenteainsectos.

Liberacindecompuestosantifngicosporsemillas
derbanoengerminacin
Enlaposicin1seaplic1gdeRsAFP1;enla
posicin2seaplicaronsemillasintactasderbano;en
laposicin3seaplicaronsemillasconunaincisinen
sucubierta.Paraelensayoseuselhongo
Pyrenophoratriticirepentis
A:Ensayoconagarcontrol;B:Ensayoconagar
complementadocon50g/mldepronasaE;C:
EnsayocomoenA,peroautoclavandoladefensina
RsAFP1ylassemillas;D:Ensayoconagar
complementadocon100Mdecidoabscsico

Tomadode:Thommaetal. Planta, 2002.

Secuenciapeptdicadedosdefensinasderbano. Laslneasdeconexinindicanpuentesdisulfuro.

19

9/15/2016

Sobrexpresin
deuna
defensina
deNicotiana
megalosiphon
ensolanceas

SobrexpresindeunadefensinadeNicotianamegalosiphonen
solanceas

Portielesetal.,Plant
BiotechnologyJournal2010

Portielesetal.,PlantBiotechnologyJournal2010

Plantastransgnicasde
papaenensayosa
campoparaevaluar
resistenciaa
Phytophthorainfestans

TransformacindecloroplastosdeSolanceasparalaexpresindela
defensina NmDef02
pUTRDef

NmDef02

StrNmDef02

pUTRstrDef

FedericoMirkin
MauricioContreras

Estrategiasparaobtenerresistencia
Expresindeprotenasantimicrobianas
deotrosorganismos

Lmen deltilacoide

Estroma

20

9/15/2016

Expresin
delgende
endoquitinasa
de
Trichoderma
harzianum

ResistenciaaAlternaria alternata deplantas

detabacotransformadasconungendeendoquitinasa
deTrichoderma harzianum

ExpresindequitinasadeTrichodermaharzianum
ResistenciaaRhizoctoniasolani enplantastransgnicasdetabaco
A

A)Plntulascultivadaspor5das
enagar
1:controlessinpatgeno
2:controlesinfectados
3:plantastransgnicassinpatgeno
4:plantastransgnicasconpatgeno

B) Plantastransgnicas ycontroles
cultivadasensueloinoculado
con Rhizoctoniasolani.Lasplantasms
erguidassontransgnicas (cajasdela
derecha).Enlaesquinainferiorizquierdase
muestranplantascontrolnoinoculadas.Las
cajascentralesylasuperiorizquierda
correspondenacontrolesnotransgnicos
inoculados

Sntomasdeenfermedadalos15dasdelainoculacinyactividadde
endoquitinasaenextractosdehojasdelneastransgnicasrepresentativas.La
actividadendoquitinasaseexpresacomopmolesde4metilumbiliferona
liberadosde4metilumbeliferilDNNNtriacetilquitotriosa/min/gde
protena

La estructura
anfiptica
de los pptidos
antimicrobianos
determina
su especificidad
y mecanismo de
accin

Tomadode:Loritoetal., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998.

Expresin
plastdica
de un pptido
antimicrobiano
para el control
de bacterias
y hongos
fitopatgenos

Mecanismos de accin postulados

para pptidos antimicrobianos

Pptidos antimicrobianos
- Son pptidos con estructuras -hlice componentes del
sistema de defensa innato de los animales.
- Participan en el control de la flora bacteriana normal
y en la defensa contra patgenos.
- Fueron aislados de diversos organismos (batracios, insectos,
clulas de mamferos).
- El pptido MSI-99 es un anlogo de la magainina-2
secretado por la piel del anuro Xenopus laevis.

La accin de los pptidos antimicrobianos es concentracindependiente. Los cloroplastos son un sistema atractivo para
lograr altos niveles de acumulacin.
Construccin empleada para transformar cloroplastos de Nicotiana tabacum

trnI

16SrDNA

Orf131

trnV

rps12

Orf70B
MSI-99
Prrn

aadA
TpsbA

Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.

21

9/15/2016

Expresin plastdica de un pptido antimicrobiano

para el control de bacterias y hongos fitopatgenos
Ensayos de actividad antibacteriana
in vitro de extractos vegetales sobre
Pseudomonas syringae pv tabaci

Resistencia in planta a
Pseudomonas syringae pv tabaci

Transgnica T0

Expresin
delpptido
MSI99,en
cloroplastosde
tabaco

EnsayodeinfeccinconColletotrichumdestructivum
Transgnica

Control

No transformada
Tomado de:DeGrayetal.,PlantPhysiol., 2001.

Setransformelgenomaplastdicoconungensinttico
MSI99,elquecodificaunanlogoaldemagainina
(Xenopuslaevis).
Seobservactividadinvitro contraColletotrichum
destructivum, Aspergillusflavus,Fusariummoniliforme y
Verticilliumdahliae.

Tomado de: De Gray et al., Plant Phisiology, 2001.

Se cuantific por DO el crecimiento bacteriano

T1 y T2: generaciones de plantas transgnicas
10A, 11A y 13A: lneas de plantas transgnicas.

Se inocularon las hojas con distinto nmero

de clulas de Pseudomanas syringae pv tabaci;
se evaluaron los sntomas a los 5 das.

PlantasdeSolanumtuberosum transformadascongenesde
dermaseptina,AP24ylisozima

PlantasdeSolanumtuberosum transformadascongenesde
dermaseptina,AP24ylisozima
ApLyDe12

ApLy47

Ly55

NT

Ap2

De8

EnsayosdeinfeccininvitroconPhytophthorainfestans
Riveroetal.,JournalofBiotechnology2011

Riveroetal.,JournalofBiotechnology2011

22

9/15/2016

PlantasdeSolanumtuberosum transformadascongenesde
dermaseptina,AP24ylisozima

IncrementoderesistenciaaFusariumsolani.A:minitubrculosdepapainoculadoscon1x108conidias
deF.solaniporml.Semuestranlesionesrepresentativasdemuestrascontrolesydedistintaslneas
transgnicasalos7d.p.i.B:InhibicindeF.solani enensayosdecrecimientoinvitro enpresenciade
extractosdehojadeplantastransgnicasycontrol.Fototomadaalos7ddeadicindelosextractos.

Desarrollodeplantastransplastmicasdepapa
(Solanumtuberosum)resistentesapatgenos GrupoBravoAlmonacid
aadA

XbaI

uidA

Trps16

16S

5UTR

NdeI

Prrn

SacII

SacI

trnI

PlantasdeSolanumtuberosum transformadascongenesde
dermaseptina,AP24ylisozima

ResistenciaaRhizoctoniasolani.A;ensayosdeinfeccinenhojasaisladadeplantastransgnicasy
control.Lashojasfueroninoculadasconuntapndemiceliode0,5cmdedimetro.Losensayos
incluyeron20hojasdecadalneatransgnica. B:InhibicindelcrecimientodeR.solani enensayosin
vitro realizadosenpresenciadeextractosdehojasdeplantastransgnicasycontrol.Fototomadaalos
5ddeadicindelosextractos.

Evaluacioneseninvernaderodelasplantastransplastmicasdetabaco
pararesistenciaalhongonecrtrofo Rhizoctonia solani (damping off)
ColaboracinconDr.BorrsHidalgo,CIGBLaHabana,Cuba

trnA

wt

pBSW5UTRGUS (8.357 pb)

AP+Gluc2

Ampr
Origen replicacin E. coli

3,790,7
%supervivencia

Flavodoxina

pUTRFld (N. Carrillo, IBR)

Greenhouse evaluation of transgenic tobacco

plants for resistance against Rhizoctonia solani.
Typical symptoms caused by R. solani were
monitored visually at one week postinoculation
(wpi). quantitative real time PCR to measure
pathogen growth in transplastomic and control
plants was determined at one wpi for R. solani, ars
represent
mean
values
(N=90;
SD).
Representative pictures corresponding to R. solani
infection experiments are displayed.

23

9/15/2016

Evaluaciones enensayos acampodelas plantas transplastmicasdetabaco para

resistencia aloomicete hemibitrofo Phytophthoraparasitica var.nicotianae
(Pata pietra oPie/vstago negro)

Evaluacionesenensayosacampodelasplantastransplastmicasdetabacopara
resistenciaaloomicete bitrofo obligadooomicete
Peronospora hyoscyami f.sp.tabacina (Mohoazul)
Fieldevaluationoftransgenictobaccoplantsfor
resistancePeronospora hyoscyami f.sp.tabacina.
EvaluationofdiseaseincidenceofP.hyoscyami f.
sp.tabacina intransplastomic tobaccoplants.
Phenotypeoftransplastomic andcontrol(wt and
utrGus)tobaccoplantsinareaswithhighinfection
pressureforP.hyoscyami f.sp.tabacina.The
percentagesofhealthyplantsweredetermined,
wheremorethanthreebluemoldsspotperleaf
wasconsideredasanunhealthyplantat35days
postplanting.Additionally,growthofP.hyoscyami
f.sp.tabacina ontobaccowasestimatedby
quantitativerealtimePCRafter35dayspost
planting.Theextentofcolonizationwas
determinedbyconstitutivelyexpressed18S
ribosomalRNAgene.Barsrepresentmeanvalues
(N=90;SD).

Fieldevaluationoftransgenictobaccoplantsfor
resistanceagainstPhytophthora parasitica var.
nicotianae.
Phenotypeoftransplastomic andcontrol(wt and
utrGus)tobaccoplantsinsoilhighlyinfected
withP.parasitica var.nicotianae.Quantification
ofstemdiseaseratingintransplastomic and
controltobaccoplantsplantedinasoilhighly
infectedwithP.parasitica var.nicotianae was
scoredat10daysafterplanting.Lowerpanels:
quantitativerealtimePCRtomeasurepathogen
growthintransplastomic andcontrolplantswas
determinedat10daysafterplantingforP.
parasitica var.nicotianae.Barsrepresentmean
values(N=90;SD).

Expresin
degenes
relacionados
conla
regulacinde
larespuesta
apatgenos

ElgenNPR1coordinavariostipos
derespuestadedefensa

Estrategiasparaobtenerresistencia
Expresindegenesrelacionadosconlaregulacinde
larespuestafrenteapatgenos

Adapadode:McDowelland Doffenden,TrendsinBiotechnolgy, 2003.

24

9/15/2016

SobrexpresindelgenNPR1 enArabidopsisthaliana yensayos

deresistenciaa Peronosporaparasitica
Controlnotransgnico

Estrategiasparaobtenerresistencia
Modulacindelarespuestaoxidativa
Lneatransgnica35SNPR1H

Tomadode:Cao etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998.

Modulacin
dela
respuesta
oxidativa

Lasespeciesreactivasdeoxgeno(ROS)cumplenvariosroles
deimportanciaenladefensadelaplanta

BA.2H:dehidrogensadel
cidobenzoico

Esposible
aumentar
losniveles
endgenos
deH2O2
enlaplanta

Cmo lograrlo?
- Inhibiendo enzimas detoxificadoras de H2O2
(catalasa, ascorbato peroxidasa).
- Introduciendo enzimas productoras de H2O2
Ejemplo: glucosa oxidasa (GO).

- Es importante considerar que un incremento

excesivo de H2O2 puede resultar perjudicial
para las clulas vegetales.

Adaptadode:Buchananetal.BiochemistryandMolecularBiologyofPlants,2000.

25

9/15/2016

Transformacin
deSolanum
tuberosum con
elgende
glucosaoxidasa
deAspergillus
niger

EnsayodeinfeccinconVerticilliumdahliae

Estrategiasparaobtenerresistencia
Interferenciaconlapatognesis

Tomadode:Wuetal.,PlantPhysiol.1997.

Elhongoatacalasracesyelsistemavascular.Lasplantasno
transformadas(Rus.Bur)otransformadasconelvectorvaco(172271)
exhibensntomasseveros.Laslneastransgnicas(2258743y225879)
resultanresistentes.Lafotofuetomadaalos40dasdelainoculacin.
TambinseobtuvoresistenciaalinocularlasplantasconPhytophthora
infestans

Existengenes
antiapoptticos
quepueden
interferir
conelprocesode
necrotrofa

Larespuestahipersensible(HR)seasemeja
alamuertecelularprogramada(PCD)
demamferos.

ResistenciaaAlternariaalternata porexpresindeprotena
antiapoptticap35debaculovirusenplantasdetomate

Esposiblequealgunoshongosnecrotrficos
operenutilizandolosmecanismosdemuerte
celulardelapropiaplanta.
Sehaninvestigadoenplantaslosefectos
degenesinhibidoresdeapoptosis
provenientesdeespeciesnovegetales,
entreellos,Bcl2 yBclxl humanos,CED9
denematodos,OpIAP yp35 debaculovirus.
Elgenp35debaculoviruscodificaun
inhibidordecistenproteasasqueacta
sobrelascapasas,unodeloscomponentesclave
delosprocesosapoptticos

Tresfrutosdeunlneasusceptible
(ascasc,izquierda)ydos
transgnicascondistintosnivelesde
expresin,inoculadasconconidios
deAlternariaalternata(centroy
derecha).
RespuestaalhongoAlternariaalternata deplantascontrolesy
transgnicaseninvernadero.Asc:Plantacontrolresistente;
asc:planta controlsusceptible;p35:plantatransgnica
Asc:genderesistenciaaAlternaria

Lincolnetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002.

26

9/15/2016

Silenciamiento gnico
y resistencia a hongos

Estrategiasparaobtenerresistencia
Silenciamientodegenesdelpatgeno
(HIGS:Hostinducedgenesilencing)

Silenciamiento gnico
y resistencia a hongos

27