E.

P Medicina Humana - UCSM

Gua Prctica de Inmunologa

PRCTICA II
OBTENCION DE CELULAS DEL SISTEMA
INMUNOLOGICO APARTIR DE ORGANOS
LINFOIDES
I. INTRODUCCIN
Las respuestas inmunitarias innata y adaptativa dependen de las actividades de los
leucocitos. Estas clulas se originan en la mdula sea, y muchas tambin se
desarrollan y maduran ah. Despus migran para proteger los tejidos perifricos,
algunas de ellas residen dentro de los tejidos, otras circulan en el torrente sanguneo
y en un sistema de vasos especializado llamado sistema linftico, que drena lquido
extracelular y clulas libres desde los tejidos, los transporta por el cuerpo como linfa,
y finalmente se vaca de regreso hacia el sistema vascular sanguneo.
Los linfocitos circulan en la sangre y la linfa, y se encuentran tambin en grandes
nmeros en tejidos linfoides u rganos linfoides, que son agregados organizados de
linfocitos en una red de clulas no linfoides. Los rganos linfoides pueden dividirse a
grandes rasgos en rganos linfoides centrales o primarios, donde se generan los
linfocitos, y rganos linfoides perifricos o secundarios, donde se mantienen los
linfocitos vrgenes maduros y se inician respuestas inmunitarias adaptativas.
Los rganos linfoides centrales son la mdula sea y el timo, un rgano que se
encuentra en la parte alta del trax. Los rganos linfoides perifricos comprenden los
ganglios linfticos, el bazo, y los tejidos linfoides de la mucosa del intestino, las vas
nasales y respiratorias, las vas urogenitales, y otras mucosas. Los ganglios linfticos
estn interconectados por medio de un sistema de vasos linfticos, que drenan lquido
extracelular desde los tejidos, a travs de los ganglios linfticos, y de regreso hacia
la sangre.
II. MATERIALES Y REACTIVOS
- Medio RPMI 1640
- Etanol al 70%
- Tijeras y frceps
- Placas petri
- Jeringas (3ml)

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- Agujas 22G1
- Tubos Falcon de 15ml
- Homogeneizador de tejidos de vidrio
- Suspensin celular.
- Hemocimetro
- Pipetas
- Pipetas pasteur
- Tubos eppendorf
- Solucin de Turk
- Azul de trypan, 0.4%(w/v) en agua
- PBS
- Tubo plstico de 5ml
III. PROCEDIMIENTO
A) OBTENCION DE CELULAS
MDULA SEA
1. Matar

la rata por dislocacin cervical o inhalacin de CO 2. Colocar la rata

sobre una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba. Empapar la rata con
etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer un corte transversal largo a travs de la piel en la parte media del rea
abdominal. Retirar la piel de las patas traseras.
3. Separar las piernas del cuerpo al nivel de la articulacin de la cadera. Retirar la
grasa y colocar las piernas en una placa petri con medio.
4. Retirar el tejido muscular del fmur y la tibia. Separar el fmur y la tibia y
cortar las epfisis en ambos extremos.
5. Inyectar por los extremos del hueso 3ml de medio o PBS, con una jeringa para
expulsar la medula sea
6. Remover los desechos grandes y los acmulos celulares.
7. Lavar la suspensin por centrifugacin a 300xg por 10 minutos a 4 grados y
colocar en el medio al 5% de FS.

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TIMO
1. Matar

la rata por dislocacin cervical o inhalacin de CO 2. Colocar la rata

sobre una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba. Empapar el abdomen la
rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Usando la tijera, hacer una incisin desde la regin xifoidea hasta la regin
3.
4.
5.
6.
7.

submandibular y retirar la piel lateralmente.

Hacer una incisin en el trax y separar los bordes de la incisin.
Usando el frceps, cuidadosamente agarrar los lbulos tmicos y levntelos.
Poner el timo en una placa petri con medio.
Cortar el timo en pequeos trozos y haga una suspensin.
Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el

embolo de una jeringa de 5 ml

8. Remover los desechos grandes y los acmulos celulares.
9. Lavar la suspensin por centrifugacin a 300xg por 10 minutos a 4 grados y
colocar en el medio al 5% de FS.

BAZO

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1. Matar

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la rata por dislocacin cervical o inhalacin de CO 2. Colocar la rata

sobre una tabla de diseccin con el vientre hacia arriba Empapar el abdomen la
rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer una incisin a travs de la piel en la regin inguinal. Con los dedos sobre
ambos lados del corte, tire entre la cabeza y la cola hasta que la pared
peritoneal este lo suficientemente expuesta. Empapar la cavidad peritoneal con
etanol.
3. Cortar el peritoneo, levante el bazo con los frceps, y separe este de los
tejidos adyacentes con la tijera. Colocar el bazo en una placa petri con medio.
4. Cortar el bazo en pequeos trozos y haga una suspensin.
5. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el
embolo de una jeringa de 5 ml.
6. Remover los desechos grandes y los acmulos celulares.
7. Lavar la suspensin por centrifugacin a 300xg por 10 minutos a 4 grados y
colocar en el medio al 5% de FS.

B)

CONTEO
1.

CELULAR
Diluir las clulas

en la solucin de Turk.
2. Mezclar completamente y aadir 1 gota en la cmara de Neubauer usando la
pipeta Pasteur o micropipeta
3. Contar las clulas de los cuadrantes de los extremos (1,3,7 y 9). Incluya en
este recuento las clulas que se observan sobre las lneas de dos lados de cada
cuadrado revisado.
4. Conteo de clulas/ml=Numero de clulas (promedio correspondiente a un rea
de 1mm2) x factor de dilucin x104.
C) DETERMINACIN DE LA VIABILIDAD CELULAR (Exclusin por azul de
Trypan)
1. Mezclar 0.05 ml de la solucin de azul de trypan, y 0.05 ml de la suspensin
celular. Dejar incubar 5 minutos.
2. Transferir una pequea cantidad de la suspensin a la cmara de Neubauer y
contar las clulas. Las clulas no viables estarn teidas de azul.

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Clulas viables (%)= Nmero total de clulas viables / ml

Nmero total de clulas / ml
COMENTARIO
-

X 100

El azul de trypan tiene mayor afinidad por las protenas del suero que por las
protenas celulares. Si el extendido es muy oscuro, resuspender las clulas en

PBS antes de realizar el conteo.

No incubar las clulas con azul de trypan por ms de 15 minutos de lo contrario
las clulas viables empezaran a captar el colorante.

ELIMINACIN DE ERITROCITOS DE LA SUSPENSIN CELULAR

MTODO DEL CLORURO DE AMONIO
MATERIALES Y REACTIVOS
- Suspensin celular
- Tubo falcon de 15 ml
- PBS
- Buffer Lisis de eritrocitos (NH4Cl 0,15M, KHCO3 y EDTA 0,1mM)
PROCEDIMIENTO
1. Mezclar

la suspensin celular con el de buffer Lisis de Eritrocitos

en una

proporcin (1/4)
2. Mezclar el tubo por inversin 5-6 veces
3. Incubar las muestras sobre hielo, durante 5min (mezclar el tubo 2-3 veces
durante la incubacin).
4. Centrifugar a 4000rpm durante 2 min.
5. Descartar el sobrenadante (cuidando de no eliminar el pellet que contiene los
leucocitos).
6. Lavar el pellet con 1mL de suero fisiolgico y volver centrifugar
Nota: Si el pellet sigue contaminado con eritrocitos repetir la lisis.
IV. RESULTADOS
Fmur y tibia y
Rata muertael procedimiento de aislamiento de clulas inmunolgicas a partir de
1. Esquematice
cortar las
la
epfisis
Medula sea, timo y bazo
Lavar la suspensinExtraer
por
centrifugacin a 300xg por
10 minutos a 4 grados

MEDULA
Inyectar PBS a
OSEA
la difisis

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Colocar en el
medio al 5% de
FS.

TIMO

Rata
muerta

Retirar timo y
ponerlo en una
placa Petri.

Colocar en el medio al 5%
de FS.

Triturar el
tejido

Lavar la suspensin por

centrifugacin a 300xg
por 10 minutos a 4
grados

Extraccin de la muertra y trituracin

de esta

BAZ
O

Lavar la suspensin por centrifugacin a

300xg por 10 minutos a 4 grados.

Colocar en el medio al 5% de FS.

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2. Haga un esquema de los rganos linfoides utilizados en la practica

ORGANOS LINFOIDES
PRIMARIOS
Medual osea.
Timo

ORGANOS LINFOIDES
SECUNDARIOS
Bazo

3. Haga los clculos para determinar el nmero de celulas por ml

4. Determine el porcentaje de viabilidad celular

V. CUESTIONARIO
1. Indique cuales son los rganos linfoides primarios y secundarios

Primarios: timo, mdula sea.

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Secundarios: bazo, ganglios linfticos, tejidos linfoides asociados a mucosas

(MALT) que incluye amgdalas, apndice vermiforme, placas de Peyer, adenoides.

2. Mencione
rganos
respuesta

cual

es la funcin de los
linfoides
en
la
inmunitaria

Los rganos linfoides primarios proporcionan el entorno para la maduracin de

linfocitos (linfopoyesis), de modo que los linfocitos adquieren su repertorio de
receptores especficos para cada tipo de antgeno.
Por otra parte, los rganos linfoides secundarios proporcionan el entorno para que los
linfocitos interaccionen entre s, o con las APC y otras clulas accesorias, y para que
entren en contacto con el antgeno.
3. Cul es la estructura del timo y qu importancia tiene desde el punto de vista
Inmunolgico
El timo est dividido en dos lbulos y presenta una cpsula de tejido conjuntivo denso.
Desde el conjuntivo parten tabiques hacia el interior pero la compartimentacin no es
completa. En el parnquima se diferencia una zona de corteza rodeando a la mdula.
Las reas medulares de los dos lbulos estn en contacto. En la corteza encontramos
clulas reticulares epiteliales. En el tejido linfoide propiamente dicho distinguimos
tres tipos de clulas segn el tamao: linfocitos grandes, medianos y pequeos. Se
observa adems que las clulas ms diferenciadas estn situadas en el borde externo
de la corteza y a medida que se van diferenciando se van trasladando hacia la mdula.

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En la corteza y sobre todo en la regin paracortical, hay macrfagos. Estos

macrfagos son los responsables de la eliminacin de los linfocitos anormales
impediendo su paso a la mdula. En la mdula hay una mayor proporcin de clulas
reticulares. En la mdula del timo las clulas reticulares suelen asociarse formando
unas estructuras caractersticas, los denominados corpusculos de Hassal o
corpsculos tmicos. Estos tienen forma esfrica, estando las clulas centrales
calcificadas. La funcin de estos corpsculos no es totalmente conocida. En la mdula
tambin se encuentran algunos linfocitos T de pequeo tamao. Esta estructuracin
permite la correcta maduracin de linfocitos T.
4. Comente la relacin estructura-funcin del bazo en la respuesta inmunolgica
A medida que la sangre penetra en los senos marginales de la zona marginal, fluye ms
all de una zona rica en macrfagos, estas clulas fagocitan antgenos de origen
sanguneo, bacterias y otro material particulado extrao. El material que no se elimina
en la zona marginal se depura en la pulpa roja en la periferia de los senos esplnicos.
Las clulas linfoides se forman en la pulpa blanca en respuesta a un reto antignico.
Las clulas B de memoria y las clulas plasmticas se forman en ndulos linfoides,
mientras que las clulas T de diversas subcategoras se producen en las PALS (vaina
linftica periarterial). Las clulas B y T recin formadas penetran en lo senos
marginales y migran al sitio de reto antignico o se constituyen en parte del fondo
comn circulante de linfocitos. Algunas clulas plasmticas pueden permanecer en la
zona marginal, elaborar anticuerpos y verter las inmunoglobulinas a los senos
marginales. Sin embargo, casi todas las clulas plasmticas migran a la mdula sea
para producir y liberar sus anticuerpos en los senos de esta estructura.
5. Explique el fundamento del Mtodo de exclusin del Azul de Trypan
El azul de tripano, azul de tripn o azul tripn es un colorante azoico que se utiliza en
tinciones histolgicas para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar clulas vivas
de clulas muertas. Las clulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se
colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qu compuestos
pueden atravesarla. En las clulas viables, con membrana intacta, no se incorpora el
azul de tripano; por el contrario, s atraviesa la membrana de las clulas muertas. Por
lo tanto, las clulas muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el
microscopio.

CONCLUSINES
El presente experimento permitio visualizar la cantidad de clulas del sistema inmune
de una rata, evidenciando la enorme cantidad de estasy su distribucin. Esto permite

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vislumbrar lo maravilloso que es elsistema inmunolgico humano pues como en la rata,

este esta distribuido en todo el organismo defendiendo asi al organismo de cuerpos
extraos, previniendo de esta manera las infecciones y las enfermedades. Este tipo de
experimentos permite comprender el sistema inmunolgico. El proceso inmunolgico
funciona as: un agente infeccioso entra en el cuerpo. Quiz es un virus de la gripe que
entra por la nariz. Quiz es una bacteria que entra por la sangre cuando se pincha con
un clavo. Este sistema est siempre alerta para detectar y atacar al agente infeccioso
antes de que cause dao. Sea cual fuere el agente, el sistema inmunolgico lo reconoce
como un cuerpo ajeno. Estos cuerpos externos se llaman antgenos. Y los antgenos
deben ser eliminados.
La primera lnea de defensa del cuerpo es un grupo de clulas llamadas macrfagos.
Estas clulas circulan por la corriente sangunea y en los tejidos del cuerpo, vigilantes
de los antgenos.
Cuando un invasor entra, un macrfago rpidamente lo detecta y lo captura dentro de
la clula. Enzimas en el interior del macrfago destruyen al antgeno procesndolo en
pedacitos pequeos llamados pptidos antignicos. A veces este proceso por s solo es
suficiente para eliminar al invasor. Sin embargo, en la mayora de los casos, otras
clulas del sistema inmunolgico deben unirse a la lucha.
Pero antes de que otras clulas puedan empezar su trabajo, los pptidos antignicos
dentro del macrfago se unen a molculas llamadas antgenos de leucocitos humanos o
HLA. La molcula de HLA unida a al pptido, ahora llamada complejo antignico, es
liberada del macrfago.
Clulas llamadas linfocitos de la clase T, pueden entonces reconocer e interactuar con
el complejo pptido antignico-HLA que se encuentra en la superficie del macrfago.
Una vez que dicho complejo es reconocido, los linfocitos T envan seales qumicas
llamadas citocinas. Estas citocinas atraen ms linfocitos T. Tambin alertan a otros
linfocitos, de la clase B, para que produzcan anticuerpos.
Estos anticuerpos se liberan a la circulacin sangunea para encontrar y unir ms
antgenos, de tal forma que los invasores no se puedan multiplicar y enfermarle. En el
ltimo paso de este proceso, una clula llamada fagocito se encarga de remover el
antgeno del cuerpo.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

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Abbas A.K. Lichtman A. H. y Pober J. S. 5 Ed. Inmunologa celular y molecular.

Sanunders-Elsevier. (2004).
Janeway Ch. A. Travers P. Walport M. Shlomchik M.J.2 Ed. Inmunologia . El
sistema inmunitario en condiciones de salud y enfermedad. (2003)
Roitt Ivan, Brostoff J. Male D. Inmunologa. Fundamentos9
Ed.Panamericana(2004),

ROSS. Histologa, 4 edicin, Ed. Panamericana, 2005.

WHEATERS, Histologa Funcional, Texto y Atlas en color. 4 Edicin, Harcourt,

2009