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Catalasa y oxidasa

Prueba de la
Catalasa
Fundamento

Material
reactivos

La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las


bacterias aerobias. Descompone el perxido de hidrgeno
en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas
procedentes del oxgeno indica que la prueba es positiva.
y Portaobjetos. H2O2 de 10 volmenes Cultivos en fase
exponencial de bacterias.Asas e hilos de siembra. Pipetas
Pasteur

Mtodo

1. Colocar una gota de agua oxigenada


portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur.

sobre

un

2. Suspender la bacteria
3.Detectar la formacin de burbujas

Prueba
Oxidasa

de

Fundamento

Material
reactivos

Mtodo

la
Determina la presencia del citocromo C, El citocromo C
oxida al NNN'N',tetrametil,1-4,fenilendiamina (solucin
acuosa al 1% (p/v). La oxidacin se detecta como color
azul.
y Papel de filtro cortado (trozos de 3x 1 cm) ;Placas de
Petri ;Reactivo de oxidasa: Solucin al 1% de NNN'N',
tetrametil, 1-4 fenilendiamina en agua destilada. El
reactivo de oxidasa es bastante txico, manejar con
precaucin. Se altera por la luz y el oxgeno, por lo que
debe ser de preparacin extempornea y protegerse
envolvindolo con papel negro
1-Poner un trozo de papel de filtro sobre una de las
tapaderas de una placa de Petri. 2-Aadir una gota del
reactivo de oxidasa.
3-. Depositar sobre el reactivo masa bacteriana (actuar de
forma rpida y con un asa de platino nueva o con un palillo
de dientes)

Resultado

La reaccin positiva la indica un color azul-violeta intenso


antes de 10 segundos

La imagen muestra varias bacterias que carecen de


citocromo c oxidasa terminal y dos que las poseen
(posiciones sobre las 11 y sobre las 13

Reactivos usados en la tincin de Gram.

Agua estril para realizar el frotis.

Cristal violeta tambin conocido como violeta de genciana.

Safranina.

Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.

Agua corriente para enjuagar.

Tcnica de la tincin de Gram.


De preferencia la tincin debe ser realizada sobre un recipiente para que los desechos sean desechados
adecuadamente.

Frotis bacteriano.
1.

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica hasta el rojo vivo y esperar a que enfre un poco.

2.

Tomar con el asa una gota de agua estril y agregarla en un portaobjetos.

3.

Flamear nuevamente el asa y esperar a que enfre.

4.

Tomar con el asa un poco de muestra bacteriana a partir de una colonia aislada.

5.

Despus agregar la muestra en la gota de agua que esta en el portaobjetos y homogeneizar suavemente con
movimientos circulares.

6.

Esperar que seque al aire libre o poner durante uno o dos segundos con la llama de un mechero para fijar la
muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor
excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar.

Tincin.
1.

Agregar

cristal

violeta,

solo

el

suficiente

para

que

se

cubra

el

extendido

bacteriano.

dejar actuar durante 60 segundos.


2.

Agregar el lugol, solo el suficiente, dejar actuar durante 60 segundos.

3.

Enjuagar con agua corriente.

4.

Agregar una o dos gotas de alcohol-acetona e inmediatamente enjuagar con agua corriente.

5.

Agrgar Safranina, solo la suficiente, Dejar actuar durante 60 segundos.

6.

Enjuagar con agua corriente.

7.

Dejar secar a temperatura ambiente.

8.

Observar en un microscopio ptico con un objetivo 100X usando aceite de inmersin.

Fundamento de la tincin de Gram.


**Los lavados con agua tienen el objetivo de arrastrar mecnicamente el exceso de colorante y quitar el alcoholacetona.

**El colorante cristal violeta es de naturaleza bsica y por lo tanto tiene afinidad por sustancias cargadas
negativamente como la pared celular de cualquier bacteria.por lo que bacterias Gram positivas y Gram negativas son
teidas de color violeta.
**Un mordiente es una sustancia que aumenta la fijacin de algn colorante sobre una superficie determinada, en
este caso el cristal violeta aumenta su fijacin a la pared clular bacteriana usando de mordiente al lugol, en la pared
bacteriana el lugol forma un complejo con el cristal violeta insoluble en agua lo que evita que se disuelva y se pierda el
colorante durante el enjuague.
Ya sabemos que la pared de los Gram positivos son ricos en cidos teicoicos no saturados estos muestran gran
afinidad por los agentes oxidantes, todos los mordientes por ejemplo el lugol son agentes oxidantes y su efecto en
general consiste en dar un caracter mas cidez de los cidos teicoicos lo que aumenta la afinidad de estos por el
colorante bsico cristal violeta.
**La mezcla de alcohol-acetona es un disolvente orgnico que decolora la pared bacteriana disolviendo el complejo
cristal violeta-lugol, esta decoloracin no afecta a las bacterias Gram positivas, hay varias explicaciones al respecto,
les

menciono

las

dos

ms

aceptadas.

-Una teora dice: El alcohol-acetona, deshidrata la pared rica en peptidoglicano de los microorganismos
grampositivos lo cual cierra los poros de la pared, propiciando una barrera que no permite la salida del complejo
cristal violeta-lugol.
En la pared de las bacterias gramnegativas hay poco pptido glicano y una gran cantidad de lpidos estos
ltimos son disueltos por el alcohol-acetona, lo que permite el escape del complejo cristal violeta-lugol.
-Otra teora dice: Las bacterias Gram positivas tienen una capa muy gruesa de peptidoglicano con gran
cantidad de enlaces entrecruzados de cidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-acetona formando una
especie de barrera en la pared bacteriana que no permite la slida del complejo cristal violeta-lugol por ende se
retiene el cristal violeta-lugol en la pared en el proceso de decoloracin.
**La safranina es un colorante catinico que tie las paredes bacterianas ya que estas tienen compuestos
cargados negativamente, por consiguiente las bacterias Gram negativas se tien de color rosa, sin embargo las
bacterias Gram positivas no se tien debido a que su pared clular esta saturada del colorante cristal violeta y esto no
permite la entrada de la safranina.

Factores que considerar en la tincin de Gram.


No

se

debe

sobrepasar

los

tiempos

de

tincin

decoloracin.

Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tian parcial o totalmente de color rosa.
Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-7.8 ya que:
Los

grampositivos

pueden

hacerse

gramnegativos

al

aumentar

la

acidez.

Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.


DAR CLIC AQUI. Realiza la tincin de Gram de forma interactiva, recuerda realizar correcatamente
los pasos. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan
State University.

Prueba de la oxidasa.
Esta prueba esta basada en la identificacin de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para
reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energa en forma de ATP a partir del proceso de respiracin tambin llamado
cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve
explicacin de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima
citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.
En la respiracin hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta
llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasale quita electrones al citocromoC, estos electrones son
transferidos por la enzima al oxgeno siendo este el ltimo aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente
debido a que el oxgeno tiene un exceso de electrones puede atraer tomos de Hidrgeno formando dos posibles
productos: Agua o perxido de hidrgeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.


Se utilizan colorantes cromgenos que actan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta
manera al oxigeno usado por la bacteria, los ms usados son:

Tetrametil-p-fenilendiamina.

Dimetil-p-fenilendiamina.

Indofenol.

El reactivo basado en una disolucin acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el ms comn y recibe el nombre
de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio
ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.
Fundamento bsico: El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC
oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es una amina aromtica y la oxidacin
de esta produce quinolonas de color morado-azulado. Para mayores detalles checa la bibliogrfia en especial el libro
de Mac Fadin.

Como realizar la prueba de la oxidasa.

Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada proveniente
de un cultivo de 24h.
La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
Se debe observar una coloracin morada en un lapso no mayor a 30segundos para que sea positivo, de lo
contrario el resultado es negativo.

Control positivo: Pseudomonas aeruginosa. Control negativo: Escherichia coli.

Factores a considrerar en la pueba de oxidasa.

No considerar un resultado positivo despus de 30 seg ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al
reactivo.

No usar asa bacteriolgica metlica ya que la mayora de estas con tienen hierro y este es capaz de

oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.


No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen
glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentacin del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado

falsos negativos en la prueba.


Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar sangre, Agar BHI,
agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.

Realiza de forma interactiva la prueba de oxidasa. La prueba interactiva pertenece y se obtuvo del: Virtual
Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State
University. http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html

Prueba de la catalasa.
Prueba de catalasa Realiza la prueba de catalasa de forma interactiva. La prueba interactiva pertenece y se
obtuvo del: Virtual Iteractive Bacteriology Laboratory. Michigan State University.

Fundamento de la pruebe de catalasa.


El perxido de hidrgeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta va metablica
recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.
La acumulacin del perxido es muy toxico por lo que la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas
exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzimallamada catalasa que degrada el perxido de hidrgeno
obteniendo agua y oxigeno gas.

Tcnica e interpretacin de la prueba.


El reactivo utilizado en la prueba es el perxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes tcnicas para realizar la prueba
la mas comn es poner una gota de perxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco
de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay
produccin de oxgeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa ., hay bacterias
que dan una reaccin positiva debil aunque son las menos.

Reaccin de la catalsa.

Control positivo: Stahylococcus aureus


Control negativo: Streptococcus pyogenes

Prueba de oxidacin y fermentacin tambin conocida como OF.


Las bacterias ocupan diferentes vas metablicas para obtener sus nutrientes y la energa, casi todas las bacterias
consumen algn tipo de carbohidrato generalmente el mas utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la va
oxdativa, fermentativa o ambas.
La va oxidativa utiliza oxgeno, un sinnimo es va aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno,
sinnimo metabolismo anaerobio.
Peptona.

2g

NaCl.

5g

D-glucosa.

10g

Azul de bromotimol.

0.03g

Agar.

3g

Fosfato dipotasico.

0.3g

Agua.

1000m
Ingredientes del medio OF.

Ph debe ser 7.1, que dara un color verde en la preparacin.

Fundamento de la prueba bioqumica de OF.


El metabolismo oxdativo de la glucosa produce cidos dbiles, por lo tanto en la prueba bioqumica se utiliza de
indicador el azul de bromotimol que tiene un vire de ph menor respecto al rojo de fenol, ya que son cidos dbiles se
agrega una mayor cantidad de glucosa hasta el 1%, para que se produzca una mayor cantidad de cidos y se alcance
mas fcilmente el vire del indicador.
El metabolismo de las peptonas produce sustancias alcalinas que podran disminuir el Ph del medio evitando as
evidenciar la presencia de los cidos dbiles producidos por la via oxidativa, para solucionar esto el medio tiene poca
cantidad de peptonas hasta el 2% respecto a la D-glucosa.
Ph de vire del azul de bromotimol: 6-7
cido: Amarillo Alclino: Verde.
En el tubo sin aceite: La produccin de cidos dbiles reducira el ph del medio esto ser evidenciado gracias al
indicador producindose una coloracin amarilla en todo el tubo, aunque puede variar su intensidad.

En el tubo con aceite: La fermentacin de la glucosa produce cidos fuertes respecto a los que produce la va
oxidativa, ejemplo de estos cidos son el cido lctico, cido frmico, cido actico, entre otros. El medio se acidifica y
el vire del indicador da como resultado una coloracin amarilla intensa en la totalidad del tubo.

Tcnica de la prueba.
Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estril,
despus se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada posteriormente se inoculan ambos tubos por el
mtodo de picadura y finalmente se preparan las condiciones de los tubos;
Un tubo se cerrara su tapa de tal forma que quede floja con la intencin de que entre algo de oxigeno, al segundo tubo
se le agregara 1.5-2ml de aceite mineral estril y la tapa se cerrara completamente, se incubarn durante 24h.
Control positivo oxidativo: Pseudomonas aeruginosa
Control positvo fermentador: Escherichia coli
Control sin cambios, no consume glucosa: Moraxella sp

Prueba de motilidad.
La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la inoculacin de los
medios OF o en un medio SIM, este mtodo es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho
chueca o irregular lo que nos darian falso positivo. Para evitar este factor se realiza la tcnica de gota suspendida
bacteriana.
Tcnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solucin fisiolgica salina estril, ponerle
un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un
cubreobjetos al que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeas de plastilina con el objetivo de evitar
que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X.
Se alcanzan haber bacterias muy pequeas y casi translcidas moverse a velocidad variable, observar al menos de 510 bacterias recorrer todo el campo de visin para declarase una motilidad positiva. La mayora de las bacterias
motiles son de morfologa bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.

Endsporas y formas de persistencia


Contenidos de la pgina

Introduccin | Caractersticas
microscpicas | Esporulacin | Induccin | Propiedades| Germinacin |
bilidad | Enlaces

Via

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ulas y Limos ] [ Pigmentos ][ Nutricin ]

Introduccin | Contenidos

Las endsporas bacterianas son formas de perdurabilidad de ciertos grupos de


bacterias frente al calor, la desecacin, la radiacin y las influencias qumicas.
Contienen un genoma y toda la maquinaria metablica esencial.
La termorresistencia de las endsporas es una de sus principales caractersticas.
Mientras que las bacterias o las formas vegetativas de las bacterias esporuladoras
sometidas a 80 C durante diez minutos (pasteurizacin) mueren, las endsporas
sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para eliminarlas son
necesarias tcnicas de esterilizacin.
Esta caracterstica permite un fcil mtodo de aislamiento de las bacterias
esporuladas, calentando el material donde se supone que existen esporas a 100
C durante 10 minutos mueren todas las bacterias y, seguidamente, las esporas
sobrevivientes se hacen germinar y crecer en el medio de cultivo adecuado.
Son formadoras de esporas las bacterias bacilares Gram positivas, entre ellas, las
pertenecientes al genero Bacillus son aerbicas y las del
genero Clostridiumanaerbicas. Un aspecto interesante es que el contenido de
GC de este tipo de bacterias es bajo, los clostridios contienen la menor
proporcin de GC de los procariotas: 22 al 27 %.
Caractersticas microscpicas | Contenidos
Observadas con microscopa ptica muestran una gran refringencia. Esto es debido al
elevado ndice de refraccin, resultante de las protenas deshidratadas y concentradas
en el pequeo espacio de la espora. Prcticamente toda la materia seca de la bacteria
esta en la espora que posee un volumen igual a la dcima parte de la bacteria que la
origino. Se colorean en caliente con carlbolfucsina y no se decoloran cuando el frotis es
lavado con etanol.

E: endospora que da al conjunto aspecto de clava o masa

Las bacterias formadoras de esporas se caracterizan por la posicin de


la endoespora en la clula madre antes de ser liberada. La espora pude
ser central, terminal o subterminal, y la clula original puede o no
hincharse para acomodar la espora.
Esporulacin | Contenidos

Esquema animado de la esporulacin

Tal como se observa en el esquema, la esporulacin comprende:


una divisin asimtrica (1), durante la cual el futuro protoplasto de la espora recibe el
material nuclear correspondiente. A diferencia de una divisin comn, el
estrangulamiento del protoplasto de la clula materna no es seguido por el de la pared
celular entre los dos protoplastos hijos (2).
a posteriori el protoplasto de la futura espora es rodeado por la membrana
citoplasmtica de la otra clula resultante de la divisin, siendo finalmente englobada
por la misma (ver esquema).
el resultado de este englobamiento es que la futura espora esta rodeada por dos
membranas citoplasmticas que intervendrn en la fase final de la espora
sintetizando
la membrana del protoplasto de la espora sintetiza hacia el exterior la pared celular
la membrana del protoplasto procedente de la otra clula sintetiza hacia el
interior el cortex de la espora, compuesto de un glucopptido similar a la murena
pero con mayor cantidad de enlaces transversales.
esta otra clula forma en algunos casos el exosporio, que rodea a la espora como una
envoltura suelta.

El material de las envolturas representa casi el 50% del peso seco de la


espora madura.
El proceso someramente descrito es uno de los fenmenos de
diferenciacin ms complejos de la clula bacteriana. Entre las
transformaciones qumicas y fsicas que acompaan a los cambios
morfolgicos destaquemos:
concentracin del material proteico en la zona de formacin de la espora
en razn de la concentracin de material aumenta el ndice de refraccin de la zona
utilizacin del material de reserva (poli-beta-hidroxibutrico, en anaerobios y
polisacridos en aerobios) para procesos de degradacin y sntesis
sntesis de cido dipicolnico, especifico de las esporas, no se lo encuentra en las
clulas vegetativas. Este cido se combina en forma de quelato con iones Ca ++. Se
localiza en el protoplasto de las esporas termorresistentes.
se liberan por autolisis de las clulas maternas
Propiedades | Contenidos
no presentan actividad metablica
gran resistencia al efecto del calor
gran resistencia al efecto de las radiaciones
gran resistencia al efecto de los productos qumicos

La resistencia a los efectos del calor se atribuye al bajo contenido de


agua (aprox. 15%) y al contenido de cido dipicolnico.
La resistencia al efecto de las radiaciones se atribuye a la presencia de
puentes disulfuro, resultante de la presencia de cistena en las
protenas de la cubierta externa.
La resistencia al efecto de los productos qumicos debe atribuirse a
la impermeabilidadque presenta en esos casos la cubierta de la espora.
Induccin | Contenidos

En condiciones favorables los bacilos de las especies esporuladoras se


reproducen indefinidamente en su forma vegetativa, la esporulacin no
es una fase obligada del ciclo de vida de la bacteria.

La formacin de esporas se desencadena cuando faltan nutrientes o se


acumula un exceso de productos del metabolismo celular.
Puede inducirse la esporulacin colocando las clulas en agua destilada,
la cual se produce a expensas de las sustancias de reserva de la clula y,
probablemente como consecuencia de la ausencia de sustrato en el
medio. Avalando esta hiptesis, la formacin de esporas no se produce
si dentro de las cinco horas de puestas en agua destilada clulas
vegetativas de Bacillus cereus, se agrega glucosa al medio.
La presencia de manganeso en el agua suele favorecer la esporulacin.
Germinacin | Contenidos

El proceso por el cual las esporas pasan a formar clulas vegetativas se


denomina germinacin. Ocurre cuando se las coloca en el medio
adecuado y se requiere en muchos casos la disponibilidad, entre otros,
de glucosa, aminocidos y nuclesidos. Es posible elevar el porcentaje
de esporas que germinan con un shock trmico.
Entre los fenmenos de la germinacin destaquemos:
perdida de la resistencia trmica
aparicin de la respiracin
aparicin de actividad enzimtica
excrecin de cido dipicolnico, pptidos y aminocidos
ruptura de las cubiertas y aparicin del "tubo germinativo"(origen de la clula
vegetativa)
A este punto
la pared celular de la clula emergente esta incompleta
la coloracin de Gram por lo tanto no es la definitiva
hay permeabilidad a molculas como el ADN (lo cual facilita fenmenos de
transformacin)

Pruebas del IMViC

Fundamento: Indol, Rojo


Metilo,
Voges-Proskauer
Citratos

de Son
cuatro
pruebas
bioqumicas.Se
emplean
y fundamentalmente
para
la
identificacin
de
las Enterobacterias (bacilos
Gram
negativos,
anaerobios
facultativos
con
metabolismo
fermentador). Dependiendo de las condiciones, las
enterobacterias, pueden realizar un metabolismo
aerobio (si disponen de oxgeno), realizar una
respiracin anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor
de electrones) y distintas fermentaciones.
Escherichia coli : Indol + ;Rojo de metilo +; VogesProskauer ;Citratos -

5.1. Produccin de Indol (I):

5.1. Produccin de Indol


a-Fundamento: Se determina si la bacteria posee una
(I)
enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el
triptfano en indol y alanina. El indol se detecta
empleando un reactivo especfico (Reactivo de
Kovacs). El triptfano forma parte de las peptonas
del medio.
b- Materiales y reactivos:Agua
de peptona
y Reactivo de Kovacs

5.1.c- Mtodo:

cMtodo:
Inocular
el
medio de cultivo (agua de
peptona). Incubar a 37 oC
durante 48 horas

Aadir unas gotas de reactivo


de Kovacs. Agitar y dejar
reposar el cultivo. El HCl
proporciona el pH cido que
requiere la reaccin. El alcohol
amlico es, insoluble en agua y
menos denso

5.1.d-Resultado:
Produccin de Indol

Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha


formado un complejo coloreado entre el indol y el pdimetilamino
benzaldehdo.El
alcohol
amlico
concentra el complejo coloreado en la superficie
A la izquierda se observa un
cultivo de E. coli y a la derecha
otro de Salmonella spp

5.2. Rojo de metilo (M)

5.2. Rojo de metilo (M)


5.2.a. Fundamento: Detecta la fermentacin cidomixta. Se acumulan cidos (actico, frmico, etc.),
relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta
4-5. Dicho cambio de pH se detecta aadiendo un
indicador (rojo de metilo) al cultivo
b. Materiales y reactivos: Medio de Clark-Lubs e
indicador de rojo de metilo

5.2.c. Mtodo

Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC


durante 48 horas.
Aadir unas gotas de rojo de metilo (rojo a pH 4-5;
amarillo a pH>6)

5.2.d. Resultado. Rojo de


Metilo
A la izquierda un cultivo de E.
coli y a la derecha otro
de Serratia

5.3.
(V)

Voges-Proskauer

Fundamento
Detecta la fermentacin butanodilica. En esta
fermentacin se producen menor cantidad de cidos
que en la fermentacin cido-mixta, y una gran
cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfanaftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un
precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o
acetona). La acetoina en presencia de oxgeno se
oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloracin
roja al reaccionar con los restos guanidnicos de
algunos aminocidos de la peptona del medio (Ej.
Arginina).
b. Materiales y reactivos: El medio de cultivo, es el
mismo que en la prueba del rojo de metilo. Reactivos
:alfa-naftol

5.3.c. Mtodo

Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC


durante 48 hora
Aadir unas gotas alfa-naftol (0.6 ml). Agitar y
aadir KOH (0.2 ml).Agitar. Iincubar 1-2 horas a
37 oC

5.3.d.Resultado:
Proskauer

La acetona en contacto con el oxgeno y la potasa


diacetilo. El alfa naftol incrementa la
sensibilidad de la reaccin. El diacetilo origina un
compuesto de color rosado.La prueba ser positiva si
en 20 minutos aparece una coloracin roja. Los
cultivos negativos se incuban 1-2 horas a 37 oC en
posicin inclinada efectundose de nuevo la lectura.
(El contacto con el oxgeno y la elevada temperatura
favorecen la reaccin).

Voges- origina

A
la
izquierda
cultivo
de Serratia spp. Y a la derecha
de E. coli

5.4.
Consumo
citratos (C)

Fundamento:

Se determina la utilizacin del

de citrato como nica fuente de carbono y energa. La


prueba emplea un medio definido (Koser) con citrato
como nica fuente carbonada (se detecta turbidez).
Alternativamente se utiliza el medio de Simmons:
utiliza un medio slido con citrato sdico y un
indicador cido-base (azul de bromotimol). En este
caso se detecta la alcalinizacin del medio por el
consumo del citrato.
Materiales y reactivos: Medio de Koser o Medio de
Simmons

5.4.c. Mtodo

Inocular uno de los medios:El medio de Simmons es


slido, y se siembra por estra con asa de platino.
Incubar a 37 oC durante 48 horas
Detectar el crecimiento en el medio de Koser por

5.4.d.
Resultado: turbidez. En el medio de Simmons por alcalinizacin
Crecimiento sobre citrato del cultivo (el indicador toma color azul)
como unica fuente de
carbono
Crecimiento en el medio de
Simmons:
a
la
izquierda
cultivo de Salmonella spp. y a
la derecha de E. coli. *Dado
que la lectura del medio de
Koser se hace detectando la
turbidez
del
medio,
es
necesario inocular con una
pequea cantidad de bacterias
y comprobar que el tubo
permanece casi transparente
tras la inoculacin.

E.M.B. Agar.
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento
selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine,
para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de
enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin
entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que
son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de
metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un
caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro
oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son
incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. como colonias
rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de
clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece en este medio como
colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras

bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede
ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al
0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas.
En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de
Salmonella y Shigella.

De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.

Resultados

Microorganismos

Tipo de Colonia

Escherichia coli ATCC 25922

Verdosas con brillo metlico y centro negro azulado

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Mucosas, rosa prpura, confluentes

Proteus mirabilis ATCC 43071

Incoloras

Enterococcus faecalis ATCC 29212

Incoloras, pequeas, puntiformes

Shigella flexneri ATCC 12022

Incoloras

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Incoloras

Baird Parker Medio Base.


Medio de alta especificidad diagnstica, selectivo y diferencial para el
aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en alimentos y otros
materiales de importancia sanitaria.

En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto de carne


constituyen la fuente de carbono y nitrgeno, el extracto de levadura aporta
vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el crecimiento de
los estafilococos.
Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y al
cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompaante. La

yema de huevo permite demostrar la actividad lecitinsica.


Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan
colonias de color grisceo-negro, y dan reaccin sobre la yema de huevo
produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una
zona clara mas externa.
Se pueden encontrar cepas no lipolticas, que presentan igual caractersticas de
colonias pero sin la zona opaca y clara.
Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas bioqumicas.
Prueba del Indol
Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido
triptfano mediante el enzima triptofanasa.

Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta
abundante triptfano). Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs.

Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las ms convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las
especies de Klebsiella (indol-).

Prueba del indol


La prueba del indol es una prueba bioqumica realizada en especies bacterianas para
determinar la habilidad del organismo de romper el indol del aminocido triptfano. Esta
divisin molecular es lograda por una serie de enzimas intracelulares diferentes, un sistema
que en conjunto se le llama con frecuencia triptofanasa.

Se genera el indol por una desaminacin reductiva del triptfano via la molcula intermediaria
cido indolpirvico. Las triptofanasas catalizan la reaccin de desaminacin, durante el cual se
remueve el grupo amino (NH2) de la molcula de triptfano. Los productos finales de la
reaccin son el indol, cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Comocoenzima de la reaccin
se requiere al fosfato de piridoxal.
ndice
[ocultar]

1Procedimiento

2Bacterias indol positivas

3Bacterias indol negativas

4Referencias

Procedimiento[editar]
Tal como ocurre con muchas pruebas bioqumicas, los resultados de una prueba de indol se
indican con el cambio de color que sigue a la reaccin. El cultivo bacteriano puro debe ser
sembrado en un caldo con triptofano o peptona estriles o ambos por 24 a 48 horas antes de
realizar la prueba. Luego de la incubacin, se aaden cinco gotas de reactivo Kovac (alcohol
isoamilo, p-dimetilaminobenzaldehdo y cido clorhdrico concentrado) al caldo del cultivo.
Una variante de la prueba se realiza usando el reactivo de Ehrlich (usando alcohol etlico en
lugar del alcohol isoamilo, desarrollado por Paul Ehrlich), en especial si se tiene un organismo
que no sea fermentador y en organismo anaerbico.
Los resultados positivos se muestran por la presencia de un color rojo o rojo-violeta en la
superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se muestra amarillo. Un
resultado variable puede ocurrir cuando se muestra un color anaranjado. Ello es debido a la
presencia de escatol, tambin conocido como metil-indol o indol metilado, otro posible
producto de la degradacin del triptfano.
O.N.P.G.
Prueba rpida, utilizada para diferenciar los microorganismos fermentadores lentos de
lactosa, de los no fermentadores.
Su uso es muy difundido para confirmar o descartar especies de Salmonella.
Fundamento
La lactosa puede ser fermentada de manera rpida (18-24 horas), en forma lenta, o
puede no ser fermentada.
Los microorganismos que la fermentan rpidamente poseen 2 enzimas: b-galactsido
permeasa, la cual est localizada en membrana celular y est involucrada en el
transporte de la lactosa, y la b-D-galactosidasa, que es intracelular y est involucrada
enla hidrlisis dela lactosa agalactosa y glucosa.
Los microorganismos fermentadores lentos de lactosa, son deficientes en b-galactsido
permeasa pero no en b-D-galactosidasa, y los microorganismos no fermentadores no
poseen ninguna de las 2 enzimas.
Los discos contienen O.N.P.G. (orto-nitrofenilgalactopiranosido), el cual tiene la
caracterstica entrar rpidamente al interior de la clula bacteriana, sin la necesidad de
utilizar la b-galactsido permeasa, y all es metabolizado por la b-D-galactosidasa,
liberndose o-nitro-fenol, compuesto de color amarillo.
Resultados
Positivo: observacin de color amarillo en la suspensin.
Negativo: la suspensin permanece sin cambio de color.

Microorganismo

ONPG

Escherichia coli ATCC 25922

Citrobacter freundii

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Proteus mirabilis ATCC 43071

Segn una definicin reciente de Pitt (1996), las micotoxinas son "metabolitos fngicos cuya ingestin,
inhalacin o absorcin cutnea reduce la actividad, hace enfermar o causa la muerte de animales (sin excluir
las aves) y personas."
Las micotoxinas se encuentran en diversos alimentos y piensos y se han relacionado (Mayer, 1953; Coker, 1997) con diversas
enfermedades de animales y personas. La exposicin a micotoxinas puede producir toxicidad tanto aguda como crnica, con resultados
que van desde la muerte a efectos nocivos en los sistemas nervioso central, cardiovascular y respiratorio y en el aparato digestivo. Las
micotoxinas pueden tambin ser agentes cancergenos, mutgenos, teratgenos e inmunodepresores. Actualmente est muy extendida la
opinin de que el efecto ms importante de las micotoxinas, particularmente en los pases en desarrollo, es la capacidad de algunas
micotoxinas de obstaculizar la respuesta inmunitaria y, por consiguiente, de reducir la resistencia a enfermedades infecciosas.
Las micotoxinas son objeto de inters mundial debido a las importantes prdidas econmicas que acarrean sus efectos sobre la salud de
las personas, la productividad de los animales y el comercio nacional e internacional. Por ejemplo, se ha calculado (Miller, comunicacin
personal), que en los Estados Unidos de Amrica y el Canad, las prdidas anuales debidas a los efectos de las micotoxinas en las
industrias forrajeras y ganaderas son del orden de 5 000 millones de dlares. En los pases en desarrollo, donde los alimentos bsicos
(como el maz y el man) son susceptibles de contaminacin, la poblacin se ver tambin probablemente afectada de forma significativa
por la morbilidad y las muertes prematuras relacionadas con las micotoxinas.

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