Digesto Trptica e Preparo de Amostra Complexa para LC-MSE, usando o

Sistema 2D nonoAcquity
Laboratrio Max Feffer de Gentica de Plantas
Departamento de Gentica
Esalq/Usp

Obs: Todos os cidos e solventes orgnicos devem ser manipulados com

muito cuidado e sempre no interior de capela de exausto e descartados de
acordo com as normas para descarte de resduos. Acetonitrila, TFA e Hidrxido
de amnio so txicos e o cido frmico corrosivo. Dessa forma, devem ser
manipulados com muito cuidado.
Obs: Cuidados a serem tomados para minimizar contaminaes com
queratina, polmeros e outras impurezas que podem interferir na qualidade das
amostras:
i)

ii)

iii)

Use luvas de nitrila: www.danny.com.br o tempo todo e lave-as, caso

necessrio, para evitar contato com poeira e fios de cabelo que
eventualmente podem ficar aderidos devido esttica do material
das luvas.
Utilize sempre qumicos (grau MS), ponteiras e microtubos novos,
graduados e no siliconizados (Tabela 1), para evitar contaminao
por polmeros na amostra. Mantenha os tubos em locais livres de
poeira e no autoclave-os. Se possvel, utilize pipetas exclusivas
para tal uso.
Sempre verifique a limpeza dos tubos, frascos de preparo dos
tampes e os vidros da cuba de eletroforese. aconselhvel separar
a vidraria que deve ser de borosilicato (Tabela 1), para tal finalidade.
Evite o uso de detergentes polimricos, tais como: Triton X100, SDS,
Tween, etc.. Recomenda-se fazer a lavagem da vidraria com gua
miilQ (5 a 6 vezes) e um enxgue final com metanol, antes do uso.

Solues:
Obs: As solues devem ser todas novas (CRTICO), preparadas na
quantidade necessria, no dia do uso. No devem ser estocadas. O
bicarbonato de amnio extremamente voltil.

Procedimento:
1) Dessalinize (100 200 g) da amostra com auxlio de uma coluna
AmiconUltra da Millipore ou Vivaspin, da GE Helthcare, seletivas
para 3000-10000 NMWL (dependendo do peso molecular das
protenas de interesse e do volume da amostra (Obs: Cuidado para
no exceder a capacidade da coluna), antes da quantificao que
pode ser realizada pelo teste de Bradford ou, no caso de protenas

pouco abundantes, com auxlio do Agilent Protein 80 Kit (cat# 50671515) ou Agilent Protein 230 kit (cat# 5067-1517), de acordo com as
normas do fabricante (Agilent Technologies).
2) Corra um gel de SDS-PAGE das amostras, juntamente com uma
amostra padro de BSA (1, 2 e/ou 5 ug) para confirmar a
quantificao da protena por Bradford, pela anlise visual e
comparativa do gel. Obs: Nem sempre, a quantificao por Bradford
compatvel com a quantificao em gel. Obs: Faa a correo da
concentrao da amostra, de acordo com o gel, pois a
quantificao correta imprecindvel !.
3) Subdividida as amostras em alquotas de 50L contendo 50g
(1g/L) para preparar as amostras para digesto com tripsina para
anlise de espectrometria de massas.
4) Transfira 50L de amostra (1g/L) para um tubo eppendorf (1.5 mL)
(Axygen, cat# MCT-150-L-C). Essa a quantidade de amostra
necessria para a digesto.
5) Adicione 25L de uma soluo RapiGest SF (0.2%) e agite (Vrtex).
A soluo de 0.2% RapiGest SF preparada adicionando-se 500 L
de gua a um vial de 1 mg de RapiGest SF (Waters Part
No186001861, 5 x 1 mg).
6) Transfira o tubo para um bloco aquecido (80C). Aquea por 15 min.
7) Remova o tubo do bloco aquecido. Centrifugue (pulso). Adicione 2.5
L de 100 mM ditiotreitol (DTT, BioRad, cat# 161-0611, MW=154.3)
= [1.5 mg/100 L H2O milliQ], para abrir a protena e deix-la mais
acessvel aos passos de alquilao e digesto. Agite (Vrtex).
8) Transfira o tubo para bloco aquecido (60C). Aquea por 30 min.
9) Remova o tubo do bloco. Espere a amostra chegar temperatura
ambiente. Centrifugue (pulso).
10) Adicione 2.5 L de 300 mM iodoacetamida (IAA, GE, cat# RPN
6302V, MW=185.0) = [5.55 mg/100L H2O milliQ], para a alquilao
de cistenas. Agite (Vrtex). Obs: Composto muito sensvel luz.
(CRTICO)
11) Transfira as amostras para o escuro, temperatura ambiente e
mantenha-as por 30 minutos (tempo de reao).
12) Adicione 10 L de soluo de tripsina (Promega) em 50 mM
NH4HCO3 (Preparada pela adio de 400 L de 50 mM NH4HCO3 em
um vial de 20 g da Promega Trypsin (= 0.05 ug/uL), Part No.
V511A, 100 g em 5 x 20 g aliquotas). Agite (Vrtex). Proceda a

digesto a (37C) overnight. Nesse caso a proporo enzima:

proteina de 1:100 (wt:wt).
13) Aps a digesto, para hidrolisar o RapiGest SF, adicione 10 L de
5% (v:v) TFA (preparado em H2O milliQ, a partir de ampolas de alta
pureza, Pierce, Part No. 53102, HPLC Grade, 10 x 1 mL). Agite
(Vrtex). Incube as amostras a (37C) por 90 min. Centrifugue
(18.000 g) a 6C, por 30 min. Transfira o sobrenadante para vial
(Waters Total Recovery Vial, Waters Part No. 186000385c,
100/pkg, preslit PTFE/silicone caps).
14) Seque as amostras em speed vac. A partir desse ponto, as
amostras precisam passar por uma coluna C18 de purificao (ZipTip
Reversed-Phase ZipTip C18, P10, da Millipore, cat# ZTC18S960)
ou (PepCleanTMC-18 Spin Column, da ThermoScientific, cat#
89870), antes de serem analisadas.
15) No caso de utilizao da coluna C18 de purificao (ZipTip
Reversed-Phase ZipTip C18, P10, da Millipore, cat# ZTC18S960),
ressuspenda as amostras em 50 L de soluo 0.1% TFA preparada
em H2O milliQ.
16) Divida a amostra (50L) em 5 fraes de 10 L em tubos eppendorf
(1.5 mL) (Axygen, cat# MCT-150-L-C), pois a capacidade de
reteno dessa coluna pequena 10 g.
17) Purifique os peptdeos resultantes da digesto, com auxlio do ZipTip
(ver protocolo no site) e faa a eluio individual dos peptdeos de
cada frao em 10 L da soluo de 0.1% TFA em (50%) ACN.
Combine as 5 fraes purificadas em um nico vial (Waters Total
Recovery Vial, Waters Part No. 186000385c, 100/pkg, preslit
PTFE/silicone caps), de forma a obter um volume final de 50L de
amostra.
18) Outra possibilidade para purificao dos peptdeos, de forma menos
trabalhosa, utilizar colunas C18 de maior capacidade, para volumes
maiores (PepCleanTMC-18 Spin Columns da ThermoScientific, cat#
89870). Nesse caso, a amostra previamente seca em speed vac,
deve ser ressuspendida em 50L de soluo 0.5% TFA em 5% ACN,
preparada em H2O milliQ. Divida a amostra em 2 fraes de 25 L e
utilize 2 colunas separadamente para cada frao, pois a capacidade
mxima de adsoro dessas colunas de 30g. Purifique e elua os
peptdeos resultantes da digesto, de acordo com o protocolo do
fabricante (Thermo Scientific). Combine as duas fraes em um
nico vial (Waters Total Recovery Vial, Waters Part No.
186000385c, 100/pkg, preslit PTFE/silicone caps), de forma a
obter um volume final de 50L de amostra.
19) Tanto para o caso de utilizao da coluna C18 de purificao (ZipTip
Reversed-Phase ZipTip C18, P10, da Millipore, assim como para o

caso da PepCleanTMC-18 Spin Column da ThermoScientific, seque

as amostras em speed vac . Obs: Nesse ponto, caso seja
necessrio, pode-se interromper o procedimento e manter as
amostras a -80C at o momento da anlise.
20) No momento da anlise, ressuspenda as amostras em 5 L de 1N
NH4OH 25% (Hidrxido de amnio, Merck, cat# K39008632, d =
0.91, MM = 35.04g) [192.5 L/5 mL H2O, grau MS], para que
ocorra uma eficiente associao da amostra coluna de 1
dimenso.
21) Adicione 1.0 L de 1pmol/L do padro interno por exemplo: (ADH,
PHB ou ENO) amostra purificada e agite (vrtex). Acrescente 44
L de uma soluo 20 mM de Formiato de amnio (NH4Fo), pH=10,
chegando a um volume final de 50 L. Obs: Dessa forma, a
concentrao final do padro interno de 20 fmol/L. Caso no seja
necessrio o uso do padro interno para quantificao, adicione qsp
L de NH4Fo 20 mM (pH=10), para obter um volume final de 50 L.
Obs: A soluo 20 mM de formiato de amnio (pH=10) deve ser
preparada a partir da diluio (1:10), em H2O (grau MS), da soluo
estoque 200mM (pH=10), que se prepara adicionando-se 1.432 mL
de NH4OH 25% (Hidrxido de amnio, Merck, cat# K39008632) em
90 mL de H2O (grau MS), acrescido de 162 L de cido frmico
(Fluka, cat# 56302-10x1ML-F, ampolas de alta pureza, CAS: 6418-6, MW= 46.03). O pH=10, deve ser ajustado utilizando-se a
soluo de NH4OH 25% (Hidrxido de amnio, Merck, cat#
K39008632) ou cido frmico (Fluka, cat# 56302-10x1ML-F).
Obs: Os passos 20 e 21, sero realizados no momento da anlise
pelo pessoal tcnico responsvel pela facility.