UNIVERSIDAD EL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA1
VI SEMESTRE
GUA No 3
VERIFICACIN DEL ADN OBTENIDO MEDIANTE
ELECTROFORESIS
1. INTRODUCCIN
La electroforesis es un trmino general que se refiere a la tcnica de separacin o
caracterizacin de molculas cargadas elctricamente con base en sus tasas especficas de
migracin en un campo elctrico. El proceso es generalmente realizado en una matriz
porosa de modo que las macromolculas puedan migrar diferencialmente de acuerdo con
sus propiedades fsicas.
Una matriz usada comnmente en la separacin de molculas de ADN con tamaos
variando principalmente entre 100 y 30.000 pb es la agarosa, una forma de agar altamente
purificado. Esta matriz porosa sirve como base a travs de la cual, las molculas se mueven
con velocidades diferentes, inversamente proporcionales a su tamao. As cuando ms
pequea es la molcula, mayor ser la distancia que ella recorre en un determinado periodo
de tiempo.
Los fragmentos de ADN migran en direccin al polo positivo, una vez que tiene carga
elctrica negativa, conferida por la ionizacin de sus grupos fosfato. Despus de la
migracin electrofortica, todas las molculas de ADN del mismo tamao quedan
agrupadas en una determinada regin del gel y son visualizadas como una banda.
El procedimiento puede dividirse en cuatro etapas: preparacin del gel, aplicacin de las
muestras, electroforesis y anlisis de los fragmentos separados. La concentracin de
agarosa en la preparacin del gel es escogida en funcin del tamao de los fragmentos que
se desea separar (Tabla 1).
Tabla 1. Relacin entre la concentracin de agarosa y el rango de separacin en tamao
molecular del ADN
Concentracin de agarosa
en el gel (%)
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2
1.5
2.0

Eficiencia en el rango de separacin de

molculas lineales de ADN (Kb)
5.0 60.0
1.0 20.0
0.8 1.0
0.5 7.0
0.4 6.0
0.2 3.0
0.1 2.0

1 Elaborada por: Ivn Daro Otero, Bilogo, C.M.Sc. Adaptada de Manual de Biologa MolecularProcedimientos bsicos. Universidad de Nario. Actualizada por: Ing. Roco Bonilla Mndez. C.M.Sc

Fuente: Puerta y Uruea, 2005.

2. OBJETIVOS
2.1 General
Determinar la calidad del DNA obtenido mediante protocolos bsicos de extraccin.
2.2 Especficos

Adquirir destreza en la corrida electrofortica de muestras de ADN en geles de

agarosa
Conocer las caractersticas que determinan un buen DNA apto para ser usado
posteriormente.

3. MATERIALES Y EQUIPOS
1
2
3
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5
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20
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22
23

pHmetro
Micropipetas de diversos volmenes
Balanza analtica
Plancha de calentamiento
Estufa u horno microondas
Cmara de electroforesis
Fuente de poder
Fotodocumentador o transiluminador
Gafas de proteccin luz ultravioleta
Reactivos y soluciones: azul de bromofenol (tampn colorante 6X), buffer TEII,
buffer TAE 1X, marcador de HindIII
Agua grado molecular
Agua destilada estril
Papel parafilm
Puntas nuevas y estriles de diferentes volmenes
Tubos eppendorf de 1.5 mL
1 erlenmeyer de 100 mL
Mscara y gorro de proteccin
Guantes de nitrilo
Frascos de descarte
Libreta de notas
Lpiz marcador
Jabn antibacterial
Papel toalla

4. REACTIVOS
TE II: 10 mM Tris-HCl pH 7.5; 0.1 mM EDTA pH 8.0

TAE (Tampn Tris-Acetato-EDTA): Solucin 50 X (stock); Tris Base

242.0 g; cido actico glacial 57.1 mL; EDTA-Na 2 pH=8.0 100 mL; agua destilada grado
molecular 1000 mL.
Solucin 1 X (stock): TAE 50X 20 mL; agua destilada grado molecular 1000 mL;
Tampn colorante 6X: Azul de bromofenol 0.25%; Glicerina 30%
5. METODOLOGA
5.1 PREPARACIN DEL GEL DE AGAROSA
Se debe tener en cuenta que, para preparar una concentracin de agarosa determinada, se
debe inicialmente pesar el erlenmeyer conteniendo la agarosa disuelta en el tampn (TAE
1X o TBE 1X), despus del calentamiento para disolucin completa se pesa nuevamente y
se completa el volumen perdido por la evaporacin con el tampn respectivo. Este
procedimiento garantiza la concentracin exacta del gel y la homogeneidad de
concentracin de agarosa entre las corridas.
5.1.1
5.1.2
5.1.3
5.1.4
5.1.5
5.1.6

Pesar la agarosa para la concentracin de 0,8 % y adicionar tampn TAE 1X en el

volumen deseado.
Disolver la agarosa en bao Mara, estufa o microondas hasta no observar grumos y
observar la solucin de color transparente.
Dejar enfriar hasta que el gel alcance la temperatura aproximada de 50-60OC,
adicionar 5 L de safe view green.
Preparar la bandeja de la cmara de electroforesis colocando el peine deseado,
verificando que este nivelada en la superficie del mesn.
Llenar la bandeja, evitando la formacin de burbujas (dispersar la agarosa
lentamente).
Dejar solidificar la agarosa (si no se va a utilizar inmediatamente, se puede sumergir
en el tampn TAE 1X y guardar en la nevera para evitar resecamiento del gel, por
un tiempo mximo de 24-48 horas.

5.2 PREPARACIN DE LA MUESTRA

5.2.1
5.2.2

Sobre papel parafina coloque 2 L de azul de bromofenol y posteriormente

adicionar 5L de ADN.
Homogenizar las muestras con cuidado y adicionar cada una, en los pozos
correspondientes del gel de agarosa que previamente se debe ubicar en la cmara de
electroforesis y que debe estar cubierto con tampn TAE 1X.

5.3 MARCADOR DE TAMAO MOLECULAR

5.3.1
5.3.2

En un tubo de microcentrfuga adicionar 1 L de marcador de tamao molecular

Hind III, 3 L de tampn TE II y 1 L de la solucin tampn colorante 6X.
Llevar la mezcla a bao Mara a 65 C por 10 minutos.

5.3.3
5.3.4

Transferir el tubo con la mezcla a hielo por 10 minutos.

Adicionar 2 L del marcador en la primera y ltima posicin del gel de agarosa.

5.4 CORRIDA ELECTROFORTICA

5.4.1
5.4.2
5.4.3
5.4.4
5.4.5

Posicionar los electrodos en la cmara de electroforesis de modo que el inicio de la

corrida este prximo al electrodo negativo (negro).
Encender la fuente de energa y seleccionar el voltaje y tiempo de corrida
apropiado.
Despus de la corrida apagar la fuente y remover los electrodos.
Retirar el gel de agarosa de la cmara de electroforesis, con mucho cuidado y
usando siempre guantes libres de talco.
Visualizar en un transiluminador o fotodocumentador y tomar la fotografa.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

Cules son las dos funciones del tampn de aplicacin de la electroforesis?

Cmo el bromuro de etidio tie el ADN? Y cmo es el fundamento con otros
colorantes existentes ya en el mercado?
Qu sucedera si:
Si la cmara de electroforesis tuviera agua en lugar de tampn TAE?
Si se utilizara agua en lugar de TAE en la preparacin del gel de agarosa?
Si los electrodos se ponen invertidos?
Qu representa una banda en un gel de agarosa?
Examine la foto de su gel y describa la calidad de cada uno de los ADN procesados
en la electroforesis.
6. RECUPERACIN, DESACTIVACIN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE
LOS RESIDUOS QUMICOS, MATERIAL ORGNICO E INORGNICO
Depositar los residuos qumicos en el recipiente asignado para esta prctica y los residuos o
materiales sobrantes debern ser entregados al tutor de la prctica previamente rotulados.
7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Bloom, M., Freyer, G., Micklos, D. (1996). Laboratory DNA science: Na

introduction to recombinant DNA techniques and methods of genombre analysis.
The Benjamin/Cummings Publ. Co. Inc.
Puerta, C., y Uruea, C. (2005). Prcticas de Biologa Molecular. Editorial
Pontificia Universidad Javeriana. Coleccin Biblioteca del Profesional. 100p.
Sambrook, J., Russell, D. (2001). "Chapter 5, protocol 1". Molecular Cloning - A
Laboratory Manual 1 (3rd ed.). pp. 5.55.6. ISBN 978-0-87969-577-4.
Sheehan, D. (2009), Physical Biochemistry: Principles and Applications (2nd ed.),
Wiley-Blackwell, p. 181, ISBN 978-0470856031.