Ao de la consolidacin del Mar de Grau

Universidad nacional AGRARIA LA MOLINA

Facultad de agronoma
CTEDRA:
MICROBIOLOGA DE SUELOS
CATEDRATICO:
Dr. C. CALDERN.
ALUMNA:
-LLACZA MUNIVE SALLY LORENA.
- Galds CARLOS.
- palomino Enrique.
TEMA:
-

BACTERIAS NITRIFICANTES - FIJADORAS DE NITRGENO DE

VIDA LIBRE.

SEMESTRE:
X
SECCIN:
F*

INTRODUCCIN

El presente trabajo est elaborado con la finalidad de dar a conocer los resultados
obtenidos en las prcticas de microbiologa de suelos. Alrededor del 12% del peso seco
de las bacterias (biomasa) es contribucin del N (Madigan et l., 2004). Particularmente,
las bacterias pueden realizar en su totalidad cada uno de los pasos en las
transformaciones requeridas para completar y balancear el ciclo del N, ganando por su
parte energa o biomasa en sus metabolismos. Los procesos avanzados para la remocin
de nitrgeno estn ntimamente relacionados con los metabolismos de las comunidades
microbianas que intervienen en las transformaciones del mismo. Las bacterias que fijan
nitrgeno (tanto simbiticas como de vida libre) son endmicas en general a la mayora de
los tipos de suelo, sin embargo, en el estado natural por lo general slo abarcan un
porcentaje muy pequeo de la poblacin total de microorganismos y a menudo son las
cepas de menor rendimiento en relacin con la cantidad de nitrgeno que pueden fijar.

OBJETIVOS:
Comprender el proceso de nitrificacin del amonio y las reacciones qumicas y
organismos involucrados en el.
Aislar los organismos participantes en la nitrificacin mediante el empleo de los
medios adecuados.
Cuantificar las poblaciones de bacterias nitrificantes por el mtodo del nmero ms
probable (NMP).
Cuantificar la capacidad de nitrificacin potencial de una muestra de suelo.
Determinar la presencia de Azotobacter spp. en la zona de influencia radicular
(rizosfera) de una especie de gramnea.
Cuantificar la poblacin de estos organismos mediante el mtodo del nmero ms
probable (NMP).
Observar el desarrollo de colonias de Azotobacter spp. en medio agarizado y
caracterizarlas.

MARCO TERICO
La fijacin biolgica de nitrgeno (FBN) es un proceso que ocurre en la naturaleza y
representa la fuente de N ms barata para los suelos cidos del trpico hmedo. El

objetivo de este trabajo fue cuantificar la cantidad de N fijado por cuatro especies de
fabceas a travs de tcnicas isotpicas con 15N, en un suelo de sabana en Mxico. Los
tratamientos se establecieron bajo un diseo de bloques completos al azar, con cuatro
repeticiones. Las variables evaluadas fueron; biomasa fresca (BF), materia seca (MS),
nmero de ndulos (NN), masa seca de ndulos (MSN), Nitrgeno total (Nt) y Nitrgeno
fijado biolgicamente (Nf). Los resultados muestran que Mucuna deerengiana L. present
mayor produccin de BF y MS (17,50 y 5,47 Mg ha-1) as como MSN (58,79 mg planta-1)
y tambin mayor contenido de Nt y Nf (526,94 y 522,11 kg ha-1) respectivamente, en
comparacin con Cajanus cajan L., Phaseolus lunatus L. y Sesbania emerus L., especies
que mostraron valores bajos en dichas variables. Se concluye que Mucuna deerengiana
L. tolera bien los factores desfavorables que predominan en los suelos cidos y por ello
expresa una eficiencia superior a 500 kg ha-1 de Nf; se considera adecuada para
aumentar el nivel de nitrgeno en los suelos de sabana sin aplicar fertilizantes qumicos.

El ciclo global del nitrgeno

El ciclo global del nitrgeno es la serie continua de procesos naturales en los cuales el
nitrgeno se transforma a distintos estados de oxidacin y reduccin: de nitrgeno
molecular (n2) a amoniaco (NH3), luego a compuestos orgnicos carbono-nitrogenados,
xidos de nitrgeno y finalmente a N2 cerrando el ciclo (Warakomski et l., 2007). Tanto la
produccin industrial de NH4+ y NO3- como fertilizantes, como la combustin de
hidrocarburos fsiles, la descarga de aguas residuales y algunas otras acciones
antropognicas, han acelerado y des-balanceado considerablemente el ciclo del
nitrgeno, con efectos negativos como la eutrofizacin de los cuerpos de agua receptores,
el efecto invernadero por la generacin de xido nitroso (N2O), y los riesgos para la salud
humana como el consumo de nitratos (NO3-) en el agua potable (Towsend et l., 2003).
Un aspecto fundamental del ciclo del nitrgeno es su importancia y participacin en la
vida, es decir, su rol primario de produccin de biomasa (Gruber y Galloway, 2008), siendo
nutriente esencial de todos los organismos e indispensable en las estructuras y los
procesos bioqumicos que definen la vida (Francis et l., 2007). Las formas del nitrgeno
pueden ser "no reactivas" como el N2 o "reactivas" (Nr) como se encuentra en todas sus
otras formas (Galloway et l., 2008). El mayor reservorio de N2 se encuentra en la
atmsfera (78% de la misma), y debe ser fijado a una forma reactiva para su
aprovechamiento en la biosfera (Francis et l., 2007). Otras formas de N presentes en la
atmsfera son las pequeas cantidades de xidos de nitrgeno, NH34+, cido ntrico
(HNO3), partculas de NO3- y N orgnico que circulan a travs de ella (Nieder y Benbi,
2008). Entre las transformaciones a gran escala se destacan: la fijacin biolgica,
lumnica e industrial, la combustin de hidrocarburos fsiles y los procesos biolgicos de
xido-reduccin. La fijacin industrial para la produccin de fertilizantes nitrogenados (100
Tg ao-1 de 355 totales fijados globalmente, 250 por microorganismos y 5 por tormentas),
ha permitido el incremento de productos agrcolas, sosteniendo el incremento de la
poblacin humana, lo cual sera literalmente imposible sin el uso de estos fertilizantes. Por

otro lado, esta misma produccin ha desbalanceado notablemente el ciclo global (Gruber
y Galloway, 2008). A continuacin se presentan los procesos en los cuales los
microorganismos intervienen en las transformaciones de los compuestos nitrogenados
dentro del ciclo del nitrgeno para su posible aplicacin a los ST relacionados con la
remocin.
Procesos de transformacin en la actividad bacteriana:
Alrededor del 12% del peso seco de las bacterias (biomasa) es contribucin del N
(Madigan et l., 2004). Particularmente, las bacterias pueden realizar en su totalidad cada
uno de los pasos en las transformaciones requeridas para completar y balancear el ciclo
del N, ganando por su parte energa o biomasa en sus metabolismos. Warakomsky y
otros en el 2007, presentan grficamente los procesos que se realizan a nivel de biosfera
y sus interrelaciones (figura 1). Entre los procesos de transformacin posibles, estudiados
hasta el momento, que realizan las bacterias, se describirn en forma general la fijacin,
la asimilacin y la amonificacin, mientras la nitrificacin y la reduccin desasimilatoria del
nitrato sern descritas en mayor detalle por su importancia en los ST.
La fijacin: es la utilizacin del N2 como fuente directa de N para la sntesis celular.
Aproximadamente 250 Tg N anuales son fijadas por estos microorganismos en la tierra y
el ocano. En la bsqueda de disminuir la aplicacin de fertilizantes, se han hecho nuevos
descubrimientos en cuanto a gneros de bacterias fijadoras, ejemplo de estos son las
bacterias cido acticas fijadoras de N, descritas por primera vez en Brasil en 1988.
Varios otros gneros de la misma familia han sido descritos posteriormente (Pedraza,
2008).
El proceso de conversin del N2 a NH3 tambin se realiza industrialmente con la
implementacin del proceso Haber-Bosch a partir del ao 1910 (fijacin industrial o
antropognica).
Asimilacin o inmovilizacin del nitrgeno: proceso de utilizacin del NH4+ o de Nr
inorgnico para la sntesis celular. La forma de N ms utilizada para asimilacin es el
NH4+, aunque las plantas tambin asimilan NO3- de acuerdo con su especie, teniendo
diferentes preferencias en cuanto a la forma de N soluble que utilizan (Vymazal, 2007).
La amonificacin o mineralizacin: el N orgnico es biolgicamente liberado como NH4+,
durante la hidrolizacin de nucletidos y protenas, catabolizado por organismos
hetertrofos (Canfield et l., 2005). Algunos microorganismos pueden liberar diferentes
enzimas como proteasas, nucleasas y ureasas que inician la degradacin de molculas
contenedoras de N, fuera de la clula (depolimerizacin), generando algunos monmeros
que son llevados al interior y metabolizados a NH4+ (Maier et l., 2000). Recientes
estudios sobre mineralizacin indican que la utilizacin de monmeros no es exclusiva de
los microorganismos, y que las plantas pueden utilizarlos directamente (Schimel y
Bennett, 2004). Los procesos que se describirn a continuacin en forma ms detallada
son los que intervienen directamente en las transformaciones del Nr dentro de las PT de
ARD e industriales. A nivel global todos los procesos equilibran y regulan el ciclo del N.

Nitrificacin: la nitrificacin se divide en dos etapas, la primera est definida por la

oxidacin de NH4+ a nitrito (NO2-) y se puede llamar "nitritacin". La segunda etapa
definida por la oxidacin de NO2- a NO3-, se denomina nitratacin, generalmente ocurren
en la naturaleza en forma conjunta. Se prefiere hacer la diferenciacin debido a que los
procesos pueden inducirse en forma aislada y ocurrir independientemente en los
reactores (Dongen e et l., 2001).
Nitritacin NH4+ a NO2-: es la oxidacin del NH4+ a NO2- por bacterias nitrificantes va
hidroxilamine. Al menos sesenta especies de dos gneros pertenecientes a
Betaproteobacteria, principalmente nitrosomonas y nitrosospira, son capaces de realizarlo
(Yuan et l., 2008). Ocurre bajo condiciones aerbias y segn las siguientes reacciones
(Craggs, 2005):

ST avanzado para la remocin del nitrgeno

Varios procesos microbiolgicos dentro del ciclo del N han conducido a replantear y
desarrollar nuevos ST, adaptndolas con ventaja a la remocin de contaminantes,
especficamente en la remocin de NH4+ y NO3-, dos nutrientes que no han podido ser
disminuidos en los efluentes de tratamientos convencionales al estndar de 10 mg N L-1
(Khin y Annchhatre, 2004). Un ejemplo de aplicabilidad novedosa de remocin de NH4+
es el realizado en la lnea secundaria de recirculacin de agua, resultante del tratamiento
de lodos, la cual aumenta la carga de N en la lnea principal de tratamiento en ms del
20% (Ahn y Choi, 2006), esta sublnea en particular contiene altas concentraciones de
nutrientes y bajas concentraciones de carbono orgnico biodegradable, para lo cual es
obvia la participacin de desnitrificacin auttrofa. La remocin de NH4+ de las aguas
residuales se ha realizado en forma tradicional usando nitrificacin y nitritacin aerobia
hasta NO3-, con altas demandas de aireacin, seguido de la denitritacin y
desnitrificacin anaerobia con altas demandas de sustrato orgnico en reactores
separados (Third et l., 2001) que han sido muy efectivas pero poco sostenibles. A
continuacin se describen algunos procesos novedosos que de distintas formas han
aprovechado las caractersticas de las comunidades microbianas asociadas a
metabolismos especficos.
Proceso anammox: oxidacin anaerobia del NH4+

Hasta 1995 el proceso de nitrificacin conocido se asociaba con el consumo de oxgeno,

es decir, el NH4+ se consideraba relativamente estable en condiciones anxicas. Mulder
et l. (1995), describieron por primera vez la oxidacin del NH4+ en condiciones
anaerobias, considerando el NH4+ como donador de electrones y el NO3- como receptor
final, a este proceso se le denomin Anammox por sus siglas en ingls (Ananerobic

Ammonium Oxidation) (Graff et l., 1995; Mulder et l., 1995); posteriormente se observ
que la clave para la oxidacin del NH4+ era el NO2- como aceptor de electrones, y no el
NO3-. Reportes iniciales de la actividad de los Anammox en el mar demuestran que son
responsables del 67% de la produccin de N2 a 700 m de profundidad, 24% a 380 m y
2% a 16 m (Dalsgaard et l., 2005). La contribucin del proceso Anammox a nivel del ciclo
global del N se calcula entre el 30 y el 50% de la produccin total de N2 especficamente
en los sedimentos marinos (Francis et l., 2007; Jetten et l., 2004). Anammox es un
metabolismo que consiste en la reduccin del NO2- acoplada a la oxidacin del NH4+
(Schmid et l., 2005) para formar N2. El NH4+ es oxidado por dos vas, primero el NH4+
es oxidado hasta hidroxilamina el cual a su vez es oxidado a nitrito por la enzima
hidroxilamine oxidoreductasa; segundo, el NH3+ y el NO2- son convertidos a N2 (Ye y
Thomas, 2001). Otros experimentos muestran que el NO2- es reducido a hidroxilamina y
que de alguna manera esta ltima reacciona con el NH4+, lo cual conduce a la produccin
de N2, con hidracina como intermediario (Jetten et l., 2001). Basada en el balance de
masa de comunidades anammox enriquecidas, la estequiometra de la segunda reaccin
es propuesta como se presenta en la ecuacin 10 (Dongen et l., 2001; Gven et l.,
2005):

Algunos estudios demuestran que el radio estequiomtrico de consumo de NH4+, y NO2comparado con la produccin de NO3- es de 1:1.2:0.33 (Tsushima et l., 2007). Se han
reconocido cuatro gneros de bacterias que comparten esta fisiologa y morfologa, stos
son: 1) Candidatus Brocadia, 2) Candidatus Kuenenia, 3) Scalindula, y 4)
Anammoxglobus, pertenecientes al gnero Planctomicetes (Francis et l., 2007; Yang et
l., 2007). Estudios realizados demuestran que las bacterias anammox pueden usar
algunos compuestos orgnicos como sustrato suplementario de carbono, aunque las
mismas han sido descritas como quimiolitoauttrofas obligadas; en otro sentido, se ha
observado que pueden ser inhibidas por algunos compuestos orgnicos como el metanol
(Gven et l., 2005). Se ha experimentado con distintas configuraciones de reactores y se
han tratado los efluentes de la digestin de lodos ricos en NH4+, demostrando con xito la
aplicabilidad del proceso en la remocin de NH4+ y NO2-. Las comunidades Anammox en
reactores simples controlados anaerbicamente han resultado muy eficientes cuando
estos dos compuestos estn en concentraciones parecidas (Strous et l., 1997). La
introduccin del proceso Anammox puede conducir a una reduccin de los costos
operacionales de hasta un 90% (Jetten et l., 2004). Aunque las bacterias Anammox
parecen capaces de oxidar el NH4+ a NO2- va hidroxilamina en un primer paso,
complementando la oxidacin del NH4+ con el NO2- producido en un segundo paso, el
proceso parece ser ms eficiente y aplicable cuando el NO2- es proporcionado por una
fuente externa, como se observar en algunos de los ejemplos que se presentan. Futura
investigacin debe conducirse a la mejor comprensin de este fenmeno.

Proceso Sharon (por sus siglas en ingls, Single reactor system for High Ammonia
Removal Over Nitrite Process): fue patentado y se basa en la nitrificacin (ecuacin 3-)
por microorganismos aerobios, y desnitrificacin (ecuacin 5) por microorganismos
hetertrofos anaerobios facultativos, en donde la nitritacin y la denitritacin se inhiben en
un reactor simple con elevadas temperaturas, aireacin limitada e intermitente,
controlando el pH y aadiendo sustrato orgnico en la fase anxica (generalmente
metano) (Volcke et l., 2002). Estequiomtricamente se representa como se muestra en la
ecuacin 12:

Es el primer proceso exitoso en el cual la nitrificacin y la desnitrificacin hasta y desde

NO2- respectivamente ha sido alcanzada en condiciones estables (Khin y Annchhatre,
2004). El proceso completo de Sharon logra un 25% menos de consumo de oxgeno,
implicando 60% en ahorro de energa, reduce las emisiones de dixido de carbono en un
20%, y reduce la produccin de lodos en nitrificacin y desnitrificacin en un 35 y 55 %
respectivamente (Peng y Zhu, 2006).

BACTERIAS NITRIFICANTES - FIJADORAS DE NITRGENO DE

VIDA LIBRE
BACTERIAS NITRIFICANTES:
1. Pesar el equivalente a 10 g de suelo seco y diluir en una botella conteniendo 90 ml.
2. Realizar diluciones seriadas.

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

.
90 ml

45 ml
45 ml

45 ml
1

10
6

10

10

45 ml

45 ml

10

10

10

3. Inocular 1 ml de la dilucin en cada tubo.

Bacterias Fijadoras de N2
-2

Bacterias Nitrificantes
-2

-3
-4
-5
-6
-7
-8

-3
-4
-5
-6

45 ml
5

10

4. Inocular durante una semana.

5. evaluar viraje de color y crecimiento en los tubos.

EVALUACIN DE BACTERIAS FIJADORAS DE NITROGENO LIBRES Y

NITRIFICANTES

PB= F0 X NMP x Inversa de dilucin x Fd

Intervalo de confianza
PB

3.30 < 3.30 : PB X 3.30>

FC=

H 2O botella+V suelo seco+ H 2 O suelo

Peso seco

10 g suelo seco

% Hg= 25 %
2,5 g agua = 1 g/ ml= 2.5 ml H2O

12,5 g

V suelo seco=

10 g
=3,77 ml
2,65 g /ml

F C=

90 ml+3,77 ml +2.5 ml
=9,63
10 g

Fd = (Volumen del inculo)

PB= 9,63 x NMP x 1 = 18 x

104

NH3 + H2O ------------------ NO-2 + H + H2O

Azul de bromotimol:
Azul= alcalino
Verde= neutro
Amarillo= cido
NMP (NMERO MS PROBABLE) 5 3 3 = 18

a b c
1 2 3
1= Nmero en dilucin mxima donde todos los tubos viraron de color (menos
concentrado)
2-3= Nmero de tubos que viraron de color en las diluciones siguientes.

-2
*
*
*
*
*

-3
*
*
*
*
*
5

-4
*
*
*
*

-5
*
*
*
*

-6

-7

-8

RESULTADOS
FIJADORES DE N2:

NMP = 5 0 0 ------- PB= 8,93 X 2,3 X

104

X 1= 2,05 X

105

104

X 1 = 4,11 X

105

NITRIFICANTES:

MNP= 5 1 1 -------- PB= 8,93 X 4,6 X

INTERVALO DE CONFIANZA: 3.3

PB
; PB X 3.3>
33

1. Fijadores de N2: PB= 2.05 X

105

organismos/gramo de suelo seco.

IC3 < 6,21 X

2. Nitrificantes: PB= 4,11 X

105

104 ; 6,77 X 105 >

organismos/ gramo de suelo seco

IC2<1,25 X

105 ; 1,36 X 106 >

CONCLUSIONES
Al concluir con las evaluaciones se encontr de que hubo crecimiento de las bacterias
(poblacin microbiana), se observ el cambio de color en cada uno de los tubos de
ensayo.

ANEXOS

Fig.1. Colocando el suelo para realizar las

diluciones.

Fig.2. Realizando las diluciones del suelo.

Fig.3. Tomando muestras con la

ayuda de una micropipeta.

Fig.4. Flameando para evitar contaminacin.

Fig.5. Sembrando en medio

lquido.

Fig.6. Siembra de bacterias.

BIBLIOGRAFA
Abma, W. R., Schultz, C. E., Mulder, J. W., van der Star, W. R. L., Strous, M.,
Tokutomi, T., van Loosdrecht, M. C. M. 2007. Full-scale granular sludge Anammox
process. Water Science & Technology 55, 27.
Date, Y., Isaka, K., Ikuta, H., Sumino, T., Kaneko, N., Yoshie, S., Tsuneda, S. and
Inamori, Y. 2009. Microbial diversity of anammox bacteria enriched from different
types of seed sludge in an anaerobic continuous-feeding cultivation reactor.
Journal of Bioscience and Bioengineering 107: 281-286.