Cintica

de crecimiento de
la microalga Chaetoceros
gracilis y Produccin de
Pigmentos Fotosintticos

ELLIOT JOSU GMEZ VANEGAS

JOS ALFREDO MOJICA PASCACIO
ROSA ERLINDA LUNA PORTILLO
LENIN ALEXANDER MERINO AVALOS

U n i v e r s i d a d d e E l s a l v a d o r F a c u l t a d d e Q u m i c a y F a r m a c i a

UNIVERSIDAD DE EL SALVADOR

FACULTAD DE QUMICA Y FARMACIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA Y CONTAMINACIN AMBIENTAL
MICROBIOLOGA APLICADA IV: MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

CICLO II / 2015

SEMINARIO
CINTICA DE CRECIMIENTO DE LA MICROALGA CHAETOCEROS GRACILIS
Y PRODUCCIN DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS.

DOCENTE INSTRUCTOR:
DRA. TANIA ETHEL CUADRA ZELAYA

INTEGRANTES:
ELLIOT JOSU GMEZ VANEGAS
JOS ALFREDO MOJICA PASCACIO
ROSA ERLINDA LUNA PORTILLO
LENIN ALEXANDER MERINO AVALOS

CIUDAD UNIVERSITARIA, JUEVES 18 DE JUNIO DE 2015

II .ANTECEDENTES:


El cultivo de microalgas y el uso prctico de su biomasa como fuente de algunos compuestos
tiene su origen en Alemania durante la Segunda Guerra Mundial. La industria de las microalgas
comenz en los aos 60 con el desarrollo de los procesos de Chlorella, siguiendo en los aos 70
con Spirulina (una cianobacteria) y en los aos 80 con Dunaliella salina. Desde la dcada de los
noventa del pasado siglo se ha venido realizando las primeras investigaciones y cultivos de las
microalgas diatomeas como el genero Chaetoceros, en algunos pases de Latinoamrica con el
objetivo de ser usadas en el maricultivo.

Muchas de estas investigaciones, estudios y cultivos se han realizado buscando conocer ms de
las microalgas, sus diferentes caractersticas nutricionales, metabolitos que elaboran, formas y
requerimientos para su cultivo, diferentes funciones en el medio ambiente, entre otras. Gracias
a estos estudios se conoce una de las funciones ecolgicas ms llamativas de las microalgas,
que es la de transformar la materia inorgnica presente en las aguas, en materia orgnica, la
cual puede ser utilizada como alimento para otros organismos, de ah su gran importancia en
acuicultura y medio ambiente, ya que de esta manera ingresa mucho del material orgnico a
las cadenas trficas, o produccin primaria.

Las microalgas y cianobacterias mayormente cultivadas para uso comercial son la Chlorella,
Spirullina, Dunaliella, Nannochioris, Scenedesmus, Nitzschia, Crypthecodinium, Schizochytrium,
Skeletonema, Isochrysis y Chaetoceros.

III. OBJETIVOS

Objetivos Generales

Realizar un estudio cintico del crecimiento exponencial de la microalga Chaetoceros
gracilis y la produccin de pigmentos fotosintticos en medios de cultivo adecuados.

Evaluar un medio de cultivo para la produccin de biomasa de Chaetoceros gracilis. Que
sea asequible y econmicamente accesible en la acuicultura salvadorea.

Objetivos Especficos:

Comparar la eficiencia de produccin de biomasa de la microalga Chaetoceros gracilis

entre un medio especializado (F2 de Guillard) y un medio alternativo de mas bajo costo
(agua de mar + metasilicato de sodio (NaSiO3.9H2O))

Comparar la eficiencia de produccion de pigmentos fotosinteticos producidos por
Chaetoceros gracilis entre un medio especializado (F2 de Guillard) y un medio
alternativo de mas bajo costo (agua de mar + metasilicato de sodio (NaSiO3.9H2O))

Comparar la eficiencia de produccion de biomasa de Chaetoceros gracilis cuando se usa
una cepa purificada quimicamente y una no purificada.

Comparar rendimiento de produccion de biomasa algal de Chaetoceros gracilis respecto
a datos teoricos ideales y otras investigaciones.

 Analizar las variaciones de ph, salinidad y concentracion de azucares entre, la cinetica de

crecimento respecto al medio F2 de Guillard y el medio alternativo de agua de mar +
metasilicato de sodio.

Dictaminar si el medio agua de mar + metasilicato de sodio es una opcion viable como
reemplazo al medio F2 de Guillard en cuanto a la produccion de biomasa algal de
Chaetoceros gracilis.

Dictaminar si el medio agua de mar + metasilicato de sodio es una opcion viable como
reemplazo al medio F2 de Guillard en cuanto a la produccion de carotenoides
elaborados por Chaetoceros gracilis.

 IV. INTRODUCCIN

En El Salvador el desarrollo de la Acuicultura es creciente, como fuente de trabajo y recursos
para la poblacin salvadorea. Por esta razn el Ministerio de Agricultura y Ganadera (MAG), a
travs del Centro de Desarrollo de la Pesca y la Acuicultura (CENDEPESCA) y con el apoyo de la
Agencia de Cooperacin Internacional del Japn (JICA), desarrolla diferentes proyectos como el
de Desarrollo de la Acuicultura de Moluscos en la Repblica de El Salvador. Este proyecto se
desarrolla en la zona de la baha de Jiquilisco, departamento de Usulutn. En el desarrollo de
este proyecto se cultivan adems de moluscos, microalgas, las cuales son utilizadas para la
alimentacin de los moluscos, desde larva hasta semilla para engorde.

En el Laboratorios de Produccin de Moluscos de CENDEPESCA, se preparan medios de cultivo
para microalgas, elaborados con kits comerciales comprados en el extranjero por JICA e
importados y donados a El Salvador, los cuales tiene altos costos; estos poseen vitaminas,
minerales y fertilizantes, combinados de tal forma que se obtengan medios de composicin
similar al medio F2 de Guillard.

En el presente trabajo de Investigacin se evalu la utilizacin de agua de mar para la
elaboracin de un medio de cultivo para el desarrollo de la microalga Chaetoceros gracilis.

Se realizaron experimentos en condiciones de laboratorio, en los cuales se formulo el medio
usando agua de mar con adicin de metasilicato de sodio.

Se realiz un estudio comparativo entre el medio comercial F2 de Guillard y el medio de Agua
de Mar + Metasilicato de Sodio, se evaluaron parmetros de cinticas de crecimiento, pH, Brix,
salinidad y pigmentos fotosintticos (clorofila a, b y carotenoides totales).

Se determin que el da 3 fue el da final de la fase exponencial del crecimiento en el medio F2
de Guillard, con una densidad celular de 7.25x106 cel/mL y la mxima produccin de biomasa
se alcanzo al da 9 con una densidad celular de 9.55 x106 cel/ml en los cultivos de Chaetoceros

gracilis. Para el medio de Agua de Mar + Metasilicato se obtuvieron valores mximos de

densidad celular de 4.12x106 cel/mL al da 8 de Chaetoceros gracilis. estos resultados reflejan
que en el Medio de Agua de Mar + Metasilicato es posible obtener aproximadamente un 43.19
% de la densidad celular de Chaetoceros gracilis de lo obtenible en el medio comercial F2 de
Guillard.

Con estos resultados podemos sugerir el medio de Agua de Mar + Metasilicato para cultivar la
microalga Chaetoceros gracilis obtenindose resultados prometedores atendiendo su bajo
costo monetario

Los experimentos se realizaron en las instalaciones del Laboratorio de Microbiologa de la
Facultad de Qumica y Farmacia, de la Universidad de El Salvador (UES), durante el periodo de
octubre a noviembre del 2015.


1.1

1. MARCO TERICO
MICROALGAS.

Bajo el trmino de microalga se incluyen aquellos microorganismos unicelulares capaces de llevar a cabo
la fotosntesis. En esta categora quedan agrupadas las cianobacterias (conocidas tradicionalmente
como algas verdeazuladas) junto con algas eucariotas (tradicionalmente algas verdes, rojas y doradas).

Las microalgas son en general organismos fotoauttrofos, es decir, obtienen la energa de la luz
proveniente del Sol y se desarrollan a partir de materia inorgnica. Sin embargo, algunas especies son
capaces de crecer empleando materia orgnica como fuente de energa o de carbono.

La produccin fotoauttrofa de algas (para uso distinto al energtico) es actualmente la nica tcnica y
econmicamente viable a gran escala (Brennan 2010) La composicin de las microalgas (contenido en
lpidos, carbohidratos y protenas) es variable, y puede ser manipulada mediante varios parmetros
durante el proceso de su cultivo. Depende obviamente tambin de la especie considerada. En general,
las cianobacterias tienen un contenido de hasta 20% en lpidos, mientras que el contenido lipdico de las
algas procariotas oscila entre un 20 y 50% en peso seco.

La relacin C:N para las microalgas vara entre 6 y 9 dependiendo de las especies.

Como frmula molecular de las microalgas se puede emplear, a modo general, la
siguiente, propuesta por Grobbelaar (2004):

C106H181O45N16P

de donde se deduce que un kilogramo de microalgas contendra:

523,9 g de carbono
74,5 g de hidrgeno
296,5 g de oxgeno
92,2 g de nitrgeno
12,76 g de fsforo

Un estudio de Ras et al (2011) da el siguiente contenido en un kilogramo de algas en masa seca:

367 g de carbono
61 g de nitrgeno
8,1 g de fsforo
6,6 g de potasio

A partir de lo que se puede deducir el grado de variabilidad en la composicin de las microalgas
estudiadas. El mismo estudio emplea un factor de conversin entre 5,1 y 7,7 109 clulas/g DQO y un
valor de 1,33-1,43 g DQO/g SSV

El tamao de las algas eucariotas vara entre 0,530 m (Markou 2011), mientras que las cianobacterias
pueden llegar a medir hasta 200 m. Cabe destacar la comparacin resultante entre las

aproximadamente 250.000 especies de plantas verdes existentes en el planeta y los varios millones
estimados de especies diferentes de microalgas.

Las microalgas son la principal fuente de alimento para los primeros estadios larvales de varias especies
de crustceos y de peces y son el nico alimento utilizado en los criaderos para alimentar a bivalvos y
larvas. Los cultivos de microalgas son conocidos como cultivos de apoyo o cultivos anexos, y son
primordiales en el desarrollo de los cultivos principales esto es para los moluscos durante todo su ciclo
de vida, crustceos y peces en su etapa larvaria. Las altas concentraciones de protenas, carbohidratos,
cidos grasos y vitaminas presentes en las microalgas las hace fundamentales para la alimentacin del
zooplancton, larvas y estadios juveniles de moluscos, crustceos y ciertos peces herbvoros.

1.2

ACUICULTURA EN EL SALVADOR

Segn el Instituto Interamericano de Cooperacin para la Agricultura (IICA), en El Salvador el sector

agropecuario ha sido uno de los ms importantes en trminos de aporte al Producto Interno Bruto (PIB),
ya que ms del 70% del valor agregado industrial es de origen agropecuario segn datos de la Fundacin
Salvadorea para el Desarrollo Econmico y Social (FUSADES), en 1994, por esta razn es un rea muy
importante para el desarrollo econmico de la nacin.

El pas cuenta con dos instituciones oficiales dedicadas al desarrollo de la tecnologa agropecuaria: el
Centro Nacional de Tecnologa Agropecuaria y Forestal (CENTA) y el Centro de Desarrollo para la Pesca y
la Acuicultura (CENDEPESCA), este ltimo est orientado al desarrollo de la pesca y la acuicultura,
mediante la conduccin de investigaciones y prestaciones de asistencia a los pescadores artesanales.

Dentro de las actividades de acuicultura que se desarrollan en El Salvador se tiene la extraccin de
moluscos, crustceos y peces, dentro de las cuales la de moluscos representa la principal fuente de
ingresos para numerosas familias, lo cual ha dado lugar a la sobre explotacin de dicho recurso,
disminuyendo las producciones naturales, volvindose no solo un problema de deterioro ambiental, sino
tambin un problema social.

Tambin hay que considerar que en El Salvador, hay buena aceptacin del consumo de moluscos y
crustceos, comparado con otros pases vecinos. En los aos 80s durante el conflicto armado, hubo una
gran migracin hacia la costa de parte de la poblacin salvadorea y la primera actividad productiva fue
la extraccin de moluscos; luego con los aos se empez a ver rpidamente, la disminucin de estos
recursos.

Bajo esta situacin, el Ministerio de Agricultura y Ganadera (MAG), a travs del Centro de Desarrollo de
Pesca y Acuicultura (CENDEPESCA), ha implementado diversos proyectos para el desarrollo de la
acuicultura, dentro de los cuales est el Proyecto para el Desarrollo de la Acuicultura de Moluscos en la
Repblica de El Salvador desde enero de 2005 con una duracin de 3 aos y 2 aos de tiempo de
prrroga hasta enero de 2015, con el apoyo del gobierno japons, a travs de la Agencia de Cooperacin
Internacional del Japn (JICA). Este Proyecto fue ejecutado en la Baha de Jiquilisco, Departamento de
Usulutn y tambin en la zona costera del Departamento de La Unin, donde muchos ribereos se
dedican a la pesca artesanal, principalmente en la recoleccin de conchas y ostras y el nivel de ingreso
econmico de las familias es ms bajo que en otros lugares del pas. Este proyecto se realiz con el
objetivo de Proponer el modelo de mejoramiento de la calidad de vida por medio de las actividades de
la acuicultura de moluscos principalmente, basadas en la conciencia de manejo de los recursos
naturales

1.3 NUTRIENTES

1.3.1 Carbono:

Las microalgas pueden emplear como fuente de carbono el CO2 presente en la atmsfera, as como los
iones bicarbonato (HCO3) con la ayuda de una enzima llamada anhidrasa carbnica. En promedio, son
capaces de tolerar hasta unas 150.000 ppmv de CO2 en aire, aunque hay especies, como Chlorella, que
han demostrado que toleran hasta 400.000 ppmv. Algunos sistemas de cultivo inyectan aire enriquecido
en dixido de carbono en el reactor. Cuando se provee a las algas de carbonato, se hace generalmente
en forma de Na2CO3 y NaHCO3.

El suministro de carbono (en forma normalmente de CO2) y la eliminacin de oxgeno generado son,
despus de la distribucin de luz, la cuestin de mayor importancia en un fotobiorreactor. La necesidad
de carbono se puede calcular estequiomtricamente conociendo la composicin de la biomasa,
resultando un mnimo de 1,85 g CO2/g biomasa. Por otro lado, para asegurar que las microalgas pueden
tomar dicho CO2, su presin parcial en el lquido ha de ser de 0,1-0,2 kPa.

1.3.2. Nitrgeno:
El contenido en nitrgeno de la biomasa puede suponer desde un 1% hasta ms del 10%, y depende de
la disponibilidad y el tipo de fuente de nitrgeno. En general, las microalgas pueden tomar nitrgeno del
medio en forma de urea, amonio, nitrato, nitrito, nitrgeno gas y xidos de nitrgeno (NOx) en algunos
casos.

En un estudio (Xin 2010) se demostr, para la microalga Scenedesmus sp. LX1, que sta crece ms
rpidamente con amonio, seguido de urea y finalmente de nitrato. Sin embargo, la eliminacin de
fsforo y nitrgeno fue ms completa en el cultivo donde ste est presente en forma de nitrato y urea
que en aqul con amonio.

El nitrgeno en forma de amonio, cuyo equilibrio de disociacin depende de la temperatura y el pH del
medio, inhibe tambin el crecimiento de las microalgas, ya que es en general txico para los organismos
fotosintticos. El amonio desacopla el transporte electrnico en el fotosistema II (uno de los dos
sistemas complejos que captan la energa lumnica y transportan los electrones por resonancia dentro
de las clulas) y compite con el agua en las reacciones de oxidacin que generan el O2 libre.

La tolerancia a l depende de la especie en cuestin. Por ejemplo, la Spirulina se ve prcticamente
inhibida ante concentraciones de 200 mg NH4+/L mientras que Chlorella sorokiniana no muestra
inhibicin ante concentraciones de 400 mg NH4+ /L.

1.3.3 Fsforo
Es otro de los macronutrientes esenciales en el crecimiento de las microalgas. Es tomado en forma de
ortofosfatos (P-PO4-3), cuya concentracin en equilibrio con las formas protonadas depende
lgicamente del pH del medio. Existen factores que ralentizan la toma de fosfatos por parte de las algas,
como un pH excesivamente alto o bajo, o la ausencia de iones como potasio, sodio o magnesio. La
cantidad necesaria de fsforo es mucho menor que la de nitrgeno para una misma cantidad de
biomasa generada. Diversos autores han concluido que la relacin N:P en el medio de cultivo influye en
la toma de nutrientes por parte de las microalgas, de modo que cuanto ms prxima est a la

composicin de los microorganismos, mayor crecimiento y toma de nutrientes tendr lugar. Por
ejemplo, para la microalga Chlorella la relacin ptima es de 8:1 segn Aslan y Kapdan (2008). Sin
embargo, las microalgas son capaces de adaptarse al medio de cultivo y tomar uno de los nutrientes en
una proporcin mayor que la presente, en principio, en su composicin celular.

Cabe destacar, por otro lado, que un dficit de nutrientes provoca en las microalgas una acumulacin de
lpidos siempre que haya luz y CO2 disponibles (Rodolfi 2009, Khozin-Goldberg 2006).

Las microalgas requieren, para su crecimiento, de otros macronutrientes como azufre, calcio, magnesio
y potasio, as como de micronutrientes como molibdeno, hierro. nquel, cobre, zinc, manganeso,
cobalto, boro y cloro. En ciertos grupos de algas se requieren nutrientes especiales o caractersticos,
como sucede con las diatomeas y el silicio.

1.4 SALINIDAD

La salinidad del medio de cultivo tiene gran influencia tanto sobre el crecimiento de las algas como
sobre la productividad de lpidos u otras sustancias de inters. En un estudio con 10 cepas diferentes de
microalgas (Araujo 2011) se observ cmo cada una de ellas responde de modo distinto ante un cambio
en la salinidad del medio de 25 g/L a 35 g/L. En diferentes estudios, se presentan resultados de
rendimiento y productividad de biomasa y de aceite por volumen cultivado. Donde se a podido
determinar que especies como Chaetoceros gracilis y Tetraselmis tetrathele no presentaron cambios
frente a la salinidad.

1.5 pH

El pH en la mayora de cultivos de microalgas se encuentra entre 7 y 9, con un ptimo entre 8,28,7. El
control de pH se consigue mediante aireacin o adicin de CO2. Como se ha explicado, el proceso
fotosinttico de fijacin de CO2 provoca un aumento gradual de pH en el medio debido a la acumulacin
de OH-, lo que puede promover la eliminacin de nitrgeno en forma de amoniaco por stripping a la
atmsfera y eliminacin de fsforo por precipitacin de ortofosfatos.


1.6 OXIGENO

El nivel de oxgeno disuelto debe ser controlado, ya que altas concentraciones pueden inhibir la fijacin
de carbono por parte del enzima RuBisCo. Esta inhibicin se ve favorecida por alta radiacin y
temperatura, as como en el caso de dficit de CO2. Muchas especies de microalgas no son capaces de
sobrevivir en un medio sobresaturado de oxgeno ms de 2 o 3 horas (para algunas el 120% de
saturacin en el aire, para otras el 200%). Adems, la produccin fotosinttica de oxgeno en cultivos de
alta densidad puede alcanzar hasta 40 mg/L, de modo que mediante la radiacin adecuada pueden
llegar a desarrollarse radicales de oxgeno. Estos radicales libres seran txicos para las clulas y
causaran daos en sus membranas. La presin parcial del oxgeno en el cultivo puede disminuirse
mediante aumento de la turbulencia y stripping de aire.

10

1.7 AGITACIN

La agitacin, adems de facilitar la eficiencia en el transporte, impedir la sedimentacin de las algas y su
adherencia a las paredes del reactor y homogeneizar el pH, asegura la distribucin de los gases y de la
luz. Una correcta agitacin es capaz de someter a las algas a ciclos rpidos de mezclado, en los que en
cuestin de milisegundos pasan de una zona oscura a una zona iluminada.

Si se tiene en cuenta que en el medio natural las densidades celulares del fitoplancton rondan las 103
clulas/ml, de modo que la distancia media entre clulas es de 250 veces su dimetro, y que en sistemas
artificiales de cultivo esta distancia se ve reducida a tan slo 10 veces su dimetro, ya que se alcanzan
densidades de 109 clulas/ml, se entiende que el flujo turbulento es de gran importancia en cultivos de
alta densidad. El flujo laminar provoca, adems de distribucin heterognea de la luz, gradientes de
difusin. Segn este principio, los fotobiorreactores con alta densidad de cultivo han de ser en general
delgados y disponer de mezclado rpido, para que la eficiencia de conversin de la luz solar se vea
incrementada. Sin embargo, tanto la construccin como la operacin de dichos reactores no hacen fcil
su escalabilidad de modo rentable.

Cabe tener en cuenta sin embargo, que no todas las especies toleran una agitacin fuerte que provea al
reactor de un buen mezclado, ya que son sensibles al estrs hidrodinmico.

1.8 TEMPERATURA

A pesar de que gran variedad de microalgas son capaces de desarrollarse en un amplio rango de
temperaturas (Chlorella destaca por ejemplo en este aspecto, ya que puede crecer entre 5 y 42C),
todas ellas presentan un rango fuera del cual se ven inhibidas o incluso mueren.

En sistemas abiertos de cultivo un incremento de temperatura se ve compensado con evaporacin del
agua, regulndose de este modo la temperatura mxima. En sistemas cerrados de cultivo es necesaria la
refrigeracin adicional en zonas clidas, donde la relacin entre nivel de luz y temperatura puede
afectar a la biomasa en gran medida. Por otro lado, si la fluctuacin entre temperatura mxima y
mnima es muy amplia, puede ser igual de importante el calentamiento durante las horas de poca luz
como la refrigeracin durante las horas del da de mayor iluminacin. Para ello es conveniente el
empleo de fro o calor recuperado del mismo proceso o de un proceso industrial asociado en el caso de
que ste exista, para mantener un balance neto favorable de energa. La refrigeracin puede ser evitada
mediante sistemas que regulen la cantidad de luz que llega al reactor (sombra, dilucin de la luz). Se ha
demostrado que en el caso de que el dixido de carbono o la luz sean limitantes en el cultivo, la
temperatura no ejerce una influencia significativa.

1.9 LUZ

Los organismos fotosintticos slo emplean la fraccin del espectro de luz solar que es
fotosintticamente activa, es decir entre 350 y 700 nm. Esta fraccin fotosintticamente activa (PAR por
sus siglas en ingls) supone un 40% de la radiacin total del Sol. La mayor parte de los ecosistemas
naturales vegetales presentan una eficiencia de alrededor del 1% en lo que a conversin de energa
lumnica en biomasa se refiere. Se han demostrado, para las microalgas, eficiencias de conversin luz-
biomasa entre 1 y 4 % en sistemas abiertos y an mayores en Fotobiorreacto es cerrados (Stephens

11

2010). El crecimiento de los microorganismos fotosintticos es proporcional a la intensidad de la luz

recibida siempre que sta se site por debajo de un cierto valor mximo (fotolimitacin). A partir de
ste, los sistemas fotosintticos receptores se ven daados y la fotosntesis se ve inhibida. A este
fenmeno se le denomina fotoinhibicin. En la mayora de las microalgas la fotosntesis se ve saturada a
niveles lumnicos que representan sobre el 30% de la radiacin total que la Tierra recibe del Sol. Esto
supone alrededor de 1700 2000 E/m2s. Las algas adaptadas a bajos niveles de luminosidad tienen
una respuesta ms rpida a cambios en la intensidad luminosa que las que estn adaptadas a
intensidades de luz altas. Las algas se adaptan a los cambios de luz variando el contenido de clorofila a
de sus clulas, de modo que las algas adaptadas a bajas intensidades lumnicas tienen ms clorofila.

Un parmetro importante en el diseo de un fotobiorreactor es la distancia de penetracin de la luz,
que depende de la intensidad de la radiacin incidente, la dispersin de la luz en la superficie del reactor
y la atenuacin en el medio de cultivo. La dispersin en la superficie debe ser minimizada para
maximizar la luz que entra al reactor, y la atenuacin depende de la densidad del cultivo y de la longitud
de onda de la radiacin, provocando un gradiente de intensidad de luz en su direccin de penetracin.

Se puede generalizar diciendo que es necesario encontrar, para cada especie, la densidad ptima de
cultivo para cada configuracin de reactor, de modo que la intensidad de luz incidente y transmitida en
el cultivo permita el crecimiento de las microalgas e impida su inhibicin. Segn Pulz (1998) la luz es
generalmente el factor limitante en la produccin de microalgas al aire libre. Por otro lado, debido a que
las concentraciones ptimas de biomasa son diferentes para diferentes niveles de irradiacin solar, y
sta cambia a lo largo del da, la biomasa debe adecuarse a ello. As como el sistema fotosinttico se
adapta mejor a la hora de capturar la energa lumnica cambiante (mediante el contenido en clorofila a),
se han llevado a cabo investigaciones que sugieren que el cuello de botella se sita en la biosntesis de
biomasa estructural a partir de carbono fijado fotosintticamente.
La iluminacin artificial puede contribuir a una produccin continua, pero obviamente a mayor coste
econmico y energtico. Ante la necesidad de eleccin de luz artificial, es importante conocer el
espectro de absorcin de las algas cultivadas, que depende de los pigmentos mayoritarios presentes en
ellas. Un estudio de Kommareddy y Anderson (2003) que inclua lmparas fluorescentes,
incandescentes, halgenas, y LEDs (emitiendo en 643 nm) determin que estos ltimos son la fuente
ms eficiente y econmica ya que emiten ms del 98% de su luz entre 600 y 700 nm. Segn Richmond
(2000), la proporcin ptima entre zona iluminada de un reactor y zona oscura es 15:85. Es decir, un
15% del reactor correspondera a zona ftica mientras que un 85% de las algas estaran en la oscuridad
en cada momento. El problema del control de la luz como factor de gran influencia en el crecimiento de
las algas es la imposibilidad de definirlo mediante un nico parmetro, ya que entran en juego
intensidades, frecuencia de cambio luz-oscuridad, proporcin de duracin de los ciclos, hidrodinmica,
configuracin del reactor o estanque, etc.

12

2. MEDIOS DE CULTIVO Y CEPA UTILIZADA

2.1 MEDIOS DE CULTIVO
En general un medio de cultivo debe proporcionar los requerimientos de la especie a cultivar, tales
como agua, sales minerales (macro y micronutrientes) una fuente de nitrgeno, pH adecuado, y en
algunos casos compuestos orgnicos o factores de crecimiento (vitaminas, hormonas).

Los componentes qumicos para preparar el medio de cultivo deben de ser de buena calidad. Es
necesario recordar que las cantidades de los nutrientes en el medio de cultivo juegan un papel crucial
para el desarrollo de las microalgas.

Para que los medios de cultivo sean lo ms efectivos posibles es necesario considerar los nutrientes
necesarios que las algas necesitan para su desarrollo.

2.1.1 Medio F2 de Guillard (Medio Patrn)

Es un medio de cultivo de microalgas que se prepara en agua de mar comn y filtrada. Es utilizado
especialmente para el cultivo de diatomeas. La concentracin de la formulacin original, denominada "F
Medium" o medio F, se ha reducido a la mitad y realizaron algunos cambios, porque se comprob que
esto era mejor para el cultivo adecuado de microalgas, dicha composicin se encuentra en la siguiente
Tabla # 1.

El Medio F2 de Guillard se prepara de la siguiente manera: Preparar las siguientes soluciones Stock:
Soluciones Stock de Macronutrientes

1. NaNO3

7.5 g / 100 mL

2. NaH2PO4.H2O

0.5 g / 100 mL

3. NaSiO3.9H2O

1.0 g / 100 mL

Solucin Stock elementos en traza (= Micronutrientes)
4. CuSO4.5H2O

0.98 g

5. ZnSO4.7H2O

2.20 g

6. CoCl2.6H2O

1.05 g

7. MnCl2.4H2O

18.0 g

13

8. Na2MoO4.2H2O

0.63 g

Diluir y completar con agua destilada hasta 100 mL.

Solucin Stock de metales en traza utilizando Na2EDTA y FeCl3.6H2O.

Disolver 3.15 g de FeCl3.6H2O y 4.36 g de Na2EDTA en 900 mL de agua destilada, adicione un mL de
cada solucin stock de metales traza, y lleve a 1 L, El pH de esta solucin es de alrededor de 2.0. La
solucin permanecer clara si es dejada a este pH.

Solucin stock primario de vitaminas del complejo B

9.

Biotina

0.1 mg / mL

10.

Cianocobalamina (B12)

1.0 mg / mL

Esterilizar por filtracin por membrana y guardar en refrigeracin

Soluciones de trabajo de Vitaminas: Tomar 1.0 mL de solucin stock de Biotina y 0.1 mL de solucin
stock de Cianocobalamina a 100 mL de agua destilada. Agregue 200 mg de Tiamina HCl.

Para obtener 1 L de Medio F2 de Guillard (Tabla # 1).

-

1 mL de solucin stock de macronutrientes

1 mL de solucin stock de micronutrientes

0.5 mL de solucin de trabajo de vitaminas

Agua de mar filtrada hasta completar 1 L.

Esterilizar en autoclave.

14

Tabla N 1: Preparacin de 1L de Medio F2 de Guillard

COMPOSICION

SOLUCION STOCK

CANTIDAD A USAR

NaNO3

75 g/L

1 mL

NaH2PO4H2O

5 g/L

1 mL

NaSiO3.9H2O

30 g/L

1 mL

CuSO4,5H2O

9,8 g/L

1 mL

ZnSO4.7H2O

22 g/L

1 mL

CoCl2.6H2O

10 g/L

1 mL

MnCl2.4H2O

180 g/L

1 mL

Na2MoO4,2H2O

6,3 g/L

1 mL

Na2EDTA

..

4,36 g

FeCl3,6H2O

..

3,15 g

Biotina

1 g/L

1 mL

Cianocobalamina

1 g/L

1 mL

Tiamina

..

200 mg

Tabla N 2:

Concentraciones de soluciones Stock y concentracin final del Medio F2 de Guillard

COMPOSICION

CONCENTRACION DE
STOCK (g/mL)

CONCENTRACION FINAL
EN EL MEDIO

NaNO3

0,075 g/mL

7,5 x 10 g/mL

NaH2PO4H2O

0,005 g/mL

0,5 x 10 g/mL

NaSiO3.9H2O

0,01 g/mL

1,0 x 10 g/mL

CuSO4,5H2O

0,0098 g/mL

0,98 x 10 g/mL

ZnSO4.7H2O

0,022 g/mL

2,2 x 10 g/mL

CoCl2.6H2O

0,0105 g/mL

1,05 x 10 g/mL

MnCl2.4H2O

0,18 g/mL

18,0 x 10 g/mL

Na2MoO4,2H2O

0,0063 g/mL

0,63 x 10 g/mL

Na2EDTA

4,36 g

0,00436 g/mL

FeCl3,6H2O

3,15 g

0,00315 g/mL

Biotina

0,001 g/mL

0,1 x 10 g/mL

Cianocobalamina

0,001 g/mL

0,1 x 10 g/mL

Tiamina

0,0002 g/mL

0,02 x 10 g/mL

-5
-5

-5

-5

-5

-5
-5
-5

-5
-5

-5

Para prepararse, se debe comenzar con 950 mL de agua de mar natural filtrada y agregar los
componentes como se expresa en la tabla anterior (Tabla N 1).
Si el alga que se cultivar no requiere de slice, entonces se recomienda que la slice se omita, ya que
mejora la precipitacin de los dems componentes. Luego esterilizar en Autoclave. Algunos estudios
reflejan que el costo del medio F2 de Guillard es de $18.98/L .

15

2.1.2 Medio Agua de Mar + Metasilicato de Sodio

Como se observa en la seccin anterior el medio F2 de Guillard es un medio altamente especializado en
nutrientes para el cultivo de microalgas, que posee un complemento especial para las diatomeas el
metasilicato de sodio, las diatomeas presentan una estructura en su pared celular llamada frustula la
cual esta formada por dixido de silicio hidratado por lo que una fuente de silicio se vuelve
indispensable para la produccin de biomasa de diatomeas, si bien es lgico que en el medio F2 de
Guillard se obtenga una produccin mayor tanto de biomasa como de pigmentos fotosintticos, el
principal objetivo de la evaluacin de el medio Agua de Mar + Metasilicato de Sodio, es evaluar la
produccin de biomasa microalgal de Chaetoceros gracilis ya que esta es cultivada en Cendepesca con el
fin de producir plancton que sirva de alimento en estados larvales de moluscos y bivalvos potenciando
as la acuicultura salvadorea, de esta manera la produccin de pigmentos fotosintticos si bien suele
ser normalmente proporcional a la densidad celular en el medio no es imperativamente dependiente,
muchos factores intervienen en su produccin pudiendo recalcar la intensidad de luz y la adaptacin a
la misma.

Debido al alto valor monetario que el uso del medio F2 de Guillard implica se evaluara el medio Agua de
Mar enriquecida con una fuente de slice (Metasilicato de Sodio) necesaria para el crecimiento de
Chaetoceros gracilis como opcin viable de reemplazo en la produccin de biomasa para la alimentacin
en los procesos de acuicultura.

El medio Agua de Mar + Metasilicato de Sodio puede expresarse en porcentaje en la tabla # 3.

Tabla # 3, composicin porcentual del medio de Agua de Mar + Metasilicato de Sodio.
COMPOSICIN

CONCENTRACIN

DEL MEDIO
AGUA DE MAR

99.97%

NaSiO3.9H2O

0.03%

16

2.2 MICROALGA Chaetoceros gracilis

Clasificacin taxonmica actual.

REINO:

Eukaryota

FILO:

Chromista

CLASE:

Ochrophyta

ORDEN:

Coscinodiscophyceae

FAMILIA:

Chaetocerotales

GENERO:

Chaetocerotaceae

ESPECIE:

Chaetoceros gracilis

Figura N 1 Dibujo de vista

microscpica de Chaetoceros gracilis
Chaetoceros gracilis es una microalga marina cntrica y microscpica, normalmente solitaria, sus clulas
se presentan individuales de forma rectangular cuyas dimensiones son de 8-12 x 7-10 m. al verla desde
vista lateral y elptica desde vista valvar. Posee dos setas por valva, una en cada uno de los extremos del
eje apical. Puede tolerar hasta de 40C. Sus valores nutricionales presentan un 23,94% de protenas,
8,69% de lpidos y 19,01% de carbohidratos, su composicin qumica al ser cultivada en medio F2 de
Guillard, en condiciones especficas la podemos encontrar en la Tabla N 4

Esta microalga, morfolgicamente posee paredes ligeramente rgidas que pueden presentar lminas que
cubren su parte exterior. Normalmente presentan organelos pigmenticos llamados cloroplastos, que
indica que su color predominante es el verde, otros organelos pigmenticos son los llamados
cromatforos, estos sistemas poseen sistemas enzimticos relacionados con la fotosntesis. Es uno de
los mayores representantes de las diatomeas las cuales son variadas y elegantes, estas presentan
caractersticas muy importantes que residen en su pared celular llamada frstula, la cual no contiene
celulosa, sino pectina impregnada de slice. La frstula no forma una pieza completa, sino est
constituida de dos valvas que se embonan una dentro de la otra.

Las diatomeas presentan dos tipos de reproduccin, una sexual por fusin de gametos y la asexual por
medio de divisin celular. En el caso de la reproduccin normal de Chaetoceros gracilis su frstula,

17

compuesta de dos valvas (conchas) estas se separan para formar clulas nuevas durante la mitosis. Las
diatomeas en el medio natural producen agrupaciones masivas de organismos esto por factores
fisicoqumicos y principalmente por incrementos en los nutrientes. Estas agrupaciones son ocasionadas
por la reproduccin asexual de los organismos, conocidas comnmente como floraciones. En el medio
acuacultural se inducen grandes producciones de estas microalgas con la adicin de fertilizantes,
mejorando las condiciones fisicoqumicas y alimenticias de los estanques. En el caso de Chaetoceros
gracilis puede ser cultivada en ciclos de luz oscuridad (ciclo natural) o bajo luz continua, obtenindose
resultados comparables de crecimiento y biomasa.

Tabla N 4:

Composicin qumica del microalga Chaetoceros gracilis a partir de medio F2 de

Guillard, en condiciones especficas de estudio.

Microalga

Chaetoceros gracilis

Composicin Qumica
Densidad celular
Protena soluble
pH
Valor de clorofila
Nitrato
Sodio
Potasio
Fosforo
Magnesio
Sulfatos

Cuantificacin
8.442 7.07x106 cel/L
0,58 0,02 mg/L
7,7 - 9,5
7,12 0,61 mg/L
0,13 0,04 mg/L
0,07 mg/L
0,02 mg/L
2,09 0,02 mg/L
14,78 0,08 mg/L
0,03 mg/L

18

3.0 METODOLOGA

3.1 MATERIAL Y EQUIPO
erlenmeyers de 1000 ml estril
probetas de 1000 ml estril
agua de mar estril
medio F2 de Guillard
solucin de metasilicato de sodio donado por CENDEPESCA
tubos de ensayo con rosca esteriles
pipetas Pasteur estriles
cmara de neubauer de 0.1 mm de profundidad (esterilizada con alcohol 70%)
cubreobjetos (esterilizado con alcohol 70%)
microscopio ptico
pipetas morh de 1.0 ml estriles
pipetas morh de 5.0 ml estriles
pipetas morh de 10.0 ml estriles
pajillas comerciales
bomba de pecera
UPS de corriente continua
Lmparas de 20 watts blancas
beaker de 500 ml Esterilizado en el momento con torunda impregnada con alcohol etlico 70%
mechero bunsen.
Papel Aluminio
Tirro y lapiceros para rotular
Tubos cnicos para centrifuga estriles
copas dosificadoras para tomar pH
celdas (tubos) para espectrofotmetro visible
perlas de ebullicin estriles
tubos de ensayo (100 x 15 mm) estriles
embudos estriles
trpodes
tringulos
cuadros de papel filtro poro grueso (7.7 x 8.4 cm)
agua destilada estril
alcohol etlico 70%
acetona calidad reactivo
microscopios
agitador vortex
salinometro
brixometro
1 centrifuga
1 espectrofotmetro visible
Estante metlico dexion de 5 pisos

19

3.2 CONDICIONES DE LABORATORIO Y CULTIVO PRELIMINAR DE MICROALGA.

- Estante metlico dexion de 5 pisos, limpio y sanitizado con alcohol etlico 70 o alcohol
isopropilico. Forrado con papel aluminio para minimizar la prdida de luz.

- Luz artificial permanente, de lmparas 20w. Los cultivos se colocaron a tal distancia que
reciban la intensidad de grados Lux necesarios para su crecimiento. Se utiliz un Luxmetro para
determinar la distancia a la que se deban colocar los cultivos, buscando que estos cultivos
recibieran la intensidad de luz necesaria segn su volumen y requerimientos.

- Aireacin y agitacin manual diaria. (Agitacin manual una vez al da para volmenes de 100
mL o inferiores, burbujeo continuo para volmenes de 1 L o superior por medio de bombas de
aire).

El sistema de luz artificial y de aireacin se respald con una batera de alimentacin elctrica
ininterrumpida, para evitar fluctuacin de energa o cambios en el proceso.

- Temperatura. Se realizaron los experimentos a temperatura ambiente del Laboratorio de

Microbiologa de la Facultad de Qumica y Farmacia de la Universidad de El Salvador, la cual fue
de aproximadamente 28 2 C.

3.3 OBTENCIN DE LA CEPA

La cepa de Chaetoceros gracilis fue donada por el Laboratorio de Produccin de Microalgas de la
Estacin Acucola Puerto El Triunfo, Jiquilisco, Usulutn, CENDEPESCA. Y purificada en el Laboratorio de
Microbiologa de la Facultad de Qumica y Farmacia, de la Universidad de El Salvador.

20

3.4 PREPARACIN DEL INOCULO, PURIFICACIN QUMICA Y MEDIO DE PRODUCCIN

2. Se cont la cantidad de clulas viables en
la muestra proporcionada por
CENDEPESCA y por medio de la formula
C V =C V se calcul el equivalente a
purificar (75,000cel/mL)
1

1.

Se purific el alga transfiriendo por duplicado el

volumen equivalente a 75000cel/mL a dos medios
que contenan adems de los nutrientes
indispensables una mezcla de Penicilina y
estreptomicina y se incubaron por dos das.

Inoculamos el equivalente
a 75000cel/mL

Cultivo
Sin
Purificar

100mL de agua
de mar.
+ 63L de
macronutrient
es medio F2 de
Guillard.
+ 63L de
Metasilicato de
Sodio.
+ Mezcla de
Penicilina y
estreptomicina

Cultivo Sin
Purificar

250mL

100mL de agua
de mar.
+ 63L de
macronutrient
es medio F2 de
Guillard.
+ 63L de
Metasilicato de
Sodio.
+ Mezcla de
Penicilina y
estreptomicina

250mL

se

250mL

250m

100mL de agua
de mar.
+ 63L de
macronutriente
s medio F2 de
Guillard.
+ 63L de
Metasilicato de
Sodio.
+ 75,000
clulas/mL de
Chaetoceros
gracilis
+ Mezcla de

100mL de agua
de mar.
+ 63L de
macronutrientes
medio F2 de
Guillard.
+ 63L de
Metasilicato de
Sodio.
+ 75,000
clulas/mL de
Chaetoceros
gracilis
+ Mezcla de

4.

1m

1m

5.

100mL de agua
de mar.
+ 63L de
macronutriente
medio F2 de
Guillard.
+ 63L de
Metasilicato de
Sodio.

Alga
purificad
a

Del alga purificada en el

paso 2 se tom 1mL de
cada Erlenmeyer y se
inocul en un nuevo
Erlenmeyer que contena
los nutrientes necesarios.
Se rotul alga purificada

Del cultivo sin purificar se tom 1mL

de cada y se inocul en un nuevo
Erlenmeyer que contena los
nutrientes necesarios. Se rotul como
Alga sin purificar

1mL
Cultivo
Cultivo sSin
Purificar
purificar

100mL de
agua de mar.
+ 63L de
macronutrient
es medio F2
de Guillard.
+ 63L de
Metasilicato
de Sodio.

Alga
Alga ssin
in
purificar
purificar

3. Luego de trasladar 1.0 ml en cada uno de los casos se incubaron por 7 das en condiciones de
al da.
Laboratorio y se agit durante un minuto 2 veces

21

6. Se cont la cantidad de clulas viables en cada uno de los medios de cultivo y por medio de la
formula C V =C V se calcul el equivalente a purificar (75,000cel/mL)
1

Alga
purificada

Alga sin
purificar

7. Se transfiri un equivalente a 75000cel/mL de los medios de cultivos anteriormente

descritos de la manera como se muestra en el siguiente esquema diferenciando entre el

cultivo purificado para cada uno de los medios I y del cultivo sin purificar para los
Erlenmeyers II y III respectivamente, pero se trabaj para las determinaciones nicamente
con los I y II para todos los parmetros a medir.

8. Los medios anteriores se dejaron con las siguientes condiciones y muestreando por duplicada
uno de erlenmeyers con los diferemnyes medios los posteriores 9 das a partir del da cero:

Luz artificial permanente, de lmparas 20w. Los cultivos se colocaron a tal distancia que
reciban la intensidad de grados Lux necesarios para su crecimiento.

Agitacin por burbujeo contino por medio de bombas de aire.

Temperatura. Se realizaron los experimentos a temperatura ambiente del aproximadamente

28 2 C.

22

3.5 PARMETROS CINTICOS

se seleccionaron las muestras de tubo I y tubo III de cada uno de los medios de cultivos con el fin de
obtener una muestra purificada y una no purificada de cada uno de los dos medios estudiados as se
cuantifico a cada uno:

pH (usando un potencimetro a 25 2 C)
Azucares Totales - por mtodo ptico (brixometro)
Salinidad por mtodo ptico (salinometro)
Densidad Celular (Cmara de Neubauber)
Cuantificacin de clorofilas A y B y carotenoides totales (mtodo espectrofotomtrico)

3.6 METODOLOGA PARA LA MEDICIN DE PARMETROS CINTICOS

3.6.1 - Metodologa para conteo en cmara de nuebauer de 0.1 mm de profundidad

- Colocar el cubreobjetos (Laminilla) bien limpio sobre los pilares de soporte de la cmara.

- Usando una pipeta Pasteur, deposite cantidad suficiente de la solucin homognea de microalgas,
entre la cmara y el cubre objetos.

- Esperar 3 minutos antes de proceder al conteo al microscopio (para que las unidades algales se
asienten debidamente).
- Contar en el microscopio a 40x, todas las clulas en cada uno de 6 cuadrantes, excluyendo las clulas
que se encuentran en las lneas bordes del lado izquierdo y superior de cada cuadrante, contando los
cuadrantes en diagonal y el cuadrante superior derecho

23


- Eliminar los valores extremos (mximo y mnimo) del conteo de microalga en la cmara de neubauer,
de los 6 cuadrantes.
- Calcular el promedio de conteo de microalga, con los 4 cuadrantes restantes.
- Utilizar la siguiente formula para determinar densidad celular:

Densidad celular (cel/mL) = (Promedio del conteo * 25 * 10.000)

3.6.2 Metodologa para la cuantificacin de pigmentos fotosintticos: Clorofilas a, b y

Carotenoides Totales.

1. Tomar 5 mL de muestra de microalgas, debidamente homogenizada y colocarla en un tubo para

centrifuga, con capacidad superior a 30 mL.
2. Centrifugar a 5,000 rpm durante 5 minutos.
3. Remover el sobrenadante, utilizando pipetas Pasteur estriles. Dejando solo el contenido celular
microalgal.
4. Adicionar 6.0 mL de acetona calidad reactivo, y agitar con vortex por 3 minutos.
5. Adicionar 10.0 mL de acetona calidad reactivo y agitar con vortex por 5 minutos.
6. Guardar en refrigeracin por 1 hora.
7. Filtrar utilizando papel filtro Whatman poro grueso No. 40. 62
8. Leer en el espectrofotmetro el filtrado a las siguientes longitudes de onda: 470, 647 y 663.
9. Cuantificar Clorofilas a, b y Carotenos totales utilizando la siguiente formula:

24

Frmula para calcular Clorofila a, b y Carotenoides totales (50).

Clorofila a (Ca) = ((12.25A663 279A647)*5)/16)
Clorofila b (Cb) = ((21.5A647 5.1A663) *5)/16)
Carotenoides totales = (((1000A470 1.82Ca 85.02Cb)/198)*5)/16)

12. Tabular los resultados
Ver Esquema:

25

3.6.3 - Metodologa para la determinacin de pH

1. Tomar 5 mL de muestra, y colocarlo en cubeta de muestras de pH.
2. Ir al pHmetro y determinar pH, documentar el pH a 25 C.
Nota: calibrar el pHmetro si es necesario.

3.6.4 - Metodologa para la determinacin azucares totales (Grados Brix)

1. Tomar 2 gotas del medio de cultivo (Cultivo preliminar) 2 gotas de sobrenadante obtenido en
cuantificacin de pigmentos fotosintticos (Cultivo a escala pre-masiva) y colocarlos en el lente el
Brixometro.
2. A contra luz, determinar el valor de Brix del medio.
Nota: calibrar el Brixometro si es necesario.

3.6.5 - Metodologa para la determinacin de salinidad (salinometro)

1. Tomar 2 gotas del medio de cultivo (Cultivo preliminar) 2 gotas de sobrenadante obtenido en
cuantificacin de pigmentos fotosintticos (Cultivo a escala pre-masiva) y colocarlos en el lente el
Salinmetro.
2. A contra luz, determinar el valor de % salinidad del medio.
Nota: calibrar el salinmetro si es necesario.

26

4.0 RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1 pH, SALINIDAD, GRADOS BRIX

Se determinaron estos parmetros a muestras extradas cada 24 horas por 9 das, del medio de
produccin F2 de Guillard inoculado con una cepa purificada qumicamente (Tubo I F2), con una cepa
no purificada (Tubo III F2), del medio Agua de Mar + Metasilicato inoculado con una cepa purificada
qumicamente (Tubo I AM), con una cepa no purificada (Tubo III AM), la leyenda de tubos se resume en
la tabla # 4.

Tabla # 4. Leyenda de tubos segn fuente de muestreo.
MEDIO/CEPA

MEDIO AGUA DE MAR +

METASILICATO

MEDIO F2 DE GUILLARD

CEPA PURIFICADA
QUMICAMENTE

TUBO I F2

TUBO I AM

CEPA NO PURIFICADA

TUBO III F2

TUBO III AM

Los resultados obtenidos para los tubos I y III de cada medio se encontraron con variaciones no
significativas entre los mismos por lo que estos valores se promediaron, el promedio se identifico con el
nombre del medio en estudio, se obtuvo la desviacin estndar del promedio, con el fin de establecer
barras de error (ver grafica # 1,2 y 3) con un 66% de confianza que evidencien la influencia de la
purificacin qumica de la cepa inoculada en cada parmetro cintico.

4.1.1 pH
Se determino este parmetro segn las muestras, la metodologa, y tratamiento estadstico expuesto en
la seccin 4.1, los resultados obtenidos se muestran en la tabla # 5.
Tabla # 5. Resultados del parmetro cintico pH
Medio F2
Agua de Mar
Da Tubo Tubo Tubo Tubo
I
III
I
III
0 7.98 7.47 7.36 7.43
1 7.61 7.62 7.5
7.51
2
7.6
7.62 7.47 7.46
3 7.55 7.58 7.52
7.3
4 7.83 7.99 7.3
7.81
5 8.27 8.24 7.55 7.82
7 7.55 7.87 7.5
7.39
8 8.02
8.2 7.84 7.96
9 7.55 8.21 7.91 7.96

F2

Agua
de Mar

Desv.
Est. F2

Desv. Est.
Agua de Mar

7.73
7.62
7.61
7.57
7.91
8.26
7.71
8.11
7.88

7.40
7.51
7.47
7.41
7.56
7.69
7.45
7.90
7.94

0.36
0.01
0.01
0.02
0.11
0.02
0.23
0.13
0.47

0.05
0.01
0.01
0.16
0.36
0.19
0.08
0.08
0.04

Desv. Est. Desv. Est.

F2/2
A. de Mar/2
0.18
0.00
0.01
0.01
0.06
0.01
0.11
0.06
0.23

0.02
0.00
0.00
0.08
0.18
0.10
0.04
0.04
0.02

27

Los resultados expuestos en la tabla #5 se resumen en la grafica # 1.

Grafica # 1. Resultados del parmetro cintico pH

pH de los medios
8.40
8.20

pH

8.00
7.80
F2
7.60

Agua de mar

7.40
7.20
0

10

Das

Para el medio F2 de Guillard (patrn), se observan siempre valores mal altos o mas alcalinos respecto al
medio Agua de Mar + metasilicato (evaluado) en general el comportamiento es igual salvo ligeras
diferencias en los das 1 y 9, se observa para el medio F2, leves descensos del da 0 al 3, y un aumento
sbito hasta el da 5, donde se alcanza una mayor alcalinidad al final de la fase exponencial (ver seccin
4.3) un descenso hasta el da 7, un nuevo aumento al da 8 y un descenso leve final al da 9. Los
resultados para el medio Agua de Mar + Metasilicato evidencian una tendencia similar, con un leve
aumento hacia el da 1, y un descenso leve hacia el da 3, aumento hacia el da 5, descenso al da 7,
aumento sbito hacia el da 8 donde se alcanza la mayor alcalinidad, y un mantenimiento de esta
alcalinidad hacia el da 9. Si bien el comportamiento de ambos medios evidencias valores dentro del
rango de tolerancia (7-9) el rango optimo (8.2 a 8.7) solo es alcanzado por el medio patrn al da 5, por
lo que se recomienda, alcalinizar los medios de produccin a un valor de 8.2 antes de inocularlos y
procurar la alcalinidad necesaria con la aireacin y dosificacin constante de CO2. Con el fin de
maximizar la produccin de biomasa y pigmentos fotosintticos.

28

4.1.2 Grados Brix

Se determino este parmetro segn las muestras, la metodologa, y tratamiento estadstico expuesto en
la seccin 4.1, los resultados obtenidos se muestran en la tabla # 6.

Tabla # 6. Resultados del parmetro Grados Brix.

Da
0

Medio F2
Tubo
Tubo I
III
4.3
4.2

Agua de Mar
Tubo
Tubo I
III
4
4.1

F2

Agua
de Mar

Desv.
Est. F2

Desv. Est.
Desv. Est. Desv. Est.
Agua de Mar
F2/2
A. de Mar/2

4.25

4.05

0.07

0.07

0.04

0.04

4.00

4.00

0.00

0.00

0.00

0.00

4.1

4.2

3.7

3.9

4.15

3.80

0.07

0.14

0.04

0.07

4.4

4.2

4.2

4.30

4.10

0.14

0.14

0.07

0.07

4.2

4.5

4.4

4.3

4.35

4.35

0.21

0.07

0.11

0.04

4.5

4.5

4.5

4.50

4.25

0.00

0.35

0.00

0.18

4.3

4.5

4.2

4.4

4.40

4.30

0.14

0.14

0.07

0.07

4.5

4.8

5.00

4.65

0.00

0.21

0.00

0.11

5.1

4.9

5.05

4.95

0.07

0.07

0.04

0.04

Los resultados expuestos en la tabla # 6. se resumen en la grafica # 2.

Grafica # 2. Resultados del parmetro cintico grados Brix

Grados Brix de los medios

5.20

Grados Brix

5.00
4.80
4.60
4.40
F2

4.20

Agua de mar

4.00
3.80
3.60
0

10

Das

29

De manera general se observa un comportamiento mas o menos similar en ambos medios de

produccin salvo diferencias leves en los das 2,4,5 y 7. La tendencia general es un aumento conforme
transcurre tiempo salvo un leve periodo de adecuacin en la fase lag (ver seccin 4.3) evidenciando de
esta manera que la actividad fotosinttica no se detiene al transcurso del estudio cintico, si
recordamos que las microalgas no necesitan de azucares como sustrato para su crecimiento, mas bien
una de sus propiedades tan nicas y valiosas es transformar la materia inorgnica en orgnica, ya que
sus fuentes de carbonos que utilizan provienen de material inorgnico principalmente CO2. Como es el
caso de la cepa en estudio, de esta manera a diferencia del crecimiento bacteriano donde los azucares
totales son un sustrato en este caso son un producto de la actividad fotosinttica de la microalga.

4.1.3 Salinidad
Se determino este parmetro segn las muestras, la metodologa, y tratamiento estadstico expuesto en
la seccin 4.1, los resultados obtenidos se muestran en la tabla # 7.

Tabla # 7. Resultados del parmetro Salinidad.
Da

Medio F2
Tubo I

Agua de Mar

Tubo III

Tubo I

Tubo III

F2

Agua
de
Mar

Desv.
Est.
F2

Desv. Est.
Agua de Mar

Desv.
Est.
F2/2

Desv. Est.
A. de Mar/2

37

37

33

38 37.00 35.50

0.00

3.54

0.00

1.77

39

39

35

38 39.00 36.50

0.00

2.12

0.00

1.06

40

39

35

37 39.50 36.00

0.71

1.41

0.35

0.71

44

41

39

42 42.50 40.50

2.12

2.12

1.06

1.06

57

42

38

42 49.50 40.00

10.61

2.83

5.30

1.41

43

45

40

39 44.00 39.50

1.41

0.71

0.71

0.35

42

43

39

42 42.50 40.50

0.71

2.12

0.35

1.06

44

45

42

45 44.50 43.50

0.71

2.12

0.35

1.06

49

45

47

51 47.00 49.00

2.83

2.83

1.41

1.41

Los resultados expuestos en la tabla # 7. se resumen en la grafica # 3.

30

Grafica # 3. Resultados del parmetro cintico Salinidad.

Salinidad de los medios

50.80
48.80

Salinidad

46.80
44.80
42.80
F2
40.80

Agua de mar

38.80
36.80
34.80
0

10

Das

El comportamiento en los medios de produccin no es comparable, en el medio F2 se observa que parte
de una salinidad mayor a partir del da cero lo cual es lgico debido a los nutrientes salinos aadidos, su
tendencia muestra un aumento hasta el da 5 donde se alcanza el mayor porcentaje de salinidad en el
medio de (49.5 g/L) luego presenta un descenso hasta el da 7 y un aumento hasta el da 9, el medio
evaluado por su parte presenta una aparente curva de adecuacin entre los das 0 y 2 en la fase lag (ver
seccin 4.3) un aumento hacia el da 3, desciende levemente hasta el da 5 y asciende hasta el da 9
donde expresa su mayor salinidad (49 g/L), como se ha expresado antes la cepa en estudio no presenta
cambios en su produccin de biomasa o pigmentos fotosintticos dependientes a la salinidad del medio
siempre que esta se encuentre en su rango de tolerancia (25 g/L a 55 g/L) por lo que no se entrara en
detalle en estos cambios pues no forman parte de los objetivos de la investigacin, mas all de saber
que el estudio se realizo bajo niveles de tolerancia aceptables.

31

4.2 PIGMENTOS FOTOSINTTICOS

La cuantificacin de pigmentos fotosintticos se realizo a muestras extradas cada 24 horas por 9 das,
del medio de produccin F2 de Guillard inoculado con una cepa purificada qumicamente y del medio
Agua de Mar + Metasilicato inoculado con una cepa purificada qumicamente. No se considero
cuantificar las muestras procedentes de inculos no purificados por que visualmente se encontraban
demasiado despigmentados en comparacin con los medios inoculados con cepas purificadas,
especialmente en el medio en estudio (Agua de Mar + Metasilicato de Sodio). Y esto solo conllevara a
gasto de recurso y reactivo innecesario, mencionado esto en base a este estudio se puede concluir que
se obtienen resultados mucho mas satisfactorios en la produccin de pigmentos fotosintticos
procedentes de la microalga Chaetoceros gracilis, cuando se usa una cepa purificada qumicamente.

Los resultados obtenidos se presentan bajo las unidades de ug/mL en forma de comparacin entre
ambos medios (patrn y estudiado) para cada uno de los pigmentos cuantificados a continuacin.

Tabla # 8. Resultados Pigmentos Fotosintticos.




CLOROFILA A

CLOROFILA B

CAROTENOIDES TOTALES

Da

Medio F2
(ug/ml)

Agua de Mar
(ug/ml)

Da

Medio F2
(ug/ml)

Agua de Mar
(ug/ml)

Da

Medio F2
(ug/ml)

Agua de Mar
(ug/ml)

0.4244

0.0910

-0.0288

-0.0083

-0.0573

-0.0086

-1.5514

-0.1063

0.0247

0.0146

0.0358

-0.0726

-12.682

-0.0910

0.9318

0.0083

-0.0554

0.0065

-1.0407

-0.5039

0.0191

0.0323

0.0588

0.0034

-3.5742

-0.2462

0.1273

0.0137

0.1904

0.0051

-4.2249

-3.1450

0.1320

0.0670

0.2422

0.2509

-5.3970

--------------

0.1171

--------------

0.4401

--------------

-5.3404

0.08715

0.1232

-0.0067

0.4359

-0.0167

Los resultados obtenidos en la cuantificacin de clorofila A y su comparacin entre los medios
estudiados se resumen en el grafico # 4.
Los resultados obtenidos en la cuantificacin de clorofila B y su comparacin entre los medios
estudiados se resumen en el grafico # 5.
Los resultados obtenidos en la cuantificacin de carotenoides totales y su comparacin entre los
medios estudiados se resumen en el grafico # 6.

32

Grafica # 4. Resultados Clorofila A.

2
0

10

-2

Clorofila A

-3.145078125
-4
-6

Medio F2
Agua de Mar

-8
-10
-12

-12.68257813

-14

Da

Grafica # 5. Resultados Clorofila B.
1
0.931875

Clorofila B

0.8

0.6

0.4

Medio F2
Agua de Mar

0.2
0.06703125
0
0
-0.2

10

Das

33

Grafico # 6. Resultados Carotenoides Totales.

0.5

Carotenoides totales

0.44011887
0.4
0.3
0.2509865
0.2

Medio F2
Agua de Mar

0.1
0
0
-0.1

10

Das

Al analizar los resultados obtenidos de los pigmentos fotosintticos (clorofilas a, b y carotenoides

totales) se puede observar la produccin de pigmentos fotosintticos elaborados por la microalga
Chaetoceros gracilis en cada uno de los medios de cultivo probados. Observando que en ambos casos
hay una aparente relacin entre la concentracin de clorofila a y b. En ambos medios de cultivo la
microalga se observa una disminucin en la concentracin de clorofila a cuando aumenta la
concentracin de clorofila b (Graficas # 5 y 6).

Esta relacin observada entre las concentraciones de clorofila a y b confirman el fenmeno del ciclo de
las clorofilas, el cual consiste en la conversin de clorofila a (debido a oxidacin), a clorofila b (ver figura
C1), lo cual pareciera estar sucediendo desde el inicio del cultivo mostrando su mxima expresin en el
da 3 en el medio F2 de Guillard y en el da siete para el caso del medio de Agua de Mar + Metasilicato).
Por otro lado se observa que el cese del crecimiento en ambos medios (ver seccin 4.3) est
acompaado de la disminucin de la clorofila b y aumento de la clorofila a, es decir un fenmeno de
reduccin, que se realiza entre el tercer y cuarto da en el medio F2 de Guillard y entre el sptimo y
octavo da en el medio de Agua de mar + Metasilicato, lo cual concuerda con las disminuciones
observadas en los valores de pH en los medios de cultivo (ver grafica # 1.) considerndose que estas
variaciones responden tambin a las transformaciones debidas al ciclo de las clorofilas.

A pesar de que se obtuvieron valores negativos de clorofila a, estos se observan consistentes en lo
relativo a su relacin con la clorofila b en lo referente al ciclo de las clorofilas. En sus procesos de oxido-
reduccin.

34

Figura C1. Estructura Molecular de las clorofilas a y b. Y Regin de absorcin en espectro visible.

En el caso de los carotenoides totales, estos siguen una ruta metablica diferente a la de las clorofilas,
(ruta del acido mevalonico) presentando un comportamiento diferente. En las cinticas de los
carotenoides totales podemos observar que para el medio F2 de Guillard a medida que pasa el tiempo
existe una mayor produccin de carotenoides totales, Tenindose valores mximos de produccin de
carotenoides totales el da 8, de 0.44 g/mL. Y Para el medio de Agua de Mar + Metasilicato podemos
observar una clara tendencia de aumento hasta el da 7 donde presenta su punto de mayor produccin
con valores de 0.25 ug/ml, coincidente con el punto de mayor produccin de biomasa como se
explicara en la seccin 4.3. seguida de una disminucin de carotenoides totales hacia el da nueve. lo
cual nos indica que podra existir una relacin directamente proporcional entre la cantidad de biomasa y
la cantidad de carotenoides totales, en la cintica de crecimiento microalgal de la cepa Chaetoceros
gracilis.

Con el fin de evaluar si el medio de Agua de Mar + Metasilicato, puede ser una opcin viable como
sustituto al medio F2 de Guillar (patrn) en produccin de carotenoides de inters industrial.
considerando los valores mximos de concentracin de carotenoides obtenidos y relacionndolos
porcentualmente se tiene que:

0.44 ug/ml

100% (obtenido en el medio patrn)
0.25 ug/ml

X

X = 57.57 %

35

De esta manera se puede concluir en base al estudio que en el medio estudiado se puede obtener un
57.57% de los carotenoides que se obtendran en el medio patrn.

Aplicando esta misma lgica a las concentraciones de clorofila b se tubo que: en el medio Agua de Mar +
Metasilicato es posible obtener un 7.19% de clorofila b respecto a lo que se obtendra en el medio F2 de
Guillard.

Siendo esto as se puede inferir que si bien conllevara el doble de tiempo y recursos cultivar
Chaetoceros gracilis para obtencin de carotenoides de inters industrial, respecto a un cultivo en el
medio patrn, el medio de Agua de Mar puede ser una opcin viable si se tiene en cuenta el elevado
costo del medio comercial F2 de Guillard, aun as la produccin se clorofilas no es significativa, esto
puede deberse a la falta de nutrientes pues como se vera en la seccin 4.3 las clorofilas son metabolitos
primarios.

4.3 DENSIDAD CELULAR

Con el fin de establecer un parmetro de referencia en el crecimiento de Chaetoceros gracilis y a su ves
evidenciar si existe una influencia directa y significativa de la pureza del inoculo para el caso particular
del medio de cultivo patrn o comercial F2 de Guillard se presentan primero los resultados del
crecimiento en este medio a partir de los valores obtenidos para densidad celular a muestras extradas
cada 24 horas por 9 das a excepcin del da 6, de este medio inoculado con una cepa purificada
qumicamente (Tubo I F2), y con una cepa no purificada (Tubo III F2) los valores obtenidos para cada
muestra se les aplico logaritmo base 10 con el fin de visualizar mejor cada una de las fases cinticas de
crecimiento estos valores se promediaron, se obtuvo la desviacin estndar del promedio para poder
graficar barras de error con un 66% de confianza, de esta manera la amplitud vertical de las barras de
error sern proporcionales a la influencia de la pureza del inoculo, se encontr que esta influencia no es
significable para el caso particular del medio patrn, as esta curva obtenida se comparo con un
crecimiento ideal reportado segn bibliografa, los valores se expresan en la tabla # 9.

Tabla # 9. Densidad Celular para medio F2 de guillard

DA
0
1
2
3
4
5
7
8
9

MEDIO F2 DE GUILLARD
PROMEDIO
Tubo I
Tubo III
(Log cel/ml) (Log cel/ml)
4.88
4.88
4.88
4.8
5.27
5.04
5.57
5.52
5.55
6.93
6.79
6.86
6.6
6.6
6.60
6.92
6.91
6.92
6.92
6.91
6.92
6.84
6.97
6.91
6.97
6.98
6.98

CRECIMIENTO
BIBLIOGRFICO

DESVIACIN
ESTNDAR

S/2

4.88
4.88
5.18
5.48
5.78
6.10
6.10
6.10
6.10

0.00
0.33
0.04
0.10
0.00
0.01
0.01
0.09
0.01

0.000
0.166
0.018
0.049
0.000
0.004
0.004
0.046
0.004
36

Los resultados expuestos en la tabla # 9. Se evidencian en la grafica # 7

Grafica # 7. Crecimiento exponencial de Chaetoceros gracilis en medio F2 de Guillard

Crecimiento Logaritmico
Crecimiento Logaritmico

6.98
6.8

6.3

6.1
5.8

5.3

4.8
0

4
Series1

6
Series2

10

Dia

La serie 1 en color azul representa el crecimiento en el medio F2 de Guillard y la serie 2 en lnea roja el crecimiento esperado
segn bibliografa para chaetoceros gracilis.

La teora reporta que chaetoceros gracilis en su crecimiento tiene una fase lag de uno a dos das, una
fase exponencial que se extiende hasta el da 5 donde promedia un intervalo de duplicacin de 24 horas,
una fase estacionaria que se extiende hasta los das 8 o 9, y una posterior fase de muerte. La grafica # 7.
Compara este comportamiento con el obtenido con la determinacin de densidad celular para el medio
F2 de Guillard, las barras de error solo son apreciables en los das 1,3 y 8, y solo se muestra significable
para el da 1, por lo que se puede concluir que la pureza del inoculo no es un factor significativo cuando
se cultiva chaetoceros gracilis en el medio patrn. El comportamiento de la grafica para el medio F2 de
Guillard muestra una aparente fase lag hasta el da 1, una fase exponencial comprendida entre el da 1 y
3, una aparente fase estacionaria que se extiende desde el da 3 al da 9 donde presenta su mxima
produccin de biomasa en valores de 9.55x106 cel/ml, las curvas obtenidas en la grafica # 7 servirn de
referencia para la evaluacin del medio Agua de Mar + Metasilicato como alternativa para la produccin
de biomasa de la cepa en estudio.

37

4.3.1 Cintica de crecimiento en medio Agua de Mar + Metasilicato.

Se cuantifico la densidad celular a muestras extradas cada 24 horas por 9 das a excepcin de los das 4
y 5, del medio de produccin Agua de Mar + Metasilicato inoculado con una cepa purificada
qumicamente (Tubo I), y con una cepa no purificada (Tubo III)

A los datos obtenidos en cel/ml se les aplico logaritmo base 10 para cada uno de los casos, con el fin de
obtener una mejor interpretacin de las fases de crecimiento logartmico en el medio. Dichos
resultados se comparan con el medio F2 y con los datos bibliogrficos esperados expuestos en la seccin
4.3, este anlisis se expresa en la tabla # 10.


Tabla # 10. Densidad celular para medio Agua de Mar + Metasilicato

AGUA DE MAR
DA

0
1
2
3
4
5
6
7
8
9

MEDIO F2 DE GUILLARD

CRECIMIENTO
BIBLIOGRFICO

TUBO I (cel/mL)

Log.
TUBO I

TUBO I (cel/mL)

Log.
TUBO III

Log. (cel/mL)

Log. (cel/mL)

75000
375000
500000
250000


2375000
1625000
4125000
2937500

4.88
5.57
5.70
5.40


6.37
6.21
6.61
6.47

75000
250000
250000
375000


375000
750000
250000
750000

4.88
5.40
5.40
5.57


5.57
5.87
5.40
5.87

4.88
5.04
5.55
6.86
6.60
6.92

6.92
6.91
6.98

4.88
4.88
5.18
5.48
5.78
6.10
6.10
6.10
6.10
6.10

Los resultados expuestos en la tabla # 10 se resumen en la grafica # 8

38

Grafica # 8. Densidades celulares para los medios en estudio.

Densidad Celular
6.98

6.8

Log. (Cel/mL)

6.61
6.3
6.1
5.87

5.8

5.3

4.8
0

Dias
Agua de Mar Cepa Puriaicada

Agua de Mar Cepa No Puriaicada

Medio F2 (Patron)

Bibliograaico (Patron)

La grafica # 8. Evidencia que los resultados en cuanto a produccin de biomasa de Chaetoeros gracilis
cultivada en Agua de Mar + metasilicato, son altamente influenciables por la pureza del inoculo inicial,
obtenindose un punto de mxima produccin para el cultivo axenico al da 8 con densidad celular de
4125000 cel/ml lo que representa el 550% de lo producido por el cultivo no axenico en su punto de
mxima produccin al da 7 con densidad celular de 750000 cel/ml.

La produccin de biomasa del cultivo no axenico se encuentra bastante por debajo de la esperada por
datos bibliogrficos, teniendo en cuenta, que el factor de dilucin de una cmara de neubauer de 0.1
mm de profundidad (en la cual se realizo la cuantificacin) es de 10,000 esto representa un promedio de
3 celulas por cuadrante, lo que conlleva a resultados con una incertidumbre en la medicin bastante
significable en especial para errores humanos, el comportamiento para el cultivo no axenico en Agua de
Mar + Metasilicato si bien no muestra etapas de crecimiento bien definidas aparentemente tiene una
fase exponecial hasta el da 3, y una fase estacionaria hasta el da 6, al da 7 al da 8 un descenso y al da
9 un nuevo incremento que mas que una fase puede atribuirse a errores de medicin.

La produccin de biomasa del cultivo axenico de Chaetoceros gracilis en medio de Agua de Mar +
Metasilicato presenta valores superiores a la esperada segn datos bibliogrficos, y cercanos a la
produccin de medio F2 de Guillard (patrn) no presenta fases de crecimiento definidas , hay un leve
incremento entre los das 0 y 2 y un leve descenso hacia el da 3 en una aparente fase lag, luego un
aparente crecimiento exponencial hasta el da 8 donde presenta su punto de mxima produccin de

39

biomasa con una densidad celular de 4125000 cel/ml que representa un 43.19% de la densidad celular
mxima obtenida en el medio patrn.

De la grafica # 8 se puede concluir que un cultivo de chaetoceros gracilis en medio de Agua de Mar +
Metasilicato no es viable cuando, el cultivo no es axenico pues la produccin mxima de biomasa con
valores de densidad celular de 750000 cel/ml solo representa un 7.8% de la produccin de biomasa
obtenida en el medio patrn (F2 de Guillard), esto puede deberse a secuestro de nutrientes por parte
de los microorganismos contaminantes con especial inters en dinoflagelados cuya morfologa se
observo en la cuantificacin de densidad celular en cmara de nuebauer al momento de la medicin. Del
grupo taxonmico de los dinoflagelados no todos son auttrofos ni fotosintticos, por lo que esto podra
explicar el por que de la baja produccin de biomasa y pigmentos fotosintticos en el cultivo no axenico
en el medio en estudio.

Teniendo en cuenta que la produccin de biomasa en el cultivo axenico, es casi la mitad (43.19%) de la
obtenida en el medio F2 de Guillard, y el bajo costo econmico del medio Agua de Mar + Metasilicato en
contraste al elevado costo del medio F2 de Guillard. Cultivar la Microalga Chaetocers gracilis en el medio
evaluado para la obtencin de plancton (biomasa) que sirva como alimento para moluscos y bivalvos,
puede ser una opcin viable siempre y cuando la cepa sea purificada qumica y fsicamente antes de su
inoculo. Por lo que de ahora en adelante los valores de densidad celular obtenidos en el medio
estudiado nicamente harn referencias a los obtenidos en el cultivo axenico en esta investigacin.

4.3.2 Comparacin de Produccin de Biomasa en el Cultivo de Chaetoceros gracilis con Otras

Investigaciones.

En la tabla # 11, se muestran a forma de comparacin los resultados obtenidos en produccin de
biomasa con relacin a otras investigaciones usando distintos medios de cultivo incluyendo el F2 de
Guillard los resultados se expresan en incrementos logartmicos segn la diferencia del logaritmo base
10 de la densidad celular final y el logaritmo base 10 de la densidad celular inicial.

Al considerar los aumentos en la densidad celular en los diferentes cultivos de Chaetoceros gracilis, se
verifico que en sta investigacin, se obtuvo un mayor crecimiento de la microalga que el obtenido por
otras investigaciones.

Cabe mencionar que para el caso del medio de Agua de Mar + Metasilicato, nicamente se hace
referencia a los resultados obtenidos para un cultivo axenico. Y que el cultivo no axenico en este medio
de produccin de biomasa no es una opcin viable por lo que esa posibilidad se descarta segn los
resultados de esta investigacin.

40

Tabla # 11, Comparacin de los aumentos de la densidad celular en unidades logartmicas, de resultados
de diferentes investigaciones, utilizando Chaetoceros gracilis.


Medios de
cultivo
/Autores

Ctedra Microbiologa
Aplicada IV FQF-UES
(2015)

Parra, E.; Cuadra, T. y

Sorto, M. (2015).

Ortega, A. y Reyes, H.
(2013).

Gonzlez, B. (1999).

Log
Inicial

Log
[Final]

Log
[Inicial]

Log
[Final]

Log
[Inicial]

Log
[Final]

Log
[Inicial]

Log
[Final]

4.88

6.61

1.73

4,88

6,50

1,63

4.88

6.98

2.10

4,88

6,72

1,85

6,34

7,16

0,82

5,40

6,18

0,78

Medio Algal

6,34

7,20

0,86

Fertilizante
Agrcola

6,34

6,99

0,65

Walne

6,34

7,22

0,87

Agua de Mar +
Metasilicato
MACM 10%
Medio F2 de
Guillard
Medio F de
Guillard

4.4 RELACIN ENTRE METABOLITOS Y PRODUCCIN DE BIOMASA

Con el fin de establecer si los pigmentos fotosintticos se producen como metabolitos primarios o
secundarios se superpusieron las graficas de produccin de biomasa y de clorofila b y carotenoides
totales para cada uno de los medios obteniendo los siguientes resultados .

Grafica # 9. Relacin Biomasa y Pigmentos fotosintticos, Medio F2 de Guillard.

Crecimiento Log

6.8

0.8

6.3

0.6
0.4

5.8

0.2
5.3

4.8

Microgramos/Mililitro

Biomasa y Pigmetos Medio F2

-0.2
0

10

Dias
Crecimiento F2

Carotenoides Totales

Cloroaila B

41

Grafica # 10. Relacin biomasa y pigmentos fotosintticos , Medio Agua de Mar + Metasilicato.

Biomasa y Pigmentos Medio Agua de Mar

Log. (cel/ml)

0.22
0.17

6.3

0.12
5.8

0.07
0.02

5.3

-0.03
4.8

Microgramos/Mililitros

0.27
6.8

-0.08
0

10

Dia
Crecimiento Agua de Mar

Cloroaila B

Carotenoides Totales

De la grafica # 9 se puede inferir que la clorofila b se forma como un metabolito primario y los
pigmentos carotenoides como metabolitos secundarios en el crecimiento en el medio F2 de Guillard,
para el crecimiento en el medio de Agua de Mar + Metasilicato, (grafica # 10) si bien no se observa un
comportamiento claro, pareciera indicar que tanto clorofila b como pigmentos catotenoides se
producen como metabolitos primarios.

Estas diferencias pueden explicarse de acuerdo a la adecuabilidad de las microalgas a los nutrientes
presentes en el medio en el cual se desarrollan. (ver secciones 1.3 -1.9) podra suponerse de esta
manera que como en el medio F2 se le presentan los nutrientes necesarios para un mejor
aprovechamiento de la luz incidente, y fuentes de carbono, nitrgeno y fosforo en los procesos
fotosintticos la microalga se adecua a estas condiciones, y no necesita de la produccin de
carotenoides como requisito para su divisin celular. Para el caso del medio Agua de Mar + Metasilicato,
la escases de nutrientes especialmente de Vitaminas B1, B8, B12, Nitrgeno y Fosforo, obligan a la
activacin de la ruta metablica del acido mevalonico como requisito para su divisin celular, lo cual se
traduce en que los pigmentos carotenoides se produzcan como metabolitos primarios y no secundarios,
pero estas solo son suposiciones, se necesita un estudio detallado y especifico para concluir al respecto.

42

5.0 INTERS INDUSTRIAL DE LAS MICROALGAS.

El cultivo de algas ha sido objeto de estudio durante las ltimas dcadas debido al inters suscitado
tanto por su capacidad para combatir el efecto invernadero (eliminar el CO2 de corrientes gaseosas
industriales) como para la obtencin de productos de valor aadido (nutricin, farmacia, qumica fina,
etc.) y, principalmente, como fuente alternativa a los combustibles fsiles tradicionales (produccin de
biodiesel, biometano, biohidrgeno y bioetanol).

A continuacin entraremos en detalle en los usos e investigacin en cada uno de estos campos:

5.1 Energa

Podra decirse que una de las principales preocupaciones actuales es la bsqueda de fuentes de energa
sustitutas o complementarias al petrleo, dado el pronstico del agotamiento de las reservas del
planeta y los problemas derivados de su uso: emisiones de efecto invernadero, subida de los precios,
inestabilidad de los mercados por dependencia energtica de pases productores, etc.

La investigacin actual en microalgas est mayoritariamente centrada en la obtencin de cultivos con
alto contenido en lpidos para la produccin de biodiesel. Existen, sin embargo, adems de dicha
conversin qumica, otras posibilidades de aprovechamiento energtico de las microalgas, de modo
similar a como se aprovechan otros tipos de biomasa del planeta (residuo forestal, residuo orgnico
urbano, etc.): mediante conversin termoqumica, qumica o bioqumica. Todas estas posibilidades se
detallan a continuacin.

5.1.1 Biodiesel

El biodiesel es un combustible lquido obtenido a partir de lpidos mediante procesos de esterificacin y
transesterificacin. Estos lpidos provienen de grasas animales o de aceites de diversos cultivos, como
los de soja (en la actualidad la materia prima ms empleada), maz, girasol, palma, colza, remolacha,
jatropha, etc. El principal problema de estas materias primas vegetales es la necesidad de grandes
extensiones de tierra para su cultivo y la competencia con productos de alimentacin, lo que ha
generado en los ltimos aos un amplio debate sobre su sostenibilidad econmica, medioambiental y
social.

Numerosas especies de microalgas pueden ser inducidas, manipulando las caractersticas fsico-qumicas
del medio de cultivo, a producir elevadas cantidades de lpidos o cidos grasos, que pueden ser
posteriormente empleados para la produccin de biodiesel. Estas manipulaciones pueden ser simples,
como variacin de la salinidad, temperatura, pH o disponibilidad de micronutrientes. La acumulacin de
lpidos se atribuye a un consumo de azcares mayor al crecimiento celular, que favorece la conversin a
lpidos de los azcares en exceso. Sin embargo, y por regla general, las microalgas con alto contenido

43

lipdico no presentan altas velocidades de crecimiento. Es por ello que lo que se busca optimizar es la
produccin neta de lpidos por unidad de volumen de reactor o de superficie ocupada.

Las ventajas del empleo de algas para la obtencin de biodiesel son principalmente las siguientes:

No compite en el mercado de productos de alimentacin.
La produccin no es estacional por dependencia con las cosechas.
El consumo de agua es menor.
La superficie necesaria para su cultivo es mucho menor: empleando aceite de colza se producen
alrededor de 1190 L biodiesel/ha de cultivo, mientras que en el caso de las algas se pueden
obtener hasta 12000 L/ha.
Su alta velocidad de crecimiento en comparacin con los cultivos tradicionales: la productividad
por unidad de superficie es entre 20 y 40 veces mayor en el caso de las algas.
Eliminacin del empleo de herbicidas y pesticidas

Los principales problemas tcnicos de la obtencin de biodiesel a partir de microalgas radican en la
dificultad de la extraccin de los lpidos de las clulas. Estos procedimientos son complejos y estn
todava en fase de desarrollo. Los principales problemas econmicos derivan por consecuente del alto
precio de la tecnologa necesaria, as como del hecho que compiten con precios de carburantes
relativamente bajos.

5.1.2 Otros Intereses Energticos

Conversin Termoqumica (Combustin Directa, Gasificacin, Pirolisis
Termoqumica)
Hidrogeno
Conversin Bioqumica (Fermentacin alcohlica, Digestin Anaerobia)

Licuefaccin

5.2 Depuracin

La fitoremediacin, en trminos generales, es el empleo de plantas para la eliminacin o transformacin
de contaminantes, incluyendo por ejemplo nutrientes presentes en el agua o el CO2 presente en gases
de escape. La fitoremediacin lleva asociada una produccin de biomasa, ya sea sta plantas superiores
(filtros verdes, etc.), macroalgas o microalgas

5.3 Otros Productos

La produccin a escala industrial de algas para usos no energticos comenz en los aos sesenta en
Japn con el cultivo de Chlorella para aditivo en alimentacin. Este consumo se extendi a pases como
los EEUU, India, Israel o Australia. El consumo de microalgas para alimentacin est sin embargo

44

restringido a unas pocas especies debido a la estricta regulacin en materia de alimentos. El mercado
est dominado por Chlorella, Dunaliella y Spirulina en forma de comprimidos o en polvo, si bien es cierto
que existen estudios que relacionan el consumo de cianobacterias con varias enfermedades del sistema
nervioso. Las microalgas son una fuente importante de cidos grasos poliinsaturados, esenciales para el
ser humano por, entre otras cosas, reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Estos cidos
grasos suelen obtenerse a partir de aceites del pescado. Actualmente el nico disponible
comercialmente a partir de microalgas es el cido docosahexaenoico (DHA) ya que la obtencin de otros
(eicosapentaenoico EPA, gamma linoleico GLA y araquidnico AA) no es competitiva con la produccin a
partir de otras fuentes.

Las microalgas se cultivan tambin para alimentacin animal como suplementos que mejoran la
respuesta inmunolgica o fertilidad, controlan el peso o el estado de las pieles de los animales. Se
emplean microalgas como Chlorella, Spirulina o Scenedesmus, principalmente en acuicultura.

De las microalgas, sobretodo de Dunaliella salina, se obtiene b-caroteno, que tiene un amplio rango de
aplicaciones como colorante, fuente de provitamina A y aditivo en cosmticos.

La microalga Haematococus pluvialis produce astaxantina, que se emplea en la industria nutracutica,
cosmtica, de colorantes y de alimentacin. Es un potente antioxidante con posibles acciones
beneficiosas en humanos como proteccin ante la radiacin UV, precursor hormonal y del sistema
inmunolgico, antiinflamatorio y fuente de provitamina A.

La C-ficocianina, que se obtiene principalmente de Spirulina platensis y Porphyridium cruentum, es un
pigmento fotosinttico con aplicaciones en nutricin humana y animal y como colorante natural para
alimentos y cosmticos, as como en la industria farmacutica por su poder antioxidante.

El carbn vegetal resultante de la pirlisis se emplea como fertilizante y se ha propuesto como un
biocombustible que fija CO2, aunque los estudios no son concluyentes (Brennan 2010).

45

Tabla # 12. Estado de Produccion de Microalgas para otros usos en 2010 (Brennan 2010)

46

6.0 DIAGRAMA DE QUMICA VERDE PARA EL PROCESO DE INVESTIGACIN

Tabla # 13. Diagrama de Qumica Verde para el proceso de investigacin.
PROCESO
MATERIALES Y EQUIPO PRINCIPIOS
PICTOGRAMA
PREPARACIN DE AGUA DE MAR
1, 2,6
MEDIOS DE
COMPOSICIN DEL
CULTIVO
MEDIO F2 DE GULLARD
AUTOCLAVE

PREPARACIN DE PENICILINA
1,2,6
SOLUCIONES DE
ESTREPTOMICINA
ANTIBITICO
AGUA ESTRIL

EVALUACIN
9

PURIFICACIN
MEDIOS DE CULTIVO
QUMICA DE CEPA CON ANTIBITICO

1,

PREPARACIN DE MEDIO F2 DE
CULTIVO SEMILLA GRILLARD
AGUA DE MAR

1,

PREPARACIN DE
CULTIVOS DE
PRODUCCIN

LMPARAS DE 20
WATTS
UPS DE CORRIENTE
CONTINUA
BOMBA DE PECERA
MEDIOS DE CULTIVO
pH-METRO
SOLUCIONES BUFFER
PH 4,7,10

1,6,11

BRIXOMETRO

SALINOMETRO

10

CMARA DE
NEUBAUER
MICROSCOPIO
ACETONA
CENTRIFUGADORA
BORTEX
ESPECTROFOTOMETRO
VISIBLE

DETERMINACIN
DE PH

DETERMINACIN
DE GRADOS BRIX
DETERMINACIN
DE SALINIDAD
DETERMINACIN
DE BIOMASA
PIGMENTOS
FOTOSINTTICOS

TOTAL
PROMEDIO

10

10

6,12

10

92
9.2

47

V. CONCLUSIONES

El Medio de Agua de Agua de Mar + Metasilicato dio lugar a un incremento mximo de
biomasa de Chaetoceros gracilis de 1.73 logaritmos, el cual constituye un mejor resultado que
el obtenido por otras investigaciones.

Al comparar porcentualmente los valores mximos de densidad celular de Chaetoceros gracilis
se tiene que, en el Medio de Agua de Mar + Metasilicato es posible obtener el equivalente a un
43.19 % de densidad celular mxima de Chaetoceros gracilis al ser cultivada en el medio
comercial F2 de Guillard, en condiciones de laboratorio.

Cultivar la Microalga Chaetocers gracilis en el medio Agua de Mar + Metasilicato para la
obtencin de plancton (biomasa) que sirva como alimento para moluscos y bivalvos, puede ser
una opcin viable siempre y cuando la cepa sea purificada qumica y fsicamente antes de su
inoculo.

La produccin de pigmentos fotosintticos en el medio de Agua de Mar + Metasilicato de Sodio
no es equiparable al obtenido en el medio de F2 de Guillard representando solo una relacin de
un 7.19 % respecto a pigmentos cloroflicos y un 57.57% de pigmentos carotenoides.

No existe diferencia apreciable entre la produccin de biomasa cuando se usa una cepa
purificada qumicamente, y un un cultivo no axenico contaminado por bacterias, en el medio F2
de Guillard tericamente lejos de perjudicar algunas bacterias potencian el crecimiento algal al
producir cianocobalamina como metabolito, un conocido factor de crecimiento microalgal. Los
rendimientos variaran segn el tipo de contaminante bacteriano.

Para el caso del medio de Agua de Mar + Metasilicato los resultados evidencian en cuanto a
produccin de biomasa de Chaetoeros gracilis, son altamente influenciables por la pureza del
inoculo inicial, obtenindose un punto de mxima produccin para el cultivo axenico al da 8 con
densidad celular de 4125000 cel/ml lo que representa el 550% de lo producido por el cultivo no
axenico en su punto de mxima produccin al da 7 con densidad celular de 750000 cel/ml.

48


El cultivo de chaetoceros gracilis en medio de Agua de Mar + Metasilicato no es viable cuando,
el cultivo no es axenico pues la produccin mxima de biomasa con valores de densidad celular
de 750000 cel/ml solo representa un 7.8% de la produccin de biomasa obtenida en el medio
patrn (F2 de Guillard), esto puede deberse a secuestro de nutrientes por parte de los
microorganismos contaminantes con especial inters en dinoflagelados cuya morfologa se
observo en la cuantificacin de densidad celular en cmara de nuebauer al momento de la
medicin. Del grupo taxonmico de los dinoflagelados no todos son auttrofos ni fotosintticos,
por lo que esto podra explicar el por que de la baja produccin de biomasa y pigmentos
fotosintticos en el cultivo no axenico en el medio en estudio.

El alto rendimiento de produccin de biomasa en medio F2 de Guillard puede deberse a
condiciones ambientales de incubacin especialmente a la intensidad de gradox lux para la
fotosntesis con especial inters en la fase Lag. Y la distancia en escala perpendicular de la
fuente de aireacin respecto a la fuente de luz.

El rango de tolerancia de pH para la produccin de biomasa algal es de 7-9, y el rango optimo va
de 8.2 a 8.7. Por lo que el medio debe contener agentes quelantes que no permitan que los
metales trazas precipiten y mantengan los mismos disponibles para la microalga. Ya que estos
precipitan ante pH alcalinos.

La microalga Chaetoceros gracilis no consume azucares u otro tipo de materia organica para su
crecimiento, de esto se deriva su interes ya que transforma materia inorganica en materia
organica, sin necesitar consumo de la ultima.

Considerando el bajo costo del medio agua de mar + metasilicato en contraste al alto valor
econmico del medio F2 de Guillard, el primero es una buena alternativa como sustitucin. Si se
busca la produccin de biomasa y pigmentos carotenoides mas no as respecto a pigmentos
cloroflicos

Al evaluar las cinticas de los pigmentos fotosintticos, elaborados por Chaetoceros gracilis, al
ser cultivada en el Medio de Agua de Mar + Metasilicato de Sodio y el medio comercial F2 de

49

Guillard, se puede observar que existe una tendencia a la disminucin de la concentracin de

clorofila a, conforme aumenta la clorofila b, fenmeno acorde a lo explicado por el ciclo de las
clorofilas, donde se desarrollan reacciones Oxido Reduccin, que podran ser las causantes de
las variaciones en los cambios de pH en los medios

La Clorofila B se forma como un metabolito primario y los pigmentos carotenoides como
metabolitos secundarios en el crecimiento en el medio F2 de Guillard, para el crecimiento en el
medio de Agua de Mar + Metasilicato, los resultados parecen indicar que tanto clorofila b como
pigmentos catotenoides se producen como metabolitos primarios. Estas diferencias pueden
explicarse de acuerdo a la adecuabilidad de las microalgas a los nutrientes presentes en el
medio en el cual se desarrollan. Podra suponerse de esta manera que como en el medio F2 de
Guillard se le presentan los nutrientes necesarios para un mejor aprovechamiento de la luz
incidente, y fuentes de carbono, nitrgeno y fosforo en los procesos fotosintticos la microalga
se adecua a estas condiciones, y no necesita de la produccin de carotenoides como requisito
para su divisin celular. Para el caso del medio Agua de Mar + Metasilicato, la escases de
nutrientes especialmente de Vitaminas B1, B8, B12, Nitrgeno y Fosforo, obligan a la activacin
de la ruta metablica del acido mevalonico como requisito para su divisin celular, lo cual se
traduce en que los pigmentos carotenoides se produzcan como metabolitos primarios y no
secundarios, estas suposiciones necesitan un estudio detallado y especifico para concluir al
respecto.

50

VI. RECOMENDACIONES

Experimentar con el Medio de Agua de Agua de Mar + Metasilicato, el cultivo de microalgas a
escala de volmenes masivos.

Experimentar con el Medio de Agua de Agua de Mar + Metasilicato, el cultivo de otras especies
de microalgas.

Alcalinizar los medios de cultivo para microalgas a valores ptimos de pH (8.2 8.7) antes de su
inoculacin y procurar la alcalinidad necesaria con la aireacin y dosificacin constante de CO2.
En todo el proceso upstream, con el fin de maximizar la produccin de biomasa y pigmentos
fotosintticos.

Realizar un estudio de disponibilidad y costos, para determinar la conveniencia econmica de
utilizar el medio de Agua de Mar + Metasilicato para el cultivo de microalgas, respecto a otros
medios de cultivo.

Formular un medio de Agua de Mar + Metasilicato con adicin de Tiamina, Biotina y
Cianocobalamina en proporciones equiparables a las presentes en el medio comercial F2 de
Guillard, y cultivar la microalga chaetoceros gracilis cuantificando la produccin de biomasa y
pigmentos fotosintticos con el fin de establecer si es viable econmicamente la inclusin de
dichos factores de crecimiento algal.

Evaluar la influencia de la intensidad de luz en el cultivo de Chaetoceros gracilis en el medio
Agua de Mar + Metasilicato, evaluando su crecimiento en parmetro de biomasa y produccin
de pigmentos fotosintticos en el medio a distintas intensidades de luz.

Disear el fotobiorreactor mas adecuado para el crecimiento de Chaetoceros gracilis en medio
de Agua de Mar + Metasilicato, con especial inters en la profundidad de la seccin
perpendicular a la fuente de luz, y ubicacin espacial de la fuente de aireacin respecto a la
intesidad de luz incidente. Se recomienda en base a lo observado en esta investigacin el uso del
fotobiorreactor B y D (Ver anexo # 2)

51

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Ruiz Martnez, Ana Tesina. PUESTA EN MARCHA DE UN CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA
ELIMINACIN DE NUTRIENTES DE UN AGUA RESIDUAL URBANA PREVIAMENTE TRATADA
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Parra Barrientos, Eduardo Alexander. Cuadra Zelaya, Tania Ethel. Sorto lvarez, Mirna Lorena.
CULTIVO DE LA MICROALGA Chaetoceros gracilis UTILIZANDO COMO MEDIO DE CRECIMIENTO
AGUA DE COCO MODIFICADA. Facultad de Qumica y Farmacia, Universidad de El Salvador, El
Salvador. 2015

Abe, K., Takahashi, E. (2008) Development of laboratory-scale photobioreactor for water
purification by use of a biofilter composed of the aerial microalga Trentepohlia aurea
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green alga Botryococcus braunii. Journal of Applied Phycology 15, 185-191.

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52

 Borowitzka, M. (1999) Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and

fermenters. Journal of Biotechnology 70, 313 321.

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production, processing, and extraction of biofuels and co-products. Renewable and Sustainable
Energy Reviews 14, 557-577.

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Culture Medium for Chaetoceros gracilis and Thalassiosira sp (Chrysophyceae) in Laboratory
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53


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microalgas marinas de uso comn en acuicultura. Fundacin La Salle de Ciencias Naturales,
tomo LIX, nmero 151.

54

VIII. NDICE

PORTADA
I. CARATULA.......

II. ANTECEDENTES...

III. OBJETIVOS .

IV. INTRODUCCIN .

1.1 Microalgas .

1.2 Acuicultura en El Salvador...

1.3 Nutrientes ..

1.4 Salinidad ..

10

1.5 pH .

10

1.6 Oxigeno .

10

1.7 Agitacin .

11

1.8 Temperatura ..

11

1.9 Luz .

11

2.1 Medios de Cultivo

13

2.1.1 Medio F2 de Guillard .

13

2.1.2 Medio de Agua de Mar + Metasilicato

16

2.2 Microalga Chaetoceros gracilis

17

3.1 Material y Equipo .

19

3.2 Condiciones de Laboratorio y Cultivo Preliminar de Microalga

20

3.3 Obtencin de la cepa .

20

3.4 Preparacin del inoculo, Purificacin Qumica y Medio de Produccin .

21

3.5 Parmetros Cinticos ..

23

3,6 Metodologa para la medicin de parmetros cinticos

23

1. MARCO TERICO

2. MEDIOS DE CULTIVO Y CEPA UTILIZADA

3. METODOLOGA

3.6.1 Metodologa para la medicin de densidad celular en

cmara de Nuebauer de 0.1 mm de profundidad.

23

3.6.2 Metodologa de cuantificacin de pigmentos fotosintticos

24

55

3.6.3 Metodologa para determinacin de pH

26

3.6.4 Metodologa para determinacin de Grados Brix

26

3.6.5 Metodologa para determinacin de salinidad .

26

4.1 Condiciones (pH, Salinidad y Grados Brix)

27

4.1.1 pH ..

27

4.1.2 Grados Brix ..

29

4.1.3 Salinidad

30

4.2 Pigmentos Fotosintticos .

32

4.3 Densidad Celular

36

38

4. RESULTADOS Y DISCUSIN

4.3.1 Cintica de Crecimiento en el medio

Agua de Mar + Metasilicato .

4.3.2 Comparacin de produccin de biomasa en el cultivo de

Chaetoceros gracilis con otras investigaciones

40

4.4 Relacin entre metabolitos y produccin de biomasa

41

5.1 Energa ..

43

5.1.1 Biodiesel

43

5.1.2 Otros intereses Energticos .

44

5.2 Depuracin

44

5.3 Otros Productos .

44

6.1 Diagrama de Qumica Verde ..

47

V. CONCLUSIONES ....

48

VI. RECOMENDACIONES ...

51

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ..

52

VIII. NDICE ...

55

IX. ANEXO 1 ...

57

X. ANEXO 2 ..

62

5. INTERS INDUSTRIAL DE MICROALGAS

6. DIAGRAMA DE QUMICA VERDE

56

IX. ANEXO # 1
HOJAS DE RECOLECCIN DE DATOS

57

Responsable: _____________________________________________________________

Muestra (Dia): _____________________

TUBOS I:
(10 ML DE MEDIO
INOCULADO CON
CEPA PURIFICADA)

TUBOS II:
(10 ML DE MEDIO
INOCULADO
DIRECTAMENTE SIN LA
PURIFICACIN DE LA

pH (usando un potencimetro a 25 2 C)
Azucares Totales - por mtodo ptico (brixometro)
Salinidad por mtodo ptico (salinometro)
Densidad Celular (Cmara de Neubauber)
Cuantificacin de clorofilas A y B y carotenoides
totales (mtodo espectrofotomtrico)

pH (usando un potencimetro a 25 2 C)
Azucares Totales - por mtodo ptico (brixometro)
Salinidad por mtodo ptico (salinometro)
Densidad Celular (Cmara de Neubauber)

DETERMINACIN/MUESTRA

pH

T de lectura de pH

TUBO I (F2)

TUBO I (Agua de Mar)

TUBO II (F2)

TUBO II (Agua de Mar)

Grados Brix

Salinidad

LECTURA EN CMARA DE NEUBAUER (TUBO I y TUBO II)

Eliminar los valores extremos (mximo y mnimo) del
conteo de microalga en la cmara de neubauer, de los 6 cuadrantes.

Calcular el promedio de conteo de microalga, con los 4
cuadrantes restantes.

Utilizar la siguiente formula para determinar densidad
celular:

Densidad celular (cel/mL) = (Promedio del conteo * 25 * 10.000)

TUBO I (Medio F2 de Guillard)

VALORES
PROMEDIO
CALCULO:
OBTENIDOS
Densidad celular (cel/mL) = (Promedio del conteo * 25 * 10.000)









TUBO II (Medio F2 de Guillard)
VALORES
PROMEDIO
CALCULO:
OBTENIDOS
Densidad celular (cel/mL) = (Promedio del conteo * 25 * 10.000)









TUBO I (Medio de Agua de Mar + Metasilicato)

VALORES
PROMEDIO
CALCULO:
OBTENIDOS
Densidad celular (cel/mL) = (Promedio del conteo * 25 * 10.000)









TUBO II (Medio de Agua de Mar + Measilicato)
VALORES
PROMEDIO
CALCULO:
OBTENIDOS
Densidad celular (cel/mL) = (Promedio del conteo * 25 * 10.000)

59

DETERMINACIN DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS (SOLO A CEPA PURIFICADA TUBO I)

Resultados Pigmentos fotosintticos: Tubo I (Medio F2 de Guillard):
Longitudes
Absorbancia
Calculo:
de Onda
470 nm

Clorofila A:

647 nm

Clorofila B:

663 nm

Carotenoides:

Resultados Pigmentos fotosintticos: Tubo I (Medio Agua de Mar + Metasilicato):
Longitudes
Absorbancia
Calculo:
de Onda
470 nm

Clorofila A:

647 nm

Clorofila B:

663 nm

Carotenoides:

Clorofila a (Ca) = ((12.25A663 279A647)*5)/16)

Clorofila b (Cb) = ((21.5A647 5.1A663) *5)/16)
Carotenoides totales = (((1000A470 1.82Ca 85.02Cb)/198)*5)/16)

60







X. ANEXO # 2
FOTOBIORREACTORES

Configuraciones de Fotobiorreactores
a: Estanques, b: Placas planas, c: Cilndricos, d: Tubulares horizontales

62