UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

E. A. P. CIENCIAS BIOLGICAS

Practica N2
Caracterizacin espectrofotomtrica del
ADN
Curso:
Laboratorio de Biologa Molecular
Profesor:
Gustavo A. Sandoval
Integrantes:
Ataucusi Vargas, Nieves Julisa
15100058
Ferrer Carhuas, Meryl Karina
15100096
Ponce Huaranga, Grace Lourdes
15100073
Sanchez Lozano, Christian
14100071
Sifuentes Gomez, Abigail
15100016

Soto Ugaldi, Luis Fernando

15100097
Fecha realizada la prctica:

13/09/16

Fecha de entrega del informe:

20/09/16

2016
INTRODUCCIN
Existen diversos mtodos para estimar la concentracin de cidos nucleicos
en una preparacin. Si la muestra es pura (no contiene cantidades
significativas de contaminantes como protenas, fenol, agarosa o incluso
otros cidos nucleicos), su medicin mediante espectrofotometra ( la cual
es usada para identificar compuestos por su espectro de absorcin y
conocer la concentracin de un material o sustancia, esto ltimo nos
permite conocer la concentracin de compuestos, seguir el curso de
reacciones qumicas y enzimticas as como determinar enzima y protenas
incluso cidos nucleicos) de la luz UV absorbida por las bases nitrogenadas
es la ms adecuada. Por el contrario, si la cantidad de ADN o ARN es muy
pequea, o si la muestra contiene grandes cantidades de impurezas, la
estimacin de los cidos nucleicos se puede llevar a cabo por la intensidad
de fluorescencia emitida por compuestos como el bromuro de etidio.
Los cidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la
presencia de bases aromticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de
DNA. La absorcin de UV de DNA es una caracterstica de la molcula, que
es usada eficientemente para determinar su concentracin. Cada una de las
bases tiene su propio y nico espectro de absorcin y por lo tanto
contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorcin de UV de
una molcula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de
contribucin de cada una de las bases al espectro de absorcin de UV de
una molcula de DNA de doble cadena de alto peso molecular (dsDNA)
puede ser ignorado. Sin embargo, esas contribuciones son ms
significativas cuando se trata de oligonucletidos y deben ser consideradas
si se requiere determinar correctamente la concentracin.
Una vez obtenido el material gentico, como se dijo anteriormente, sera
apropiado
determinar
el
rendimiento
(concentracin)
mediante
espectrofotometra, debido a su rapidez, simplicidad y ausencia de dao. La
ley de Beer-Lambert indica que la concentracin de una molcula en
solucin depende de la cantidad de luz absorbida de las molculas
disueltas. Otra caracterstica del ADN es que tienen una mxima
absorbancia de la luz ultravioleta (UV) a 260 nm.
Para estimar la pureza del ADN se considera la proporcin de la absorbancia
a 260 nm y 280 nm (las protenas tienen su mxima absorbancia a esta
longitud de onda). Una proporcin entre 2 y 1.8 es aceptada como ADN

puro, proporciones menores a este valor indican la presencia de protenas.

Una segunda valoracin de la pureza de cidos nucleicos es la proporcin
260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango de 2.0 a 2.2, si la
relacin es menor indican la presencia de contaminantes como
carbohidratos o fenol.
Sin embargo, esta tcnica es poco sensible, y para la mayora de los
espectrofotmetros se requiere una concentracin de ADN de al menos 1
g.mL-1 en la muestra para poder realizar estimaciones vlidas. En esta
prctica utilizaremos esta tcnica, para evaluar la muestra de ADN vegetal y
animal obtenidos del Pisum sativum y la concha de abanico,
respectivamente, de la clase anterior.

RESULTADOS DEL ANLISIS

ANLISIS ESPECTROFOTOMTRICO DEL ADN
Se registr las siguientes absorbancias:

ADN
Argopecten
diluido Animal
ADN Pisum
sativum
diluido Vegetal

Muestra
1
Muestra
2
Muestra
3
Muestra
4

Absorbancia a
260 nm

Absorbancia a
280 nm

H2O

0,464

0,367

NAOH

0,687

H2O

0,197

0,118

NAOH

0,253

ESTADO DEL ADN:

Calculando el porcentaje de incremento (%) de la absorbancia a 260nm
(efecto hipercrmico), para lo cual se compara muestra 2 Vs muestra 1 y
muestra 3 Vs muestra 4.
Teniendo en cuenta que:

Si el incremento es mayor o igual al 30 %, se considera al ADN en

estado nativo.
Si el incremento no supera el 30%, el ADN se considera denaturado o
persiste el ARN en la solucin.

Muestra animal:

0,464 100

0,687 X
X =148
El porcentaje de incremento es del 48%, por tanto el ADN animal se
encuentra en estado nativo.
Muestra vegetal:

0,197 100
0,253 X

X =128
El porcentaje de incremento es del 28%, por tanto, el ADN vegetal se
encuentra denaturado o persiste el ARN en la solucin.

CONCENTRACION DE LA MUESTRA

Para ADN en estado nativo:

1 mg/ml ADN =20 unidades de absorbancia a 260 nm.

Para ADN en estado denaturado:

1 mg /ml ADN =27 unidades de absorbancia a 260 nm .

Para la muestra animal:

1 mg/ml 20.000
X 0,464

X =0,0232mg /ml
Entonces la concentracin de la muestra ser:

0.0232 mg /ml 2 2=0,09281mg/ml

Para la muestra vegetal:

1 mg/ml 27.000

X 0,197
X =7.296 103 mg/ml
Entonces la concentracin de la muestra ser:

7.296 103 mg/ml 2 3=0,0437 mg/ml

GRADO DE PUREZA
A 260
= 1,82,0>
A 280
Si el valor es menor a 1,8 entonces habr presencia de protenas
contaminantes: y si es mayor a 2 habr presencia de otros cidos nucleicos,
por ejemplo el ARN.
Muestra Animal:

A 260 0,464
=
=1,264
A 280 0,367
La muestra presenta protenas contaminantes, por tanto, la concentracin
de protenas se determinar con la siguiente ecuacin:

|280|
|260|
Reemplazando:

0,76
(0,464)
Proteina ( mg/ ml ) =1,55(0,367)0,76
Proteina ( mg/ml ) =1,55
Proteina ( mg/ ml ) =0,21621mg /ml

Finalmente la concentracin de protenas contaminantes ser:

0.21621 mg/ml 2 2=0,86484 mg/ml

Muestra Vegetal:
A 260 0,197
=
=1,6695
A 280 0,118
Reemplazando:
Proteina ( mg/ml ) =1,55(0,118)0,76(0,197)
Proteina ( mg/ ml ) =0,03318 mg/ml

Finalmente la concentracin de protenas contaminantes ser:

0.03318 mg/ml 2 3=0,19908 mg/ml

ACCION DE NUCLEASAS
SOBRE SUSTRATO NATURAL
Se registr las siguientes absorbancias:

Muestra de ADN
Animal diluida
Muestra de ADN
Vegetal diluida

Tiempo (min.)
0
15
0
15

Absorbancia a 260nm
0,114
0,179
0,349
0,430

Muestra animal:

0,114 100

0,179 X
X =157
El porcentaje de incremento es del 57%.
Muestra vegetal:

0,349 100
0,430 X

X =123
El porcentaje de incremento es del 23%.

SOBRE SUSTRATO SINTETICO (bis-Pnff)

Tubo1
Tubo2

Absorbancia 400nm
0,187
0,340

Se determin la Actividad Especfica (AE), con la siguiente ecuacin:

AE =Cantidad de producto liberado / Unidad de tiempo / Cantidad de enzima

(M )
(min .)
(mg .)
Teniendo en cuenta que:

Factor de calibracin ( pnitrgeno )=6 M

6 M equivale a 1.000unidad de absorbancia
Para el tubo 1:

Cantidad de producto liberado:

6 M 1.000
X 0,187

X =1,122 M

Tiempo usado: 3min.

Cantidad de enzima usada:

Concentracin de enzima usada Volumen=Cantidad de enzima .

Reemplazando:

2 mg/ml 0,1 ml=0,2 mg

Reemplazando en la ecuacin:

AE=1,122 M /3 min/0,2 mg
AE=1,87 M /min/mg

Para el tubo 2:
Cantidad de producto liberado:

6 M 1.000
X 0,340

X =2,04 M

Tiempo usado: 6min.

Cantidad de enzima usada:

2 mg/ml 0,1 ml=0,2 mg

Reemplazando en la ecuacin:

AE=2,04 M /6 min/ 0,2 mg

AE=1,7 M /min/mg

DISCUSIN Y ANLISIS DE RESULTADOS

A ANLISIS ESPECTROFOTOMTRICO

1 ESTADO DEL ADN

Para decir que el ADN est en estado nativo, en principio la absorbancia de
la muestra denaturada qumicamente (en la prctica aadiendo NAOH) debe
tener un aumento entre el 30% y 35%, si es menor se concluye que el ADN
ya estaba denaturado y si es mayor a ese rango se puede sospechar que
hay algn contaminante o impureza como protena, ARN, entre otros.
Muestra animal: El incremento es un 48%, este valor esta fuera del rango
aceptable por lo que se duda que sea correcto, pero con el anlisis de
accin de nucleasas que es un mtodo ms confiable se podra corroborar si
el valor es correcto o no y por ende si estaba naturado o denaturado el ADN
desde la extraccin.
Muestra vegetal: El incremento de la absorbancia es del 28% como es
inferior al rango se concluye que el ADN se encuentra en estado
denaturado.
En esta parte del experimento se puede dar algunas razones por la cual el
DNA inicial se encuentra denaturado, estas podran ser la mala extraccin
del DNA o una mala limpieza de los materiales usados.

2 CONCENTRACIN DE LA MUESTRA
Calcularemos cunto es la concentracin ADN (en mg/ml), de la extraccin
de ADN en las muestras.
En caso de la muestra animal se extrajo

18,5 mg

de las gnadas de la

Argopecten Purpuratus (o concha de abanico) y se obtuvo

0,09281 mg. ml

de ADN.
Y en la muestra vegetal se extrajo ADN de pisum sativa (alverja),
obteniendo

0,0437 mg /ml

de ADN .

3 GRADO DE PUREZA
Para decir que nuestra extraccin fue exitosa el cociente de la absorbancia a
260 nm y 280 nm debe estar en el rango de

1.82.0 , si el cociente tiene

valores bajos de ese rango se dira que hay protenas presentes en la

muestra y tendramos que calcular cul es su concentracin.
En la muestra animal el cociente es

1.264 , este valor se encuentra debajo

del rango concluyendo que hay protenas presentes teniendo una

concentracin de

0.86484 mg/ml .

En la muestra vegetal el cociente es

1,6695 que tambin est por debajo

del intervalo, calculando la concentracin de protenas presentes es

0.19908 mg /ml

Si comparamos los grados de pureza de la muestra animal que se obtuvo

1.264, y la muestra vegetal que tuvo un valor de 1.6695; indicara una
mayor cantidad de contaminantes en la muestra animal (si el valor es ms
lejano al rango es porque el denominador es mayor y de esto se concluye
que hay mayor nmero de contaminantes).

B ACCION DE NUCLEASAS
1 SOBRE EL SUSTRATO NATURAL
MUESTRA ANIMAL: El incremento de la absorbancia es 57%, lo que
comprobara el resultado anterior (determinacin del estado del ADN) que
tena un aumento de 43% y al ser valores mayores al 30% se deduce que el
ADN estaba inicialmente denaturado.
MUESTRA VEGETAL: El incremento de la absorbancia es del 23% es porque
el ADN ya estaba denaturado antes de la prueba, pero si comparamos el
resultado anterior (determinacin del estado del ADN) que era un aumento
de 36% se deca que el ADN estaba en estado nativo. Los diferentes
resultados en la prueba son porque el segundo mtodo es ms confiable por
usar enzimas, que son las especficas, y permita corroborar o no los
resultados del primer mtodo.

2 SOBRE EL SUSTRATO SINTETICO (BIS-PNFF)

Consiste en determinar la actividad enzimtica que es

2 M /min /mg

, los

valores de la actividad especfica del sustrato sinttico bis-Pnff no deberan

variar a travs del tiempo (pero la variacin de la condicin inicial de la
enzima ya sea por la temperatura, presin u otros factores o por una
disminucin de la cantidad de sustrato. Usando la ecuacin:

AE=Cantidad de producto liberado( M ) Unidad de tiempo ( min) Cantidad de enzima(mg)

En el caso de nuestro grupo los valores obtenidos son:
Para el tubo 1 que estuvo encubado durante 3 minutos la actividad
enzimtica resulto

1,87 M /min /mg y para el tubo 2 que estuvo durante 6

minutos la actividad enzimtica resulto

1,7 M /min/mg

Los valores son menores que 2 por lo que la actividad enzimtica no es

ptima o puede ser error tcnico como: se sac antes del tiempo correcto el
tubo para inhibir la actividad enzimtica o al momento de pipetear las
cantidades no fueron exactas lo que pudo afectar a disminuir la actividad
enzimtica. Incluso la lectura de la absorbancia puede no ser precisa
dependiendo del espectrofotmetro.

Comparacin de las AE con los dems grupos de laboratorio

Para la mesa 1

M /min/mg

El tubo con 3 min la AE es 2.12

y para el tubo de los 6 min la

M /min/mg y por ende la AE promedio resulta 1.955

AE es 1.790

M /min/mg

Para la mesa 2 (nosotros)

M /min/mg

El tubo con 3 min la AE es 1.87

AE es 1.7

y para el tubo de los 6 min la

M /min/mg y por ende la AE promedio resulta 1.785

M /min/mg

Para la mesa 3

M /min/mg

El tubo con 3 min la AE es 1.47

y para el tubo de los 6 min la

M /min/mg y por ende la AE promedio resulta 1.51

AE es 1.55

M /min/mg

Comparacin de la AE experimental con la terica

Para el tubo de 3 minutos

%ERROR=

|21.87|
2

%ERROR=6.5

Para el tubo de 6 minutos

%ERROR=

|21.7|
2

%ERROR=15

Promedio y desviacin estndar de los datos

La AE experimental para el tubo de 3 min es 1.87
tubo de los 6 min la AE es 1.7

M /min/mg

Entonces la media resulta 1.785

M /min/mg

M /min/mg y para el

Sx =

( 1.7851.87 )2+ ( 1.7851.7 )2

21

S x =0.01445

Conclusiones

De acuerdo al anlisis de resultados tenemos una concentracin de

DNA para la muestra animal de 0.09281 mg./ml. y concentracin de
protena de 0.86484 mg./ml, en otras palabras, un 9.69% de DNA y
90.31% de protenas; de la misma forma la concentracin del DNA
vegetal fue de 0.0437 mg./ml y la concentracin de protena de
0.19908 mg./ml, es decir, un 18% de DNA y 82% de protenas. Estos
resultados se corroboran en la tabla Absorvence of Nucleic Acids and
Proteins del libro Molecular Cloning: A Laboratory Manual

Razones por las que el ADN result denaturado, puede ser el primer
motivo que la extraccin haya sido incorrecta y el otro motivo puede
ser que en los procedimientos de pipetear se halla daado la muestra
de ADN.
A pesar que la muestra animal resulto ser mayor al 30% en
incremento de absorbancia era un valor sospechoso pues sala del
rango comn que es entre el 30 35% pero como la primera prueba
era menos sofisticada que la de accin por nucleasas, bamos a
corroborar si el resultado era el correcto, pero no se pudo realizar a
causa ya no haba muestra diluida y no se poda diluir otra muestra
pues no estara en las mismas condiciones que el anterior.
Al determinar las concentraciones del DNA de las muestras animal y
vegetal, se nota que la muestra animal tiene mayor concentracin,
esto puede ser porque la extraccin de ADN para la muestra fue ms
estricta en los pasos pues usbamos distintas soluciones para la
extraccin a diferencia de la vegetal que solo usamos calor para la
extraccin.
Al determinar el grado de pureza de las muestras, la muestra animal
tiene menor grado de pureza, es decir mayor presencia de protenas
pese a que el mtodo para la extraccin de muestra animal era ms
precisa, lo ms probable es que al momento de extraer el ADN
despus de la centrifugacin se contamino la pipeta con la protena.
Cuando se hizo la prueba de accin de nucleasas sobre el sustrato
natural, esta prueba era para comprobar si eran correctos los
resultados sobre el estado del ADN, como nuestro grupo no realizo la
prueba uso los datos del grupo que, si lo realizo, donde podemos
decir que en la muestra animal se comprob que la muestra si se
encontraba en estado nativo al principio, pero en el caso de la
muestra vegetal desmiente el resultado anterior afirmando que la
muestra ya se encontraba denaturada.

En la accin de nucleasas sobre el sustrato sinttico, los valores de la

AE resultaron menores al valor terico, esto puede deberse a que los
tiempos no fueron precisos o las cantidades pipeteadas no fueron
exactas.

Bibliografia

Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3er

ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001