ELISA((Enzyme-linked immuno sorbent assay).

Os mtodos imunolgicos desenvolvidos para quantificar a concentrao de

antgenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade,
tornaram-se tcnicas padronizadas para pesquisa e aplicaes clnicas. Entre
esses mtodos, um dos mais usados o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent
assay).
Nesse mtodo, uma enzima, que reage com um substrato incolor para
produzir um produto colorido, covalentemente ligada a um anticorpo especfico
que reconhece um antgeno alvo. Se o antgeno estiver presente, o complexo
anticorpo-enzima ir ligar-se a ele e a enzima catalisar a reao. Ento, a
presena de produto colorido indica a presena de antgeno. Trata-se de um
mtodo eficiente pois permite detectar quantidades de protena da ordem de
nanogramas (10-9 g).
No ELISA, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser
monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior
especificidade.
Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUCHE.
Nesse mtodo, o anticorpo de um antgeno particular , inicialmente, adsorvido no
well. Depois, o antgeno (soro, urina ou outra soluo contendo o antgeno)
adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo
ligado enzima adicionado. Nesse caso, a intensidade da reao proporcional
quantidade de antgeno presente. Logo, permite mensurar at pequenas
quantidades de antgeno.

[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H.

Freeman and Company, 2000), p. 162.]

Quanto ao mtodo de revelao, pode ser direto ou indireto. No primeiro, a

enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo,
enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo.
O ELISA constitui a base do teste para infeco por HIV. Nesse teste,
protenas virais (os antgenos) adsorvem nos poos (wells) da placa de ELISA.
Em seguida, adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos
antgenos. Finalmente, anticorpos ligados enzima ligam-se aos anticorpos
humanos, propiciando a reao enzimtica com mudana de cor.

[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H.

Freeman and Company, 2000), p. 162.]

EQUIPAMENTOS NECESSRIOS:
PLACA DE ELISA

http://www.callisto.si.usherb.ca:8080/iml302/images/elisa3.jpg

 PIPETAS AUTOMTICAS

http://www.jaelsa.com/imagenes/pipeta1.jpg

http://pandora.labgeminis.com:8909/images/
8x200_ul.jpg

LEITOR DE ELISA
Leitor de placas ELISA

Leitor de tiras ELISA

http://www.rclcomercial.com.br/drake/i004.jpg

http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnic
a_elisa.htm

LAVADOR AUTOMTICO DE PLACAS

http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnica_elisa.htm

CUIDADOS:

Data de validade e estocagem dos REAGENTES

Processamento e estocagem das AMOSTRAS
Evitar contaminao e espuma no PREPARO DE
SOLUES
CALIBRAO de pipetas e demais aparelhos
LIMPEZA

PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUCHE:

1O ANTICORPO

ANTGENO DA 2O ANTICORPO
AMOSTRA

ANTICORPO
LIGADO

MUDANA
DE COR

ADAPTADO DE: http://www.med4you.at/laborbefunde/techniken/enzyme/eliza.gif

Coloca-se, na placa de ELISA, soluo tampo contendo o

primeiro anticorpo com concentrao conhecida e suficiente para
adsorver nos poos (wells) da placa. Em geral, a soluo
saturada.
Lavam-se os poos com tampo de lavagem, de forma a retirar
o tampo, mas deixar o anticorpo aderido placa.
Adiciona-se soluo contendo protena de alto peso molecular,
como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de
bloquear as reas onde os anticorpos no aderiram na placa
(stios inespecficos).

http://www.iitri.org/ServImmunology.shtml

 Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAO da

placa est cumprida.
Incubao com as amostras (solues teste com antgenos em
concentrao desconhecida devem ser adicionadas placa)
Nova lavagem e o antgeno que reagiu com o anticorpo
previamente aderido placa tambm permanecer aderido. Por
outro lado, os antgenos no ligados sero removidos.
Incubao com segundo anticorpo, seguida de lavagem.
Incubao com terceiro anticorpo anti-espcie conjugado a uma
enzima, como a peroxidase. Segue-se outra lavagem.
Adio de substrato para revelao. Trata-se de um substrato
incolor que, quando ativado pela poro enzimtica do ligante,
produz um produto final corado. A mudana de cor pode ser lida
diretamente em aparelho apropriado. Em geral, bloqueia-se a
reao para evitar que o produto final fique muito escuro e
atrapalhe a leitura do teste. Alm de bloquear a reao,
possvel adicionar um cido que provoque mudana para uma
cor cuja absorbncia melhor detectada pelo leitor de ELISA.

http://www.positivehealth.com/permit/Articles/
Colon%20Health/abraham62.htm
http://www.netria.co.uk/images/elisa2.jpg

OBSERVAES IMPORTANTES
Em geral, faz-se uma CURVA PADRO, preenchendo 8 poos de
uma fileira com concentraes crescentes e conhecidas de antgeno. A

curva serve como padro de comparao para deduzir as quantidades

de antgenos nas solues-testes. O grfico fornecido por um
programa prprio para a leitura de ELISA.
EXEMPLO DE CURVA PADRO

http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm

Um outro controle feito o TESTE BRANCO, que consiste

na adio somente do tampo com o objetivo de avaliar se houve
contaminao durante o experimento.

O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATA, servindo

de controle para os erros de manuseio. A mdia dos resultados deve
ser avaliada e se houver diferena significativa, o experimento deve
ser repetido.

PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for sangue,

deve-se centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar. Clulas
em cultura devem ser trituradas, o tampo deve ter pH adequado,
substncia detergente(para lisar a membrana) e inibidores de
proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para
anlise.

Aps a leitura do texto de ELISA e de CBA responda as questes

abaixo:
a)
Diferencie ELISA e CBA.
b)
Faa um desenho esquemtico do teste ELISA sanduiche
e CBA.
c)
Defina conjugado e para que serve.
d)
Qual o tipo de conjugado usado no ELISA e no CBA?
e)
Quais testes laboratoriais podem ser feitos usando o
ELISA e o CBA?
f)
Fale sobre para que serve o uma curva padro e como no
ELISA e CBA podemos ter reprodutibilidade do teste para um
melhor controle de qualidade.