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MANUAL LABORATORIO
QUMICA ANALTICA E INSTRUMENTAL
(QUIM 420)
INDICE
Pgina
Reglamento de Laboratorio
Seguridad en el laboratorio
10
15
19
24
26
29
LABORATORIO 6: HPLC
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LABORATORIO 7: RECUPERATIVO
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Reglamento de Laboratorio
1. El alumno deber presentarse puntualmente a la hora de inicio del laboratorio. De lo
contrario NO podr realizar el control de entrada, que significa un 1.0 en la evaluacin del
control.
2. Durante el desarrollo del prctico, es obligatorio el uso del delantal y gafas de seguridad.
3. Es obligacin del alumno realizar el total de los laboratorios programados. Slo se
podr recuperar 1 (uno) laboratorio siempre y cuando la inasistencia sea debidamente
justificada, mediante un certificado mdico a travs de la Direccin del Departamento de
Ciencias Qumicas, dentro de las 72 horas siguientes a la ausencia del prctico.
La falta del prctico sin justificar a tiempo o la ausencia a ms de una prctica significa
automticamente un 1.0 en las evaluaciones de control e informe.
4. El alumno es responsable de la destruccin de cualquier material de laboratorio y
deber reponerlo.
5. Como norma de seguridad, los alumnos dejarn sus pertenencias en los taquilleros con
candado que se encuentran en el exterior del laboratorio. Por ningn motivo dentro del
laboratorio o sobre los mesones de trabajo.
6. Frente al uso de algn reactivo, el alumno debe tomar las precauciones indicadas por el
profesor y/o ayudante, como asimismo las sealadas por el fabricante. Ante cualquier
duda, ms vale preguntar.
7. Se dispondr de recipientes para los deshechos. SELOS
8. Se recomienda el uso del cuaderno de laboratorio ya que le ayudara a recopilar toda la
informacin realizada en el laboratorio para posteriormente elaborar el informe que se
entregar la semana siguiente al laboratorio, el cual ser evaluado.
9. La no entrega oportuna del informe ser calificada con la nota mnima y significar
reprobar el correspondiente prctico.
10. Evaluaciones y ponderaciones se detallan a continuacin:
Controles de Laboratorio (CL):
Informes de Laboratorio (I):
Nota de Laboratorio:
Ponderacin a la Nota Final:
(60 %)
(40 %)
(CL* 0.60 + I*0.40)
(40 %)
11. El alumno que obtenga una nota inferior a 4.0 se considerar reprobado en la
asignatura.
Departamento de Ciencias Qumicas, Facultad de Ciencias Exactas
Formato Informe Laboratorio: La letra debe ser Arial o Time New Roman 12,
interlineado simple, hoja tamao carta.
1.
P 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
N 4.2 4.3 4.5 4.6 4.8 4.9 5.1 5.2 5.4 5.5 5.7 5.8 6.0 6.1 6.3 6.4 6.6 6.7 6.9 7.0
Laboratorio 1
Determinacin potenciomtrica de la concentracin en una disolucin de
H3PO4 y en una mezcla de HCl y H3PO4
Objetivos
1. Conocer algunos conceptos tericos, procedimientos y lenguaje para la medicin de pH.
2. Aprender el uso, cuidado y calibracin de un electrodo medidor de pH.
3. Construir una curva de titulacin experimental para la determinacin de la
concentracin de H3PO4, por valoracin potenciomtrica.
4. Determinacin de la concentracin de HCl y H3PO4, en una mezcla, por valoracin
potenciomtrica.
Introduccin
Los mtodos potenciomtricos de anlisis se basan en las medidas del potencial de
las celdas electroqumicas en ausencia de corrientes apreciables. Desde hace mucho
tiempo las tcnicas potenciomtricas se han utilizado para la deteccin de puntos finales
en mtodos volumtricos de anlisis.
El equipo requerido para los mtodos potenciomtricos incluye un electrodo de
referencia, un electrodo indicador y un dispositivo para medir el potencial.
El potencial de un electrodo indicador adecuado se puede utilizar para establecer el
punto de equivalencia de una valoracin (valoracin potenciomtrica). El punto final
potenciomtrico es ampliamente aplicable y proporciona datos ms precisos que los
mtodos que utilizan indicadores. Este tipo de valoraciones es muy til en la valoracin de
soluciones coloreadas, turbias y para detectar la presencia de especies insospechadas en
solucin.
La utilidad del pH como una medida de la acidez o basicidad de un medio acuoso y
la amplia disponibilidad de electrodos indicadores de pH (electrodos de vidrio), han hecho
que las medidas potenciomtricas sean una de las medidas ms utilizadas en el anlisis
qumico.
Parte experimental
Materiales y reactivos
Bureta graduada de 25 mL
pH metro
Agitador magntico
Barra magntica
Pipeta aforada de 10 mL
Matraz aforado de 100 mL
Probeta graduada de 100 mL
Vaso de precipitados de 150 mL
Pizeta con agua destilada
NaOH 0.1 mol/L, estandarizada previamente
Laboratorio 2
Determinacin potenciomtrica del contenido de iones cloruro y de iones
fluoruro usando un electrodo selectivo de iones (ISE)
Objetivos
1. Conocer el manejo, mantenimiento y aplicaciones de electrodos selectivos de iones, ISE.
2. Construir curvas de calibracin tpica aplicables en potenciometra directa.
3. Analizar muestras de enjuagatorio bucal para la determinacin de in fluoruro.
4. Construir una curva de valoracin potenciomtrica experimental para la determinacin
de la concentracin de Cl en una muestra de vino, expresada como ppm de NaCl, en la
cual se utiliza un electrodo selectivo de iones cloruro como electrodo indicador.
Introduccin
Los Electrodos Selectivos de Iones (ISE, por sus siglas en ingls) son dispositivos
relativamente simples y econmicos que, al sumergirse en una solucin, desarrollan un
potencial elctrico cuya magnitud depende selectivamente de la concentracin (en rigor,
de la actividad) de un tipo de in en particular, an en presencia de otros iones en la
solucin.
Cuando este electrodo selectivo es utilizado conjuntamente con un electrodo de
referencia, se forma una celda electroqumica cuyo potencial permite conocer la actividad
de este in particular realizando una calibracin apropiada.
El ISE contiene en su estructura un sensor electroqumico, que consiste en una
membrana de composicin especial que permite establecer un equilibrio de intercambio
inico en forma selectiva con el in analito al cual se aplica.
En el lmite entre las fases membrana-solucin se produce una distribucin de
cargas, la cual es responsable del potencial elctrico. La magnitud de este potencial
depende de la posicin del equilibrio de intercambio inico, la cual depende, a su vez, de la
actividad de los iones seleccionados en esta zona lmite, llamada interfase del electrodo.
Estos electrodos han encontrado una amplia gama de aplicaciones, que incluyen
reas como anlisis de laboratorio, control de procesos industriales, mediciones en el
campo de la fisiologa, monitoreo ambiental, monitoreo de aguas residuales, control de
calidad en alimentos, agricultura y pesca, diagnstico mdico, control de calidad en
industrias farmacuticas y de cosmticos.
Adems, en titulaciones potenciomtricas, estos electrodos amplan la aplicabilidad
de esta tcnica a una gran variedad de reacciones donde participan especies qumicas para
las cuales no existen electrodos apropiados basados en transferencias de electrones.
El electrodo selectivo de Fluoruro quizs sea el electrodo de estado slido ms
comn, est basado en la utilizacin de un cristal de fluoruro de lantano impurificado con
europio (II). En este caso, la impurificacin (o dopaje) consiste en aadir pequeas
cantidades de Eu(II) en vez de La(III). La solucin de relleno interna del electrodo consiste
en NaF y NaCl 0.1M. Su fundamento consiste en que el in fluoruro en solucin est
selectivamente absorbido en las dos caras del cristal; por lo que los iones F pueden
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Probeta graduada de 50 mL
Pipeta graduada de 5 mL
Solucin estandarizada de AgNO3 0.02 mol/L
Soluciones 0.0100 0.100 0.500 mol/L de NaCl para calibracin
Solucin 1.0 mol/L de KNO3, reguladora de fuerza inica para la calibracin (ISAB)
Muestra problema de vino tinto
A) Procedimiento Experimental
1. Dependiendo del nivel de la concentracin esperable en la muestra, prepare una curva
de calibracin para ion fluoruro (el tramo de concentraciones puede variar).
2. Para la determinacin en un tramo diluido prepare 250 mL de una solucin patrn de F
de 10 ppm por dilucin de la solucin estndar de 100 ppm y a partir de sta prepare un
conjunto de matraces con soluciones patrn que contengan 0.4, 1.0, 2.0, 4.0 y 5.0 ppm de
F. Utilice matraces aforados de 50 mL a los que se aaden 25 mL de solucin TISAB.
3. Las muestras tambin deben contener la proporcin correspondiente de TISAB (50%).
4. Despus de enjuagar bien introduzca los electrodos en el estndar de 5.0 ppm (vaso
plstico), agite durante 3 - 5 minutos hasta alcanzar un valor de equilibrio, registre el
potencial. Repita con los estndares restantes y con la muestra.
5. Trace un grfico de potencial versus log concentracin de los estndares. Determine la
ecuacin y el coeficiente de regresin. (Analice la ecuacin).
6. Utilice esta ecuacin para determinar la concentracin en ppm de F en la muestra
problema (esta concentracin deber ser corregida por la dilucin que ha sufrido la
muestra por efecto del TISAB).
7. Haga repeticiones para la determinacin de la muestra (soluciones diferentes).
8. Como se podra llevar a cabo una determinacin mediante adicin de estndar?
Investigue como podra efectuarse una medicin por lectura directa en el instrumento
(calibracin del instrumento para la medicin de F).
9. Escriba la ecuacin que describe la relacin entre potencial y concentracin para un
electrodo de F.
10. Por qu debemos efectuar las mediciones a una temperatura constante?
11. La sensibilidad del electrodo de fluoruro es apropiada?
12. Porqu el pH del TISAB debe mantenerse en el rango 5.0 - 5.5?
13. Cmo funciona el control de la fuerza inica?
B) Procedimiento Experimental
i) Calibracin del potencimetro
1. Calibre el potencimetro con las soluciones de NaCl para calibracin (pCl 2.00 -1.00 y
0.301):
Vierta 50 mL de cada una de las soluciones calibradoras en los vasos de 100 mL y
adicione 2.0 mL de la solucin ISAB.
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Laboratorio 2A
Valoracin conductomtrica de una mezcla de cido fuerte y cido
dbil y de precipitacin
Objetivos
1. Aprender el uso, cuidado y calibracin de un conductmetro.
2. Determinacin conductomtrica del punto final en la valoracin de una mezcla de un
cido fuerte y un cido dbil con NaOH.
3. Determinacin conductomtrica del punto final en la valoracin por precipitacin de
cloruro de potasio con nitrato de plata.
Introduccin
La conductividad es el recproco de la resistencia y sus unidades ms comunes son
Ohms y Siemens. Las determinaciones de la conductividad reciben el nombre de
determinacin conductomtricas.
La conductancia de una solucin vara con el nmero, tamao y carga de los iones y
con algunas caractersticas del solvente, como la viscosidad. Adems, del rea (A) y la
distancia (l) de las placas, es decir, depende del electrodo (o celda) que se est utilizando.
As, para independizar la medida, se debe determinar previamente la constante de la celda
( = distancia/rea), la cual es especfica para cada electrodo. Si a travs del tiempo, el
rea o la distancia de las placas varan, se obtendr otro valor de conductividad.
Para determinar la constante de la celda generalmente se utilizan soluciones de KCl
patrn de concentracin exactamente conocida, se desgasan y se termostatizan a 25C.
Luego se busca en tablas la conductividad especfica (k) de estas soluciones y se calcula:
=
Conductividad especfica (k, ohms/ cm)
Conductividad medida (L, ohms)
KCl (N)
0.02
0.01
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Grfico N 1
Grfico N 2
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Figura 1
Los mtodos conductimtricos basados en reacciones de precipitacin o formacin
de complejos no son tan tiles como aquellos que involucran procesos de neutralizacin.
Los cambios en la conductancia durante estas titulaciones raramente son tan grandes
como los observados en las reacciones cido-base puesto que ningn otro ion se aproxima
a la conductancia del ion hidronio u hidroxilo. Factores tales como la lentitud de la reaccin
y la coprecipitacin representan otras fuentes de dificultad en las reacciones de
precipitacin. En las valoraciones conductimtricas no importan los valores absolutos de la
conductividad, ya que stos desplazan la curva en el eje Y, sin que esto afecte el volumen
del punto de equivalencia, eje X. Lo que s es indispensable es realizar la correccin por la
dilucin:
Lcorregido = Lmedido x (Volumen inicial + Volumen agregado)
Volumen inicial
Parte experimental
Materiales y reactivos
Bureta graduada de 25 mL
Pipeta volumtrica de 10 mL
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Matraz aforado de 50 mL
Vaso de precipitados de 100 mL
Conductmetro
Agitador magntico
Barra magntica
Soporte universal
Mariposa (pinza para buretas)
Pizeta
Propipeta
Solucin de NaOH 0.1 mol/L, estandarizada previamente
Muestra Problema de HCl-HAc
Solucin de AgNO3 0.01 mol/L, estandarizada previamente
Solucin problema de KCl
Procedimiento Experimental
1. Mida exactamente 10 mL de solucin problema y diluya exactamente a 50 mL en un
matraz aforado. Vierta en un vaso de 100 mL y anote el volumen final.
2. Instale el vaso sobre el agitador magntico. Coloque la celda de conductividad de modo
que quede totalmente sumergida. Ajuste la velocidad de la agitacin de forma tal que no
produzca turbulencias.
3. Encienda el equipo y espere a que se estabilice. Con ayuda de su profesor seleccione la
escala apropiada.
4. Tabule volumen en mL versus Conductancia Corregida. Anote la lectura inicial. Valore
adicionando alcuotas de 0.5 mL de valorante, hasta completar 10-12 mL agregados (o
lectura inicial).
5. Retire la celda y lave los electrodos. Valore una nueva alcuota con incrementos de 0.1
mL de valorante.
6. Tabule: Volumen, Conductancia leda, Conductancia corregida.
Cond. Corregida = Cond. Leda x VolTotal
VolInicial
7. Grafique Conductancia corregida versus volumen de NaOH. Defina los puntos de
equivalencia de forma grfica.
8. Grafique Conductancia corregida versus volumen de AgNO3. Defina el punto de
equivalencia de forma grfica.
9. Calcule la concentracin de las especies en las soluciones valoradas en Molaridad.
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Laboratorio 3
Determinacin del contenido de fsforo por Espectrofotometra
Objetivos
1. Anlisis del contenido de fsforo en una muestra real mediante espectrofotometra UV
Visible.
2. Aplicacin de mtodos de cuantificacin haciendo uso de curvas de calibracin y de
adicin estndar.
Introduccin
La espectrofotometra, especialmente en la regin visible se utiliza a menudo como
mtodo de anlisis. Muchas sustancias pueden convertirse en derivados coloreados y, por
lo tanto, pueden ser analizados en la regin visible del espectro electromagntico.
La radiacin electromagntica se puede considerar como una forma de energa
radiante que se propaga como onda transversal con un movimiento ondulatorio. La
distancia entre las ondas se describe en trminos de longitud de onda (). La regin visible
es una parte muy pequea del espectro electromagntico y se extiende desde el
ultravioleta cercano, 380 nm hasta aproximadamente 780 nm.
La cantidad de radiacin absorbida por una especie qumica se puede relacionar con
la concentracin de la sustancia que se analiza, mediante la Ley de Beer:
A=kbC
Donde:
A = Absorbancia
C = Concentracin del analito
b = El paso ptico
k = La constante de proporcionalidad.
La constante de proporcionalidad k se denomina absortividad (a) si la concentracin
de la sustancia a analizar se expresa en gramos/litro y absortividad molar () si la
concentracin del analito se expresa en moles/litro.
Es posible realizar clculos cuantitativos cuando dos especies absorbentes de la
solucin tienen espectros que se superponen. De acuerdo con la ley de Beer, la
absorbancia total de una mezcla a determinada longitud de onda, ser igual a la suma de
las absorbancias individuales de las especies que absorben.
En la mayora de los anlisis qumicos se mide la respuesta del procedimiento
analtico a cantidades conocidas de analito (llamadas patrones o estndares) y basndose
en ellas se puede interpretar la respuesta a una muestra de contenido desconocido. Para
este fin se prepara una curva de calibrado, que es un grfico que muestra la respuesta de
un mtodo analtico en funcin de cantidades conocidas de analito.
Las disoluciones que contienen concentraciones conocidas de analito se llaman
disoluciones patrn o estndar. Las disoluciones que contienen todos los reactivos y
disolventes usados en el anlisis, pero sin analito, se llaman disoluciones blanco o
Departamento de Ciencias Qumicas, Facultad de Ciencias Exactas
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Zona Lineal
Concentracin
El mtodo de adicin patrn consiste en aadir cantidades conocidas de analito a la
muestra problema, cuyo contenido en analito se quiere determinar. A partir del aumento
de seal se deduce cunto analito hay en la muestra problema. Este mtodo requiere una
respuesta lineal frente al analito.
Este mtodo es especialmente apropiado cuando la composicin de la muestra es
desconocida o compleja y afecta a la seal analtica. La matriz es todo lo que hay en la
muestra problema adems del analito. Se define como efecto de matriz el cambio que
experimenta una seal analtica por todo lo que hay en la muestra adems del analito. La
composicin de la matriz afecta la magnitud de la seal analtica. Puede ser que la matriz
contenga componentes desconocidos que, como tales es imposible incluir en las
disoluciones patrn al construir la curva de calibrado. Si se agrega un volumen pequeo de
solucin concentrada de patrn a una muestra desconocida, no vara significativamente la
concentracin de la matriz, esto debido a que la matriz ejerce el mismo efecto sobre el
mismo analito aadido que sobre el que hay en la muestra problema.
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Seal de la muestra
sin patrn aadido
CMP = b CSt
m VMP
Donde:
b = intercepto
CSt = concentracin del estndar
m = pendiente
VMP = volumen aadido de la muestra (mL)
Parte experimental
Materiales y Reactivos:
Espectrofotmetro de doble haz UV-Vis
Cubeta de 1 cm de paso ptico
Matraces aforados de 50 mL
Matraces aforados de 100 mL
Bureta graduada de 10 mL
Pipeta aforada de 10 mL
Propipeta
Pipeta graduada de 10 mL
Solucin patrn stock de fsforo de aproximadamente 100 mg/L
H2SO4 concentrado
Solucin A: Molibdato de amonio con tartrato de antimonio y potasio en H2SO4 5 N
Solucin B: Solucin A ms cido ascrbico
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Laboratorio 4
Determinacin de la concentracin de Co (II) y Ni (II) por Espectrofotometra
Visible
Objetivos
1. Estudiar los principios de la espectrofotometra visible.
2. Conocer las caractersticas de operacin de un espectrofotmetro.
3. Determinar la concentracin de Co (II) y Ni (II) en una mezcla.
Introduccin
La absorbancia es una propiedad aditiva, es decir, en disoluciones que contengan
ms de una especie absorbente la absorbancia total es la suma de las absorbancias
individuales de cada especie absorbente. Suponiendo que no haya interaccin entre las
distintas especies absorbentes (es decir, que estas sean independientes entre s), la
absorbancia total para un sistema absorbente multicomponente 1, 2, 3,... n, cuyas
absorbancias individuales sean A1, A2, A3,....An viene dado por:
A TOTAL = Ai = A1 + A2 + A3 +.......... + An
Ai = 1bC1 + 2bC2 + 3bC3 + + nbCn
Parte experimental
Materiales y reactivos
Bureta graduada de 10 mL
Matraces aforados de 50 mL
Matraces aforados de 25 mL
Espectrofotmetro UV-Visible
Celdas
Pizeta
Soluciones patrn de Co(II) y Ni(II) 0.5 mol/L
Muestra Problema
Procedimiento Experimental
i) Espectro de Absorcin
1. A partir de una solucin estndar y mediante dilucin apropiada prepare una solucin de
Cobalto (II) 0.075 molar y una solucin de Nquel (II) 0.100 molar en matraces volumtricos
de 50 mL.
2. Prepare una solucin mezcla de concentracin 0.100 molar en Co (II) y 0.050 molar en Ni
(II) en un volumen final de 50 mL.
3. Utilizando el equipo, seleccione el rango de barrido en (nm) que Ud. desea analizar (370
a 550 nm, con un intervalo de 1 nm).
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N solucin
Concentracin
(mol/L)
1
2
3
4
5
0.15
0.10
0.08
0.04
0.02
Volumen (mL)
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Laboratorio 4A
Determinacin de la concentracin de Cobre por Espectrofotometra de
Absorcin Atmica
Objetivos
1. Conocer el funcionamiento de un equipo de absorcin atmica.
2. Determinar la concentracin de Cobre en una muestra.
3. Analizar los mtodos de curva de calibracin y de adicin estndar.
Introduccin
La caracterstica especial de la Espectroscopa de Absorcin Atmica, (EAA) es que
la muestra debe atomizarse. Esto se hace normalmente con una llama, horno calentado
elctricamente o un plasma de radiofrecuencia. La sensibilidad y los efectos de
interferencia que se observan en la espectroscopia de Absorcin Atmica dependen de los
detalles del mtodo de calentamiento.
En la atomizacin de la muestra mediante una llama la combinacin ms comn de
combustible y oxidante es acetileno/aire. Cuando se requiere de mayor temperatura puede
utilizarse una combinacin de acetileno/xido nitroso. Los hornos calentados
elctricamente (hornos de grafito) presentan una mayor sensibilidad y necesitan un menor
volumen de muestra.
La medicin de Absorbancia en espectroscopia de Absorcin Atmica se rige por la
Ley de Beer. Aunque en la prctica a menudo se encuentran desviaciones de la linealidad,
esto no constituye un obstculo para trabajar con curvas de calibracin empricas.
Cuando no es posible eliminar las interferencias de matriz se puede utilizar el
mtodo de adicin estndar, tcnica que permite trabajar en presencia de un interferente,
realizando una determinacin correcta del analito. Con esta tcnica es posible determinar
ms de 60 elementos.
Parte experimental
Materiales y Reactivos
Equipo de Absorcin Atmica
Estndar de Cu de 1000 ppm
cido ntrico al 5% v/v
Bureta graduada de 10 mL
Matraces aforados de 50 y 100 mL
Pipetas aforadas de 10 y 25 mL
Pizeta
Propipeta
Muestra problema de Cu
Agua potable
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Seal
Seal de la muestra
sin patrn aadido
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CMP = b CSt
m VMP
Donde:
b = intercepto
CSt = concentracin del estndar
m = pendiente
VMP = volumen aadido de la muestra (mL)
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Laboratorio 5
Separacin de Aminocidos por Cromatografa en Capa Fina
Objetivos
1. Conocer la tcnica de cromatografa en capa fina, sus caractersticas y factores que en
ella intervienen.
2. Calcular los valores de Rf de varias sustancias.
3. Deducir, mediante los valores de Rf, la relacin que existe entre la polaridad de las
sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.
4. Aplicar la tcnica de Cromatografa de Capa Fina como criterio de pureza de las
sustancias.
5. Aplicar la tcnica de Cromatografa de Capa Fina (TLC) como criterio parcial de
identificacin de sustancias.
6. Adquirir destreza de aplicacin de muestras sobre cromatofolios.
7. Utilizar mtodos fsicos y qumicos de localizacin de manchas.
8. Determinar la composicin cualitativa de una muestra problema.
Introduccin
La cromatografa en capa fina (TLC), es un mtodo analtico verstil, sensible en alto
grado y rpido para separar en forma bien definida compuestos estructuralmente
parecidos. El mecanismo de separacin predominante es el de adsorcin, pero tambin se
puede dar el mecanismo de reparto, intercambio inico, inclusin o una combinacin de
stos, dependiendo de la fase estacionaria utilizada. Es una tcnica muy usada con la que
se logra la separacin de sustancias de naturaleza hidroflicas o hidrofbicas.
La muestra aplicada en la placa es adsorbida en la superficie del material por la
accin de fuerzas electrostticas. Luego, cuando la placa es expuesta a un flujo por accin
capilar, se inicia una competencia de enlace entre los sitios activos del adsorbente y la
sustancia con el disolvente. Una vez aplicada la muestra sobre el cromatofolio se coloca en
una cmara cromatogrfica, la cual contiene la mezcla de disolventes adecuada para el
desarrollo de la cromatografa, segn se muestra en la figura.
29
30
Frente de disolvente
Posicin final del
Compuesto
2.5 cm
Rf = 1.8 cm = 0.72
2.5 cm
1.8 cm
Origen
El valor de Rf, siempre es menor o igual a 1, depende de las condiciones
experimentales como identidad y composicin de las fases estacionarias y mviles,
temperatura, estructura qumica de los compuestos que se separan, pero es independiente
del tiempo y dimensiones de la placa. Generalmente se corren las muestras junto con
estndares sobre la misma placa en las mismas condiciones para poder comparar los Rf.
Es posible afirmar que: sustancias que poseen diferentes valores de Rf son distintas,
siempre que se desarrollen en idnticas condiciones, pero no es posible asegurar que dos
manchas con igual Rf correspondan a la misma sustancia. Se deben realizar otras pruebas
para tener certeza de que son esas manchas.
Despus del desarrollo de la cromatografa, la placa cromatogrfica se retira de la
cmara, se marca con un lpiz el frente del disolvente y se deja al aire hasta que se seque o
se ayuda con un ventilador o secador de cabello o en un horno. Si los solutos son
coloreados se vern a simple vista su localizacin. Si los solutos son incoloros hay que
localizarlos por mtodos especiales. Dentro de los mtodos para localizar los solutos se
tienen:
1. Mtodos qumicos
2. Mtodos fsicos
3. Radiactividad
4. Mtodos biolgicos y enzimticos
Dependiendo del tipo de analito a estudiar se podrn emplear diferentes sustancias
qumicas para revelarlas. Por ejemplo: para aminocidos se puede utilizar ninhidrina, para
cidos se puede realizar un revelado selectivo mediante un indicador cido-base, utilizando
la tcnica de baado.
Parte experimental
Materiales y Reactivos
Regla graduada
Lpiz grafito
Placa cromatogrfica (Slica gel)
Papel filtro
Secador de pelo
Placas para cromatografa de 10x10 cm (cromatofolios)
Cmara cromatogrfica
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Capilares de vidrio
Tubos de ensayo
Gradilla para tubos
Aspersor
Estufa de secado a 105C
n-Propanol
NH4OH 34 %
cido actico glacial
n-Butanol
Agua destilada
Solucin de ninhidrina (0.2% en etanol)
Solucin de Yodo (opcional)
Sulfato de amonio al 20%, acidificada con H2SO4 (opcional)
Soluciones estndares de aminocidos (AA)
Muestra problema de aminocidos
Procedimiento Experimental
Sembrado de muestras y patrones de caracterizacin.
1. Se trabajar con una muestra problema de aminocidos la cual ser entregada por el
Profesor.
2. Marcar lnea de origen con lpiz grafito y con cuidado de no levantar la slice, a una
distancia de 1 cm desde el borde inferior del cromatofolio.
3. Realizar en el cuaderno una tabla en la que se indica el orden de sembrado como se
indica a continuacin:
Siendo AAn, el estndar n de AA.
Placa
Posicin 1
Posicin 2
Posicin 3
Posicin 4
1
2
AA1
AA4
AA2
AA5
MP
MP
AA3
AA6
32
33
34
Laboratorio 6
Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC). Determinacin de
Teofilina en una muestra problema
Objetivos
1. Conocer y manejar un equipo HPLC.
2. Determinar el contenido de Teofilina en una muestra problema.
Introduccin
La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) es un tipo de cromatografa en
columna utilizada frecuentemente en Bioqumica y Qumica Analtica.
Es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en
diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatogrfica.
En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de
la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con
ciertas caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase
mvil) a alta presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en
pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las
interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la
columna.
El grado de retencin de los componentes de la muestra depende de la naturaleza
del compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que
tarda un compuesto a ser eludo de la columna se denomina tiempo de retencin y se
considera una propiedad identificativa caracterstica de un compuesto en una determinada
fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas
incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce as su
difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes
ms utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo.
El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el cido
trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.
Un estndar interno (IS) es una sustancia que se aade a todas las muestras en una
cantidad constante. La calibracin supone representar la razn entre la seal del analito y
la del estndar interno como una funcin de la concentracin del analito.
El estndar interno puede compensar distintos tipos de errores indeterminados y
sistemticos. Si el IS y el analito responden proporcionalmente a los errores instrumentales
y fluctuaciones del mtodo, la razn entre las seales es independiente de las
fluctuaciones.
La mayor dificultad es encontrar un IS adecuado, con seal reproducible y que
genere una seal similar a la del analito.
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Material Adicional
Curva de calibracin con patrn interno
Un patrn interno es un compuesto, diferente del analito, que se agrega en cantidad
conocida y constante a la muestra y a los patrones. La seal del analito se compara con las
del patrn interno para determinar la cantidad de analito presente en la muestra.
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S PI k PI CPI
Donde kA y kPI, son respectivamente, las sensibilidades del analito y del patrn interno. El
cociente entre las dos seales ser:
S A kA CA
C
K A
S PI k PI C PI
C PI
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pendiente = K/CPI
Concentracin
analito
38
Aanalito/Apatrn interno
2
y = 6,916x + 0,062
1,5
1
0,5
0
0
0,1
0,2
0,3
[Hidrocarburo]/%
Cmuestra
1.192 0.062
0.163%
6.916
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Laboratorio 7 : RECUPERATIVO
Espectrofotometra de Absorcin Molecular Visible
Objetivos
1. Conocer la instrumentacin y el manejo de un espectrofotmetro.
2. Obtener, interpretar y calcular el rango de concentraciones de trabajo en un espectro.
3. Utilizar mtodos de cuantificacin por curva de calibracin y de adicin estndar.
Introduccin
P
P0
%T
P
x 100
P0
Otra magnitud comn para expresar la cantidad de luz absorbida es la absorbancia (A), la
cual est definida por:
A log T
Departamento de Ciencias Qumicas, Facultad de Ciencias Exactas
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41
Cst
Vx
Donde:
= intercepto
CSt = concentracin del estndar
= pendiente
VMP = volumen aadido de la muestra (mL)
CLCULOS
1. Calcular la concentracin de la muestra problema
2. Realizar su muestra por triplicado, de modo de poder calcular la media, la
desviacin estndar y el coeficiente de variacin de la muestra.
3. En el caso de una muestra con concentracin conocida calcular el error relativo
para cada caso (interpolacin y adicin estndar).
4. Discutir los resultados obtenidos.
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