Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

4IM2 Seccin 2

OBJETIVOS
Analizar la actividad proteolitica de enzimas (bromelana, papana y otras proteasas)
Crear curva de calibracin de actividad enzimtica.

FUNDAMENTO
Determinacin de actividad de enzimas proteolticas mediante el mtodo de Kunitz, que
se basa en medir cantidad de pptidos y aminocidos solubles liberados durante la
hidrolisis aprovechando la capacidad, de algunos de ellos, de absorber selectivamente
a 280 nm.

DATOS EXPERIMENTALES
Tabla 1. Actividad enzimtica de la Tripsina.
Tubo

Concentracin de Tripsina
(mg/mL)

T1 y 1
T2 y 2
T3 y 3
T4 y 4
T5 y 5

0.04
0.08
0.12
0.16
0.2

A280

Problema
0.119
0.292
0.4
0.492
0.594

Testigo
-

0.119
0.292
0.4
0.492
0.594

0.576
0.385
0.418
0.176

0.186
0.1
0.268
0.115

0.39
0.285
0.15
0.061

Problemas
Bromelana 1:10
Bromelana 1:20
Papana 1:2
Papana 1:4

TI y I
TII y II
TIII y III
TIV y IV

A280
corregid
a

Grfica 1. Curva de actividad enzimtica.

a) Cuntas unidades trpticas hay por miligramo de tripsina?

U.T. = Pendiente de la recta/20 = 2.875/20= 0.1437
Tabla 2. Curva de actividad enzimtica especfica para la digestin de casena por
tripsina.
Tubo

Unidades Trpticas

A280 corregida

1
5.74x10-3
0.119
2
0.0114
0.292
3
0.0172
0.400
4
0.0229
0.492
5
0.0287
0.594
Para calcular las unidades trpticas: (0.1437)(Concentracin de Tripsina)
Ejemplo: (0.1437)(0.04)= 5.74x10-3
Grfica 2. Actividad enzimtica especfica.

b) Indique la actividad especfica, en unidades trpticas por gramo de

muestra, de la pia (bromelana) y la papaya (papana).
De la ecuacin y=20.02x+0.0353 se despeja x:
X= (y-0.0353)/20.02

Bromelana 1:10

X= (0.39-0.0353)/20.02= 0.0177 UT (10 mL)= 0.177 UT en 1 mL.

En 39 mL= 6.903 UT
6.903 UT en 25 g de pia
En 1g de pia 0.2761 UT

Bromelana 1:20

X= (0.285-0.0353)/20.02= 0.0124 UT (20 mL)= 0.2494 UT en 1mL

En 39 mL= 9.7285 UT
9.7285 UT en 25g de pia
En 1g de pia 0.3891 UT

Papana 1:2

X= (0.15-0.0353)/20.02= 0.0057 UT (2 mL)= 0.0114 UT en 1 mL

En 45 mL= 0.513 UT
0.513 UT en 25g de papaya.

En 1g de papaya 0.0205 UT

Papana 1:4

X= (0.061-0.0353)/20.02= 0.0012 UT (4 mL) = 0.0051 UT en 1 mL

En 45 mL= 0.2310 UT
0.2310 UT en 25g de papaya.
En 1g de papaya 0.00924 UT

PREGUNTAS ADICIONALES
a) Defina actividad enzimtica y actividad enzimtica especfica.
La actividad enzimtica queda definida como la cantidad de enzima que cataliza la
conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad enzimtica se obtiene
dividiendo la actividad total por la protena total.

b) Escriba la clasificacin de las proteasas, en funcin de su mecanismo de

accin y diga en qu grupo se ubican las determinadas en la prctica.

Se clasifican de la siguiente manera de acuerdo a su mecanismo

cataltico:
-Serin proteasas: Contienen un residuo de serina en su sitio
activo. Inhibidas por diisopropoil-flourofosforo y otros
organofosforados.
- Tiol proteasas: Requieren de la presencia de un grupo SH en su
sitio activo. Inhibidas por iones de metales pesados, agentes
alquilantes y agentes oxidantes.
-Proteasas acidas: Poseen uno o ms grupos carboxilo en su sitio
activo.
-Mtalo proteasas: Requieren de cationes metlicos divalentes.
Inactivadas en presencia de agentes quelantes.
La papana y la bromelana pertenecen al grupo de las tiol
proteasas. La tripsina se encuentra en el grupo de las serin
proteasas.

c) Para qu se aficiona cistena en las muestras de pia, y papaya?

Debido a que requieren de cistena para ser activadas.
d) Cul es la especificidad de enlace de la tripsina?
La tripsina muestra su especificidad para romper el enlace peptdico por el lado del
grupo carboxilo de los aminocidos con cadenas laterales voluminosas y con carga
positiva, como la lisina y arginina.

DISCUSIN

CONCLUSIN
Se logr realizar una curva de actividad enzimtica y gracias a la pendiente de esta
determinamos las unidades trpticas por miligramo de tripsina.

BIBLIOGRAFA
Buttle J. D., (1998), Handbook of Proteolytic Enzymes, Academic Press London, 558pp.
Stryer L.. (1995). Bioqumica. Revert. Espaa.263-275.
Lenhninger A., Nelson D., Cox M., (1999), Principios de Bioqumica. Ediciones
Omega.115pp