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Desafos en la relacin entre el anlisis y la

biotecnologa
abstracta. Los mtodos analticos y sistemas para aplicaciones
biotecnolgicas son cada vez ms importantes. El desarrollo de estos
mtodos y Sys- tem piden un enfoque interdisciplinario. El uso de mtodos
analticos y sistemas en la prctica diaria en la investigacin biotecnolgica,
el desarrollo, la aplicacin y la produccin industrial es esencial para el
progreso de la biotecnologa. Los mtodos analticos y los sistemas no son
exclusivamente utilizados para el control de la investigacin, desarrollo y
produccin de productos biotecnolgicos, sino tambin la meta en s se
utiliza en muchas aplicaciones, como mdicos, medioambientales, etc. Esta
conferencia presenta una visin general de los progresos actuales en
qumica analtica en relacin con la biotecnologa- nologa. Elementos
especiales seleccionadas han sido tratados en ms detalle.
Palabras clave: la qumica analtica, la biotecnologa, el control de procesos,
control de contaminantes.
Cuando hablamos de biotecnologa, tenemos que darnos cuenta de que este
sector no es slo una de las reas de ms rpido crecimiento en la industria,
pero tambin es una de las ms antiguas tecnologas gies 'en la historia
humana.
La biotecnologa es, por definicin, la integracin de las disciplinas bsicas
bio- qumica, la gentica, la microbiologa y la tecnologa de procesos en los
sistemas biolgicos, en nombre de los procesos industriales y el medio
ambiente. Esta definicin incluye no slo las actividades de la industria de
fermentacin tradicional, pero tambin da entrada a nuevos campos de la
biotecnologa como comercializa el cultivo de tejidos vegetales, su uso para
la produccin de compuestos qumicos relacionados con especies vegetales
de importancia, la utilizacin de animales, ms concretamente de clulas de
mamferos para fines especiales y la rpidamente creciente campo de los
anticuerpos monoclonales.
Ms de 10000 aos atrs los procesos bioqumicos, ya eran utilizadas para
patroci- taneous fermentacin de alimentos, que se traduce en una mejor
digestibilidad, mejor sabor, mejor estabilidad y viabilidad, etc. Slo pensar
de la levadura de pan y la produccin de una amplia variedad de alimentos
y bebidas fermentadas.
Direccin actual: Gist-brocados N.V., investigacin y desarrollo, P.O. Box 1,
NL-2600 MA en Delft, Holanda
168 B. te Nijenhuis
procedimientos de seleccin a travs de los siglos, y an en este siglo se
basa en la seleccin natural y la mutacin, resultando en la modificacin
gentica natural. Suc- cessful productos de esta biotecnologa clsica son la
penicilina y enzimas para la industria alimentaria, farmacutica y de las
aplicaciones. La aceleracin de estos procesos de seleccin lento en
principio tuvo lugar con la introduccin de la fusin celular, tcnicas de ADN
recombinante y la ingeniera de protenas. La aplicacin de estas tcnicas
en los procesos industriales se tradujo en el impulso de la biotecnologa en
el da de hoy.
Marly nuevos productos se han introducido en varias zonas [i]:
-- los productos farmacuticos: la teraputica (por ejemplo, la insulina
humana, los interferones, las interleucinas, las hormonas de crecimiento
humano, la vacuna contra la hepatitis B, etc.); los diagnsticos (ms de
300); - nuevas aplicaciones de productos agrcolas: Crop Protection
(bioplaguicidas), animal Therapeutics, diagnsticos; -- productos de

especialidad: enzimas, especialidades qumicas, Biofine TM de productos


qumicos.
En general podemos afirmar que los productos en el rea mdica, la
agroindustria y la actividad industrial todava son principalmente el
resultado de la investigacin en nuevas aplicaciones con la ayuda de
microorganismos. Pero la evolucin en el cultivo de tejidos vegetales y el
uso de clulas de mamferos son tan rpido, que a su debido tiempo una
gama de productos procedentes de estas fuentes puede ser esperada.
Biotecnologa y Qumica Analtica
Qumica Analtica Cmo hacer frente a este creciente sector.
En primer lugar, veamos un desglose de las principales tecnologas en
desarrollo hoy (Fig. 1). Uno puede reconocer el crecer de biotecnologa en
estado embrional crece hasta la madurez. Uno tambin puede esperar
mucho trabajo en la fase de I+D en la parte izquierda de la figura, mientras
que el control de procesos de produccin desempear un papel importante
en procesos maduros.
Esto da tambin una rpida visin de lo que se espera de la disciplina
analtica:
orientacin en la temprana fase de I+D, la asistencia para el desarrollo de
productos y procesos, y finalmente el proceso y control de calidad del
producto.
Rnicr clsica o bi~o~4_ Enzyn Fermlnt ~ R-ADN: Micro-org ~11" Biodeteccin (e)
Biocatlisis~ inmuno-anlisis
R-ADN: Ani
'Dir NA-sondas bio-sensores
Ernbryonal creciente envejecimiento maduros
Fig. 1. Biotechnotogy ciclo de vida. Fuente: Arthur D. Little (ref. [-2]) las
dificultades en la relacin entre el anlisis y la biotecnologa 169
Mdicos Veterinarios de agricultura alimentaria Medio Ambiente Defensa
forense otros qumica analtica x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x La
microbiologa clsica x x x x x x x x x x x x x x x x? X x x x enzimtica x x x
x x x x x ? Inmunologa x x x x x x x ( x ) de ( x ) x x ? Biosensores x x ( x )
( x ) ( x ) las sondas de ADN ( x ) de ( x ) x ?
Fig. 2. Estado actual: Tecnologa versus aplicacin ( x x x fuerte impacto,
impacto moderado, impacto limitado, ( ) primero introducciones de
productos). Fuente: Arthur D. Little (ref. [2])
Qu tiene la disciplina analtica disponible? En los das del clsico- nologa
de biotecnologa de fermentacin y las tcnicas fsico-qumicas comunes
fueron utilizados con una extensin a los mtodos microbiolgicos,
utilizados principalmente para la deteccin de contaminacin y, a veces,
para la determinacin de la actividad. En un tiempo relativamente breve
procedimientos analticos bioqumicos han encontrado su camino en la
biotecnologa y en la actualidad la gama analtica se ha ampliado con
mtodos enzimticos, inmunologa, bio-sensores y sondas de ADN, ms
generalmente llamado: biodetection. El Estado aplica- cin actual se
muestra en la Fig. 2.
Sin embargo, la qumica analtica no slo es rpido en la introduccin de la
nueva bio- mtodos qumicos en su paquete, pero tambin est trabajando
muy duro en aplicaciones de mtodos qumicos fsicos existentes en
biotecnologa con resultados sorprendentes. Uno reconoce que la
biotecnologa moderna no slo es capaz de producir nuevos productos para

su uso en la sociedad, pero tambin capaz de preparar dispositivos


analticos para propsitos de prueba en la disciplina Bioqumica.
iTor externo informacin ms profunda, me gustara llamar su atencin
sobre una serie de simposios dedicados a "mtodos analticos en materia de
biotecnologa", los llamados Anabiotec simposios celebrados en
Noordwijkerhout en los Pases Bajos en 1984 y 1988.
Este simposio internacional ya ha volado sobre el Atlntico y ha sido
celebrada en octubre de 1990 en San Francisco. Noordwijkerhout es el lugar
nuevamente en 1992 [3].
Como una segunda opcin para mencionar es el de seminarios anuales
sobre biotecnologa analtica bajo la presidencia de profesores Karger y
Regnier, dedicados a temas especiales. La reunin de este ao fue dedicado
al seguimiento de la composicin de los productos genticamente
modificados y pureza, especialmente para uso en la industria farmacutica
Industria Farmacutica [4].
Las principales tcnicas analticas en Biotechnoiogy aunque casi todas las
tcnicas analticas fsico-qumicas clsicas se han aplicado en el mbito de
la biotecnologa, las tcnicas principales de hoy son [2, 4]: HPLC,
espectrometra de masas, resonancia magntica nuclear, anlisis por
inyeccin en flujo (FIA), la electro- phoresis, y combinaciones de tcnicas.

170 B. te Nijenhuis como una extensin de un segundo grupo de tcnicas


analticas, llamado biodetection, tiene que ser mencionado. La biotecnologa
ha descubierto y desarrollado nuevos mtodos analticos y herramientas
basadas en la especificidad y selectividad de varios tipos de bio-qumicas
selectores como enzimas, anticuerpos y sondas de ADN. El grupo
biodetection incluye tambin el rea de biosensores. Si estos dispositivos
nunca superar el nivel acadmico sigue siendo cuestionable. Permtanos
tener una opinin sobre cmo y donde algunas de las tcnicas mencionadas
anteriormente son utilizados.
HPLC HPLC es visto como la tcnica de separacin ms potente en el campo
de las ciencias. Un muy amplio suministro de columnas para todos los tipos
de biomolculas est disponible [6]. Separaciones de alta velocidad,
utilizando columnas de partculas pequeas, cortas sern ms comunes.
Combinando con electroforesis HPLC ser realidad en el futuro y las
sensibilidades mejora contribuir incluso invalidar la femto attomole y nivel.
Para el anlisis estructural, las combinaciones de cromatografa lquida (LC)espectrometra de masas (MS) y la electroforesis capilar de zona (CZE)-LCMS parecen ser las tcnicas ms prometedoras del futuro [7]. La
interconexin es bastante simple, mediante el uso de tcnicas como la
ionizacin electrospray, que puede ser utilizado tanto para baja y
compuestos de elevado peso molecular.
Para la monitorizacin teraputica del frmaco en el hospital, por ejemplo,
estudios de eficacia, estabilidad, biotransformacin y eliminacin, etc., el
HPLC es la mejor opcin debido a su relativa buena tolerancia de complejas
matrices biolgicas. A este respecto puede competir con el HPLC tambin
suelen utilizar ensayos ELISA. Productos farmacuticos, supervisados por
HPLC se tabulan por Kulinsky [8] (Fig. 3).
Separaciones quirales son extremadamente importantes porque el hecho de
que, como regla general, slo uno de los enantimeros es fisiolgicamente

activa. Existen varios sistemas: fase estacionaria quiral, modificadores


quiral en la fase mvil o derivatizacin precolumna con agentes quirales [7].
La FDA propone que el tamizaje de toda la farma- ceuticals para actividad
ptica un requisito legal.
Penicilina Verapamilo Levodopa p-cido aminosaliclico cefalosporinas
imipramina codena isoniazida aminoglucsidos Captopril cimetidina
trimetoprima cloramfenicol eritromicina Wafarin Extromethorphan Aciclovir
carbamazepina ciclosporina Carbutamide tetraciclina clorpromazina 6mercaptopurina El econazol clofibrato Benperidol Theophyline cloroquina
dapsona Clonazepam Fig. 3. Productos farmacuticos ensayadas por HPLC.
Fuente:
Kulinsky (ref. I-8]) las dificultades en la relacin entre el anlisis y la
biotecnologa 171
Espectrometra de Masas MS ha demostrado su aplicabilidad, tanto para el
control de la fermentacin y la estructura infor- macin sobre las
biomolculas. Informacin sobre protenas de peso molecular de hasta
alrededor de 25- 50000 dalton puede ser obtenida por medio de plasmadesorcin la espectrometra de masas.
Secuencia de pptidos fragmentacin informativa ha sido reportado como
un efecto conjunto de la industria (Gist-brocados, Pases Bajos) y la
universidad (Leiden) [9]. PDMS podra convertirse as en una alternativa
para un rpido bombardeo tomo MS como herramienta para la
secuenciacin de protenas.
Anlisis por inyeccin en flujo (FIA) Desde su descubrimiento por Ruzicka y
Hansen de la importancia de la FIA como un mtodo para el anlisis de
rutina y control de proceso en lnea es bien reconocida. La FIA es simple,
flexible y permite combinaciones con muchos dispositivos de deteccin. Sin
embargo, control en lnea de bioprocesos provoca problemas, especialmente
con muestreo estril. En general es un problema de control en lnea de
fermentacin y muchos grupos han intentado encontrar soluciones para
este problema de muestreo. Sofisticados sistemas de filtro de membrana,
sistemas basados en dilisis o ultrafiltracin o by-pass se proponen sistemas
[10] y probado en la prctica.
Electroforesis
electroforesis capilar demuestra ser un mtodo de separacin casi perfecta
de los componentes solubles en agua en pequeos volmenes de muestra.
Tres modos de ejecucin se utilizan en la prctica: electroforesis capilar de
zona, gel de electroforesis capilar, y separa- cin de molculas inalteradas
por complejacin y la inclusin de mtodos.
Las aplicaciones incluyen la separacin de protenas y pptidos, trptico de
mapeo, secuenciacin de ADN, suero, etc. anlisis de secuenciacin de ADN
es la cuestin ms candente debido al inters en determinar el genoma
humano [11, 12]. En combinacin con la LC y MS muy potente combinacin
puede ser configurado.
Una tcnica de espectroscopia de infrarrojo cercano no se menciona
normalmente entre importantes tcnicas analticas es la espectroscopia NIR.
Una combinacin de mediciones exactas, expertos disponibles archivos y
tratamiento de los datos chemometric NIR hace una tcnica fiable para un
determina- ciones en conocidas matrices. Sin embargo, un gran defecto es
esa inquietante, matriz de componentes extraos son desastrosas para la
medicin.
El sistema en s es perfectamente adecuado para mediciones en lnea y
equipado con fibra ptica tambin es adecuado para mediciones en lnea.
Sin embargo, los costos de las fibras pticas es un obstculo y tambin

eventual suciedad de las fibras podran causar problemas. Si el mtodo es


adecuado para determinadas situaciones bioqumicas ha de determinarse
caso por caso [13]. De todos modos, una caracterstica interesante para
especiales situaciones bien considerado.
172 B. te Nijenhuis
biosensores
porque todava altas expectativas de esta rea especial en biodetection
algunos comentarios crticos estn en orden. Los biosensores pueden
definirse como dispositivos que convertir eventos biolgicos en seales de
salida electrnica. Una definicin ms prctica es "biosensores son sensores
de medicin" en los sistemas biolgicos, incluyendo as tambin de pH y
electrodos selectivos en el biosensor definiciones. Un montn de los
biosensores son conocidos. Fig. 4 Se da una descripcin general de los
diferentes elementos biolgicos y transductores estn siendo utilizados en
dispositivos biosensores.
Alrededor de 100 ejemplos se han publicado ahora, de los cuales unos 10
son commer- mente disponible. La mayora de las aplicaciones de los
biosensores son de mdicos y de diagnstico clnico con un spin-off de la
biotecnologa y el medio ambiente [15, 17]. Aunque el entusiasmo en el
mundo acadmico es alta y sin menoscabo de las expectativas en el
mercado tambin son an elevados, es dudoso que el avance vendr pronto
[14, 16]. El uso de la biotecnologa se ve muy limitada, no slo por el hecho
de que no se puede esterilizar los biosensores, sino tambin sobre otras
propiedades indeseadas (Fig. 5).
Se necesitan enfoques radicalmente nuevos, por ejemplo, el desarrollo y la
incorporacin de los compuestos biolgicos termoestable.
Como conclusin, se puede afirmar que, debido a las limitaciones
presentadas en el presente biosensores slo pueden ser utilizados en
biotecnologa en los siguientes modos: off-line y discontinuos, on-line tras
un tratamiento de muestreo, en lnea detrs de una membrana.
Elementos biolgicos organismos transductores potenciomtricos tejidos
clulas
orgnulos
Conductometric
amperomtricos
membranas
Impedimetric enzimas enzima calorimtrico componentes pticos
receptores acsticos anticuerpos mecnico "Molecular" electronic cidos
nucleicos molculas orgnicas Fig. 4. Componentes que pueden ser
utilizados para la construccin de un biosensor. Fuente: te Nijenhuis (ref.
[14])
menor estabilidad tiempo de respuesta demasiado largo No apto para
operacin continua reutilizacin incierto el ensuciamiento por obstruccin
de materia particulada recalibracin difcilmente posible sensibilidad para
pH, fuerza inica, la temperatura Fig. 5. Desventajas de los biosensores.
Fuente: te Nijenhuis (ref. 1-14]) las

dificultades en la relacin entre el anlisis y la biotecnologa 173


Aplicacin de tcnicas analticas en biotecnologa Dos reas son elegidos
aqu para demostrar el uso de diversas tcnicas analticas, tanto fsicoqumicas y bioqumicas. Esas reas son: control de proceso en fermentation, monitoreo de contaminantes en control de calidad del producto.
Control del proceso de fermentacin, uno puede esperar que, debido a su
edad, el control de procesos de bioprocesos en el pasado fue un evento
intuitivo y totalmente basado en las habilidades del productor. Cuando se

estableci en el bioprocesamiento de una manera ms industrial prevencin


de la contaminacin y control de crecimiento fueron las principales
cuestiones. Muy lentamente se agregaron nuevos parmetros para el
sistema.
En la dcada de 1970 el profesor Cooney del MIT comenz a trabajar en la
computadora de control de las fermentaciones y desarroll feed back y
alimentar estrategias orientadas hacia el futuro.
En la actualidad el control sobre la base de sistema experto est en fase
experimental.
El objetivo del proceso qumica analtica es suministrar informacin
cuantitativa y cualitativa sobre un proceso [18]. Esta informacin puede
suministrarse de varias maneras:
fuera de lnea, en lnea, en lnea, en lnea, no invasiva.
"La informacin no slo puede utilizarse para realizar un seguimiento y un
control del proceso, sino tambin para propsitos de optimizacin. El
principal cuello de botella para on-line y en proceso de lnea de anlisis es la
continua falta de sensores, especialmente los sensores bioqumicos, para un
buen control del proceso" [18].
En el siguiente estado de cosas con respecto a en lnea y en lnea anlisis
bioprocess es discutido.
La produccin tiene lugar en el fermentador (Fig. 6) que normalmente es un
agitador agitado (salida de aire) nutrientes
/cido corrosivo I antiespumante de
refrigeracin de agua de refrigeracin de aire (admisin)
vapor producto Fig. 6. Fermentor
174 B. te Nijenhuis
reactor con sistemas de alimentacin y diversos instrumentos. Compuestos
nutricionales en solucin o como una papilla se aaden al fermentador, un
inculo de los microorganismos deseados es aadido, toda la masa se
revuelve, aire de suministro de oxgeno pasa a travs de la masa y el
proceso de fermentacin contina. Tras la fermenta- cin de los productos
estn aisladas en un proceso de recuperacin. El producto es la microorganismo (por ejemplo, levadura) o sus metabolitos como enzimas o
antibiticos.
Propiedades tpicas de un proceso de fermentacin son: matrices complejas,
el tiempo de proceso de 1-7 das o ms, el monocultivo, los sistemas
acuosos, variaciones durante el proceso (proceso por lotes). Debido al hecho
de que el objetivo de un proceso de fermentacin para producir
monocultivos incontaminado, altas exigencias necesarias para prevenir la
contamina- cin. Esto no slo es para la adicin de los distintos compuestos
de nutricin, sino tambin para los sistemas de muestreo y anlisis en lnea
de los sistemas que tienen que ser esterilizables en autoclave.
Se recopila informacin para la monitorizacin de procesos, de injerencia en
el proceso manual y/o automtico. Los parmetros se determinan tanto en
fase gas y en fase acuosa.
Parmetros tpicos se encuentran en la fase gaseosa: oxgeno, dixido de
carbono, gases y productos olites metab-; y en la fase acuosa: pH,
temperatura, oxgeno disuelto, dixido de carbono disuelto, los gases
disueltos, nutricin compuestos, la biomasa, la concentracin del producto,
etc.
aunque todava se utilizan mtodos convencionales, medicin en fase gas
es ahora el dominio de la espectrometra de masas en lnea. Precauciones
especiales que deben adoptarse para evitar la entrada de lquidos y

aerosoles entrar en la admisin. Introduccin en las plantas de produccin


industrial ya ha comenzado.
Medicin en la fase acuosa es relativamente difcil. Un enfoque directo a
travs de los sensores es la mejor solucin, y me di cuenta de pH, de la
temperatura, pero la aplicacin de los biosensores an es cuestionable y de
escasa importancia. Investigadores como Schiigerl Mattiasson y trabajar
muy duro para hacer un xito de los biosensores en bio- procesos [2, 10, 17,
19, 20].
Debido al riesgo de contaminacin, ya ha sido mencionado, dispositivos de
muestreo tiene que ser instalado en el fermentador. Posteriormente
cualquiera de los sensores pueden ser utilizados para la medicin directa o
analticas arreglos tienen que ser instalados para una rpida determinacin
de los parmetros que quera. Las mejores tcnicas o las mediciones en los
filtrados de hoy son HPLC y FIA, junto con dispositivos de deteccin de
espectrometra de masas, mientras que tambin puede desempear su
papel. Un plan sencillo para este tipo de sistemas analticos de control de
fermentacin se muestran en la Fig. 7. Se menciona tambin un interesante
enfoque NIR para ulterior consideracin. Medicin de la biomasa y determinnacin del tpico "vida" componentes como ATP, NADH, ADN, ARN, etc., son
hasta ahora reservados a la situacin de laboratorio.
Monitoreo de contaminantes "monitoreo de contaminantes es un pequeo
pero dinmico segmento de biotecnologa que crecer rpidamente en
importancia como la conciencia pblica y la preocupacin por la
contaminacin de los alimentos, el aire, el suelo y el agua aumenta" [4].
Los mtodos convencionales incluyen la cromatografa y espectrometra de
masas, pero inmuno Diagnostics es un rea de rpido crecimiento. Aqu, se
dedica especial atencin a otra zona de vigilancia de contaminantes:
aspectos de pureza modificadas genticamente
desafos en la relacin entre el anlisis y la biotecnologa 175
II FERMENTADOR l[
I
F ............ ............ 1 F ........ ~-----l F ...... .......... l I GAS P~SE YO AQ~OU
P~SE I L ........ T__3 L ..... T ......... U
I
F- V~pagars ~- SENSORES I I I I I ~- (NIR)
I I L_ MS I ] EL SISTEMA DE MUESTREO I
L ..... T ........... ]
I ~- SENSORES I
I ~-~LC+detectores
i
~- FIA+DETECTORES
Fig. 7. Los sistemas analticos de fer- I L_ MS cacin de
productos de control de composiciones y las pruebas en ausencia de todo
tipo de compuestos relacionados con el sistema de produccin: decir,
contaminantes de los cultivos celulares utilizados y el proceso de produccin. Restos de ADN, protenas, polisacridos, esp. toxinas subdividido en las
endotoxinas y micotoxinas son considerados en este sentido [22]. Esta zona
no solamente es de importancia analtica, sino tambin altamente
influenciada polticamente. La CE est muy activa en este campo y la
Organizacin Europea para el Control de Calidad en la industria
farmacutica y cosmtica est tratando de influir en la configuracin de las
reglas de tal manera que los lmites estn en consonancia con criterios
razonables y viabilidad analtica.

Aqu, una vez ms, los lmites de la qumica analtica hoy se acercaron y
inmensos esfuerzos se han hecho para ser capaces de detectar el susodicho
compuestos en el nivel deseado. Puede preverse que los mtodos
convencionales no son lo suficientemente buenas para los objetivos fijados.
Probablemente HPLC-MS y CZE-MS puede alcanzar los niveles bajos solicit,
junto a mtodos biodetection.
Para ADN residual disponible comercialmente se estn probando sistemas
muy seriamente. Los niveles de dos picogramos parecen ser alcanzables
que est cercana a las exigencias actuales de la FDA. Para protena residual
pyrochemoluminiscence se dice que es una buena tcnica. La mayora
simple, por supuesto, es una determinacin en lo que se supone que es una
preparacin de nitrgeno-libre, pero surgen problemas cuando ese no es el
caso. Por endotoxinas la prueba microlumilus es una buena alternativa tanto
para las micotoxinas los inmunoensayos son recomendadas junto a
determinaciones GC-MS.
No explcitamente tocado en esta contribucin es la importancia de la
calidad y, por consiguiente, de la validacin de mtodos, pero se supone
que la situacin de extrema importancia para la investigacin y la
produccin es generalmente reconocida.
Conclusin
El objetivo final de la industria y la investigacin previa es producir
productos seguros y eficaces que estn adecuadamente controladas
durante el proceso de produccin. Para lograr
176 Desafos en la relacin entre el anlisis y la biotecnologa
esta meta, la utilidad de un bien desarrollado en qumica analtica se
destac la biotecnologa e, implcitamente, a los grandes problemas que an
deben ser tratados para su ulterior desarrollo fueron mencionados.
Nota
Biofine qumicos TM es una marca registrada de International B.V. BioSynthetics los productos implicados son intermediarios de especialidad con
al menos un paso de transformacin biocatalytic durante la sntesis.
Agradecimientos. El autor agradece a los Drs. J. G. A. M. Raaijmakers (Gistbrocados N.V.) por su excelente asistencia en la preparacin de esta
conferencia.