2.

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE PEROXIDASA Y DE SU

REGENERACIN.

a) La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidacin de ciertos compuestos dadores de

hidrgeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromticas (o-fenilendiamina) por medio de
perxidos (
). El substrato oxidable ms usado es el guayacol, que es oxidado a un complejo
coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa:

La velocidad de formacin del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad
enzimtica por lecturas espectrofotomtricas de las absorbancias en relacin con el tiempo.
La peroxidasa presenta como grupo prosttico un grupo Hem, cuyo tomo central de hierro forma
complejos con diferentes compuestos, como los cianuros y la hidroxilamina, inhibindose su
actividad enzimtica.
La actividad enzimtica depende del vegetal (los rbanos picantes son especialmente activos), del
substrato oxidable que se emplea como reactivo y del pH y temperatura a que se trabaja.
Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las
que precisa mayor temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad
peculiar de laregeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del
calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado,
aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo parcial, con
prdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, producindose luego
una reversin de la protena a su estado normal por recombinacin de sus grupos hidrgenos o
sulfhidrlicos.
Este efecto del calor sobre la actividad peroxidsica es muy, importante en la industria de alimentos
y la regeneracin enzimtica de la peroxidasa puede causar serios problemas en los caracteres
organolpticos. Se ha demostrado en el laboratorio que esta actividad enzimtica puede detenerse

totalmente, si el calentamiento es suficientemente largo, de manera que sobre 30" la regeneracin

es muy dbil generalmente.
La investigacin de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del escaldado o
blanqueo de verduras y tambin en el control de pasteurizacin de la leche. As, a la temperatura
de pasteurizacin, la lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es
sobrecalentada (ms de 80-85C) la peroxidasa pierde su actividad en forma definitiva.
b) Procedimiento: Colocar 0,1 ml de guayacol liquido junto con 0,2 ml de
al 0,9% y 4,7 ml de
agua en un tubo de ensayo (a). Dentro de un tubo del espectrofotmetro colocar 1 ml de jugo de
expresin de nabo, filtrado y diluido (1 + 199) y 4 ml de agua (b). Agregar la mezcla de guayacol y
agua oxigenada (a) al tubo del espectrofotmetro y tomar el tiempo con cronmetro. Vaciar
rpidamente la mezcla al tubo vaco y luego nuevamente al tubo del espectrofotmetro. Colocar el
tubo en el espectrofotmetro, previamente estandarizado con agua a 470 nm. Anotar las lecturas
de absorbancia a 470 nm cada 20 segundos hasta obtener 4 5 puntos. Graficar las lecturas de
absorbancia contra los tiempos para obtener as la graduacin de la reaccin.
c) Regeneracin: Colocar alrededor de 4 ml del jugo diluido (1 + 199) en tres diferentes tubos de
ensayo. Colocarlos en un bao hirviente (o calentado al vapor) y sacar el primer tubo despus, de
30 segundos, el 20 despus de 1 minuto y el 39 despus de 2 minutos. Enfriarlos rpidamente en
un bao de agua y determinar de inmediato la actividad peroxidsica, como Se ha descrito
anteriormente. Despus de 1 hora repetir la determinacin de la actividad en los tres tubos
calentados.
2.1. DETERMINACIN DE PEROXIDASA EN VEGETALES (59, 60, 61, 62).
Fundamento del mtodo:
El mtodo se basa en la oxidacin del guayacol (incoloro) a tetraguayacol (rojo ladrillo). El
substrato es el guayacol-perxido de hidrgeno y la reaccin es catalizada por la enzima
peroxidasa.
Obtencin del extracto crudo (de arvejas, porotitos verdes)
Se homogeneiza la muestra (60 a 150 g) en un omni-mixer a velocidad mxima por espacio de 3
minutos, manteniendo la temperatura a 0C en bao de hielo. El extracto se obtiene en tampn
de citrato 0,6 M a pH 4,5 (3 ml por g de tejido) y ms o menos 1 g de carbonato de calcio.
La centrifugacin se hace en una centrfuga tipo Sorvall a 0C y a velocidad de 12.000 rpm
durante 10 minutos. Algunos autores saturan la muestra con , usando un tubo de vidrio corriente.
Se filtra el extracto a travs de algodn, descartando los primeros 10 a 20 ml del filtrado.
Reactivos:
a) Nitrgeno (de cilindro).
b) Citrato tampn (pH 4,5) preparado de la siguiente forma:
-Disolver 126 g de cido ctrico en ms o menos 800 ml de agua dest.
-Agregar suficiente sol. de NaOH para llevar el pH a 4,5 (solucin 7,5 N de NaOH). Enrasar a 1.000
ml; la concentracin del citrato es de 0,6 M.

-Agregar unos ml de tolueno como preservativo, agitar y usarlo diluido con parte igual de agua
dest. Guardar en refrigerador para retardar el desarrollo de hongos.
c) Solucin de guayacol 0,5% en alcohol de 50%.
d) Agua oxigenada al 0,085% 0,05 N (diluir a un litro con agua dest., 2,83 ml de agua oxigenada
de 30%). Guardar en refrigerador, preferiblemente en frasco obscuro, y renovarla semanal o
mensualmente, dependiendo de la frecuencia de su uso.
Procedimiento:
En un tubo de ensayo que contiene 20 ml de agua dest., agregar 2 ml del extracto enzimtico.
Agregar 1 ml del reactivo de guayacol, dejndolo escurrir por las paredes del tubo, para formar una
capa intermedia.
Se agrega 1 ml de la sol. de agua oxigenada al 0,085%, del mismo modo que el reactivo anterior.
Se tapa el tubo, se invierte rpidamente 2 3 veces para mezclar bien y se coloca en la forma ms
rpida en el tubo del colormetro Klett-Summerson, leyendo a 420 nm. Previamente el aparato
debe ajustarse a 0 con agua dest. a la misma longitud de onda. La medicin peridica de la
intensidad de color desarrollado se hace por triplicado.
La reaccin es lineal en el tiempo hasta los 15 min., considerndose el mejor tiempo los 5 minutos.
La actividad de peroxidasa se expresa como unidades KLETT/mg de protena por 5 minutos de
reaccin.
Determinacin de protena:
Si se trata de extracto opaco, se recomienda la determinacin por el mtodo turbidimtrico (70).
Pueden aplicarse tambin otros mtodos de valoracin de protenas.
La enzima ms usada para evaluar el grado de escaldado es la peroxidasa. Las principales
razones para este uso son las siguientes:
-su presencia en cantidad considerable en prcticamente todos los alimentos que requieren del
proceso de escaldado;
-su estabilidad al calor;
-su actividad puede ser fcilmente evaluada tambin por mtodos simples y rpidos, como su
extraccin semicuantitativa que es una simplificacin del mtodo cuantitativo anteriormente
sealado, en que se detecta visualmente el color a los 3,5 minutos de reaccin. Para ello se miden:
1 ml de sol. de guayacol;
1 ml de sol. de agua oxigenada;
0,1 ml de extracto enzimtico, y
21,9 ml de agua.
Se incuba a 25C y se va observando el desarrollo o no de color rojo, medible a 460 nm (61, 62).
2.2. En forma semejante se procede a la determinacin de la LACTOPEROXIDASA para el control
de la pasteurizacin, sobrecalentamiento o esterilizacin de leche: a 3 ml de leche se agregan 3 ml

de solucin de guayacol al 1 %, en alcohol de 50% y 3 gotas de agua oxigenada. Dentro de 5

minutos se produce color rojo o salmn en leche cruda o pasteurizada a baja temperatura, siendo
su lmite trmico de 75 a 82C.
2.3. DETERMINACIN DE PEROXIDASA EN ALIMENTOS QUE LA CONTIENEN EN
PEQUEAS CANTIDADES (por ejemplo, en maz dulce) (75).
Fundamento:
Este mtodo de valoracin de la enzima peroxidasa se basa en medir el color desarrollado al
reaccionar la enzima sobre la o-fenilendiamina, en presencia de perxido de hidrgeno, leyndose
la absorbancia a 430 nm.
Reactivos:
a) Solucin tampn de pH 6,5 (fosfato-citrato).
Se prepara mezclando 14,2 partes de fosfato disdico 0,2 M y 5,8 partes de cido ctrico 0,1 M.
b) Orto-fenilendiamina al 1 % (en alcohol al 95%; se debe preparar fresca cada 4 horas).
c) Agua oxigenada al 0,3%.
d) Solucin saturada de bisulfito de sodio.
Procedimiento:
Se pesan aproximadamente 4 g de material fresco y se lleva a 250 ml con tampn fosfato-citrato
(a) de pH 6,5 y se somete a homogeneizacin en mezcladora elctrica por 3 minutos; 10 ml de este
extracto se llevan a 250 ml con el mismo tampn.
Una alcuota de 25 ml de la muestra homogeneizada y diluida se transfiere a una botella centrfuga
de 250 ml. Por otra parte, 25 ml de alcuota de cada muestra se usan para preparar los blancos.
Debe mezclarse bien antes de tomar las alcuotas, pues parte de la enzima se localiza en las
partculas slidas que tienden a sedimentar. Las muestras se mantienen en bao a t constante
de 25C por 30 min.
A continuacin, a la muestra problema se le agrega 1 ml de solucin de o-fenilendiamina al 1 % y 1
ml de
al 0,3%, dejndose la mezcla reaccionar por 5 minutos. A este tiempo debe detenerse
la reaccin agregando 2 ml de la solucin saturada de bisulfito de sodio.
A los blancos se les agrega la fenilendiamina, luego el bisulfito y, por ltimo, el agua oxigenada. La
enzima es inhibida por el bisulfito de modo que ella est inactivada cuando se agrega el perxido
de hidrgeno.
Cuando se trata de productos ricos en almidn, es aconsejable precipitarlo, agregando para ello 25
ml de alcohol de 95%; se agita mientras se agrega el alcohol para lograr una buena floculacin.
Las muestras se centrifugan a 3.000 rpm por 5 minutos. El supernadante se presenta como una
solucin clara y se transfiere a un tubo del colormetro.
Se lee la absorbancia a 430 nm. El colormetro se lleva a 100% de transmitancia con el
correspondiente blanco de cada muestra.

Si se pesan 4 g de material fresco y se obtiene una lectura de 0,5, el resultado se calcula de

acuerdo a la siguiente frmula:

Cuando se toman cantidades mayores y se hacen diluciones menores, los valores de U/g se
pueden calcular de la misma manera.
2.4. DETERMINACIN DE PEROXIDASA EN VEGETALES CONGELADOS (68).
Reactivos estables:
a) Solucin tampn de fosfato-oxalato 0,1 M, pH 6,0: Disolver 14,2 g de

(o 26,81 g

de
+7
) y 12,6 g de
+2
en agua y calentar; enfriar, ajustar el pH a 6,0
con hidrxido de sodio 1 N y diluir a 1 litro.
b) Solucin de cido oxlico 1 M: Disolver 126 g de cido oxlico en agua y diluir a 1 litro.
c) Solucin de cloruro de sodio al 2%: Disolver 20 g de NaCl en agua y diluir a 1 litro. Enfriar a
0C y mantenerlo a esa temperatura.
Reactivos relativamente inestables:
d) Solucin de agua oxigenada 0,1 N: Diluir 0,58 ml de agua oxigenada al 30% a 100 ml con agua.
Estandarizarla yodomtricamente como sigue: a 25 ml de agua oxigenada 0,1 N agregar 10 ml de
cido sulfrico 4 N, 6 ml de KI 1 N y 3 gotas de molibdato de amonio 1 N. Titular con solucin de
tiosulfato de sodio 0,1 N, usando almidn como indicador. Esta solucin debe mantenerse en
refrigeracin cuando no se use. Debe prepararse semanalmente.
e) Solucin de indo-fenol 0,001 N: Disolver 200 mg de 2,6-diclorofenol-indofenol o 175 mg de su
sal sdica, en agua y diluir a 1 litro. Estandarizarla contra tiosulfato de sodio 0,01 N titulando el
yodo liberado con 50 ml del colorante despus de adicionar 10 ml de KI 1 N y 10 m1 de H 2SO4 4 N.
Mantener en refrigeracin y prepararla cada semana.
f) Solucin de cido ascrbico 0,05 M: Disolver 880 mg de 1-cido ascrbico en tampn (a) 0,1 M y
diluir a 100 ml. Prepararla fresca todos los das.
Preparacin del extracto enzimtico:
Homogeneizar 50 g de material fresco o congelado en una mezcladora a alta velocidad con 200 ml
de la solucin de cloruro de sodio al 2%, fra. Eliminar las partculas mayores, por filtracin, a
travs de gasa. Usar esta solucin dentro de 30 minutos.
Procedimiento:
En un vaso de 400 ml colocar: 75 ml de tampn (a), 50 ml del colorante (e), 5 ml de cido
ascrbico (f) y suficiente cantidad de agua (para alcanzar un total de 250 ml despus de adicionar

el extracto en ensayo y agua oxigenada). Calentar a una temperatura de ms o menos 25C o

enfriar en caso de bajarla a la misma temperatura.
Colocar el vaso en un agitador magntico y agitar por 30 segundos, a una velocidad tal de impedir
la penetracin de aire. Agregar a continuacin 1-3 ml del extracto enzimtico problema (equivalente
a 0,2-0,4 g de tejido) y rpidamente agregar 5 ml de
. Poner en funcin el cronmetro
inmediatamente despus de agregar el agua oxigenada. Continuar mezclando a medida que se
agrega el agua oxigenada y hasta que se retire la primera alicuota.
Dentro de los 15-30 segundos despus de agregar el agua oxigenada, medir 25 ml de la mezcla
reaccionante con una pipeta de flujo rpido de tal manera de poder expulsar el contenido en 5
segundos y hacerlos caer en 5 m1 de la solucin de cido oxlico (b) colocados en un Erlenmeyer
de 125 ml. Tomar 4-5 muestras consecutivas a 1 minuto de intervalo y vaciar en otros matraces de
125 ml que contiene cada uno 5 ml de cido oxlico (b).
Registrar el tiempo de reaccin que corresponde al tiempo que deplore en vaciarse la pipeta.
Titular el cido ascrbico residual con la solucin de indo-fenol y calcular la reaccin de primer
orden. Ajustar la actividad enzimtica de modo que la constante sea de la magnitud de 5-20 x
y expresar la actividad de peroxidasa Kf como

de tejido usado.

Los puntos finales deben ser rosados claramente visibles y permanecer por espacio de 1 minuto.
Todas las titulaciones deben asemejarse a la primera en su limite. Agregar el indo-fenol en forma
rpida al comienzo y posteriormente en forma ms lenta.

ta y tb son tiempos iniciales y finales de dos titulaciones bajo las condiciones estipuladas.
Bajo condiciones ptimas el valor de la titulacin inicial es de 35-40 ml de colorante y los valores
disminuyen a 20-25 m1 en 5 minutos.
Este es el mtodo de clculo que se aplica en la determinacin de catalasa, pero tambin puede
tomarse la recta (slope of plot) del logaritmo de los ml de colorante versus tiempo. Dividir el
promedio del valor de para los diversos intervalos de tiempo (0-1, 1-2, 2-3 minutos) por el peso
del tejido vegetal, correspondiendo al vol. de extracto en la mezcla de reaccin.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA EN

PLANTAS: Ensayo de la actividad de la Glutamina Sintetasa (GS) del
girasol

La actividad enzimtica es el motor molecular sobre el

que se asienta todo el funcionamiento de la planta,
luego si queremos realizar un estudio sobre la fisiologa
vegetal una buena aproximacin es llevar a cabo el
Prcticas
estudio de la actividad enzimtica.
de

Botnica

Laborato
rio

Una de las enzimas ms importantes dentro de la planta

es la Glutamina Sintetasa, ya que es fundamental en la
Ecologa
incorporacin del nitrgeno (adems de cumplir otras
Fisiolog
a Vegetal muchas funciones importantes). La reaccin que lleva a
cabo es:

Galeria
de
imgene
s

Pgina
principal
Nuestra prctica consiste en demostrar si es necesario
aadir dos compuestos cuya funcin ya se mencionar
ms adelante o si por el contrario con uno slo basta.
Estos compuestos son el beta-mercaptoetanol y la
polivinilpolipirrolidona (PVPP).

El primer paso a realizar sera preparar el extracto

enzimtico a partir del tejido, que en nuestro caso son
hojas de girasol. Es necesario conseguir un extracto
porque las enzimas se encuentran en los
compartimentos celulares y para liberarlos hay que
romper las clulas. Pero cuando los tenemos aislados es
necesario estabilizarlos pues de lo contrario perderan
su integridad. Con este fin preparamos un tampn de
extraccin, que entre otras cosas lleva una sustancia:
- Sustancia tamponadora de pH
- Leupeptina: previene la accin de las proteasas

liberadas
- beta-mercaptoetanol: inhibe la difenol oxidasa
- Polivinilpolipirrolidona: adsorbe los compuestos
fenlicos
Estos dos ltimos compuestos son muy importantes, ya
que al destruir las clulas se libera la difenol oxidasa,
que convierte los abundantes compuestos fenlicos en
o-quinonas, muy oxidantes, responsables de inactivacin
enzimtica.
- Finalmente el compuesto tambin lleva agua destilada

Como vamos a hacer dos ensayos preparamos dos

tampones, uno con todo lo mencionado y otro con todo
excepto con beta-mercaptoetanol. A continuacin
preparamos hojas de girasol, las pesamos, las
trituramos usando nitrgeno lquido y aadimos el polvo
obtenido a los tubos con el tampn. Se mantiene en
hielo. Es necesario adems centrifugar para eliminar los
restos celulares y exceso de polivinilpolipirrolidona. Del
sobrenadante obtenido tomamos 1,5 ml que
transferimos a tubos eppendorf. Ya tenemos preparado
nuestro extracto enzimtico.

Para medir la actividad de dicho extracto nos basamos

en la velocidad de reaccin del mismo (es decir,
medimos la cantidad de sustrato desaparecido o
cantidad de producto formado) en unas condiciones
tales que:
- Sustratos a condiciones fijas y saturantes
- Temperatura y pH constantes
- Presencia de iones y cofactores

Y adems hay que tener muy en cuenta que el ensayo

sea lineal con respecto al tiempo de reaccin y a la

cantidad de extracto ensayado.
Pero ahora nos encontramos un nuevo problema, y es
que no podemos detectar fcilmente la actividad de la
Glutamina Sintetasa. Por ello, en lugar de medir el
amonio o el Glutamato medimos la capacidad que posee
la Glutamina Sintetasa de forma gammaGlutamilhidroxamato:

Esta capacidad de medir el gamma-Glutamilhidroxamato

se conoce como ensayo de la actividad transferasa de la
Glutamina Sintetasa.

As pues, preparamos cuatro tubos, dos para cada

ensayo. Uno servir como control (y tendr ms
cantidad de agua destilada) y el otro ser el ensayo
propiamente dicho. Nada ms iniciar la reaccin en las
dos muestras se incuba durante 5 minutos a 35 C.
Pasado este tiempo aadimos Mezcla Reveladora y
dejamos durante otros 5 minutos, pero ahora a
temperatura ambiente. La finalidad de la Mezcla
Reveladora es que sus iones Fe3+ reaccionen con el ?Glutamilhidroxamato en medio cido formando un
complejo coloreado cuya concentracin podr ser
cuantificada mediante absorbancia a 500 nm.

Ajustamos en un principio el espectrofotmetro a cero

con el tubo control y a continuacin mediamos los
ensayos. Los valores obtenidos son:
- Tubo con beta-mercaptoetanol: 0,304
- Tubo sin beta-mercaptoetanol: 0,632

Luego mediante estos datos, y observando a simple

vista el color de los tubos podemos afirmar que el
ensayo sin beta-mercaptoetanol es muy parecido a los
controles, en los cuales no hay reaccin, luego el betamercaptoetanol es necesario para que la enzima
funcione. Y por otro lado, la polivinilpolipirrolidona est
de ms, ya que en el tubo donde no aadimos betamercaptoetanol sale lo mismo que en el control y sola no
sirve para nada (otra cosa a estudiar sera el efecto
conjunto con el beta-mercaptoetanol).

Para finalizar pasemos a calcular la actividad de la

enzima en unidades de actividad. La unidad utilizada es
el katal (k) que podra definirse como la cantidad
enzimtica que lleva a cabo la transformacin de 1 mol
de sustrato en producto en 1 segundo. Luego en
realidad sera una medida de la velocidad. Sin embargo,
esta medida es muy grande y se suelen usar
submltiplos, como el nkatal, que sera la cantidad
enzimtica que lleva a cabo la transformacin de 1 nmol
de sustrato en producto en 1 segundo.

Lo que pretendemos calcular es la actividad por gramo

de peso fresco de material extrado, lo que se conoce
como actividad especfica. El peso se nuestras hojas es
de 2,03 g y 1,96 g para el caso de beta-mercaptoetanol
y sin beta-mercaptoetanol respectivamente.

Antes de nada hay que decir que es necesario conocer

el factor de calibracin que relaciona la absorbancia
con la concentracin. Para ello realizamos una recta de
calibrado en las condiciones particulares del ensayo de
actividad de la Glutamina Sintetasa. En nuestro caso el
valor es F = 2,86

La frmula a utilizar es la siguiente:

Teniendo en cuenta que el volumen del extracto es de

10 ml y el volumen ensayado es 0,1 ml, sustituyendo
obtenemos:
- Ensayo con beta-mercaptoetanol: 1,423 x 10-4 nK/g
peso fresco
- Ensayo sin beta-mercaptoetanol: 2,968 x 10 -4 nK/g
peso fresco