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EL MICROSCOPIO COMPUESTO.

4.1.-Breve resea histrica


Los orgenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la
ciudad de Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas relacionadas
con el mundo del espectculo inventaron tanto el microscopio compuesto
como el telescopio. Hans Janssen y su hijo Zacharias, fabricantes de
anteojos, se mencionan como posibles inventores. Sin embargo, algunos
atribuyen a Galileo Galilei su invencin en la primera mitad del siglo XVII,
gracias a que l difundi el microscopio y su uso. El microscopio compuesto
original consista en dos o ms lentes colocadas en un tubo rgido (17).
Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia, A. van
Leeuwenhoek, de Holanda; Hooke y N. Grew, de Inglaterra. Leeuwenhoek
fabric un microscopio simple (17) (fig. 4-1) y Hooke utiliz un microscopio
compuesto. Los instrumentos empleados por Leeuwenhoek eran superiores
a aquellos utilizados por Hooke, en parte debido a que se desconoca el
efecto de las aberraciones de las lentes y como corregirlas. El microscopio
compuesto de Hooke sumaba los defectos de los dos juegos de lentes
(objetivo y ocular), dificultando la observacin, de manera que en la historia
de la microscopa fue Leeuwenhoek quien realiz la mayor cantidad de
descubrimientos con su microscopio simple.
Sin embargo, el microscopio compuesto sera el instrumento con ms futuro.
El instrumento de Hooke del ao 1665 tena las partes bsicas, dos lentes
(una que aumentaba la imagen de la otra), una estructura mecnica,
mecanismos de enfoque y un frasco esfrico para concentrar la luz (fig. 42). Mejoras considerables se han realizado desde entonces.
Aunque algunos fabricantes como Culpeper y Cuff crearon microscopios
apropiados y mejorados por modelos con bases en trpode y la conocida
base en herradura; no obstante, el verdadero microscopio til apareci con
la invencin de las lentes acromticas, desarrolladas en Inglaterra por
Chester Moore Hall en 1729. El desarrollo de los instrumentos de ptica es
inseparable del de la industria del vidrio y la fabricacin de las lentes (61).
Sin embargo, an era difcil fabricar lentes acromticas poderosas y a
finales del siglo XVIII Jan y Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron la
comercializacin de objetivos acromticos. Las lentes con mayores
aperturas numricas fueron realizadas alrededor de 1890. Un fabricante
famoso de microscopios de calidad superior era la firma de Powell y de
Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder, apocromticos y de
inmersin con una apertura numrica de 1,50.
Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realiz objetivos de
inmersin diseados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teora ptica
de las lentes del microscopio y desarroll el diseo de las mismas basado en
un procedimiento matemtico riguroso (62). A finales del siglo XIX los

microscopios de campo claro fueron modificados para obtener campo


oscuro y polarizacin, detalles que permitieron incrementar el contraste.
A principios del siglo XX la fabricacin de microscopios se concentr en
Alemania y en los aos sucesivos se desarroll la fluorescencia, contraste de
fase, interferencia, holografa, luz ultravioleta, rayos X, mtodos con
electrones y protones, microscopios computarizados para la observacin,
cuantificacin y anlisis tridimensional. Estos instrumentos abrieron muchas
posibilidades en el campo de la microscopa.
Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas
necesidades, haciendo microscopios ms efectivos, de uso universal,
capaces de utilizar el tipo de radiacin (luz visible o no) que revele de la
mejor manera posible la naturaleza del espcimen y convierta detalles
invisibles de la imagen en un patrn visible que pueda ser analizado.

Figura 4-1.-Microscopio de Leeuwenhoek. La lente est instalada entre dos


placas de bronce. Lo que se quiere observar se coloca en la punta de un
tornillo, de manera que se puede regular en forma precisa la distancia entre
el objeto y la lente; el observador tiene que acercar el ojo al instrumento y
mirar a travs de la lente.

Figura 4-2.-Microscopio utilizado por Hooke.

4.2.-Partes del microscopio compuesto moderno


El microscopio compuesto de uso comn tambin se conoce con el nombre
microscopio ptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de
lentes pticas.
Es un microscopio ptico que tiene ms de una lente de objetivo. Se utilizan
especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en lminas
tan finas que se transparentan. Adems se emplea para aumentar o ampliar
las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El
microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:
Est constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados de
tal manera que garantizan un funcionamiento ptimo y ergonmico (19)
(ver fig. 4-3):
Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y
dems elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina,
revolver, tubo).
Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y
resolucin (objetivos y ocular)
Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz
visible o no) y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la
cantidad de rayos que van a incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de
iluminacin, espejo, condensador y diafragma).

Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del


instrumento (cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para
dibujar, entre otros).

Figura 4-3.-Microscopio compuesto moderno con sus partes.

Parte mecnica del microscopio


La parte mecnica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revlver, el
asa, la platina, el carro y el tornillo micromtrico. Estos elementos sostienen
la parte ptica y de iluminacin; adems, permiten los desplazamientos
necesarios para el enfoque del objeto.
El pie y soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y
tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular.
La columna o brazo: llamada tambin asa, es una pieza en forma de C,
unida a la base por su parte inferior mediante una charnela, permitiendo la
inclinacin del tubo para mejorar la captacin de luz cuando se utilizan los
espejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se
adapta al pie.
El tubo: tiene forma cilndrica y est ennegrecido internamente para evitar
los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los oculares y en
el extremo inferior el revlver de objetivos. El tubo se encuentra unido a la
parte superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las
cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.

El tornillo macromtrico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo


del microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a un mecanismo
de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rpido de la
preparacin.
El tornillo micromtrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi
imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el
enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva acoplado un tambor
graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus
movimientos y puede medir el espesor de los objetos.
La platina: es una pieza metlica plana en la que se coloca la preparacin u
objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo,
que permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin. La platina
puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede ser
giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir
movimientos circulares.
Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar la preparacin.
Se encuentran en la platina.
Carro mvil: es un dispositivo que consta de dos tornillos y est colocado
sobre la platina, que permite deslizar la preparacin con movimiento
ortogonal de adelante hacia atrs y de derecha a izquierda.
El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se
enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos pasan por el eje del
tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se nota por el ruido de un
pin que lo fija.
Sistema ptico del microscopio
Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes
aumentadas y ntidas de los especmenes que se observan. Los
componentes pticos estn colocados en una base estable que permite un
intercambio rpido y un alineamiento preciso. El sistema ptico est
constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.
4.4.1.-Los objetivos
Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su
principal funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y
proyectar una imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del
microscopio.
Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales
deben estar centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir
exactamente para formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn hechas
a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de
calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento,

resolucin y de la correccin de las aberraciones. Muchos fabricantes


elaboran objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en
microscopios de otras marcas comerciales.
Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos
categoras de objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y los
objetivos apocromticos. En cada categora se distinguen an dos grupos,
los objetivos secos y los objetivos de inmersin (64, 65, 66):
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y
roja. Correccin de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con
filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografa blanco y negro.
Se asume que un objetivo es acromtico cuando no posee ninguna
denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita.
Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin
de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados
con luz blanca y estn mejor diseados para la microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de
aberraciones y por ello, son ms costosos. Presentan correccin cromtica
para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); correccin de
esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para
microfotografa y video a color. Debido a su alto grado de correccin, estos
objetivos poseen mayores aperturas numricas que los acromticos y las
fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de
observacin se presenta un poco curvo.
Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se
manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se
denominan plan-acromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersin:
Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto
entre el cubre-objeto de la lmina histolgica y la lente frontal del objetivo.
En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo ndice de
refraccin (n=1) es muy diferente del ndice del vidrio porta y cubre-objeto
(n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersin el
medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un
lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms prximo al del vidrio. Este lquido
puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite de cedro, que posee
un ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o
eliminacin de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el
objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada,

mientras que en los objetivos secos, est disminuida. El empleo de la


inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y permite mayor
resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos
refractados (11, 64) (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de
mayor aumento.
ptica finita y ptica infinita:
La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en sus
sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver
por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una
determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que
funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a
160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de
microscopios modernos el tubo no es rectilneo y los rayos de luz
transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas,
especialmente en los microscopios trinoculares para fotografa. Emplear
objetivos diseados para una determinada longitud de tubo en otro
microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones de
esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente.
Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes,
espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y
actualmente casi todos los fabricantes estn elaborando microscopios que
puedan aceptar objetivos diseados para realizar una correccin infinita.
Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra
lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal
del ocular. Los objetivos con esta correccin poseen el smbolo infinito
grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al infinito son
significativos porque corrigen la aparicin de imgenes fantasma que con
frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante estos nuevos
modelos son de mayor tamao (66) (fig. 4-4).

Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin


al infinito.
Estructura de los objetivos:
Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un
revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y
alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee grabadas las especificaciones
y caractersticas.

Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromtico que contiene una


lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromtico o fluorita,
con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromtico que contiene un
triplete, dos pares, un menisco y una lente esfrica frontal.
Nomenclatura de los objetivos:
La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es posible
gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las
especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa
informacin, generalmente en el idioma ingls, puede contener (fig. 4-6):
Nombre del fabricante: Casa comercial
Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar
(semi- apocromticos); Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura
de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N,
NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y
muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante.
Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono
luminoso.

Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente
en milmetros (160, 170, 220) o con el smbolo (8) para objetivos con
correccin infinita.
Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero
hay diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos
poseen un collar de correccin en las lentes internas para realizar la
correccin y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala
graduada mvil para el ajuste.
Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del
objetivo, expresada en milmetros.
Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas
condiciones tienen resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de
fase, entre otros).
Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de
acuerdo a la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad
universal y se designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos
fabricantes tiene sus propias dimensiones. El dimetro general es de 20mm,
pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca ms amplia y slo funcionan
en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm
respectivamente.
Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de
inmersin y para ello se emplea un cdigo de colores o las abreviaciones
Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y
Gly (glicerol).
Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de
colores para facilitar la identificacin del aumento (ver tabla 4-1).

Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas especiales


en este objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de
contraste diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa
que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage).

Cdigo de color de inmersin


Negro
Naranja
Blanco
Rojo

Medio de inmersin
Aceite
Glicerol
Agua
Especial o multiuso

Cdigo de color de aumento


Negro
Marrn
Rojo
Amarillo
Verde
Azul turquesa
Azul celeste
Azul Cobalto
Blanco, crema

Aumento
1x, 2.5x
2x, 2.5x
4x, 5x
10x
16x, 20x
25x, 32x
40x, 50x
60x, 63x
100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos.


4.4.2.-El ocular
El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que
generalmente son separadas por un diafragma, montadas en las
extremidades de un cilindro que va introducido en la parte superior del tubo.
El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el
objetivo, ejerciendo dos funciones:

Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con


respecto a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto.
Posteriormente el ojo endereza la imagen.
Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el
objeto.
La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento
de la imagen real del objetivo; la lente inferior tambin se denomina
colectora y es la que aplana y aclara el campo (fig. 4-7).
Clasificacin:
Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y
formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad est dirigida hacia
el objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. Tambin denominado
ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes. Muy comn
en modelos de microscopios antiguos (11).
Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias
lentes unidas entre s y colocadas por encima del diafragma. Generalmente
corrigen aberraciones y funcionan de manera ptima con los objetivos
corregidos al infinito (15).
Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de
aumento para los diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que se
aprecia en los objetivos apocromticos. No tiene buen rendimiento con
objetivos acromticos secos.
Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la
imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para
dibujar o para exhibicin (11).
Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo
perfectamente plano y el poder de resolucin es igual tanto en el centro
como en la periferia del campo ptico (11).
Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce
con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo
Huygens pero con una doble lente ocular (11).

Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular


compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b)
poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares
positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c).
Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38)
(fig. 4-8) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromticas,
la curvatura de campo y su empleo ptimo es en combinacin con objetivos
de gran poder de aumento.

Figura 4-8.-Diagrama de la constitucin del ocular Periplan. Es un ocular


negativo.
Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (monooculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos
ms modernos son trinoculares, especiales para la microfotografa. Los
binoculares tienen los objetivos dispuestos con una inclinacin de 45 para
realizar la observacin cmodamente.

Campo del microscopio:


Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en el
ocular. Tambin podemos definirlo como la porcin del plano visible
observado a travs de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo
disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional
al aumento del microscopio. La forma del campo est determinada por el
diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no
obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy til al realizar
estudios de coprologa o hematologa, en donde se requiere reconstruir la

totalidad del campo de observacin de la preparacin, lo cual se dificulta


con un campo circular clsico al quedar zonas superpuestas (11).
El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el
objetivo. El valor de este aumento est inscrito en la superficie del ocular y
generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el nmero de
campo que consiste en el dimetro en milmetros de la apertura fija del
diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus
caractersticas:
UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.
H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la
observacin microscpica.
K, C, comp: Para oculares compensadores.
Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos
planos.
Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin
de estructuras del espcimen en estudio. En ciertos casos es relevante
conocer el nmero, tamao o dimensiones de las clulas y dems
elementos del tejido.
Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza
circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece
enfocada y superpuesta a la imagen del espcimen al encontrarse en el
plano de formacin de la misma. Los oculares para la medicin poseen un
mecanismo de enfoque mediante rotacin. Se debe calibrar la escala de
medicin del ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se
puede emplear algn software de computacin para realizar mediciones
sobre las imgenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el
mtodo ms econmico y de uso ms generalizado es la medicin con los
oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura
filamentosa (alambre, pestaa, cerda) denominada sealador, con la
finalidad de indicar de manera especfica alguna estructura en particular en
el campo de observacin. El sealador se aprecia como una lnea oscura
que parte del borde del campo hacia el centro del mismo.
Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por
una parte colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por otra,
impedir la formacin de reflejos luminosos que dificulten la visualizacin.
Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del
ocular que ajusta las dioptras en caso que el observador posea una
disminucin de su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto

para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la


distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm).

Figura 4-9.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se


observa un campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en
este caso son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamao de una
clula se cuenta el nmero de divisiones que ocupa y la cifra se divide entre
el aumento del objetivo empleado, dando como resultado un valor que
corresponde al tamao de la misma. Si la clula mide 7 divisiones,
corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 100x, se divide
0.7mm:100 = 0.007mm = 7m.
Sistema de iluminacin
El sistema de iluminacin est constituido por las partes del microscopio
que producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se
utiliza para la observacin microscpica. Uno de los aspectos crticos a
considerar en la microscopa ptica es la fuente de luz que se emplea para
iluminar el espcimen. Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la
calidad de la imagen que se obtiene se ver afectada, aun cuando se
disponga de un excelente sistema ptico. La iluminacin ptima debe ser
brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera
uniforme en el campo de observacin.
Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le
denomine fotnico. En sus inicios, la microscopa se practicaba con
iluminacin por reflexin; se utilizaba un espejo que se orientaba para
recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero
a gas, lmparas de aceite o petrleo) y la desviaba hacia la preparacin.
Este mtodo se mantuvo durante mucho tiempo, en parte debido al lento
perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que consisten en un
globo de cristal en el que se ha hecho el vaco y dentro del cual va colocado

un hilo de metal (platino, carbn, tungsteno, entre otros) que al paso de una
corriente elctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar (50).
Con el uso de la bombilla elctrica se suprime este espejo y los microscopios
pueden utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de
microscopios actuales, desde los ms sencillos y econmicos hasta los ms
sofisticados, an poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida
por la bombilla, en el caso que sta no se encuentre alineada con la platina.
El sistema de iluminacin est constituido por la fuente de luz, el
condensador y un diafragma o iris. Como regla general, el sistema de
iluminacin est colocado debajo de la platina y la finalidad es de iluminar
mediante luz transmitida. En la mayora de los casos el estudio de las
preparaciones histolgicas se hace por transiluminacin. En otros casos muy
especficos se emplea el mtodo de luz reflejada, en el cual se ilumina la
superficie del espcimen mediante epi-iluminacin (ver captulo 3). La
fuente de luz emite una radiacin que es recogida por un dispositivo
denominado condensador, que a su vez forma un cono luminoso necesario
para la visualizacin con objetivos de mayor aumento.
4.5.1.-Fuentes de luz
Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo,
existen numerosas fuentes de iluminacin artificial, tanto para la
observacin rutinaria como para la microfotografa. La luz artificial presenta
numerosas ventajas tales como la constancia, la uniformidad y la
intensidad; adems es muy favorable para los mayores aumentos. Existen
varios tipos de fuentes de luz artificial:
Bombillas de tungsteno y halgenas: La mayora de microscopios de luz
estn dotados de lmparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y
100W. Se emplean como fuentes principales o accesorias. Estas lmparas
son radiadores trmicos que emiten una luz continua en un espectro
comprendido entre 300 1200 nm. Estn constituidas por un bulbo de
cristal relleno de un gas inerte y un filamento de tungsteno que es activado
por una corriente elctrica produciendo una importante cantidad de luz y
calor. Varan mucho en tamao, diseo y forma (68). Producen una luz
blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La luz puede ser muy
brillante para la observacin y se reduce con filtros que disminuyen la
intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la
intensidad sin alterar los colores. Tambin se emplean filtros de colores que
compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del
espcimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul
corrige el tinte amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz
suave y agradable que aumenta la definicin.
Lmparas de arco elctrico: Son lmparas que pueden contener gases
(vapor de mercurio, xenn o circonio) y son empleadas para proveer una luz
monocromtica con filtros apropiados, ideal para microfotografa en blanco

y negro o a colores. Tambin se utilizan en microscopios especiales


(fluorescencia).
Lser: En los ltimos aos se ha incrementado el uso de lser (Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificacin de Luz por
Emisin Estimulada de Radiacin) (42), que consiste en un dispositivo que
genera un haz de luz con caractersticas de tamao, coherencia, forma y
pureza controladas. El lser de argn es uno de los ms utilizados, cuya
emisin est en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se
emplea principalmente en microscopa confocal.
LED: De las siglas en ingls Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es
un dispositivo emisor de luz con caractersticas muy prximas a la luz
monocromtica (espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente
elctrica pasa a travs del material semiconductor (arseniuro de galioaluminio) del que estn hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de
artefactos y lmparas. En comparacin con las bombillas incandescentes,
son ms interesantes porque permiten ahorro de energa con un mayor
rendimiento lumnico. Para microscopa se emplean LED de larga duracin
que proveen una luz muy brillante y fra; esto ltimo es una gran ventaja,
puesto que no genera calor y la observacin es ms cmoda para el usuario.
En la actualidad se producen combinaciones de diodos que emiten una luz
blanca.
4.5.2.-Condensador
Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes,
con aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor
aumento. El trmino condensador puede considerarse inadecuado, ya que
no produce una condensacin de los rayos luminosos, por el contrario,
produce un aumento de la seccin del cono luminoso (11) que a su vez
forma una imagen ms clara.
El condensador est conformado por una o varias lentes situadas debajo de
la platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espcimen.
El primer condensador que se fabric en 1838 (por Dujardin) posea tres
lentes acromticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador
poseen poder de aumento y tambin producen aberraciones, sin embargo,
stas tambin pueden corregirse.
Tipos de condensadores de acuerdo al grado de correccin de aberraciones
pticas (15):
Condensador de Abbe: Es el ms simple, sin correccin de aberraciones y
el ms econmico. Compuesto de dos o ms lentes. Puede llegar a tener
una apertura numrica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para
observacin de rutina y con objetivos de modesta apertura numrica y
amplificacin. Una de las ventajas es el amplio cono de iluminacin que
puede producir.

Aplantico: Corrige aberraciones de esfericidad.


Acromtico: Corrige aberraciones cromticas. Contiene tres o cuatro lentes
corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es til para
observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografa (blanco y
negro o color).
Aplantico-Acromtico: Poseen el ms alto nivel de correccin y es el
condensador de eleccin para microfotografa a color con luz blanca. Puede
contener ocho lentes y su uso es ptimo con inmersin y objetivos de mayor
aumento.
El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera
apropiada para optimizar la intensidad y el ngulo de apertura. Cada vez
que se cambia un objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el cono
de luz conveniente a la apertura numrica del nuevo objetivo. A menudo no
es prctico utilizar el mismo condensador para un amplio rango de objetivos
(2x hasta 100x). Para objetivos de bajo poder de aumento (menor a 10x)
algunos condensadores poseen una lente frontal adicional que es abatible.
La altura del condensador es regulada mediante un mecanismo activado
con un tornillo que lo baja o lo sube, acercndolo o no a la platina donde
est colocado el espcimen (fig. 4-10).
Adems de los condensadores empleados en los microscopios de campo
claro, existe una variedad de modelos de condensadores especializados que
se utilizan en diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el
incremento del contraste entre los detalles de la estructura del espcimen.
Se han desarrollado condensadores especiales para microscopa de campo
oscuro, contraste de fase, luz polarizada, contraste de interferencia
diferencial.

Figura 4-10.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un


condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio
fotnico. El medio de inmersin, en este caso aceite, se puede colocar tanto
entre la lente frontal del condensador y el preparado histolgico como entre
el preparado y la lente frontal del objetivo.
4.5.3.-Diafragma o iris
Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe
permitir cambios en la apertura y con dimetros variables cuya finalidad es
la de obtener conos luminosos cada vez ms estrechos y eliminar los rayos
de luz sobrantes. Los primeros diafragmas consistan en un disco de metal
con agujeros de diferente dimetro, el cual se rotaba segn la necesidad.
Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo ms elaborado y
con un diseo que le permite cambiar de dimetro. La apertura del
diafragma se regula en relacin con el tipo de objetivo que se est
utilizando. El diafragma o iris est pintado de negro con la finalidad de
eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminacin
del objeto. (11, 70, 71). (fig. 4-11).

Figura 4-11.-Iris con mecanismo para variar la apertura.


4.5.4.-Iluminacin Khler
La iluminacin es una variable crtica que hay que considerar al poner en
funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la
iluminacin, an en equipos sofisticados, conduce a la obtencin de
imgenes defectuosas. El espcimen debe ser iluminado mediante una
fuente de luz artificial, la cual puede producir artificios en la imagen que se
observa.
En el ao 1893, el profesor August Khler propuso un mtodo de iluminacin
para optimizar la observacin microscpica y la microfotografa (15), que
permite aprovechar al mximo las capacidades de las lentes (objetivos)
iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo
dimetro sea igual al del rea de captura del objetivo. Los microscopios
modernos estn diseados para aplicar la iluminacin Khler y los
requerimientos son (figs. 4-12 y 4-13):
Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.
Bombilla con lente colectora.

Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lmpara y


un diafragma de apertura, colocado debajo del condensador.

Figura 4-12.-Iluminacin Khler. Se debe iluminar el espcimen siguiendo el


esquema. La lmpara posee un filamento (S) incandescente cuya luz es
captada por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1.
La imagen S del filamento de la lmpara es proyectada al plano del
segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza con D1 completamente
abierto. La altura del condensador L2 se regula de manera que su punto
focal est en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es
proyectada en el plano de la preparacin por el condensador.

El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen ntida


del diafragma de campo. La iluminacin ideal se consigue cundo el
condensador se encuentra lo ms cerca de la preparacin. El diafragma de
campo regula el dimetro de la apertura de la iluminacin y al cerrarlo se
incrementan los contrastes (15). Una vez ajustada la iluminacin Khler no
se debe regular la intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o
cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la
intensidad de la lmpara mediante un ajuste de voltaje.

Figura 4-13.-Trayectoria de la luz en la iluminacin Khler.


4.6.-Formacin de la imagen en el microscopio compuesto
Con la finalidad de facilitar la comprensin de la propiedad de aumento que
tienen las lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos
minsculos, es necesario conocer algunos aspectos del fenmeno de la
visin. El ojo humano est constituido de tal manera que slo puede tener
una visin clara cuando los rayos luminosos incidentes son paralelos o
ligeramente divergentes, debido a que la retina requiere la participacin del
cristalino para enfocar los rayos en su superficie.
El lmite para visin cercana es la mnima distancia a la cual se puede
observar claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima
entre 15 y 25 cm (6 y 10 pulgadas respectivamente), depende de la edad y
otros factores. El valor considerado normal es de 25 cm. El tamao aparente
de un objeto depende del ngulo formado por dos lneas proyectadas desde
el centro del ojo a las extremidades de dicho objeto (fig. 4-14)

Figura 4-14. Las lneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ngulo, el


cual es dos veces ms grande que el ngulo de las lneas O-W. De igual
manera, la distancia del ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo
a la flecha AR. La flecha en AR aparece dos veces ms grande que la flecha
en OW. Las proporciones se mantienen al alejar o acercar la flecha.
Este ngulo as formado se conoce como ngulo de visin o ngulo visual
(73). La utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto
cercano consiste en la reduccin de la divergencia de los rayos luminosos
emanados del objeto, de manera que puedan entrar al ojo en un estado de
moderada divergencia, como si emanaran de un objeto situado ms all del
lmite de visin cercana y en consecuencia se forma la imagen en la retina
(fig. 4-15).

Figura 4-15. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y
a una flecha pequea (objeto en estudio) cuyos conos dibujados

representan parte de los rayos de luz divergentes emanados de varios


puntos. Los rayos emanados del objeto muy cercano, al incidir en la pupila,
son an tan divergentes que no permiten formar una imagen enfocada en la
retina; pero al pasar primero por la lente son desviados para formar lneas
casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si ste est a su vez
muy cercano a la lente.
Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente
son recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una
flecha (objeto) ms grande, aparentemente situada en el lmite de visin
cercana del observador (aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamao
entre la flecha real y la flecha imaginaria estar determinada por el poder
de aumento de la lente. La imagen formada no es real, no puede ser
proyectada en una pantalla o recogida en una placa fotogrfica; es una
imagen mental. Por esta razn la imagen se denomina virtual y la distancia
desde la lente hasta la imagen formada se denomina distancia focal virtual
(74,75).
Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el
ngulo de visin y en consecuencia el objeto se ver ms grande (fig. 4-16)

Figura 4-16. Sin la lente colocada en fg el ojo ver la flecha con el ngulo
formado por las lneas punteadas b y c, formando la imagen bc. Los rayos
bf y cg emanados de las extremidades de la flecha son refractados por la
lente hacia el ojo en direccin f y g, los cuales crean un ngulo visual mayor
que hace que la fecha se vea ms grande (d-e).
Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitir comprender
el principio del microscopio compuesto, denominado as, en oposicin a la
lupa (microscopio simple) en base a que est conformado por dos sistemas
de lentes, los cuales deben estar centrados, es decir, tener el mismo eje
ptico. El primer sistema, cercano al objeto en estudio, se denomina

objetivo, posee una distancia focal muy corta y es posible colocar el objeto
un poco ms all de su punto focal para obtener una imagen real, invertida
y aumentada.
El sistema de lentes a travs del cual el observador examina se denomina
ocular y funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por
el objetivo. La distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de
manera que la imagen real obtenida por el objetivo se forme entre el ocular
y su punto focal (11). El aumento del microscopio depender en principio de
la longitud focal del objetivo. Mientras ms pequea sea esta longitud y el
objeto se acerque al objetivo, ms grande ser la imagen real. El aumento
tambin depende de la distancia focal del ocular y mientras ms corta sea
esta, mayor ser el aumento (fig. 4-17).

Figura 4-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los
rayos emanados del espcimen en estudio y su paso a travs de las lentes
objetivo y ocular para la formacin de las imgenes. La flecha ab
corresponde al espcimen, que est colocado un poco por delante del foco
(f) del objetivo, el cual forma una imagen real, aumentada e invertida en
ab. Esta imagen se forma por dentro del foco (f ) de la lente ocular. El ojo
del observador percibir a travs del ocular la imagen virtual, aumentada y
derecha ab de la imagen real ab.
4.7.-Accesorios del microscopio

Habindose familiarizado con la estructura y funcionamiento del


microscopio compuesto, hay que considerar aquellos accesorios que
conducen a una excelente prctica microscpica y que facilitan el trabajo,
hacindolo ms rpido y efectivo o ampliando las capacidades del
instrumento. Dentro de las actividades o posibilidades se pueden citar:
Medir y cuantificar: Consiste en la micrometra (morfometra) aproximada
de los especmenes observados al microscopio. Para cuantificar longitudes,
cantidades (conteo de clulas, ncleos, partculas), ngulos. Se emplean
oculares de medicin con retculos o gradillas en combinacin con
micrmetros especializados, lminas calibradas, cmaras de conteo y el
vernier. En la actualidad se han desarrollado instrumentos para morfometra
que emplean tecnologa digital y los datos obtenidos pueden ser
transmitidos a un computador, permitiendo as la automatizacin, el
almacenamiento de los datos y la obtencin de variables estadsticas a
partir de ellos.
Dibujar: Dibujar las preparaciones microscpicas es una actividad de las
ms completas y precisas que permite obtener una representacin fiel del
espcimen en estudio tal y como el observador la percibe y representa la
suma de detalles que se observan al cambiar el plano de enfoque,
obtenindose la sensacin de relieve y profundidad. Se emplean las
cmaras claras y otros dispositivos para dibujar que estn concebidos con
una serie de espejos y prismas que hacen coincidir en la retina o en una
pantalla tanto el campo observado como el plano en el cual se debe dibujar.
Se sigue sobre una hoja de papel el contorno de la imagen observada al
mismo tiempo que se dibuja con un lpiz.
Fotografiar: Una manera de preservar lo observado al microscopio es
mediante la microfotografa. Las imgenes obtenidas se archivan y se
emplean en publicaciones cientficas y presentaciones con fines docentes y
banco de datos. Se necesitan adaptadores para conectar la cmara a un
tubo semejante al tubo del ocular en microscopios trinoculares. Se emplean
desde las cmaras fotogrficas clsicas hasta las cmaras digitales
especializadas para acoplar al microscopio y las cmaras fotogrficas
digitales de uso comn. Actualmente la fotografa clsica resulta
complicada, costosa, de resultados menos atractivos y ha sido desplazada
por la fotografa digital que es de ms fcil y prctica ejecucin. Con las
cmaras digitales de alta resolucin se obtienen resultados muy
satisfactorios e inmediatos que pueden ser archivados en el computador
para su posterior anlisis y procesamiento.
Filmar: La captura de imgenes en movimiento se realiza mediante
cmaras de video (digitales o no) que registran la actividad de especmenes
vivos, clulas en cultivo, cmaras de perfusin, dispositivos con motor y
automatizados, entre otros, para la demostracin y anlisis de procesos
fisiolgicos en videomicroscopa.

Incrementar el contraste: Para facilitar la observacin de especmenes con


una estructura particular y clulas vivas se emplean filtros, condensadores y
otros dispositivos que transforman al microscopio de campo claro en un
instrumento para tal fin, logrndose la microscopia fotnica especial (campo
oscuro, contraste de fases, polarizacin, entre otras).
Procesamiento de imgenes: Con el empleo del computador y de software
especializados para captura, administracin y procesamiento de las
microfotografas, en la actualidad se ha llegado a nuevos niveles en
facilidad de uso y sofisticacin que simplifican la investigacin cientfica (76,
77).
Tipos de microscopios
Existen diversas clases de microscopios, segn la conformacin, la
naturaleza de los sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener
las imgenes.
El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para
microfotografa). En los microscopios binoculares la observacin se hace con
los dos ojos y esto permite una observacin ms cmoda y se percibe una
mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se fabrican en diferentes
tamaos incluyendo microscopios pequeos porttiles o de viaje. Dentro de
los tipos de microscopios se describen:
Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a
partir de los modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la
base, por debajo de la platina. Es el microscopio de uso ms comn.
Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en
comparacin al microscopio convencional. La fuente de luz est ubicada por
encima de la platina y el principio de funcionamiento y formacin de la
imagen es el mismo que el del microscopio tradicional. Utilizado
principalmente para cultivos celulares (clulas vivas) sin una preparacin
previa y para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento) (fig. 418).

Figura 4-18.-Microscopio invertido con el revlver y objetivos por debajo de


la platina. La fuente de luz se ubica en la parte superior.
Microscopio estereoscpico: Este tipo de microscopio proporciona una
imagen estereoscpica, en tres dimensiones (3D) del espcimen. Se
fundamenta en la visin binocular convencional, en la que los dos ojos
observan el espcimen con ngulos levemente distintos. El microscopio
estereoscpico debe ser binocular. Se utiliza para observar especmenes de
gran tamao, sin corte o preparacin previa puesto que emplea luz
incidente y no funciona por trans-iluminacin. Es ideal para realizar
microdiseccion (fig. 4-19).

Figura 4-19.-Microscopio estereoscpico.


Microscopio quirrgico: Es un microscopio que se emplea en microciruga.
Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras
anatmicas, facilitndole al cirujano una mayor visibilidad de los tejidos
sanos y patolgicos que sern manipulados ms cuidadosamente y con
menores posibilidades de lesin. Algunos modelos ms sofisticados tienen
piezas automatizadas robticas. Se utiliza principalmente en intervenciones
quirrgicas en las que se amerite una minuciosa diseccin, como por
ejemplo del crneo y cerebro o del globo ocular (fig. 4-20) (80, 81).

Figura 4-20.-Cirujano empleando microscopio quirrgico.


Microscopios fotnicos especiales: Ciertos especmenes, principalmente
las clulas vivas o muestras no coloreadas, al ser observados en el
microscopio comn de campo claro, muestran un muy pobre contraste de
sus estructuras y no aportan datos relevantes, a pesar del poder de
resolucin de los objetivos empleados. Para ello se han creado microscopios
con ciertas particularidades que permiten la observacin de ese tipo de
especmenes con un incremento muy satisfactorio del contraste. Entre ellos
se citan:
Microscopio de campo oscuro.
Microscopio de luz ultravioleta.
Microscopio de fluorescencia.
Microscopio de polarizacin.
Microscopio de contraste de fases.
Microscopios interferenciales.