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RESUMEN
Un protoplasto vegetal es una clula que carece de pared celular, se encuentra rodeada por su membrana
plasmtica y es potencialmente capaz de regenerar la pared celular, crecer y dividirse. El objetivo del trabajo
fue evaluar diferentes concentraciones de enzimas comerciales y tiempos de accin en el aislamiento de
protoplastos de Dioscorea alata cultivar Pico de Botella. Los protoplastos fueron aislados del mesfilo
de vitroplantas combinando concentraciones de las enzimas Celulasa Onozuka R10 (0,0 a 1,5% p/v) y
Macerozima R10 (0,0 a 0,5% p/v), a tiempos de accin de 6 a 18h y pH de 5,6; exponiendo aproximadamente
0,015g de hoja en medio de aislamiento de protoplastos de ame a 272 C, 40 rpm, seguido de lavado en
medio de aislamiento sin enzimas, purificacin en sacarosa al 24%, resuspensin en medio de cultivo de
protoplastos de ame y conteo en cmara de Neubauer. La mayor cantidad de protoplastos se obtuvo con
Celulasa al 1% y Macerozima al 0,5% en 18h de accin, con un promedio de 18,6 x106 protoplastos g-1
de tejido fresco. Los anlisis de regresin (R2 = 0,84) de los datos obtenidos arrojaron, que las condiciones
ptimas para obtener la mayor cantidad de protoplastos aislados corresponden a una combinacin de 0,96%
de Celulasa y 0,36% de Macerozima, a 13,99 h de accin, estimando un valor de 15,3x106 protoplastos g-1
de tejido. El mtodo enzimtico permite aislar protoplastos de ame, recomendndose evaluar su viabilidad
para regeneracin su pared celular, crecer, dividirse y formar microcolonias y microcallos.
Palabras clave: ame, celulasa, macerozima, protoplasto.
ABSTRACT
A plant protoplast cell lacking a cell wall is surrounded by its plasma membrane and is potentially able
to regenerate the cell wall, grow and divide. The aim of this study was to evaluate different commercial
enzyme concentrations and times of action in the isolation of protoplasts of D. alata cultivar Bottle Peak. The
protoplasts were isolated from mesophyll of vitroplants combining concentrations of the enzymes Cellulase
Onozuka R10 (0,0 to 1,5% w/v) and Macerozyme R10 (0,0 to 0,5% w/v), to action times of 6 to 18h and pH
Universidad de Crdoba, Departamento de Ingeniera de Alimentos. Km 12 va a Cinaga de Oro. Tel: 301 253 14 00.
Email: josmartbio@hotmail.com
2
Universidad de Sucre, Departamento de Biologa. Cra 28 No. 5-267. Telfono: 282 1240 Ext. 219, Sincelejo (Sucre).
*1
58
of 5,6, giving approximately 0,015g of leaf protoplast isolation medium yam at 27 2 C, 40 rpm, followed by
washing in isolation medium without enzymes, purification in 24% sucrose, resuspension in protoplast culture
medium yam and counting in Neubauer camera. Most protoplasts were obtained with 1% Cellulase and 0,5%
macerozyme in 18h of action, with an average of 18,6 x106 protoplasts g-1 fresh tissue. Regression analysis
(R2 = 0,84) yielded the data obtained, optimum conditions for the most isolated protoplasts correspond to a
combination of 0,96% Cellulase and 0,36% macerozyme to 13,99 h action, with an value estimated of 15,3
x106 protoplasts g-1 tissue. The enzymatic method to isolate protoplasts yam, recommended assessing their
feasibility for cell wall regeneration, growing, dividing and forming microcolonies and microcallos.
Key words: yam, cellulase, macerozyme, protoplast.
INTRODUCCIN
El ame pertenece al gnero Dioscorea, se
incluye dentro de las monocotiledneas, y
comprende alrededor de 650 especies de
considerable importancia econmica; sus
tubrculos son utilizados como fuente de
carbohidratos en la dieta de millones de
personas en el Oeste de frica, Sur de Asia,
Islas del Pacfico y Regin Caribe de Amrica
Latina (Twyford y Mantell 1996; Cogne 2002;
Prez et al. 2005). La familia Dioscoreaceae
es reconocida tambin por la presencia de
diferentes metabolitos como las sapogeninas
esteroidales,
saponinas
y
esteroides
relacionados, alcaloides y diterpenoides, tiles
para la industria farmacutica (Cogne 2002).
MATERIALES Y MTODOS
Localizacin geogrfica
Este estudio fue realizado en el Laboratorio de
Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad
de Sucre, sede Puerta Roja, Sincelejo-Sucre,
ubicada geogrficamente a 9 58 23.8 latitud
Norte y 74 58 58.4 longitud Oeste de
Greenwich, con una temperatura de 273 C y
una humedad relativa de 4560 %.
Material vegetal
Se utilizaron hojas jvenes de vitroplantas de
la especie Dioscorea alata cultivar Pico de
Botella de diferente madurez correlacionada
con la longitud de las hojas y la coloracin
de las mismas, mantenidas en cultivo de
segmentos nodales en medio MS suplementado
con 0,5 mg L-1 de cido naftalen-actico (ANA)
y 4 mg L-1 de 6-Bencil-aminopurina (BAP)
(Rodrguez y Beltrn 2002), mantenidos a
27C con una intensidad lumnica 505 mol
m2 s-1, humedad relativa entre 4560 % y un
fotoperodo de 12 h luz.
Aislamiento de protoplastos
El aislamiento enzimtico de los protoplastos
de ame fue realizado utilizando diferentes
Anlisis estadstico
Para evaluar el efecto de los tratamientos en la
obtencin de protoplastos, se utiliz un diseo
completamente al azar con arreglo factorial
con tres factores (concentracin de celulasa,
concentracin de macerozima y tiempo
de exposicin). Los datos obtenidos fueron
RESULTADOS Y DISCUSIN
La eficiencia del aislamiento enzimtico
depende de varios factores entre los que
se tiene la edad del material vegetal, el tipo
y concentracin de enzimas utilizadas, la
temperatura y el tiempo de accin (Guangyu
et al. 1997; Assani et al. 2001; Pindel 2007;
Geerts et al. 2008) y la eliminacin de la
cutcula. La mayor cantidad de protoplastos
se obtuvo al realizar maceracin suave
previa del tejido (>5x104 protoplastos mL-1)
y agitacin durante la incubacin con las
enzimas. Probablemente, estos resultados se
deben a que en este procedimiento se presenta
una mayor rea de exposicin del tejido a las
enzimas, y la penetracin de stas es facilitada
por la agitacin durante la incubacin.
reflejaron las
y fisiolgicas
Figura 1.
Diferencia en el tamao de protoplastos (m) aislados de hoja de Dioscorea alata c.v pico de
Botella. a) Protoplastos de hojas pequeas y b) Protoplastos de hojas grandes
Figura 2.
Tabla 1. Nmero promedio de Protoplastos aislados en cada combinacin enzimtica y tiempo de incubacin
Combinacin enzimtica
%p/v Celulasa R10
10
14
18
1,5
1,5
0,2
25583
119194
163111
5389
1,5
0,4
2778
24028
46111
54722
1,5
0,5
9306
60417
53750
7778
0,2
20111
34584
22723
12556
0,4
12778
11639
69416
13306
0,5
49942
122111
125945
280000
0,5
0,5
0,2
69723
99000
199000
140972
0,5
0,4
8472
23472
25228
76806
0,5
0,5
41945
27945
30139
7500
0,2
3584
1667
0,4
3195
58167
6167
23639
0,5
6334
17417
1750
64
Factor
celulasa
Protoplastos1
Factor
macerozima
Protoplastos1
Factor
tiempo
Protoplastos1
0,0
7619,8 c
0,0
0,0 c
15237,8 c
0,5
47703,1 a
0,2
57309,0 a
10
36904,5 b
1,0
48442,7 a
0,4
29560,8 b
14
48253,5 a
1,5
35744,8 b
0,5
52640,6 a
18
39114,6 a
65
B:Macerozima
BB
A:Celulasa
AA
AC
C:Tiempo
CC
BC
AB
0
Figura 3.
10
20
30
Efectos estandarizados
40
REFERENCIAS
CONCLUSIONES
El mtodo enzimtico nos permite aislar
grandes cantidades de protoplastos a partir de
mesfilo de Dioscorea alata cultivar Pico de
Botella; en este proceso influye la edad tejido,
el rea de exposicin del material vegetal a
las enzimas, las condiciones de incubacin
enzimtica y medios de aislamiento y cultivo
de protoplastos. Es as, por ejemplo, el tamao
de los protoplastos aislados de hojas de
vitroplantas depende del tamao y la edad
del material vegetal utilizado. Es importante
corroborar la capacidad de regenerativa de
los protoplastos por tcnicas que nos permita
dilucidar la viabilidad de los mismos de
restablecer su pared celular, crecer, dividirse y
formar microcolonias y microcallos.
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