INSTRUMENTACION DE LABORATORIO CLINICO

RESUMEN TEMA # 4

LUZ Y MEDICION

INTEGRANTES:
JAVIER GUERRERO
CARLA GABRIELA BONILLA
OMAR SOLANO
DHAMARIS CAMACHO

SECCION 2

Radiacin electromagntica

La radiacin electromagntica es un tipo de campo electromagntico variable, es

decir, una combinacin de campos elctricos y magnticos oscilantes, que se propagan a
travs del espacio, transportando energa de un lugar a otro.
La radiacin electromagntica puede manifestarse de diversas maneras como calor
radiado, luz visible, rayos X o rayos gamma. A diferencia de otros tipos de onda, como el
sonido, que necesitan un medio material para propagarse, la radiacin electromagntica se
puede propagar en el vaco.

Naturaleza
Las radiaciones electromagnticas se caracterizan por la existencia en cada punto
del espacio en que se transmiten de un campo elctrico y un campo magntico relacionados
entre s. Las ondas electromagnticas presentan una variacin peridica que se propaga en
el vaco a una velocidad de 300.000 km/seg.
La radiacin electromagntica es portadora de una cantidad de energa y presenta
caractersticas especficas segn la banda de frecuencias (o longitud de onda) en que se
halle inscrita. La radiacin electromagntica puede propagarse sin un soporte material, es
decir, viajar por el vaco.
Espectro electromagntico

Se denomina espectro electromagntico a la distribucin energtica del conjunto de

las ondas electromagnticas. Referido a un objeto se denomina espectro electromagntico o
simplemente espectro a la radiacin electromagntica que emite (espectro de emisin) o
absorbe (espectro de absorcin) una sustancia. Dicha radiacin sirve para identificar la
sustancia de manera anloga a una huella dactilar. Los espectros se pueden observar
mediante espectroscopios que, adems de permitir ver el espectro, permiten realizar
medidas sobre el mismo, como son la longitud de onda, la frecuencia y la intensidad de la
radiacin.

El espectro electromagntico se extiende desde la radiacin de menor longitud de

onda, como los rayos csmicos, rayos gamma y los rayos X, pasando por la radiacin

ultravioleta, la luz visible y la radiacin infrarroja, hasta las ondas electromagnticas de

mayor longitud de onda, como son las ondas de radio. Se cree que el lmite para la longitud
de onda ms pequea posible es la longitud de Planck (La longitud de Planck u hodn es la
distancia o escala de longitud por debajo de la cual se espera que el espacio deje de tener
una geometra clsica). Mientras que el lmite mximo sera el tamao del Universo aunque
formalmente el espectro electromagntico es infinito y continuo.
Las ondas electromagnticas cubren una amplia gama de frecuencias o de
longitudes de ondas y pueden clasificarse segn su principal fuente de produccin. La
clasificacin no tiene lmites precisos.

Interaccin de la radiacin electromagntica y la materia

Cuando un alambre o cualquier objeto conductor, tal como una antena,

conduce corriente alterna, la radiacin electromagntica se propaga en la misma frecuencia
que la corriente.
De forma similar, cuando una radiacin electromagntica incide en un conductor
elctrico, hace que los electrones de su superficie oscilen, generndose de esta forma una
corriente alterna cuya frecuencia es la misma que la de la radiacin incidente. Este efecto se
usa en las antenas, que pueden actuar como emisores o receptores de radiacin
electromagntica.
Todos los empleos de la radiacin estn basados en cualquiera de las dos siguientes
propiedades: penetracin de la materia y depsito de energa. Las radiografas, por ejemplo,
son posibles gracias a que los rayos X penetran de manera distinta a los diferentes
materiales. Por su lado, en la radioterapia se busca depositar energa en los tejidos malignos
para eliminarlos.

El paso de la radiacin electromagntica por la materia

Los rayos X y gamma, al no tener carga, no pueden ser frenados lentamente por
ionizacin al atravesar un material. Sufren otros mecanismos que al final los hacen
desaparecer, transfiriendo su energa, pueden atravesar varios centmetros de un slido, o
cientos de metros de aire, sin sufrir ningn proceso ni afectar la materia que cruzan. Luego
sufren uno de los tres efectos y depositan all gran parte de su energa. Los tres mecanismos

de interaccin con la materia son: el efecto fotoelctrico, el efecto Compton y la produccin

de pares.
a) El efecto fotoelctrico consiste en que el fotn se encuentra con un electrn del material
y le transfiere toda su energa, desapareciendo el fotn original. El electrn secundario
adquiere toda la energa del fotn en forma de energa cintica, y es suficiente para
desligarlo de su tomo y convertirlo en proyectil. Se frena ste por ionizacin y excitacin
del material
b) En el efecto Compton el fotn choca con un electrn como si fuera un choque entre dos
esferas elsticas. El electrn secundario adquiere slo parte de la energa del fotn y el resto
se la lleva otro fotn de menor energa y desviado.
c) Cuando un fotn energtico se acerca al campo elctrico intenso de un ncleo puede
suceder la produccin de pares. En este caso el fotn se transforma en un par electrnpositrn. Como la suma de las masas del par es 1.02 MeV, no puede suceder si la energa
del fotn es menor que esta cantidad. Si la energa del fotn original en mayor que 1.02
MeV, el excedente se lo reparten el electrn y el positrn como energa cintica, pudiendo
ionizar el material. El positrn al final de su trayecto forma un positronio y luego se
aniquila producindose dos fotones de aniquilacin, de 0.51 MeV cada uno.
Cada uno de los efectos predomina a diferentes energas de los fotones. A bajas
energas (rayos X) predomina el fotoelctrico; a energas medianas (alrededor de 1MeV) ,
el Compton; a energas mayores, la produccin de pares.

Espectroscopia

La espectroscopia estudia la interaccin entre la radiacin y la materia, con

absorcin o emisin de energa radiante. Se ocupa del estudio de los "espectros": la forma
de obtenerlos, la forma de medirlos y su aplicacin al anlisis qumico.
La interaccion de la radiacion electromagnetica con la materia se utiliza para
obtener informacion cualitativa y cuantitativa acerca de la composicion de una muestra.

Tcnicas espectroscpicas

La radiacin electromagntica es una forma de energa que se transmite por el

espacio a velocidades muy altas. Consiste en un campo elctrico con un campo magntico
asociado que responde a una propagacin ondulatoria sinusoidal y en la que tambin existe
una propagacin de energa, energa que esta cuantizada en forma de fotones. La energa
del fotn es proporcional a la frecuencia de la radiacin. Analizando exclusivamente la
componente elctrica podemos entender los efectos que provoca sobre la materia.
El transporte de energa asociado a la radiacin electromagntica puede producirse
tanto a altas como bajas frecuencias. Podemos diferenciar dos tipos de fenmenos
asociados a la radiacin electromagntica:
Los producidos como consecuencia del transporte de energa: proceso de absorcin,
emisin, entre otros. Espectroscpicos (fenmeno energtico)
Y Aquellos debido a su carcter ondulatorio, procesos de reflexin, refraccin y
dispersin. No espectroscpicos (fenmeno ondulatorio)

Mtodos Espectroscpicos
Basados en los procesos de Absorcin, Emisin y luminiscencia

Espectroscopia de absorcin

Basada en la capacidad de las molculas para absolver radiacin electromagntica

cuya longitud de onda depende de la estructura atmica del compuesto.
Cuando la molcula absorbe energa radiante, se origina un salto desde un estado
energtico fundamental E1 a un estado excitado E2.
El espectro de absorcin es una seal de identidad para cada molcula, pues es la
representacin grfica de la absorbancia frente a la longitud de onda, nmero de onda o la
frecuencia.
La espectroscopia de absorcin puede ser atmica o molecular.
De absorcin atmica: Involucra radiaciones electromagnticas de alta energa que
por un instante promueve los electrones orbitales de mayor energa como consecuencia de
la absorcin de fotones.
De absorcin molecular: Estudia cmo responden las molculas cuando incide
sobre ellas radiaciones electromagnticas de menor energa.
Las molculas excitadas por energa radiante pueden sufrir tres tipos de transiciones
fotonicas: Electrnicas, vibratorias y rotacionales.

Transiciones fotonicas

La excitacin originada por radiaciones visibles o ultravioleta promueve

transferencias de electrones que se hallan en niveles bajos de energa hasta orbitales de
energa superior.
La transicin de un electrn entre distintos niveles de energa se denomina
transiciones electrnicas. A dems de las transiciones electrnicas, las molculas presentan
transiciones vibratorias que ocurren como consecuencia de los niveles de energa
cuantizados asociados a los enlaces intramoleculares.
Una molcula tambin posee un gran nmero de estados rotacionales cuantizados
debidos al movimiento rotacional de la molcula alrededor de centro de gravedad.
La radiacin de la absorcin infrarroja presenta una energa que puede inducir
transiciones vibratorias y rotacionales, por su parte la radiacin de la absorcin
ultravioleta- visible posee suficiente energa para inducir transiciones electrnicas.

Espectro de emisin

Un espectro de emisin que permite caracterizar la radiacin de una fuente, es la

representacin grfica de la energa radiante de la radiacin emitida frente a la longitud de
onda o la frecuencia.
Dentro del espectro de emisin se diferencias tres tipos: de lneas, de bandas y
continuos.

Fluorescencia y fosforescencia

La fluorescencia es un fenmeno fsico que consiste en la capacidad que poseen

ciertas sustancias para absorber energa radiante y emitirla nuevamente en forma de luz
caracterstica. Solamente tiene lugar mientras dura el estmulo que lo provoca, es decir, al
desaparecer la radiacin desaparece la emisin.
La fosforescencia es casi lo mismo que la fluorescencia pero la diferencia es que la
fosforescencia es un proceso ms lento, la sustancia absorbe la energa radiante y la
almacena para emitirla posteriormente en forma de luz.
Hay varias formas en las cuales un tomo o molcula excitada libera su exceso de
energa y se relaja a su estado fundamental. Las ms importantes son: Relajacin
vibracional y conversin interna.
La relajacin vibracional tiene lugar durante las colisiones entre las molculas
excitadas y las molculas del disolvente. Durante estas colisiones el exceso de energa
vibracional se transfiere a las molculas del disolvente en una serie de etapas como se
indica en la figura. La ganancia de energa vibracional del disolvente se refleja en un ligero
incremento de la temperatura del medio. La relajacin vibracional es un proceso tan
eficiente que el tiempo de vida promedio de un estado vibracional excitado es de 10-15 s
aproximadamente.
Y la conversin interna ocurre cuando la molcula pasa a un estado electrnico de
ms baja energa sin emisin de radiacin

Los mtodos espectroscpicos estn basados en los procesos de absorcin, emisin

y luminiscencia.
Los basados en los procesos de absorcin son: Ultravioleta- visible, infrarrojo,
absorcin atmica, rayos x.
Y los basados en el proceso de emisin son: fluorimetria, fosforimetria,
quimioluminiscencia, emisin atmica, fluorescencia de rayos x.

Espectrometra Ultravioleta
La regin UV est definida en el rango de longitudes de onda de 195 a 400nm.

Todos los tomos absorben en la regin ultravioleta (UV) ya que estos fotones son
bastantes energticos para excitar a los electrones externos. Si la frecuencia es lo bastante
alta, se produce la fotoionizacin.
La espectrofotometra UV se usa para la cuantificacin de protenas y concentracin
de ADN as como para la proporcin de protenas y ADN en una solucin.

Ultravioleta-visible

Utiliza radiacin electromagntica de las regiones visibles, ultravioleta e infrarrojas

del espectro EM (entre 380 y 780nm).
Las molculas manifiestan una absorcin al momento de entrar en contacto con el
espectro. Esto genera transiciones electrnicas que son cuantificables.
Utiliza el principio de absorcin para determinar la concentracin de un compuesto
en una solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y
a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin.
Cuando un haz incidente de radiacin que tiene una longitud de onda adecuada
golpea una molcula, se lleva a cabo la absorcin de un fotn y la molcula se excita.
Cuando las molculas se excitan estas perdern la energa de excitacin en forma de calor
emitiendo fotones (luminiscencia).

Algunas aplicaciones

Determinacin de grupos funcionales en molculas orgnicas

Anlisis de muestras bioqumicas

Anlisis de semiconductores

Seguimiento de la cintica de procesos qumicos y bioqumicos

De Infrarrojo

Se trata de una tcnica de anlisis, para obtener informacin acerca de los procesos
de absorcin y emisin sobre las molculas que se encuentran en la materia. Esto debido a
que cuando una molcula absorbe radiacin infrarroja, la vibracin intramolecular con
frecuencia igual a la de la radiacin, aumenta en intensidad, lo que genera seales con
frecuencias que corresponden a la vibracin de un enlace especfico. La regin infrarroja se
divide en tres regiones denominadas infrarrojo cercano (NIR), infrarrojo medio (MIR) e
infrarrojo lejano (FIR). El espectrmetro de IR con transformada de Fourier permite la
obtencin de espectros de forma rpida, precisa y con relaciones Seal/Ruido (S/N)
elevadas.

Aplicaciones
La Espectroscopa de Infrarrojo es una de las tcnicas espectroscpicas ms
verstiles y de mayor aplicacin en la caracterizacin e identificacin de materiales,
anlisis de productos farmacuticos y de sntesis, anlisis de contaminantes, ciencia
forense, biomedicina, agricultura, alimentos, adhesivos y polmeros entre otros.

De absorcin atmica:

La espectroscopia de absorcin atmica mide la luz de una determinada longitud de

onda absorbida por los tomos de un elemento. En su estado fundamental, los tomos en
forma de vapor absorben luz de longitudes de onda muy estrechas y pasan a estados de
excitacin. El elemento que quiere medirse se vaporiza por medio de una llama o un
mtodo electrotrmico (horno de grafito). La fuente de energa radiante son las lmparas de
ctodo hueco, construidas con el mismo elemento que quiere medirse. Cuando se excitan
los tomos de la lmpara producen un vapor que emite un rayo de luz monocromtica de la
misma longitud de onda que la que absorben los tomos de ese elemento. Cuando la luz
procedente de la lmpara de ctodo hueco atraviesa la llama, parte de aquella es absorbida
por los tomos vaporizados en su estado fundamental, lo que ocasiona un descenso de
intensidad del rayo de la lmpara.

Aplicaciones:
Este mtodo se puede aplicar para la determinacin de ciertos metales tales como:
antimonio, cadmio, calcio, cesio, cromo, cobalto, oro, plomo, nquel, entre otros. Se emplea
en anlisis de agua, de suelos, bioqumica, toxicologa, medicina, industria farmacutica,
alimenticia, petroqumica, etctera.

Espectroscopia de luminiscencia:

En la luminiscencia se consideran 3 tipos de mtodos pticos relacionados entre s:

fluorescencia, fosforecencia molecular y quimioluminiscencia. En todos ellos, las
molculas de analito se excitan para dar una especia cuyo espectro de emisin suministra
informacin para un anlisis cuantitativo y cualitativo. A estos mtodos se le conoce
colectivamente como procedimientos luminiscentes moleculares.
Aplicaciones:
Determinacin de:

Especies inorgnicas (cationes que forman quelatos fluorescentes).

Especies orgnicas y bioqumicas (cidos nucleicos, aminocidos, enzimas,
hidrocarburos, etc.). Cromatografa.
Anlisis de gases (mtodos quimioluminiscentes).
Deteccin de sangre en ciencias forenses (luminol, hemascena, etc.)

Mtodos no espectroscpicos

Se basan en la interaccin entre la radiacin electromagntica y la materia cuando la

radiacin es considerada nicamente como una onda. Se basan en los procesos de:
Refraccin, dispersin y difraccin.

Refraccin:
Es el cambio de direccin que experimenta una onda al pasar de un medio material a
otro. Un ejemplo de este fenmeno se ve cuando se sumerge un lpiz en un vaso con agua,
el lpiz se ve quebrado.

Refractometria

Mtodo ptico de determinar la velocidad de propagacin de la luz en un

medio/compuesto/substancia/cuerpo, la cual se relaciona directamente con la densidad de
este medio/compuesto/substancia/cuerpo.
Los refractmetros se utilizan para medir en lquidos, slidos y gases como vidrios
o gemas

Interferometria

Es una tcnica utilizada en astronoma que consiste en combinar la luz proveniente

de diferentes receptores, telescopios o antenas de radio para obtener una imagen de mayor
resolucin.

Dispersin:
Fenmeno de separacin de las ondas de distinta frecuencia al atravesar un material.

Polarimetria

Es la medicin de la rotacin angular de las sustancias pticamente activas en un

plano de luz polarizada.

Nefelometra

Se basa en la dispersin de la radiacin que atraviesan las partculas de materia.

Turbidimetria

Mide la disminucin de la luz trasmitida a travs de una suspensin de partculas

utilizando para ello un espectrofotmetro.

Difraccin:
Es un fenmeno caracterstico de las ondas que se basa en la desviacin de estas al
encontrar un obstculo o al atravesar una rendija. La difraccin ocurre en todo tipo de
ondas, desde ondas sonoras, ondas en la superficie de un fluido y ondas electromagnticas
como la luz visible y ondas de radio.

Difraccin de rayos X

Consiste bsicamente en un proceso de interferencias constructivas de ondas de

rayos x que se producen en determinadas direcciones de espacio.

Aplicaciones de los mtodos analticos no espectroscpicos

Refractometria
La aplicacin ms comn de los refractmetros es la de determinar la concentracin
de los slidos disueltos en una solucin.

Polorimetria
Son ampliamente utilizados en las industrias qumicas y farmacuticas para el
control de calidad.
Se aplica las medidas con polarmetros para aditivos alimenticios, esencias y
perfumes.
En anlisis de azcares, siendo la forma standard de medicin empleando la unidad
Internacional Standard de escala de azcar.

Nefelometria
En la prctica clnica, la Nefelometra es utilizada principalmente para:

Contar clulas sanguneas distinguiendo los distintos tipos de clulas de la sangre.

Contar clulas de un tipo especfico.
Determinar inmunoglobulinas IgE, IgA, IgM, IgG total, complemento C3 y C4,
protenas plasmticas, antiestreptolisina O, factor reumatodeo, Haptoglobina,
Alfa1-antitripsina, protena C reactiva y otras protenas plasmticas.
Medir complejos antgeno anticuerpo.Determinar algunos frmacos

Turbidimetria
Determinacin de protenas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las protenas
precipiten con cido sulfosalicilico).

Difraccin de rayos x
Esta tcnica permiti descubrir la estructura de la doble hlice del ADN en 1953 y
actualmente se utiliza para determinar la estructura de las protenas.
La difraccin de rayos X es el nico mtodo que permite, tras un procedimiento
generalmente largo y complicado, determinar de modo exacto la estructura molecular de
cualquier producto, ya sea un frmaco, un compuesto inorgnico, un mineral, una protena
o incluso un virus.

Transmitancia

La transmitancia se define como la cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en

determinada cantidad de tiempo.
Existen varios tipos de transmitancia, dependiendo de qu tipo de energa
consideremos.

La transmitancia ptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo, en

una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido,
una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra fraccin de ese haz de luz atraversar
el cuerpo, segn su transmitancia. El valor de la transmitancia ptica de un objeto se puede
determinar segn la siguiente expresin:
I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz incidente.
Muchas veces encontraremos la transmitancia expresada en porcentaje, segn la
frmula:

Absorbancia

Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esta luz es
absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad
de luz absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz ser
transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos
aspectos del mismo fenmeno. La absorbancia, a una determinada longitud de onda
lambda, se define como:

Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I0 es la

intensidad de la luz incidente.
La medida de la absorbancia de una solucin es usada con mucha frecuencia en
laboratorio clnico, para determinar la concentracin de analitos tales como colesterol,
glucosa, creatinina y triglicridos en sangre. Cada uno de estos analitos se hace reaccionar
qumicamente con determinados compuestos, a fin de obtener una solucin coloreada. A
mayor intensidad de color, mayor ser la absorbancia de la solucin en una determinada
longitud de onda. La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentracin
del analito en sangre.
Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada
intensidad y longitud de onda, sobre la solucin, y se mide la luz transmitida al otro lado de
la cubeta que contiene dicha solucin. Estas tcnicas estn comprendidas en el rea de la
espectrofotometra
Aspectos cuantitativos de la absorcin de radiacin.

De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, que rige los clculos cuantitativos, la

transmitancia est relacionada con la longitud de paso ptico b (en cm) a travs de la
solucin y la concentracin c (moles/l) del soluto absorbente de la solucin en la siguiente
forma:
Donde es la absortividad molar, caracterstica de la especie absorbente y funcin
de la longitud de onda de la luz. Al trmino -log P/Po se lo denomina absorbancia, A,
entonces

A= b c

A= a b c

Siendo a la absortividad para una especie cuya concentracin se expone en gramo/litro.

La expresin anterior, es la forma ms conveniente de la ley de Beer para fines
analticos, pues la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin del analito
absorbente de inters, cuando la absortividad y el camino ptico se mantienen constantes.
La figura 1 muestra la grfica correspondiente a la absorbancia vs. Concentracin
que resulta una recta que pasa por el origen.

En el proceso de una determinacin fotomtrica, uno de los aspectos ms

importantes es la seleccin de la longitud de onda apropiada para las mediciones de
absorbancias. Esta seleccin se realiza sobre una curva obtenida con la absorbancia de una
solucin del analito investigado, obtenida a varas longitudes de onda, es decir una curva de
la A (ordenadas) en funcin de (abcisas). La grfica as obtenida se designa como el
espectro de absorcin del compuesto.
Si se desea obtener alta sensibilidad es preciso elegir una longitud de onda para la
cual el valor de la absorbancia sea alto.
La ley de Lambert-Beer es vlida slo para luz monocromtica, un requisito que se
alcanza difcilmente en la prctica. Es as que se trabaja con filtros o monocromadores para
obtener una banda estrecha de longitud de onda, que adems deber corresponder a una
zona de poca pendiente en la curva espectral, se tiene entonces una monocromacidad
aceptable
Una tcnica experimental de amplia difusin en espectrofotometra visible es el uso
de una curva de calibrado. Se la obtiene midiendo la absorbancia de distintas soluciones del
analito de inters en concentraciones conocidas y distintas, y graficando la absorbancia en

funcin de estas con concentraciones. A continuacin se mide la absorbancia de la solucin

problema y la concentracin de la especie absorbente se lee en la curva de calibrado.

Espectrofotmetro

La palabra espectrofotmetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa

imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotmetro,
construido mediante procesos avanzados de fabricacin, es uno de los principales
instrumentos diagnsticos y de investigacin desarrollados por el ser humano. Utiliza las
propiedades de la luz y su interaccin con otras sustancias, para determinar la naturaleza de
las mismas. En general, la luz de una lmpara de caractersticas especiales es guiada a
travs de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y
la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y
comparada con la intensidad de la luz que incidi en la muestra y a partir de esto se calcula
la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentracin de la
sustancia.

Tipos de Espectrofotmetros
-

De absorcin atmica
De emisin
ultravioleta
Infrarrojo
etc

Utilidad
-

Los espectrofotmetros son tiles debido a la relacin de la intensidad del color en

una muestra y su relacin a la cantidad de solute dentro de la muestra. Por ejemplo,
si usted utiliza una solucin del colorante rojo del alimento en agua y mide la
cantidad de luz azul absorbida cuando pasa a travs de la solucin, una fluctuacin
mensurable del voltaje puede ser inducido en una fotoclula en el lado opuesto. Si
ahora la solucin del tinte rojo es diluida por la adicin del agua el color ser menos
intenso. As, hay una relacin entre el voltaje y la cantidad de tinte en la muestra.

El espectrofotmetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica

(de una longitud de onda particular) a travs de una muestra y medir la cantidad de

luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al experimentador realizar
dos funciones:
1. Nos da informacin sobre la naturaleza de la muestra. Esto podemos lograrlo
midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (1) y graficar estos
valores en funcin de los largos de onda, formando un espectrograma. Como
cada sustancia tiene unas propiedades espectrales nicas, distintas sustancias
producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un
arreglo de tomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga
caractersticas nicas.
Al ser expuestos a la luz de espectrofotmetro, algunos electrones de los tomos
que forman las molculas absorben energa entrando a un estado alterado o de
excitacin. Al recuperar el estado original, la energa absorbida es emitida en
forma de fotones. Esa emisin de fotones es distinta para cada sustancia,
generando un patrn particular, que vara con el largo de onda usado.
Dependiendo del largo de onda, ser la cantidad de energa absorbida por una
sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs 1.
2. Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la
muestra. La concentracin es proporcional a la absorbancia segn la Ley BerrLambert: a mayor cantidad de molculas presentas en la muestra, mayor ser la
cantidad de energa absorbida por sus electrones.
Abs = K C L Abs: absorbancia
K: coeficiente de excitacin molar
C: concentracin
L: distancia que viaja la luz a travs de la muestra (normalmente es de 1 cm)
La cuveta promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un
centmetro (L). La ecuacin describe una lnea recta, donde el origen es cero. Si
L es constante (1.0 cm) y se conoce el valor de K, podemos calcular C en base a
Abs: Abs/K L = C

Componentes de los instrumentos espectroscpicos.

Este tipo de instrumentos consta de 5 elementos bsicos:

Fuente estable de energa radiante: Continuas o discontinuas (de lneas)

Selectores de longitud de onda:

Dispositivos que asle una determinada regin del espectro, entre los tipos de
selectores filtros y monocromadores.

Filtros:

Su funcin es absorber toda la radiacin procedente de un haz de luz excepto de una

banda, pueden ser de absorcin, de interferencia, de corte o de banda.

Monocromadores:

Dispersan la radiacin separando espacialmente las distintas bandas de la regin

espectral de la luz policromtica proporcionando bandas de anchura pequea, pueden
ser de prisma o de red y est compuesta por: rendija de entrada, colimador o espejo
cncavo, prisma o red, elemento de enfoque de salida, rendija de salida.

Recipiente contenedor transparente a la radiacin:

Todos los mtodos espectroscpicos , excepto los atmicos emplean un recipiente

que contenga a la muestra (celda o cubeta y se fabrican de : plstico o vidrio (para la regin
Visible) slice fundido (cuarzo, para la regin Visible y UV por debajo de 350 nm e IR
hasta 3000 nm ) vidrio de silicato para medidas entre 375 y 2000 nm (V e IR) NaCl para la
regin del IR La longitud ms comn en la trayectoria de las cubetas para Visible y UV,
suele ser de 1 cm, aunque las puede haber menores o mayores. Hay cubetas acopladas a los
sistemas de medidas continuas (FIA o HPLC), a travs de las cuales pasa el flujo de
muestra.
El receptculo en el que se deposita la muestra mantiene la solucin en el
instrumento mientras se realiza la medicin de la absorcin; necesariamente deben ser
transparentes a la radiacin utilizada.

Detector de radiacin:

Son sistemas que amplifican y transforman la energa radiante no absorbida por la

muestra en energa elctrica y la convierten en una seal elctrica y cuantificable. Los tipos
de detectores que se emplean en la actualidad difieren ante todo en las propiedades fsicas
que utilizan para la deteccin; pueden ser: dispositivos fotoemisores y diodos.

Sistema de procesamiento y lectura de seal.

En la actualidad todos los aparatos incorporan ya la lectura digital (la seal elctrica
analgica se transforma mediante un microprocesador en seal digital), la cual unida
tambin a la introduccin de microprocesadores, permite clculos directos de concentracin
con arreglo a factores de calibracin prefijados y lectura contra estndares, o curvas de
calibracin en memoria.

Espectrofotmetro de simple y doble haz

Los instrumentos de simple haz son aquellos en los cuales el haz de luz sigue una
nica trayectoria entre la fuente y el detector, La banda de luz atraviesa la muestra que se
halla contenida en una celda, la luz transmitida por la muestra pasa al detector originndose
una corriente elctrica que por medio de diferentes circuitos permite observar una seal, ya
sea el movimiento de una aguja o seal digital o un registro grfico.
En los instrumentos de doble haz la luz proveniente de la fuente es dividida en dos
haces despus de salir del monocromador mediante un sistema de espejos divisores, esta
divisin produce dos haces de luz, uno de ellos se dirige a la celda de referencia, que
contiene el blanco, y el otro haz se dirige hacia la celda de muestra. Los dos haces de luz
despus de atravesar la celda de referencia y la de muestra llegan a detectores separados
para obtener la seal correspondiente.
Los sistemas de doble haz tienen la ventaja de que cualquier variacin en la
intensidad de la fuente, la eficiencia de la red, la reflectividad de los espejos, la
fotosensibilidad del detector, etc., afecta simultneamente a los dos haces. En consecuencia,
la relacin de energa de los dos haces permanece siempre constante. Tienen los mismos
componentes que el de haz nico, adems de un haz de referencia y uno de muestra para
corregir las variaciones de intensidad de la fuente luminosa. En este tipo de
espectrofotmetros, una vez que la radiacin ha atravesado el monocromador, un
dispositivo con capacidad reflectante (chopper) le obliga a seguir alternativamente dos
direcciones. Una de ellas atraviesa la cubeta en que se deposita el blanco y la otra atraviesa
la cubeta en que est la muestra. Ambas cubetas deben de ser idnticas.

Parmetros de calidad de las tcnicas espectromtricas

Las tcnicas espectromtricas se basan en la interaccin de las radiaciones

electromagnticas con la materia. Las principales tcnicas empleadas en la actualidad en los
laboratorios de bioqumica clnica son:

La espectrometra de absorcin molecular en el ultravioleta y en el visible

La fluorimetra

La turbidimetra

La nefelometra

La luminometra

La espectrometra de absorcin atmica

La espectrometra de emisin atmica

Desviaciones de la Ley de Beer

Son desviaciones producidas en la linealidad de la relacin entre concentracin y
absorbancias; la recta se curva antes de su lmite de linealidad. Pueden causarlas diversos
factores:
Se miden concentraciones muy elevadas de cromgeno
La radiacin incidente no es monocromtica
La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto
La luz es transmitida por otros mecanismos (luz errtica, o luz monocromtica que
llega al detector)
Los lados de la cubeta no son paralelos
Si hay interferentes (otros cromgenos absorben tambin a esa longitud de onda)
Si existe fenmeno de fluorescencia
Clculo de concentraciones
La Ley de Beer tiene una aplicacin prctica para averiguar la concentracin de una
sustancia de inters en una solucin basndose en la relacin lineal entre absorbancia y
concentracin; as podemos conocer la concentracin de una sustancia de 2 maneras:

Por comparacin con una solucin conocida

Por la curva de calibracin

Por comparacin con una solucin conocida:

Si tenemos 2 soluciones, P (problema) y S (estndar de concentracin conocida).
Curva de calibracin:
Es la representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente
a concentracin (abscisas).
El mtodo de trabajo con curva de calibracin consiste en ensayar varias soluciones
de concentraciones conocidas, determinar sus absorbancias y a continuacin construir la
curva de calibracin (que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a
absorbancias grficamente; en la construccin de la curva se emplean un mnimo de 3
puntos y a continuacin se traza una lnea recta que se aproxime a ellos lo ms posible.

Mtodos fotomtricos No estroboscpicos: turbidimetra y nefelometra

Estas tcnicas se basan en la propiedad que poseen las partculas en suspensin de

dispersar la radiacin electromagntica. Por su parte la turbimetria va a medir la turbidez,
estos mtodos turbidimtricos se basan en la medicin de la intensidad de luz transmitida,
despus de que un haz de luz atraviese una suspensin de partculas. En realidad mide la
prdida energtica debida a fenmenos de absorcin reflexin y dispersin.
La intensidad de luz bloqueada por la muestra es directamente proporcional a la
concentracin de partculas, siguiendo la ley de Lambert-Beer en un intervalo limitado de
concentraciones. Esta intensidad transmitida se mide en un espectrofotmetro normal de
absorcin molecular. Generalmente se hacen mediciones entre 300-380 nm y entre 500-650
nm.
La nefelometra se basa en la medida de la luz dispersada por la suspensin de
partculas a un ngulo distinto al del haz incidente. Miden la luz dispersada, y el detector
est ubicado a un ngulo de 15 o 90 con respecto al haz incidente. Los hay que estn
fijos y los hay en los que se puede modificar el ngulo. La gran mayora de los
nefelmetros tienen un monocromador situado antes de la muestra y otro despus. En estos
medimos la luz dispersada.

Aplicaciones.
Turbidimetra:

Determinacin de protenas totales en orina y lquido cefaloraqudeo

Determinacin de ciertas protenas plasmticas mediante mtodos
inmunoturbidimetra.
Para el contaje de crecimiento bacteriano en cultivos.
Tambin tiene aplicaciones en hematologa (deteccin formacin cogulo, etc.)

de

Nefelometra:

Inmunonefelometra, se determinan protenas plasmticas y tambin se utilizan para

la determinacin de frmacos.
Para hematologa, los citmetros para el contaje de clulas.